Method Article

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

DOI:

10.3791/65257

⸱

May 12th, 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach eukariotycznych składniki błony, w tym białka i lipidy, są czasoprzestrzennie transportowane do miejsca przeznaczenia w systemie endomembranowym. Obejmuje to transport wydzielniczy nowo zsyntetyzowanych białek na powierzchnię komórki lub na zewnątrz komórki, transport endocytarny ładunków zewnątrzkomórkowych lub składników błony plazmatycznej do komórki oraz recykling lub transport transportowy ładunków między organellami subkomórkowymi itp. Zdarzenia związane z transportem błonowym mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, wzrostu i adaptacji środowiskowej wszystkich komórek eukariotycznych, a zatem podlegają ścisłej regulacji. Kinazy receptorowe na powierzchni komórki, które odbierają sygnały ligandowe z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, przechodzą zarówno transport wydzielniczy, jak i endocytarny. Opisano tutaj powszechnie stosowane podejścia do badania zdarzeń transportu błonowego przy użyciu kinazy receptorowej bogatej w powtórzenia leucyny zlokalizowanej w błonie plazmatycznej, ERL1. Podejścia obejmują przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalne obrazowanie konfokalne. Aby monitorować czasoprzestrzenną regulację ERL1, w badaniu tym opisano analizę kolokalizacji między ERL1 a wielopęcherzykowym białkiem markerowym ciała, RFP-Ara7, analizę szeregów czasowych tych dwóch białek oraz analizę z-stack ERL1-YFP traktowaną inhibitorami transportu błonowego brefeldyną A i wortmanniną.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruch błonowy to konserwatywny proces komórkowy, który rozdziela składniki błony (znane również jako ładunki), w tym białka, lipidy i inne produkty biologiczne, między różnymi organellami w komórce eukariotycznej lub przez błonę plazmatyczną do i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej1. Proces ten jest ułatwiony przez zbiór błon i organelli zwanych systemem endomembranowym, który składa się z błony jądrowej, retikulum endoplazmatycznego, aparatu Golgiego, wakuoli/lizosomów, błony plazmatycznej i wielu endosomów1. System endomembranowy umożliwia modyfikację, pakowanie i transport elementów błony za pomocą dynamicznych pęcherzyków, które przemieszczają się między tymi organellami. Zdarzenia związane z transportem błonowym mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, wzrostu i adaptacji do środowiska, a zatem podlegają rygorystycznym i złożonym regulacjom2. Obecnie opracowano i zastosowano wiele podejść w biologii molekularnej, biologii chemicznej, mikroskopii i spektrometrii mas w dziedzinie transportu błonowego i znacznie poszerzyły zrozumienie czasoprzestrzennej regulacji systemu endomembranowego3,4. Biologia molekularna jest wykorzystywana do klasycznych manipulacji genetycznych domniemanych graczy zaangażowanych w transport błonowy, takich jak zmiana ekspresji genu białka będącego przedmiotem zainteresowania lub oznaczanie białka będącego przedmiotem zainteresowania pewnymi znacznikami. Narzędzia w biologii chemicznej obejmują wykorzystanie molekuł, które specyficznie zakłócają ruch na określonych trasach4,5. Spektrometria mas jest skuteczna w identyfikacji składników organelli, która została mechanicznie wyizolowana za pomocą metod biochemicznych3,4. Jednak ruch błonowy jest dynamicznym, zróżnicowanym i złożonym procesem biologicznym1. Aby zobrazować proces transportu błonowego w żywych komórkach w różnych warunkach, niezbędnym narzędziem jest mikroskopia świetlna. Ciągły postęp został osiągnięty w zaawansowanych technikach mikroskopowych, aby sprostać wyzwaniom związanym z pomiarem wydajności, kinetyki i różnorodności zdarzeń4. W tym miejscu badanie to koncentruje się na szeroko stosowanych metodologiach w biologii chemicznej/farmakologicznej, biologii molekularnej i mikroskopii w celu zbadania zdarzeń transportu błonowego w naturalnie uproszczonym i eksperymentalnie dostępnym systemie, procesie rozwoju aparatów szparkowych.

