Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Podsumowanie

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Streszczenie

W komórkach eukariotycznych składniki błony, w tym białka i lipidy, są czasoprzestrzennie transportowane do miejsca przeznaczenia w systemie endomembranowym. Obejmuje to transport wydzielniczy nowo zsyntetyzowanych białek na powierzchnię komórki lub na zewnątrz komórki, transport endocytarny ładunków zewnątrzkomórkowych lub składników błony plazmatycznej do komórki oraz recykling lub transport transportowy ładunków między organellami subkomórkowymi itp. Zdarzenia związane z transportem błonowym mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, wzrostu i adaptacji środowiskowej wszystkich komórek eukariotycznych, a zatem podlegają ścisłej regulacji. Kinazy receptorowe na powierzchni komórki, które odbierają sygnały ligandowe z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, przechodzą zarówno transport wydzielniczy, jak i endocytarny. Opisano tutaj powszechnie stosowane podejścia do badania zdarzeń transportu błonowego przy użyciu kinazy receptorowej bogatej w powtórzenia leucyny zlokalizowanej w błonie plazmatycznej, ERL1. Podejścia obejmują przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalne obrazowanie konfokalne. Aby monitorować czasoprzestrzenną regulację ERL1, w badaniu tym opisano analizę kolokalizacji między ERL1 a wielopęcherzykowym białkiem markerowym ciała, RFP-Ara7, analizę szeregów czasowych tych dwóch białek oraz analizę z-stack ERL1-YFP traktowaną inhibitorami transportu błonowego brefeldyną A i wortmanniną.

Wprowadzenie

Ruch błonowy to konserwatywny proces komórkowy, który rozdziela składniki błony (znane również jako ładunki), w tym białka, lipidy i inne produkty biologiczne, między różnymi organellami w komórce eukariotycznej lub przez błonę plazmatyczną do i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej¹. Proces ten jest ułatwiony przez zbiór błon i organelli zwanych systemem endomembranowym, który składa się z błony jądrowej, retikulum endoplazmatycznego, aparatu Golgiego, wakuoli/lizosomów, błony plazmatycznej i wielu endosomów¹. System endomembranowy umożliwia modyfikację, pakowanie i transport elementów błony za pomocą dynamicznych pęcherzykó....

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj roztwór do sterylizacji nasion, mieszając 15 mL wybielacza z 35 mL wody destylowanej i 50 µL Triton X-100.
2. Przygotuj roztwór brefeldyny A (BFA), rozpuszczając proszek BFA w etanolu do stężenia końcowego 10 mM (roztwór zapasowy). Przygotuj roztwór wortmanniny (Wm), rozpuszczając proszek Wm w DMSO do stężenia końcowego 10 mM (roztwór zapasowy).

2. Sianie nasion

1. Odmierz 10-50 nasion z każdej z wymaganych roślin transgenicznych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki dodaj 1 mL roztworu do sterylizacji n....

Wyniki

Poprzednie badanie wykazało, że ERL1 jest aktywną kinazą receptorową, która ulega dynamicznym procesom transportu błonowego²⁰. ERL1 jest transbłonową kinazą receptorową LRR zlokalizowaną na błonie plazmatycznej. Nowo syntetyzowane białko ERL1 w retikulum endoplazmatycznym jest przetwarzane w aparatach Golgiego, a następnie transportowane do błony plazmatycznej. Cząsteczki ERL1 na błonie plazmatycznej mogą rozpoznawać ligandy EPF za pomocą swojej zewnątrzkomórkowej domeny LRR¹⁸

Dyskusja

System endomembranowy rozdziela cytoplazmę komórki eukariotycznej na różne przedziały, co umożliwia wyspecjalizowaną funkcję biologiczną tych organelli. Aby dostarczyć białka ładunkowe i makrocząsteczki do miejsca docelowego we właściwym czasie, liczne pęcherzyki są kierowane do przemieszczania się między tymi organellami. Wysoce regulowane zdarzenia transportu błonowego odgrywają fundamentalną rolę w żywotności, rozwoju i wzroście komórek. Mechanizm regulujący ten kluczowy i skomplikowany proces jest wciąż słabo poznany.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki 10 ml	VWR	BD309695	Próbki próżniowe
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	Mikroskop
konfokalny	Leica	Lecia SP8 TCS z pakietem oprogramowania LAS-X	Kleszcze
prosektoryjne	VWR	82027-402	Krzyżówka genetyczna
Fidżi	NIH	https://imagej.net/Fiji	Przetwarzanie obrazu
Oprogramowanie Leica LAS AF	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Przetwarzanie obrazów
transgeniczne nasiona ERL1-YFP			Qi, X. et al. Wielorakie działanie peptydów sygnałowych na subkomórkową dynamikę receptora określa los komórek szparkowych. Życie w Egipcie. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgeniczne nasiona RFP-Ara7			Ebine, K. i wsp. Szlak transportu błonowego regulowany przez specyficzną dla roślin GTPazę RAB ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membranowy narkotyk do handlu

do obrazowania