Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65258

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Streszczenie

MikroSiM (μSiM) to oparta na błonie platforma hodowlana do modelowania bariery krew-mózg (BBB). W przeciwieństwie do konwencjonalnych platform opartych na membranach, μSiM zapewnia eksperymentatorom nowe możliwości, w tym obrazowanie żywych komórek, niezakłóconą sygnalizację parakrynną między komorami "krwi" i "mózgu" oraz możliwość bezpośredniego obrazowania immunofluorescencji bez konieczności ekstrakcji/ponownego montażu błon. W tym miejscu pokazujemy podstawowe zastosowanie platformy do tworzenia modeli monokulturowych (komórki śródbłonka) i kokulturowych (komórki śródbłonka i perycyty) bariery krew-mózg przy użyciu ultracienkich nanoporowatych membran z azotku krzemu. Wykazujemy zgodność zarówno z pierwotnymi hodowlami komórkowymi, jak i hodowlami indukowanych przez ludzi pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Dostarczamy metody analizy jakościowej modeli BBB za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i demonstrujemy użycie μSiM do ilościowej oceny funkcji bariery w teście przepuszczalności małych cząsteczek. Przedstawione metody powinny umożliwić użytkownikom stworzenie własnych modeli barierowych na platformie, co przyczyni się do postępu w wykorzystaniu technologii chipów tkankowych do badania tkanek ludzkich.

Wprowadzenie

Żywe tkanki są podzielone na wyspecjalizowane komórki, które tworzą i utrzymują bariery oraz regulują, które komórki i cząsteczki są transportowane z jednego przedziału do drugiego. Niewłaściwa regulacja funkcji bariery może być źródłem zarówno ostrych chorób, jak i chorób przewlekłych. Bariera krew-mózg (BBB) jest najbardziej restrykcyjną barierą tkankową w ludzkim ciele1. Dysfunkcja bariery krew-mózg leży u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym choroby Alzheimera2, choroby Parkinsona3,4 i stwardnienia rozsianego5,6. Uraz bariery krew-mózg jest również związany z długotrwałym upośledzeniem funkcji poznawczych w wyniku ostrych zaburzeń, takich jak sepsa7, COVID-198 i maja9. Opracowanie leków, które mogą potencjalnie leczyć choroby mózgu, było frustrująco trudne ze względu na wyzwanie polegające na celowym naruszeniu bariery krew-mózg w celu dostarczenia bioaktywnych cząsteczek do celów w mózgu10. Z tych powodów metody badania funkcji BBB in vitro mają ogromne znaczenie dla zrozumienia i leczenia chorób OUN.

Podstawowe metody pomiaru funkcji bariery in vitro polegają na stworzeniu monowarstwy lub kokultury na półprzepuszczalnej membranie i zmierzeniu oporu wywieranego przez komórki na dyfuzję małych cząsteczek lub małe prądy elektryczne11,12,13,14. Podczas gdy pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS) stworzyło wiele możliwości modelowania BBB w 3D15,16, różnorodność geometrii systemów utrudnia porównanie pomiarów przepuszczalności między MPS lub z ustalonymi wartościami literaturowymi. Ustalenie wiarygodnych wartości wyjściowych jest szczególnie ważne w badaniach BBB, w których, ze względu na rozległą regulację bariery przez komórki śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu, wartości przepuszczalności in vitro są dokładnie analizowane12,17,18. Z tych powodów pomiary przepuszczalności w monowarstwach ustanowionych na membranach 2D pozostaną podstawą badań BBB w nadchodzących latach. Dotyczy to również innych barier tkankowych, w tym barier nabłonkowych, w przypadku których bezwzględne wartości przepuszczalności linii bazowej są wykorzystywane do walidacji i porównania modeli in vitro19,20,21.

Mając na celu stworzenie nowego, wartościowego narzędzia dla społeczności badawczej BBB, wprowadziliśmy22 i zaawansowane23,24,25,26 mikrourządzenie wyposażone w silicon membrane (μSiM) do wykorzystania w modelowaniu tkanek barierowych w ciągu ostatnich 5 lat. Cechą umożliwiającą platformę jest ultracienka (o grubości <100 nm) membrana z setkami milionów nanoporów27,28 lub mieszanka nanoporów i mikroporów29. Wolnostojące chipy membranowe są produkowane na krzemowym "chipie" o grubości 300 μm, który stabilizuje ultracienkie struktury30 i umożliwia ich obsługę za pomocą pęsety do montażu urządzenia. Ze względu na ich ultracienką naturę, membrany mają przepuszczalność o dwa rzędy wielkości wyższą niż w przypadku konwencjonalnych membran trawionych ścieżkowo stosowanych w komercyjnych urządzeniach do hodowli membranowej31,32. W praktyce oznacza to, że przeszkoda membrany w dyfuzji cząsteczek mniejszych niż nanopory (<60 nm) jest znikoma33. Tak więc, w przypadku barier komórkowych, tylko komórki i zdeponowane przez nie matryce będą określać szybkość transportu małych cząsteczek z przedziałów wierzchołkowych do podstawnych, które są oddzielone błoną34. Konstrukcja urządzenia i ultracienka natura membran zapewniają również wiele korzyści dla mikroskopii optycznej. Należą do nich: 1) możliwość śledzenia żywych kultur za pomocą kontrastu fazowego lub obrazowania w jasnym polu, 2) zdolność do barwienia fluorescencyjnego i obrazowania in situ bez konieczności ekstrakcji i przenoszenia membrany do szkła nakrywkowego oraz 3) fakt, że błony są cieńsze niż "plastry" konfokalne, dzięki czemu bezpośrednie kokultury mają bardziej naturalne odstępy między typami komórek niż można to osiągnąć w przypadku membran trawionych ścieżkowo o grubości 6-10 μm.

Ostatnio rozwinęliśmy platformę do formatu modułowego, aby ułatwić szybki montaż34 i dostosowywanie35,36. Wykorzystaliśmy format modułowy do dystrybucji komponentów urządzenia między naszymi laboratoriami bioinżynieryjnymi i współpracującymi laboratoriami zajmującymi się barierą mózgową. Następnie wspólnie opracowaliśmy protokoły montażu urządzeń, monokultury i kohodowli, barwienia immunofluorescencyjnego oraz przepuszczalności małych cząsteczek i wykazaliśmy, że metody te są powtarzalne między laboratoriami. Korzystając z tych protokołów, wykazaliśmy również, że modułowa platforma obsługuje zwalidowaną barierę krew-mózg opracowaną przy użyciu metody rozszerzonej hodowli śródbłonka (EECM) do tworzenia mikrokrążopodobnych komórek śródbłonka mózgu (BMEC) z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)37. Celem niniejszego raportu jest bardziej szczegółowy przegląd tych metod i, za pomocą dołączonego filmu, ułatwienie szerszego przyjęcia platformy w społeczności BBB.

Protokół

1. Montaż urządzenia µSiM

UWAGA: Ta metoda opisuje montaż urządzeń. Chip membranowy posiada stronę z rowkiem oraz stronę płaską i może być montowany rowkiem do góry lub rowkiem do dołu. Urządzenia z rowkiem skierowanym do dołu są najczęściej stosowane w hodowli komórkowej.