Aparaty szparkowe to mikropory na powierzchniach roślin, które otwierają się i zamykają, aby ułatwić wymianę gazową między wewnętrznymi komórkami a środowiskiem6,7,8. W związku z tym aparaty szparkowe są niezbędne do fotosyntezy i transpiracji, dwóch zdarzeń, które mają kluczowe znaczenie dla przetrwania i wzrostu roślin. Rozwój aparatów szparkowych jest dynamicznie dostosowywany przez sygnały środowiskowe w celu optymalizacji adaptacji rośliny do otoczenia9. Począwszy od badań z 2002 roku, identyfikacja białka receptorowego Too Many Mouths (TMM) otworzyła drzwi do nowej ery badania molekularnych mechanizmów rozwoju aparatów szparkowych w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana10. Już po kilku dekadach zidentyfikowano klasyczny szlak sygnałowy. Od góry do dalszej części szlak ten obejmuje grupę ligandów peptydów wydzielniczych z rodziny czynników wzorcowania naskórka (EFP), kilka kinaz receptorowych bogatych w powtórzenia leucyny (LRR) na powierzchni komórki w rodzinie EREECTA (ER), białko receptora LRR TMM, kaskadę MAPK i kilka czynników transkrypcyjnych bHLH, w tym SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA i SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26. Wcześniejsze prace wskazują, że jedna z kinaz receptorowych, ER-LIKE 1 (ERL1), wykazuje aktywne zachowania subkomórkowe po percepcji EPF20. ERL2 również dynamicznie przemieszcza się między błoną plazmatyczną a niektórymi organellami wewnątrzkomórkowymi27. Zablokowanie etapów transportu błony powoduje nieprawidłowy wzór aparatów szparkowych, co skutkuje skupiskami aparatów szparkowych na powierzchni liścia28. Wyniki te sugerują, że ruch błonowy odgrywa istotną rolę w rozwoju aparatów szparkowych. W badaniu tym opisano protokół czasowo-przestrzennego badania dynamiki ERL1 za pomocą analizy kolokalizacji subkomórkowej białko-białko w połączeniu z leczeniem farmakologicznym przy użyciu niektórych inhibitorów transportu błonowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj roztwór do sterylizacji nasion, mieszając 15 ml wybielacza z 35 ml wody destylowanej i 50 μl Triton X-100.
  2. Przygotować roztwór brefeldyny A (BFA), rozpuszczając proszek BFA w etanolu do końcowego stężenia 10 mM (zapas). Przygotować roztwór wortmanniny (Wm), rozpuszczając proszek Wm w DMSO do końcowego stężenia 10 mM (zapas).

2. Siew nasion

  1. Podwielokrotność 10-50 nasion z każdej z wymaganych roślin transgenicznych do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 1 ml roztworu do sterylizacji nasion do każdej probówki i dokładnie wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę przez 10 minut na shakerze.
  2. Wyrzuć roztwór do sterylizacji nasion i umyj nasiona 1 ml autoklawowanej wody destylowanej pięć razy.
  3. Dodać 300 μl autoklawowanej wody destylowanej do każdej probówki i zasiać nasiona na pożywce MS o połowie mocy zawierającej 1% (w/v) sacharozy i 0,75% (w/v) agaru. W razie potrzeby uzupełnij pożywkę odpowiednimi antybiotykami.
  4. Trzymaj płytkę do góry nogami w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.
  5. Po 2 dniach przenieść płytkę do pomieszczenia wzrostowego z cyklem 16 godzin światła/8 godzin ciemności (80 μmol/m2/s1) w temperaturze 22 °C. Uważa się, że jest to pierwszy dzień po wykiełkowaniu (1 dpg).
  6. Przeszczep sadzonki do gleby w temperaturze 10 dpg w celu dalszego wzrostu.