  1. W środowisku sterylnym (np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza), przygotuj wszystkie materiały do montażu, w tym uchwyty montażowe, komponenty, chipy membranowe oraz pęsety.
  2. Umieść chip membranowy w centrum uchwytu A1 za pomocą pęsety do chipów. Płaska powierzchnia chipu powinna być skierowana w dół, a obszar rowka w górę w przypadku urządzeń z rowkiem skierowanym w dół (trench-down), i odwrotnie w przypadku urządzeń z rowkiem skierowanym w górę (trench-up).
    UWAGA: Kolejne kroki montażu zostały zilustrowane na przykładzie urządzenia z rowkiem skierowanym w dół, co zapewnia płaski obszar wzrostu w górnej komorze.
  3. Przyklej komponent 1 do chipu. Najpierw, za pomocą pęsety prostej, odklej niebieskie warstwy ochronne z obu stron komponentu 1 i umieść go w uchwycie A1 górną komorą do dołu. Delikatnie dociśnij komponent 1, aż klej wrażliwy na nacisk (PSA) dotknie chipu.
  4. Nałóż uchwyt A2 na uchwyt A1 i wywrzyj silny nacisk w różnych narożnikach, aby zapewnić szczelne dopasowanie chipu i komponentu.
    UWAGA: Należy upewnić się, że warstwa PSA nie została usunięta. Jest to warstwa przezroczysta i sztywniejsza w porównaniu do niebieskich warstw ochronnych.
  5. Przyklej komponent 2 do komponentu 1 z chipem. Najpierw przygotuj komponent 2, chwytając jeden jego narożnik pęsetą prostą i odrywając go od arkusza. Następnie chwyć obszar „trójkąta” komponentu 2 pozbawiony warstwy PSA i usuń wspólnie grubą, przezroczystą warstwę ochronną oraz warstwę niebieską komponentu 2, odsłaniając powierzchnię PSA. Umieść komponent 2 w uchwycie B1 stroną PSA do góry.
  6. Umieść komponent 1 z chipem membranowym w uchwycie B1 górną komorą do góry.
  7. Nałóż uchwyt B2 na komponent 1 i wywrzyj silny nacisk w różnych narożnikach uchwytu B2.
  8. Wyjmij zmontowane urządzenie z uchwytu i za pomocą pęsety prostej wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza z dolnej strony urządzenia oraz uszczelnij krawędzie kanału, unikając kontaktu z obszarem membrany. Przed użyciem do hodowli komórkowej, wysterylizuj nowo zmontowane urządzenia promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez 20 min.

2. Hodowla komórek

UWAGA: Niniejsza metoda opisuje protokoły dla kultur pierwotnych oraz pochodnych z hiPSC na tej platformie. Metody opisują monokulturę komórek śródbłonka w górnej komorze urządzenia oraz kokulturę pericytów i komórek śródbłonka, w której pericyty znajdują się w dolnej komorze, a komórki śródbłonka w górnej komorze urządzeń zmontowanych w konfiguracji trench-down. Wymiary i objętości komór przedstawiono w Tabeli 1. Są to najczęściej stosowane formaty, jednak w zależności od potrzeb użytkownika można zastosować inne układy hodowli komórkowych.

  1. Przygotowanie komory hodowli komórkowej
    1. Zmontować urządzenia zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w sekcji 1.
    2. Umieścić urządzenia w sterylnych zaciskach do węży. Przed hodowlą komórkową wysterylizować zaciski, namaczając je w etanolu przez ≥20 min. Ponownie wysterylizować po każdym eksperymencie w celu ponownego użycia.
    3. Hodować urządzenia w dużej sterylnej płytce Petriego. Aby zwiększyć wilgotność, dodać małą płytkę Petriego lub zakrętkę od probówki stożkowej 50 mL wypełnioną sterylną wodą.
    4. Przemyć górną komorę urządzeń dwukrotnie 100 µL sterylnej wody. W przypadku hodowli komórkowej w komorze dolnej, przemyć komorę dolną 20 µL sterylnej wody.
  2. Monokultura linii komórkowej hCMEC/D3 (BBB)
    1. Przygotować komorę hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
    2. Pokryć górne komory 25 µg/cm2 kolagenu I oraz 5 µg/cm2 ludzkiej fibronektyny zmieszanych z solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS). Pozostawić na 1-2 h w 37 °C lub przez noc w 4 °C.
    3. Usunąć roztwór do pokrywania i dodać 100 µL podgrzanego medium endotelialnego pozbawionego czynników wzrostu (medium analityczne) do górnej komory oraz 20 µL do komory dolnej. Aby przygotować medium analityczne, zmieszać 100 mL podstawowego medium endotelialnego + 400 µL ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów + 40 µL hydrokortyzonu + 100 µL siarczanu gentamycyny + 2 mL płodowej surowicy bydlęcej.
    4. Prowadzić pasażowanie komórek hCMEC/D3 zgodnie z protokołem producenta; trypsynizować komórki w inkubatorze w 37 °C przez 3-5 min, a następnie przerwać trypsynizację poprzez dodanie podgrzanego medium endotelialnego. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i wirować przy 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Resuspender osad komórkowy w medium analitycznym i wysiać komórki w górnych komorach z gęstością 40 000-60 000 komórek/cm2. Inkubować urządzenia w 37 °C przy 5% dwutlenku węgla (CO2) przez 2-4 h w celu ułatwienia adhezji komórek. Na przykład, aby osiągnąć 40 000 komórek/cm2 na chipie 0,37 cm2, dodać do górnej komory 100 µL roztworu komórkowego o stężeniu 150 000 komórek/mL.
      UWAGA: Hodujemy i pasażujemy hCMEC/D3 zgodnie z Hudecz et al.38, stosując zmodyfikowaną formulację medium wzrostowego dla komórek endotelialnych-2 (EGM-2) do utrzymania komórek oraz „medium analityczne” o zredukowanej zawartości czynników wzrostu po subkulturze do analiz. Inne formulacje mediów powinny być kompatybilne z urządzeniami, choć zalecamy formulacje mediów według Hudecz et al.38, jeśli użytkownicy napotkają problemy z przeżywalnością hCMEC/D3.
    5. Po 2-4 h adhezji komórek wymienić medium na świeże medium analityczne w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyległe komórki.
    6. Utrzymywać urządzenia w 37 °C przy 5% CO2, wymieniając medium analityczne w obu komorach co 2-3 dni aż do rozpoczęcia eksperymentów. Analizy są zazwyczaj wykonywane po 2 tygodniach hodowli.
  3. Monokultura komórek pochodnych hiPSC typu EECM-BMEC
    1. Przygotować komorę hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
    2. Przygotować roztwór kolagenu IV z ludzkiej łożyska, dodając 5 mL 0,5 mg/mL kwasu octowego do 5 mg kolagenu IV, aby uzyskać roztwór 1 mg/mL. Pozostawić roztwór na ≥4 h w 4 °C do pełnej rekonstytucji. Roztwór jest stabilny w 4 °C przez 2 tygodnie.
    3. Pokryć górne komory 100 µL mieszaniny kolagenu IV, wołowej fibronektyny i sterylnej wody w stosunku 4:1:5. Pokrywać w 37 °C przez 2-4 h.
    4. Usunąć roztwór do pokrywania i dodać 100 µL hECSR w temperaturze pokojowej do górnej komory oraz 20 µL do komory dolnej.
    5. Prowadzić pasażowanie komórek typu EECM-BMEC zgodnie z Nishihara et al.37; dodać do komórek mieszaninę enzymów odrywających i przenieść do inkubatora w 37 °C na 5-8 min. Pipetować roztwór komórkowy w celu zsingularyzowania i dodać 4-krotną objętość medium endotelialnego w probówce wirówkowej. Wirować przy 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej; resuspender komórki w hECSR i wysiać w górnych komorach z gęstością 40 000 komórek/cm2. Inkubować urządzenia w 37 °C przy 5% CO2 przez 2-4 h w celu ułatwienia adhezji komórek. Na przykład, aby osiągnąć 40 000 komórek/cm2, dodać 100 µL roztworu komórkowego o stężeniu 150 000 komórek/mL.
    6. Po 2-4 h adhezji komórek wymienić medium na świeże hECSR w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyległe komórki.
    7. Utrzymywać urządzenia w 37 °C przy 5% CO2, wymieniając hECSR w obu komorach co 1-2 dni aż do rozpoczęcia eksperymentów. Analizy są zazwyczaj wykonywane w 6. dniu hodowli.
  4. Kokultura hCMEC/D3 i pierwotnych ludzkich perycytów naczyniowych mózgu (HBVP)
    1. Przed montażem urządzenia pokryć chipy membranowe 2 µg/cm2 poli-L-lizyny (PLL) zmieszanej w PBS. Nanieść 50-80 μL PLL w formie kropli tylko na stronę, która będzie skierowana w dół w końcowym montażu urządzenia. Proces pokrywania zakończyć w 1-2 h w 37 °C lub przez noc w 4 °C.
    2. Usunąć roztwór do pokrywania. Przemyć chipy membranowe sterylną wodą ultrapurystyczną i pozostawić do wyschnięcia.
    3. Zmontować urządzenia zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w sekcji 1 powyżej, stroną pokrytą PLL skierowaną w dół, i przygotować komorę hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
    4. Pokryć górne komory zgodnie z sekcją 2.2.2.
    5. Dodać 50 µL podgrzanego medium dla perycytów do górnych komór oraz 20 µL do dolnych kanałów.
    6. Prowadzić pasażowanie HBVPs zgodnie z protokołem producenta; trypsynizować komórki w inkubatorze w 37 °C przez 3-5 min, a następnie przerwać trypsynizację poprzez dodanie podgrzanego medium dla perycytów. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i wirować przy 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Resuspender osad komórkowy w medium dla perycytów i wysiać komórki w dolnych komorach z gęstością 14 000-25 000 komórek/cm2. Odwrócić urządzenia, ale zachować interfejs powietrzny z górnymi komorami, aby ułatwić wymianę gazową.
      UWAGA: Interfejs powietrzny wymagany podczas odwracania można uzyskać, obracając urządzenia po umieszczeniu ich w zaciskach do węży i dociśnięciu wszystkich narożników przed obrotem, lub kładąc urządzenia do góry dnem na równoległych paskach akrylu lub silikonu rozstawionych na tyle szeroko, aby górne komory pozostały niezasłonięte. Gęstość siewu może wymagać optymalizacji dla każdego użytkownika. Aby osiągnąć 14 000 komórek/cm2, dodać 20 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu ~590 000 komórek/mL. Należy zauważyć, że 20 µL pipetuje się do dolnej komory, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, ale gęstość oblicza się przy użyciu objętości dolnej komory wynoszącej 10 µL.
    7. Inkubować komórki w 37 °C przy 5% CO2 przez 2-4 h w pozycji odwróconej w celu ułatwienia adhezji komórek.
    8. Po 2-4 h adhezji komórek obrócić urządzenia do pozycji pionowej i wymienić medium na świeże medium dla perycytów w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyległe komórki.
    9. Po siewie perycytów wysiać hCMEC/D3 w górnej komorze, postępując zgodnie z krokami 2.2.4-2.2.5. Przełączyć obie komory na medium analityczne.
    10. Utrzymywać urządzenia w 37 °C przy 5% CO2, wymieniając medium analityczne w obu komorach co 1-2 dni aż do rozpoczęcia eksperymentów. Kokulturę komórek pierwotnych zazwyczaj utrzymuje się przez 6-8 dni przed analizami.
      UWAGA: Jeśli monokultury HBVP będą porównywane z monokulturami hCMEC/D3 lub kokulturami hCMEC/D3 i HBVP, należy wymienić medium dla perycytów na medium analityczne 2-3 dni po siewie HBVPs.
  5. Kokultura komórek pochodnych hiPSC typu EECM-BMEC i komórek podobnych do perycytów mózgowych (BPLC)
    1. Przygotować komorę hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1 i pokryć górne komory zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.3.
    2. Usunąć roztwór do pokrywania i dodać 50 µL Essential 6 Medium + 10% płodowej surowicy bydlęcej (E6 + 10% FBS) w temperaturze pokojowej do górnej komory.
    3. Prowadzić pasażowanie BPLC zgodnie z Gastfriend et al.39; dodać do komórek mieszaninę enzymów odrywających i przenieść do inkubatora w 37 °C na 5-15 min, aż ok. 90% komórek stanie się okrągłych. Pipetować roztwór komórkowy w celu zsingularyzowania i dodać 4-krotną objętość DMEM/F12 w probówce wirówkowej 50 mL, używając sitka komórkowego 40 µm do filtrowania i pełnego zsingularyzowania komórek. Przenieść do probówki wirówkowej 15 mL, wirować przy 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, resuspender osad komórkowy w E6 + 10% FBS i wysiać komórki w dolnych komorach z gęstością 14 000-25 000 komórek/cm2. Odwrócić urządzenia, ale zachować interfejs powietrzny z górną komorą, aby ułatwić wymianę gazową.
      UWAGA: Interfejs powietrzny wymagany podczas odwracania można uzyskać, obracając urządzenia po umieszczeniu ich w zaciskach do węży i dociśnięciu wszystkich narożników przed obrotem, lub kładąc urządzenia do góry dnem na równoległych paskach akrylu lub silikonu rozstawionych na tyle szeroko, aby górne komory pozostały niezasłonięte. Gęstość siewu może wymagać optymalizacji dla każdego użytkownika. Aby osiągnąć 14 000 komórek/cm2, dodać 20 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu ~590 000 komórek/mL. Należy zauważyć, że 20 µL pipetuje się do dolnej komory, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, ale gęstość oblicza się przy użyciu objętości dolnej komory wynoszącej 10 µL.
    4. Inkubować komórki w 37 °C przy 5% CO2 przez 2-4 h w pozycji odwróconej w celu ułatwienia adhezji komórek.
    5. Po 2-4 h adhezji komórek obrócić urządzenia do pozycji pionowej i wymienić medium na świeże E6 + 10% FBS w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyległe komórki.
    6. Jeden dzień po siewie perycytów wysiać komórki typu EECM-BMEC w górnej komorze, postępując zgodnie z krokami 2.3.5-2.3.6. Przełączyć obie komory na hECSR.
    7. Utrzymywać urządzenia w 37 °C przy 5% CO2, wymieniając medium analityczne w obu komorach co 1-2 dni aż do rozpoczęcia eksperymentów. Kokulturę pochodną hiPSC zazwyczaj utrzymuje się przez 7 dni dla BPLC i 6 dni dla komórek typu EECM-BMEC przed analizami.
      UWAGA: Jeśli monokultury BPLC będą porównywane z monokulturami EECM-BMEC lub kokulturami EECM-BMEC i BPLC, należy wymienić E6 + 10% FBS na hECSR 1 dzień po siewie BPLC.