3. Przygotowanie dwukolorowych roślin transgenicznych F1

  1. Hoduj homozygotyczne rośliny transgeniczne z ERL1-YFP (roślina A) i homozygotyczne rośliny transgeniczne z białkiem markerowym znakowanym RFP-Ara7 (roślina B) 20 obok siebie, aż do kwitnienia w pomieszczeniu wzrostu z 16 godzinami światła/8 godzinami ciemnego cyklu (80 μmol/m2/s1) w temperaturze 22 °C.
  2. Wybierz młody kwiatostan z rośliny A. Zachowaj jeden kwiat, który właśnie ma się otworzyć na kwiatostanie, aby uzyskać krzyżówki genetyczne. Usuń wszystkie starsze kwiaty i silikony. Dodatkowo ostrożnie usuń młodsze kwiaty i merystemy kwiatowe, aby uniknąć przyszłych nieporozumień.
  3. Delikatnie rozetnij nieotwarty kwiat, usuwając działki, płatki i pręcik za pomocą ostrej pęsety. Słupek należy pozostawić tylko na kwiatostanie.
  4. Weź dojrzały pręcik z otwartego kwiatu na roślinie B i umieść ziarna pyłku na znamieniu rozciętego słupka na roślinie A.
  5. Oznacz ten ręcznie skrzyżowany kwiat, wskazując jego ojca, matkę i datę krzyżówki genetycznej. Pozwól kwiatowi dojrzeć i zbierz nasiona F1, gdy krzemionka zmieni kolor na żółty/brązowy (~ 20 dni po krzyżówce). Sprawdź, czy instalacja F1 odniosła sukces, a obsługuje zarówno sygnały YFP, jak i RFP.

4. Leczenie farmakologiczne

  1. W przypadku zabiegu BFA należy usunąć liścienie z 7-dniowych siewek, zanurzyć resztę sadzonek w roztworze imitującym (0,3% etanolu) lub roztworze BFA 30 μM, zastosować próżnię przez 1 minutę i pozostawić próbkę zanurzoną przez 30 minut przed obrazowaniem.
  2. W celu leczenia wortmanninem należy usunąć liścienie z 7-dniowych siewek, zanurzyć resztę sadzonek w 0,25% roztworze DMSO lub 25 mM wortmannin, zastosować próżnię przez 1 minutę i trzymać próbkę zanurzoną przez 30 minut przed obrazowaniem.
  3. W celu obróbki próżniowej próbek, w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 500 μl odpowiedniego roztworu leku i zanurz wypreparowane sadzonki w roztworze. Szczelnie przymocuj strzykawkę o pojemności 10 ml do probówki mikrowirówki i stosuj podciśnienie przez 1 minutę (Rysunek 1). Wyjąć strzykawkę i trzymać próbkę w roztworze przez wymagany czas. Delikatnie wyjmij sadzonki w celu przygotowania obrazowania.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Proste urządzenie próżniowe. Strzykawka o pojemności 10 ml jest podłączona do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w celu obróbki próżniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie próbki do obrazowania

  1. Wyciąć prawdziwy liść z próbki poddanej działaniu środka za pomocą ostrej żyletki. Delikatnie umieść prawdziwy liść w kropli wody na szkiełku podstawowym i trzymaj abaksjalną stroną do góry. Powoli przykryj prawdziwy liść szkiełkiem nakrywkowym, unikając uwięzienia pęcherzyków.

6. Obrazowanie konfokalne

UWAGA: Odwrócony skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP8 został użyty do zobrazowania sygnału fluorescencji próbek w tej pracy.