3. Immunocytochemia

UWAGA: Niniejsza metoda opisuje protokół barwienia immunocytochemicznego i obrazowania komórek hodowanych na górnej i/lub dolnej stronie membrany. Celem tego eksperymentu jest określenie obecności i lokalizacji kluczowych białek, które powinny znajdować się w BBB, takich jak białka połączeń przylegających i ścisłych oraz białka identyfikacyjne komórek. Z platformą tą kompatybilne są również alternatywne metody barwienia oraz barwienie żywych komórek.

  1. Fiksacja i barwienie na urządzeniach
    1. Przenieść przeciwciała pierwszorzędowe na lód w celu rozmrożenia.
    2. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej (np. rozcieńczając 16% PFA trzykrotną objętością PBS) lub schłodzić 100% metanol do -20 °C.
    3. Przygotować odpowiedni roztwór blokujący zgodnie z Tabelą 2. Przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Może być konieczne wymieszanie roztworu w vortexie, aby całkowicie rozpuścić Triton X-100.
    4. Ufiksować komórki, pipetując 20 µL utrwalacza (np. PFA lub metanolu) do komory dolnej i 50 µL do komory górnej. Inkubować urządzenia przez 10 min (PFA) lub 2 min (metanol) w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyć 3 x 5 min, pipetując 20 µL PBS przez komorę dolną i 100 µL do komory górnej.
    6. Blokować przez 30 min w temperaturze pokojowej, dodając 20 µL roztworu blokującego do komory dolnej i 50 µL roztworu blokującego do komory górnej. Sprawdzić, czy w komorze dolnej nie ma pęcherzyków powietrza.
    7. Przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała w roztworze blokującym zgodnie z Tabelą 2. Przechowywać na lodzie.
    8. Barwić przeciwciałami pierwszorzędowymi, dodając 20 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do komory dolnej i zastępując objętość komory górnej 50 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. Sprawdzić, czy w komorze dolnej nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
    9. Przemyć 3 x 5 min, pipetując 20 µL PBS przez komorę dolną i 100 µL do komory górnej.
    10. Przygotować roztwór przeciwciał wtórnych, rozcieńczając przeciwciała w roztworze blokującym zgodnie z Tabelą 2. Przechowywać na lodzie, chroniąc przed światłem.
    11. Barwić przeciwciałami wtórnymi, dodając 20 µL roztworu przeciwciał wtórnych do komory dolnej i zastępując objętość komory górnej 50 µL roztworu przeciwciał wtórnych. Sprawdzić, czy w komorze dolnej nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    12. Przemyć 3 x 5 min, pipetując 20 µL PBS przez komorę dolną i 100 µL do komory górnej.
    13. Przygotować roztwór barwnika jądrowego. Rozcieńczyć Hoechst 1:10 000 w PBS. Dodać 20 µL roztworu barwnika jądrowego do komory dolnej i zastąpić objętość komory górnej 50 µL roztworu barwnika jądrowego. Sprawdzić, czy w komorze dolnej nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    14. Usunąć barwnik, dodając 20 µL PBS do komory dolnej i zastępując objętość komory górnej 100 µL PBS. Wykonać obrazowanie urządzeń natychmiast lub przechowywać je w 4 °C w szalce Petri owiniętej parafilmem i chronionej przed światłem do czasu obrazowania.
  2. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: Ta sekcja opisuje obrazowanie urządzeń przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z dyskiem wirującym i obiektywem 40x o długiej odległości roboczej (LWD) (immersja wodna, WD 590-610, apertura numeryczna 1,15) jako przykład. W kwestii odległości roboczych i kompatybilności soczewek należy odnieść się do materiałów uzupełniających w pracy McCloskey et al.34. Obrazy całego obszaru błony są również pozyskiwane przy użyciu obiektywu 10x, aby upewnić się, że obrazy 40x są reprezentatywne dla całego pola. Są one zazwyczaj wykonywane w trybie szerokopolowym.
    1. Włączyć mikroskop i uruchomić oprogramowanie do obrazowania.
    2. Ustawić kanały zgodnie z właściwościami przeciwciała wtórnego i barwnika jądrowego, korzystając z trybu Confocal Imaging Mode. Zoptymalizować moc lasera i czas ekspozycji, aby upewnić się, że sygnał jest powyżej tła i aby zminimalizować artefakty obrazowania.
      1. Dla barwienia jądrowego Hoechst należy użyć wzbudzenia 405, emisji 450/50 Bandpass (BP), czasu ekspozycji 500 ms i mocy lasera 50%. Dla znaczników z użyciem przeciwciała wtórnego koniugowanego z Alexa Fluor (AF) 488 należy użyć wzbudzenia 488, emisji 525/50BP, czasu ekspozycji 500 ms i mocy lasera 50%. Dla znaczników z użyciem przeciwciała wtórnego koniugowanego z AF568 należy użyć wzbudzenia 561, emisji 600/50BP, czasu ekspozycji 500 ms i mocy lasera 100%.
    3. Umieścić urządzenie w uchwycie na preparaty mikroskopowe, komorą górną do góry, i zamocować w mikroskopie za pomocą uchwytu na szkiełka. Włączyć tryb Live i wybrać kanał dla barwnika jądrowego. Znaleźć błonę przy użyciu obiektywu o niskim powiększeniu, upewniając się, że przezroczysty obszar błony z azotku krzemu jest wycentrowany, ponieważ światło nie przejdzie przez niebieski, lity obszar silikonowy. Po prawidłowym wycentrowaniu urządzenia i znalezieniu warstwy komórek, przełączyć na obiektyw 40x, zwilżyć obiektyw i ustawić ostrość na obszar błony, kierując się barwieniem jądrowym.
    4. Włączyć obrazowanie z-stack i ustawić Scan Mode na Start/End. Ustawić wielkość kroku lub ich liczbę. Używając pokrętła grubego ustawienia mikroskopu, ustawić początek skanowania (scan start) na górnej krawędzi warstwy komórek śródbłonka (kierując się barwieniem jądrowym), a koniec skanowania (scan end) na dolnej krawędzi warstwy perycytów (również kierując się barwieniem jądrowym). Sprawdzić wszystkie kanały, aby upewnić się, że wszystko zostanie uchwycone w polu obrazowania.
      ​UWAGA: Zazwyczaj stosujemy automatyczny krok, co daje plastry o grubości ~0,2 µm.
    5. Wpisać nazwę obrazu (Image Name) i nacisnąć Acquire, aby rozpocząć obrazowanie. Powtórzyć czynność w różnych obszarach w razie potrzeby.
    6. Przetworzyć obrazy konfokalne za pomocą programu ImageJ40 lub Imaris.
      1. Aby przetworzyć obrazy w Imaris, przeciągnąć plik obrazu do programu, aby go otworzyć. Wybrać Section na górnym pasku menu, aby wyświetlić obraz 2D płaszczyzny x-y wraz z odpowiadającymi mu widokami płaszczyzn x-z i y-z. Wybrać 3D View na górnym pasku menu, aby wyświetlić obraz 3D. Kliknąć obraz i przeciągnąć go, aby obrócić. Wybrać Snapshot na górnym pasku menu, aby zapisać obraz.

4. Analiza próbkowania przepuszczalności małych cząsteczek

UWAGA: Ta sekcja opisuje metodologię ilościowych pomiarów właściwości barierowych kultur komórkowych. Celem tego eksperymentu jest oznaczenie stężenia fluorescencyjnej małej cząsteczki, która przechodzi przez warstwy komórek i dostaje się do dolnej komory platformy. Dane te są następnie wykorzystywane do obliczenia przepuszczalności komórkowej.

  1. Technika pobierania próbek
    1. Zmontować urządzenia zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w sekcji 1 i hodować wybrane linie komórkowe zgodnie z opisem w sekcji 2. Uwzględnić dodatkowe urządzenie, które będzie służyć jako bezkomórkowa, powlekana kontrola w celu pomiaru przepuszczalności układu.
      UWAGA: Zaleca się wykonanie co najmniej trzech powtórzeń technicznych dla każdego warunku; jednak w przypadku kontroli powlekanej wymagane jest tylko jedno powtórzenie.
    2. Przed rozpoczęciem analizy próbkowania wymień medium w dolnej komorze na świeże medium. Pod mikroskopem sprawdź stopień konfluencji monowarstwy śródbłonka w każdym urządzeniu. Odnotuj wszelkie przerwy w monowarstwach komórek, ponieważ będą one miały wpływ na dyfuzję barwnika do dolnej komory.
      UWAGA: Zdrowa hodowla komórek śródbłonka powinna być w 100% konfluentna.
    3. Przygotuj roztwór fluorescencyjnej małej cząsteczki (np. 150 µg/mL Lucifer Yellow, 457 Da) w pożywce hodowlanej. Należy przygotować nadmiarową objętość roztworu fluorescencyjnej małej cząsteczki, która zostanie wykorzystana do sporządzenia roztworów wzorcowych służących jako referencje do obliczenia stężenia fluorescencyjnej małej cząsteczki pobranej z kanału dolnego.
      UWAGA: Zalecamy przygotowanie 400 µL nadmiaru roztworu, który zostanie wykorzystany jako roztwór wzorcowy o najwyższym stężeniu fluorescencyjnej małej cząsteczki.
    4. Wymień medium w górnej studzience na 100 µL roztworu fluorescencyjnej małej cząsteczki.
      UWAGA: Zalecamy użycie pisaka hydrofobowego do obrysowania kół wokół portów próbkowania i odczekanie do całkowitego wyschnięcia tuszu hydrofobowego przed dodaniem roztworu barwnika fluorescencyjnego. Zapobiega to rozprzestrzenianiu się medium z kanału dolnego wokół portu próbkowania w kroku 4.1.7. Zalecamy etapowe dodawanie roztworu fluorescencyjnej małej cząsteczki do górnej studni – należy odczekać 2 min przed dodaniem roztworu fluorescencyjnego do kolejnego urządzenia lub pracować w grupach po 3 (dodać roztwór do trzech urządzeń jednocześnie, a następnie odczekać 5 min przed dodaniem go do kolejnych trzech urządzeń).
    5. Inkubować urządzenia w temperaturze 37 °C, 5% CO22 przez 1 h.
    6. Podczas godzinnej inkubacji z poprzedniego etapu należy przygotować roztwory standardowe, wykonując dwukrotne rozcieńczenia szeregowe roztworu fluorescencyjnej małej cząsteczki przygotowanego w punkcie 4.1.3. Pipetować 50 µL każdego roztworu do czarnej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem w trzech powtórzeniach. Jako roztwór standardowy bazowy należy zastosować jałową pożywkę do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Do przygotowania roztworów standardowych zalecamy wykonanie 11 rozcieńczeń seryjnych o końcowej objętości wynoszącej 200 µL or zastosowanie pożywki do hodowli komórkowej jako próbki ślepej w celu pomiaru bazowej intensywności fluorescencji.
      1. Transfer 200 µL z 400 µL nadmiaru przygotowanego w kroku 4.1.3 roztworu fluorescencyjnych małych cząsteczek do probówki zawierającej 200 µL pożywki, dokładnie wymieszać i przenieść 200 µL tego roztworu do następnej probówki zawierającej 200 µL pożywki. Powtarzać rozcieńczenia 1:2 aż do uzyskania łącznie 10 probówek. Pipetować 50 µL najbardziej stężonego roztworu wzorcowego do kolumny 1 w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej (B1, C1, D1), a następnie 2nd najbardziej stężony roztwór do kolumny 2 (B2, C2, D2) i tak dalej. Dla 12th kolumna w płytce, pipetuj 50 µL pustych nośników w trzech powtórzeniach (B12, C12, D12).
    7. Wykonaj następujące kroki, aby pobrać próbkę roztworu fluorescencyjnych małych cząsteczek z dolnego kanału.
      1. Usunąć roztwór fluorescencyjnej małej cząsteczki z dołka, aby zatrzymać proces dyfuzji.
      2. Umieść końcówkę zawierającą 50 µL pożywki do górnego portu, aby pełnił on funkcję zbiornika, poprzez wprowadzenie końcówki z 50 µL do portu, podnosząc urządzenie i delikatnie wysuwając końcówkę, trzymając jednocześnie górną część w celu stabilizacji. Odstawić urządzenie. Upewnić się, że w końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza ani powietrza na jej wierzchołku, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków do dolnej komory podczas pobierania próbek.
      3. Dodaj 50 µL pożywki do górnej studni, aby zapobiec uszkodzeniu monowarstwy komórek podczas pobierania prób.
      4. Aby pobrać próbkę roztworu z dolnego kanału, należy docisnąć pipetę z pustą końcówką do pierwszego stopnia oporu, wprowadzić końcówkę do portu pobierania próbek, a następnie pobrać ciecz metodą odwróconego pipetowania. 50 µL roztworu z dolnego kanału. Przenieść go bezpośrednio do czarnej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem zawierającej roztwory wzorcowe. 
        UWAGA: Zalecamy sprawdzenie monowarstwy komórek pod mikroskopem bezpośrednio po pobraniu próbek. Pobieranie medium z kanału dolnego może sporadycznie prowadzić do przerwania warstwy komórek w studni górnej, co może skutkować niespójnymi pomiarami przepuszczalności. Szybkie przeprowadzenie czynności opisanych w punkcie 4.1.7 pomoże zapobiec temu zjawisku.
    8. Zmierz intensywność fluorescencji w czytniku mikropłytek, stosując odpowiednie parametry długości fali wzbudzenia i emisji dla użytej fluorescencyjnej małej cząsteczki. W przypadku Lucifer Yellow należy zastosować wzbudzenie 428 nm i emisję 536 nm przy optymalnym wzmocnieniu. Fluorescencję mierzy się od góry płytki. Włóż płytkę do czytnika, zaznacz dołki z próbką (w tym krzywą wzorcową) i wybierz Start do odczytu płytki.
  2. Obliczanie wartości przepuszczalności (patrz Plik uzupełniający 1 dla szablonu)
    1. Od wszystkich zmierzonych wartości intensywności fluorescencji odjąć średnią wartość intensywności fluorescencji dla medium kontrolnego.
    2. Użyj równania (1) aby obliczyć przepuszczalność układu Ps:
      Równanie współczynnika przepuszczalności, PS = ([A]A × V) / ([A]L × t × S), schemat wzoru.     (1)
      Gdzie [A]A jest stężeniem fluorescencyjnej małej cząsteczki pobranej z kanału dolnego, V to objętość próbki dodanej do płytki (0,050 ml), [A]L czy stężenie fluorescencyjnej małej cząsteczki dodanej do górnej studni (np. 0,15 mg/ml), t jest czasem inkubacji (w s lub min, w zależności od pożądanych jednostek), a S czy powierzchnia membrany (0,014 cm2).
      1. Oblicz [A]A przy użyciu równania otrzymanego z krzywej wzorcowej, sporządzonej na podstawie wartości intensywności fluorescencji oraz znanych stężeń roztworów wzorcowych. Oblicz stężenia (x) próbek badawczych, podstawiając wartości intensywności fluorescencji (y) do równania.
        UWAGA: Należy wykorzystać liniowy odcinek krzywej wzorcowej. Zaleca się pomiar powierzchni membrany na podstawie zdjęcia wykonanego pod mikroskopem, ponieważ powierzchnia membrany może się różnić w zależności od numeru partii, co może znacząco wpłynąć na obliczone wartości przepuszczalności, jeżeli będą one odbiegać od wartości dla kontroli powlekanej.
    3. Użyj równania (2) w celu obliczenia przepuszczalności monowarstwy komórek Pe:
      Koncepcja prawa Raoulta, równanie ciśnień pary, 1/Pe=1/Ps−1/Pc, wzór chemiczny.     (2)
      Gdzie PS czy przepuszczalność układu obliczona w kroku 4.2.2 oraz PC jest wartością przepuszczalności układu dla urządzenia kontrolnego z powłoką, pozbawionego komórek.

Wyniki

Montaż urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w dół przedstawiono na Rysunku 1. Przyrządy pomocnicze prowadzą proces montażu komponentów oraz chipa membranowego. Komponent 1 wykonany jest głównie z akrylu z powierzchnią PSA umożliwiającą wiązanie z chipem, posiada otwór do komory dolnej oraz porty umożliwiające dostęp pipetą do komory dolnej. Komponent 2 stanowi warstwę kanałów i zawiera w prawym górnym rogu nieprzylepny obszar „trójkąta” bez PSA, służący do chwytania. Urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w dół zapewniają płaski obszar wzrostu hodowli komórkowych w komorze górnej, podczas gdy urządzenia w konfiguracji z rowkiem skierowanym w górę mają płaską powierzchnię do hodowli komórkowych w komorze dolnej.

Przeprowadziliśmy monokultury endotelialne oraz kokultury hCMEC/D3 i HBVPs, a także hiPSC IMR90-4-pochodnych komórek EECM-BMEC-like i BPLCs; obrazy w kontraście fazowym pozyskano za pomocą mikroskopu kontrastowego Nikon Eclipse Ts2 z obiektywem 10x (Rycina 2). Przedstawiono optymalne gęstości wysiewu dla pierwotnych kultur komórkowych (obrazy wykonane 1 dzień po wysiewie), a także zbyt niską gęstość wysiewu HBVPs (Rycina 2A). Końcowe obrazy fazowe kokultur i monokultur (6 dni hodowli komórek endotelialnych) mogą być trudne do rozróżnienia (Rycina 2C), a potwierdzenie pomyślnej kokultury komórek pierwotnych może wymagać barwienia immunofluorescencyjnego (patrz sekcja 3 protokołu). Zilustrowano również niską, wysoką i optymalną gęstość wysiewu BPLC pochodzących z hiPSC (Rycina 2B). Kokultura pochodząca z hiPSC jest łatwiejsza do rozróżnienia w obrazowaniu kontrastowym w porównaniu do kokultur pierwotnych (Rycina 2D). Niski wysiew BPLC skutkuje słabym pokryciem przez perycyty i ich grudkowaniem, natomiast zbyt gęsty wysiew prowadzi do odwarstwiania się warstwy perycytów od membrany. Ponadto zbyt szybka wymiana medium w dolnej komorze może spowodować utratę perycytów, ponieważ komórki te są bardzo wrażliwe na siły ścinające. Optymalne pokrycie przez perycyty dla modelu BBB wynosi ~90%, bez przerw w warstwie endotelialnej.

Reprezentatywne obrazy immunobarwionej kokultury pochodzącej z hiPSC przedstawiono na Rysunku 3 (6 dni hodowli komórek śródbłonka). Pochodne z IMR90-4 komórki BPLC zabarwiono na marker perycytów PDGFRβ, a pochodne z IMR90-4 komórki EECM-BMEC-like zabarwiono na marker połączeń przylegających VE-cadherin. Do barwienia jąder komórkowych użyto Hoechst. Obrazy pozyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym (Spinning Disc), stosując obiektyw 40x LWD z grubością warstwy optycznej 0,2 µm, a następnie przetworzono w programie Imaris. Obie warstwy komórek są widoczne, mimo że cienka nanomembrana nie jest dostrzegalna.