  1. Konfiguracja ścieżki belki
    1. Wybierz laser 514 nm do wzbudzenia YFP. Użyj dużej mocy lasera, aby zwiększyć intensywność sygnału, a tym samym uzyskać wysoką jakość obrazu. Jednak moce lasera powyżej 5% stwarzają ryzyko fotowybielania, co może mieć wpływ na zdrowie próbki. Jeśli próbka sygnału nie jest zbyt słaba, zacznij od niskiej intensywności lasera.
    2. Włącz PMT/HyD do wykrywania i zdefiniuj górne i dolne progi pasma emisji na podstawie widma dla fluoroforu YFP. Ustaw okno detekcji 530-570 nm, aby odebrać sygnał YFP.
    3. Obrazowanie sekwencyjne dla drugiego koloru: Kliknij przycisk Seq i dodaj nowy kanał. Domyślnie poprzednio zaprojektowaną ścieżką wiązki YFP będzie Seq 1. W Seq 2 wybierz laser 561 nm do wzbudzenia RFP i ustaw okno wykrywania 570-630 nm w celu zebrania sygnału RFP.
  2. Konfiguracja warunków skanowania (Rysunek 2)
    1. Aby zobrazować aktywność ruchu błony subkomórkowej w komórkach prekursorowych aparatów szparkowych, wybierz soczewkę Corr 63x/1,2 W w systemie do obrazowania.
    2. Format odnosi się do rozmiaru obrazu w pikselach. Zacznij od 1 024 x 1 024 pikseli, a następnie zoptymalizuj to w oparciu o współczynnik powiększenia i ustawienia obiektywu, aby uzyskać dobrą rozdzielczość i jakość publikacji.
    3. Prędkość odnosi się do prędkości głowicy skanującej, gdy laser przechodzi przez każdy piksel. Chociaż niskie prędkości skanowania często skutkują lepszym stosunkiem sygnału do szumu, mogą one nie wychwytywać skutecznie szybko zmieniających się zdarzeń związanych z transportem membranowym. Zacznij od prędkości 400 Hz i optymalizuj ją w zależności od konkretnej sytuacji próbek.
    4. Współczynnik powiększenia służy do przybliżania obszaru zainteresowania bez zmiany soczewki obiektywu. Zacznij od współczynnika powiększenia wynoszącego 1 i zoptymalizuj go w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu.
    5. Średnia liniowa odnosi się do tego, ile razy każda linia X zostanie zeskanowana w celu uzyskania uśrednionego wyniku. Większa średnia liniowa zmniejsza szum w wynikowym obrazie, ale także wydłuża czas skanowania i czas ekspozycji na światło lasera. Aby zobrazować zdarzenia trafikowania membranowego, nie należy używać wysokiej średniej wierszowej. Zacznij od średniej liniowej 2x i optymalizuj w razie potrzeby.
  3. Zbieranie szeregów czasowych
    UWAGA: Podczas badania zdarzeń transportu błonowego często potrzebny jest szereg czasowy, aby zarejestrować szybki ruch endosomów subkomórkowych.
    1. W trybie akwizycji wybierz tryb skanowania xyt, aby włączyć narzędzie szeregów czasowych.
    2. Określ okres oczekiwania między punktami czasowymi w obszarze Przedział czasu. Możesz też kliknąć Minimalizuj, aby zrobić zdjęcia natychmiast jedno po drugim. W poniższym eksperymencie z szeregami czasowymi zastosowano 7-sekundowy interwał czasowy.
    3. Wybierz pozycję Czas trwania i wprowadź łączny czas uruchomienia eksperymentu. Możesz też zdefiniować liczbę ramek, które mają zostać zebrane, wybierając opcję Ramki (Rysunek 3).
  4. Aby zebrać trójwymiarowe informacje dotyczące zdarzenia transportu błony w całej komórce, użyj trybu skanowania stosu Z. Do analizy często używana jest projekcja maksymalnej intensywności obrazów ze stosu Z.
    1. Wybierz tryb skanowania xyz w trybie akwizycji, a narzędzie Z-Stack stanie się dostępne.
    2. Wybierz opcję Z-wide. W trybie skanowania zdefiniuj górny i dolny obraz stosu Z za pomocą przycisków Początek i Koniec.
    3. Określ grubość kroku z, klikając rozmiar kroku z. Alternatywnie określ, ile zdjęć ma zostać wykonanych, aby pokryć cały zakres stosu Z. Aby zapewnić spójność między próbkami, zdefiniuj rozmiar kroku z (Rysunek 4).
  5. Przetwarzanie obrazu