Przeprowadziliśmy pomiar przepuszczalności małych cząsteczek oparty na pobieraniu próbek, stosując te same warunki eksperymentalne w dwóch fizycznie oddalonych od siebie laboratoriach na Uniwersytecie w Bernie w Szwajcarii oraz Uniwersytecie w Rochester w stanie Nowy Jork w USA, aby wykazać międzylaboratoryjną powtarzalność wyników (Rysunek 4)34. Komórki typu EECM-BMEC pochodzące z hiPSC IMR90-4 hodowano w urządzeniu µSiM przez 2, 4 lub 6 dni oraz na filtrach transwell przez 6 dni. W obu laboratoriach test przeprowadzono przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow (457 Da). Wysoka zmienność przepuszczalności komórek śródbłonka hodowanych w urządzeniu przez 2 dni wskazuje, że 2 dni hodowli były niewystarczające do dojrzewania bariery. Po dojrzewaniu bariery – od 4. dnia – nie stwierdzono istotnych różnic w przepuszczalności między laboratoriami. Wykazaliśmy również, że przepuszczalność komórek śródbłonka hodowanych w µSiM oraz na filtrach transwell przez 6 dni była zgodna z wynikami opublikowanymi wcześniej40.

Schemat montażu urządzenia mikrofluidycznego: warstwy akrylowe, klej naciskowy, port pipety, konfiguracja rowka.
Rycina 1: Etapy montażu µSiM. (A) Przygotowanie chipa poprzez umieszczenie go w uchwycie A1. Chip należy ułożyć rowkiem do góry, aby otrzymać urządzenie z rowkiem skierowanym w dół, lub rowkiem do dołu, aby otrzymać urządzenie z rowkiem skierowanym do góry. (B) Połączenie komponentu 1 z chipem poprzez usunięcie masek ochronnych z komponentu 1 i umieszczenie go stroną aktywną do dołu w FA1. Połączenie następuje poprzez wywarcie nacisku za pomocą uchwytu A2. (C) Połączenie komponentu 2 z komponentem 1 poprzez oddzielenie komponentu 2 od arkusza i odarcie górnych warstw ochronnych. Należy umieścić kanał skierowany do góry w uchwycie B1, a następnie położyć komponent 1 na komponentcie 2 stroną aktywną do góry. Połączenie następuje poprzez wywarcie nacisku za pomocą uchwytu B2. Skróty: FAn = uchwyt An; FBn = uchwyt Bn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat hodowli komórek mózgu; obrazy gęstości wysiewu; analiza współhodowli komórek śródbłonka i perycytów.
Rycina 2: Schemat współhodowli oraz reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym hodowli komórkowych w urządzeniach. (A) Lokalizacja wysiewu perycytów i komórek śródbłonka. (B) Schemat widoku z boku przedstawiający rozmieszczenie komórek w poprzek rowka chipa membranowego. (C) Reprezentatywne obrazy niskiej i optymalnej gęstości wysiewu dla pierwotnych HBVP oraz linii komórkowej śródbłonka mózgu hCMEC/D3. Obrazy pozyskano 1 dzień po wysiewie (HBVP) i 2 h po wysiewie (hCMEC/D3). (D) Reprezentatywne obrazy niskiej, wysokiej i optymalnej gęstości wysiewu dla komórek podobnych do perycytów mózgu pochodzących z hiPSC. Obrazy pozyskano 1 dzień po wysiewie. (E) Reprezentatywne obrazy końcowej współhodowli HBVP i hCMEC/D3 oraz monokultury hCMEC/D3. Obrazy pozyskano 8 dni po wysiewie HBVP i 7 dni po wysiewie hCMEC/D3. (F) Reprezentatywne obrazy nieudanej i udanej współhodowli komórek BPLC i komórek podobnych do EECM-BMEC oraz monokultury komórek podobnych do EECM-BMEC. Obrazy pozyskano 7 dni po wysiewie BPLC i 6 dni po wysiewie EECM-BMEC. Niedostatecznie wysiane hodowle BPLC nie wykazują wystarczającego pokrycia, natomiast zbyt gęsto wysiane hodowle BPLC stają się nadmiernie konfluentne i zaczynają tworzyć skupiska lub obumierać. Paski skali = 100 µm (C-F). Skróty: HBVPs = ludzkie perycyty naczyniowe mózgu; hiPSC = ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste; BPLCs = komórki podobne do perycytów mózgu pochodzące z hiPSC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej nanomembrany przedstawiający komórki barwione na VE-cadherin, PDGFRβ oraz Hoechst.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy immunobarwionej kokultury komórek pochodzących z hiPSC w urządzeniach. Komórki zostały zabarwione na marker komórek śródbłonka VE-cadherin (zielony), marker perycytów PDGFRβ (czerwony) oraz barwnik jądrowy (niebieski). Widoczne są dwie warstwy komórek w bliskim sąsiedztwie, oddzielone jedynie cienką nanomembraną z azotku krzemu (biała strzałka wskazuje położenie membrany na lewym obrazie). Pasek skali = 50 µm. Skróty: hiPSC = ludzka indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta; PDGFRβ = receptor beta czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat badania przepuszczalności; monowarstwa komórek, metoda fluorescencyjna, wykresy przepuszczalności, badanie naukowe.
Rycina 4Analiza przepuszczalności małych cząsteczek oparta na pobieraniu próbek. (A) Schemat toku postępowania eksperymentalnego. (B) Wykazanie powtarzalności międzylaboratoryjnej pomiędzy dwoma oddalonymi od siebie laboratoriami na Uniwersytecie w Bernie (UniBe), Szwajcaria, oraz Uniwersytecie w Rochester (UR), Nowy Jork, USA: komórki śródbłonka pochodzące z hiPSC hodowano w µSiM urządzenia przez 2, 4 lub 6 dni oraz w filtrach Transwell przez 6 dni. Test przepuszczalności przeprowadzono przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow (457 Da). Czerwony słupek wskazuje wcześniej opublikowane dane dotyczące przepuszczalności fluoresceiny sodowej (376 Da) dla tych samych komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC, hodowanych przez 6 dni na filtrach transwell40N = 4–16 na grupę. Zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya, a porównania przedstawiono jedynie dla istotnych wartości p. < 0.05. (C) Demonstracja odpowiedzi cytokinowej z wykorzystaniem komórek podobnych do BMEC, pochodzących z hiPSC i hodowanych w EECM µSiM przez 2 dni; 0,1 ng/mL TNFα + 2 IU/mL IFNγ) lub kontrolę z medium (niestymulowaną, NS) do górnej komory na 20 h przed przeprowadzeniem testu przepuszczalności przy użyciu 150 µg/mL Lucifer Yellow. N = 3 na grupę. Student’s t-test, p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Powierzchnia wysiewu górnej komoryObjętość górnej studniPowierzchnia wysiewu dolnej komoryObjętość dolnego kanału
~37 mm2100 µL (pojemność ≥115 µL)~42 mm210 µL (pipetować 20 µL, aby uniknąć pęcherzyków powietrza)

Tabela 1: Krytyczna powierzchnia i objętości µSiM.

CelUtrwalaczRoztwór blokującyRozcieńczanie
VE-kadheryna4% PFA lub 100% MeOH5% GS + 0,4% Tx-100 lub 10% GS + 0,3% Triton X-1001:50
CD314% PFA lub 100% MeOH5% GS + 0,3–0,4% Triton X-1001:100
Klaudyna-5100% MeOH5-10% GS + 0,3% Triton X-1001:200
ZO-1100% MeOH5-10% GS + 0,3% Triton X-1001:200
Okludyna100% MeOH5-10% GS + 0,3% Triton X-1001:50
PDGFRβ4% PFA5% GS + 0,4% Triton X-1001:100
NG24% PFA5% GS + 0,4% Triton X-1001:100
Kozie przeciwciała anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 4881:200
Kozie przeciwciała anty-mysie IgG znakowane Alexa Fluor 5681:200

Tabela 2: Przeciwciała i metody barwienia zwalidowane dla immunocytochemii w kokulturze w urządzeniach µSiM. Skróty: PFA = paraformaldehyd; MeOH = metanol; GS = surowica kozia.

Plik uzupełniający 1: Szablon do obliczania wartości przepuszczalności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chociaż wióry membranowe zostały zaprojektowane z myślą o stabilności, mogą pękać lub pękać, jeśli są nieprawidłowo obsługiwane podczas montażu. Dlatego tak ważne jest, aby chwycić chip w nacięciach pęsety do wiórów i delikatnie umieścić go w uchwycie. Podczas ogólnego obchodzenia się z urządzeniami należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, aby nie uderzyć ani nie upuścić urządzeń. Podczas łączenia chipa membranowego z uchwytem A1, chip musi być ułożony płasko i wyśrodkowany na filarze uchwytu A1, aby uniknąć pękania membrany podczas łączenia z elementem 1. Ponadto po zdjęciu masek ochronnych należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z odsłoniętymi warstwami PSA. Podczas obchodzenia się z komponentem 2 po zdjęciu masek ochronnych zaleca się trzymanie go wzdłuż krawędzi elementu i użycie pęsety w celu złapania trójkątnego rogu, który jest wolny od PSA.

Podczas gdy opisano protokoły hodowli komórkowych dla możliwych modeli BBB, opisany tutaj model kohodowli BMEC/perycytów BBB może być wystarczający lub niewystarczający w zależności od kontekstu fizjologicznego i interesujących pytań. Na przykład transport komórek odpornościowych zachodzi głównie w żyłkach pozakapilarnych mózgu41,42. W tych regionach przestrzeń okołonaczyniowa oddziela barierę BMEC/perycytów od granic glejowych ustanowionych przez astrocyty. Tak więc w żyłkach pozakapilarnych jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) składa się z dwóch fizycznie oddzielonych barier połączonych szeregowo, a astrocyty stopy końcowe nie stykają się bezpośrednio z barierą krwi BMEC / perycytów, która jest dobrze reprezentowana przez obecny model. Jeśli celem jest model NVU, który uwzględnia wpływ czynników wydzielanych przez astrocyty na barierę krwi, do urządzenia można dodać przedział astrocytów, który umożliwia wymianę rozpuszczalnych czynników przez przestrzeń okołonaczyniową. Przykład ten został zilustrowany wcześniej34 i może zostać rozszerzony o inne komórki, takie jak mikroglej i neurony, w przedziale "mózgu" 3D. Modułowa architektura platformy umożliwia wykorzystanie prostych strategii montażu w celu osiągnięcia tych rekonfiguracji, dzięki czemu platforma jest tak prosta lub złożona, jak to jest potrzebne do rozwiązania istniejących hipotez. Każda konfiguracja hodowli komórkowej; Musi być jednak zoptymalizowany pod kątem nowych linii komórkowych i wielokultur. Na przykład, ze względu na właściwości membran z azotku krzemu, może być konieczne dostosowanie roztworów powlekających w porównaniu z płytkami do hodowli tkankowych. Włączenie fibronektyny zazwyczaj pomaga w przyczepianiu się komórek i przetrwaniu. Co więcej, użytkownicy mogą hodować komórki śródbłonka i perycyty w przeciwnych kierunkach. W takim przypadku konieczna może okazać się modyfikacja np. sposobu wykonywania i interpretacji pomiarów przepuszczalności. Przedstawienie kroków dla tego typu kultury wykracza jednak poza zakres tego artykułu.

Innym wyzwaniem, które można napotkać podczas hodowli komórkowej, jest szybkie odparowanie pożywki, ponieważ urządzenia mogą być bardziej wrażliwe na zmiany w środowisku w porównaniu ze standardowymi płytkami i kolbami do hodowli tkankowych. Jeśli zaobserwuje się nadmierne parowanie lub spowolnienie wzrostu komórek, należy zmierzyć wszystkie krytyczne parametry inkubatora, aby zapewnić dokładne ustawienia. Do nasadki tkankowej lub małej szalki Petriego umieszczonej w komorze hodowli komórkowej można dodać więcej wody lub należy częściej wymieniać pożywkę. Ponadto bąbelki mogą dostać się do dolnego kanału i utknąć w wykopie dla urządzeń do kopania. Chociaż można je usunąć, najłatwiej jest unikać dodawania bąbelków w pierwszej kolejności. W tym celu należy sprawdzić, czy na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza ani czy na końcu końcówki pipety nie ma pęcherzyków powietrza, zanim doda się media do dolnej komory. Ponadto parowanie mediów w kanale może prowadzić do powstania szczeliny między powierzchnią nośnika a górną częścią portu. Niewielka objętość nośnika może być pipetowana do jednego portu, aż nośnik dotrze do powierzchni przeciwległego portu, po czym nośnik może być wymieniany w tym przeciwległym porcie. Podczas gdy pożywki hECSR i E6 + 10% FBS nie powinny być podgrzewane w łaźni wodnej, inne media można wstępnie podgrzać, aby ograniczyć tworzenie się pęcherzyków. Jeśli pęcherzyk dostanie się do dolnej komory, można go usunąć, szybko pipetując 100 μl przez kanał. Jednak ta metoda może prowadzić do zanieczyszczenia między komorami lub mediów rozlanych po powierzchni urządzenia. Może również zaburzać warstwy komórkowe. Alternatywnie pożywkę można najpierw wyjąć z kanału, a następnie ponownie wprowadzić w objętości 50 μl. Usunięcie nośnika w pierwszej kolejności może jednak spowodować powstawanie większej ilości pęcherzyków w kanale. Jeśli pęcherzyk nie znajduje się bezpośrednio pod obszarem błony, można go pozostawić w kanale bez wpływu na hodowlę komórkową.

Przyczepianie i wzrost perycytów, jak pokazano na rycinie 2, może być trudne. Zastosowanie zoptymalizowanej gęstości wysiewu jest niezbędne do utworzenia warstwy o fizjologicznie istotnym stosunku komórek perycytów do śródbłonka. Ponadto, ponieważ perycyty są wrażliwe na ścinanie, cała wymiana pożywki w kanale powinna odbywać się bardzo powoli, aby chronić komórki. W przypadku hodowli BPLC lepsze przyleganie można uzyskać, pokrywając dolną komorę 800 μg/ml kolagenu typu IV lub 100 μg/ml fibronektyny.

Immunocytochemia w opisywanych tu urządzeniach umożliwia jakościową analizę zdrowia i funkcji komórek. Metody barwienia na płytkach do hodowli tkankowych lub innych platformach powinny być bezpośrednio przekładalne na platformę. W przypadku hodowli komórkowej tylko w górnej komorze, po utrwaleniu, PBS można dodać do dolnej komory i pozostawić na pozostałe etapy, z blokowaniem i barwieniem wykonanym tylko w górnej komorze. Minimalizuje to ryzyko pęknięcia membran lub dostania się pęcherzyków do dolnej komory. Do barwienia kokultur zalecamy stosowanie obu komór na wszystkich etapach. Ważne jest, aby pamiętać, że lepkość utrwalacza i PBS różni się od lepkości pożywki. W związku z tym dodawanie pęcherzyków powietrza do dolnej komory może być łatwiejsze i należy zachować szczególną ostrożność, aby przed pipetowaniem do dolnej komory sprawdzić, czy na końcówkach pipet znajduje się powietrze na końcu końcówki.