    1. Projekcja maksymalnej intensywności obrazów ze stosu z jest generowana przez oprogramowanie konfokalne (http://www.leica-microsystems.com). Na głównej karcie Proces najpierw wybierz odpowiedni plik z-stack na karcie Otwórz projekty po lewej stronie. Następnie przejdź do środkowej zakładki o nazwie Narzędzia procesu, wybierz funkcję Projekcja, wybierz Maksimum z panelu rozwijanego Metoda i kliknij przycisk Zastosuj. Obraz projekcji z-stack zostanie wygenerowany na karcie Open Projects (Otwarte projekty).
    2. Wideo obrazów szeregów czasowych jest generowane przez Fidżi (https://imagej.net/Fiji). Na karcie Plik użyj funkcji Otwórz, aby otworzyć wszystkie obrazy szeregów czasowych w odpowiedniej kolejności. Na karcie Obraz znajdź funkcję Stos i wybierz Obrazy do ułożenia w stos, aby wygenerować wideo. Zapisz plik w formacie .avi z żądaną liczbą klatek na sekundę (5 klatek/s dla Wideo 1).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Panel trybu skanowania wymiaru XY. Panel trybu skanowania służy do ustawiania warunków skanowania obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Narzędzie szeregów czasowych w trybie skanowania xyt. Narzędzie szeregów czasowych służy do ustawiania warunków obrazowania w celu sekwencyjnego zbierania serii obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Narzędzie z-stack w trybie skanowania xyz. Narzędzie z-stack służy do ustawiania warunków obrazowania w celu zebrania serii obrazów na osi z. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednie badanie wykazało, że ERL1 jest aktywną kinazą receptorową, która ulega dynamicznym zdarzeniom transportu błonowego20. ERL1 jest transbłonową kinazą receptora LRR na błonie komórkowej. Nowo zsyntetyzowany ERL1 w retikulum endoplazmatycznym jest przetwarzany w ciałach Golgiego i dalej transportowany do błony komórkowej. Cząsteczki ERL1 na błonie plazmatycznej mogą postrzegać ligandy EPF za pomocą swojej zewnątrzkomórkowej domeny LRR18. Po aktywacji przez hamujące E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System endomembranowy rozdziela cytoplazmę komórki eukariotycznej na różne przedziały, co umożliwia wyspecjalizowaną funkcję biologiczną tych organelli. Aby dostarczyć białka ładunkowe i makrocząsteczki do miejsca docelowego we właściwym czasie, liczne pęcherzyki są kierowane do przemieszczania się między tymi organellami. Wysoce regulowane zdarzenia transportu błonowego odgrywają fundamentalną rolę w żywotności, rozwoju i wzroście komórek. Mechanizm regulujący ten kluczowy i skomplikowany proces jest wciąż słabo poznany...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) oraz University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawki 10 mlVWRBD309695Próbki próżniowe
Brefeldin A (BFA)SigmaB7651Mikroskop
konfokalnyLeicaLecia SP8 TCS z pakietem oprogramowania LAS-XKleszcze
prosektoryjneVWR82027-402Krzyżówka genetyczna
FidżiNIHhttps://imagej.net/FijiPrzetwarzanie obrazu
Oprogramowanie Leica LAS AFLeicahttp://www.leica-microsystems.comPrzetwarzanie obrazów
transgeniczne nasiona ERL1-YFPQi, X. et al. Wielorakie działanie peptydów sygnałowych na subkomórkową dynamikę receptora określa los komórek szparkowych. Życie w Egipcie. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgeniczne nasiona RFP-Ara7Ebine, K. i wsp. Szlak transportu błonowego regulowany przez specyficzną dla roślin GTPazę RAB ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)SigmaW1628membranowy narkotyk do handlu
do obrazowania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756(2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21(2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852(2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114(2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097(2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090(2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102(2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Membrane TraffickingStomatal Lineage CellsConfocal ImagingERL1 YFPRFP Ara7Multivesicular BodiesPharmacological TreatmentZ Stack AnalysisTime Series ImagingEndocytic Transport

Related Articles