Protokół opisany dla testu przepuszczalności małych cząsteczek pozwala na funkcjonalną i ilościową ocenę funkcji barierowej komórek śródbłonka hodowanych w urządzeniu μSiM. Jednym z problemów, który może wystąpić podczas tego testu, jest wciąganie pęcherzyków powietrza do pipety podczas pobierania próbki z dolnego kanału na kroku protokołu 4.1.7.4. Aby uniknąć tego problemu, ważne jest, aby upewnić się, że końcówka jest uszczelniona w porcie przed rozpoczęciem pobierania próbki, a próbka nie powinna być pobierana zbyt szybko. Jeśli to nie rozwiąże problemu, rozmiar użytych końcówek może być zbyt mały lub zbyt duży, aby zmieścić się w portach; skorzystaj ze wskazówek podanych w Tabeli materiałów. W przypadku zmierzenia nieoczekiwanie wysokich wartości przepuszczalności pomimo zdrowo wyglądającej zlewającej się monowarstwy, należy sprawdzić integralność monowarstwy pod kątem zakłóceń podczas pobierania próbki. Zalecamy, aby zawsze sprawdzać monowarstwę pod mikroskopem natychmiast po pobraniu próbki. Jeśli monowarstwa nadal wydaje się nienaruszona i zdrowa, próbkę można utrwalić i ocenić biologiczne markery funkcji bariery, na przykład poprzez barwienie immunologiczne białek połączeniowych. I odwrotnie, w przypadku pomiaru nieoczekiwanie niskich wartości przepuszczalności, ważne jest, aby upewnić się, że próbka 50 μl pożywki jest pobierana z dolnego kanału bez pęcherzyków powietrza. Jeżeli pożywka wydostaje się z portu do pobierania próbek zaraz po umieszczeniu końcówki zbiornika, należy ją zebrać przed włożeniem pipety do portu do pobierania próbek, ponieważ większość małych cząsteczek fluorescencyjnych będzie obecna w początkowej objętości 10 μl pobranej z dolnego kanału. Rysowanie okręgów wokół portów za pomocą pisaka hydrofobowego lub umieszczenie taśmy hydrofobowej z otworem wokół portu zapobiega rozprzestrzenianiu się pasywnie pompowanych mediów. Jeżeli podczas pobierania próbek zostaną usunięte pęcherzyki powietrza lub nie zostanie usunięta cała próbka o objętości 50 μl, próbki nie wolno używać. Alternatywnie można określić dokładną objętość i wykorzystać ją w obliczeniach przepuszczalności; należy to jednak zrobić tylko wtedy, gdy usunięta objętość wynosi ≥40 μl, co odpowiada ~98-99% odzysku barwnika34.

Oświadczenia

J.L.M. jest współzałożycielem SiMPore i posiada udziały w spółce. SiMPore komercjalizuje ultracienkie technologie oparte na krzemie, w tym membrany wykorzystane w tym badaniu.

Podziękowania

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C., i L.W. zostały sfinansowane przez NIH grant R33 HL154249. J.L.M. został ufundowany przez R44 GM137651. M.M. został ufundowany przez Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. został sfinansowany przez RF1 AG079138. K.C. był finansowany przez International Foundation for Ethical Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
CD31 Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificPA5-32321
Mysie przeciwciało IgG Claudin-5, 4C3C2Thermo Fisher Scientific35-2500
Koza &alfa;-Mysz IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
Koza &alfa;-Królik IgG Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11011
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
NG2, mysz IgG2a, 9.2.27Millipore 
Mysie przeciwciało IgG Occlludin, OC-3F10Thermo Fisher Scientific33-1500
PDGFRβ, przeciwciało IgG królika, 28E1Technologia sygnalizacji komórkowej3169
VE-kadheryna mysz IgG2B Klon # 123413R& D SystemsMAB9381
królicze przeciwciało IgG ZO-1, poliklonalneThermo Fisher Scientific40-2200
Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane
100% MetanolVWR101443-718Można zastąpić podobnymi produktami
16% ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908Może być zastąpiony podobnymi produktami
: AccutaseThermo Fisher ScientificA1110501
Kwas octowySigma-Aldrich695092
suplement B27Thermo Fischer Scientific17504044
bFGFR& D Systems233-FB-025
Kolagen IV z ludzkiego łożyskaSigma-AldrichC5533
Kolagen, roztwór typu I z ogona szczuraSigma-AldrichC3867-1VLMożna zastąpić podobnymi produktami
DMEM/Szynka" s F12Thermo Fisher Scientific11320033
EGM-2 Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKitLonzaCC-3162
Essential 6 mediumThermo Fisher ScientificA1516401
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Szczytowa surowicaPS-FB1
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigma-AldrichF1141
Fibronektyna białko ludzkie, osoczeThermoFisher Scientific33016015Można zastąpić podobnymi produktami
hESFMThermo Fisher Scientific11111044
Lucifer Yellow CH sól dilitowaSigma-Aldrich861502
Normalna surowica koziaThermo Fisher Scientific500627Może być zastąpiony podobnymi produktami
PBS bez wapń, magnezCytivaSH30256.01Może być zastąpiony podobnymi produktami
Pericyte MediumScienCell1201Użyj kompletnego zestawu (zawiera suplementy)
Poli-L-lizyna, 10 mg/mlScienCell0413
Triton X-100JT BakerX198-05Może być zastąpiony podobnymi produktami
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNazInvitrogen&handel;10977015Może być zastąpiony podobnymi produktami
Modele eksperymentalne: Linie komórkowe< / silna>
bariera krew-mózg linia komórkowa hCMEC/D3Sigma-AldrichSCC066
Perycyty naczyniowe ludzkiego mózguScienCell1200
iPS(IMR90)-4 ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzysteWiCellRRID:CVCL_C437
Wyroby szklane i plastikowe
150 mm Naczynie do hodowli komórkowych z siatką 20 mmFalcon353025
Płytki do hodowli tkankowych Corning (6-dołkowe)Corning3506
Płaskie 96-dołkowe niewiążące mikropłytkiGreiner Bio-One655900
Uchwyt na szkiełko mikroskopowe  SiMPoreUSIM-SBWymiary kompatybilne z uchwytami do szkiełek mikroskopowych
Nunc 15 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkoweThermo Fischer Scientific339651
Nunc 50 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówkiwirówkowe Thermo Fischer Scientific339653Nasadki do probówek można napełnić wodą do hodowli komórkowych
Końcówki do pipet P20-200VWR76322-516Alternatywne marki mogą nie uszczelniać tak skutecznie
portów Filtry Transwell (12 dołków, 12 mm, 0,4 i mu; m wielkość porów, PC)CoStar3401
Instruments
10X Obiektyw (dla Andor)Nikon Instruments Inc.MRD00105Powietrze; szerokość szer.: 4 mm; Obiektyw NA 0.45
10X (dla Nikona)Nikon Instruments Inc.MRP40102Powietrze; szerokość szerokość: 6,2 mm; NA 0.25
Obiektyw 40X (LWD) (dla Andor)Nikon Instruments Inc.MRD77410Zanurzenie w wodzie; Szerokość szerokość: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiemOxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Mikroskop z kontrastem fazowymNikon Instruments Inc.Może być zastąpiony podobnymi produktami
TECAN Infinite M200TECANMoże być zastąpiony podobnymi produktami
Inne
2 mm
Zestaw montażowy z uchwytamiSiMPoreUSIM-JIGSETW tym mocowanie A1, A2, B1 i B2
Adapter do aparatu fotograficznego do mikroskopów:AmScopeCA-CAN-SLR, Canon SLR / D-SLRΦ 23.2 - Φ Adapter 30 pasuje do Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR CameraCanonEOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001Można zastąpić podobnymi produktami
Sitko do komórek, 40 i mikro; mMillipore Sigma (Corning)CLS431750
Składnik 1SiMPoreUSIM-C1
Składnik 2SiMPoreUSIM-C2
Chipy membranoweSiMPoreNPSN100-1LDostępne są inne formaty chipów
Pęseta do obsługi SMD pod podwójnym kątemTechni-Tool758TW003"Pęseta do wiórów"
Nierdzewny stalowa precyzyjna pęseta GGTechni-Tool758TW534"Pęseta prosta"
Oprogramowanie
FijiImageJDo przetwarzania obrazu
FusionOxford Instruments, AndorInstrukcje dla wersji 2.3.0.44
i-controlTECANInstrukcje dla wersji 2.0
ImarisOxford InstrumentsDo przetwarzania obrazu. Instrukcje dla wersji 9.9.0
MAB2029 Clamps VWR MFLX06832-10 Advanced PAP Pen Zalecana końcówka Millipore Sigma Z672548 ,

Bibliografia

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671(2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685(2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111(2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21(2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chip tkankowyplatforma MicroSiMfunkcja barierowatest przepuszczalnościbarwienie immunofluorescencyjnekomórki śródbłonkamodel kokulturyhodowla hiPSCmikroskopia konfokalna
Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.