Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Podsumowanie

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Streszczenie

MikroSiM (μSiM) to oparta na błonie platforma hodowlana do modelowania bariery krew-mózg (BBB). W przeciwieństwie do konwencjonalnych platform opartych na membranach, μSiM zapewnia eksperymentatorom nowe możliwości, w tym obrazowanie żywych komórek, niezakłóconą sygnalizację parakrynną między komorami "krwi" i "mózgu" oraz możliwość bezpośredniego obrazowania immunofluorescencji bez konieczności ekstrakcji/ponownego montażu błon. W tym miejscu pokazujemy podstawowe zastosowanie platformy do tworzenia modeli monokulturowych (komórki śródbłonka) i kokulturowych (komórki śródbłonka i perycyty) bariery krew-mózg przy użyciu ultracienkich nanoporowatych membran z azotku krzemu. Wykazujemy zgodność zarówno z pierwotnymi hodowlami komórkowymi, jak i hodowlami indukowanych przez ludzi pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Dostarczamy metody analizy jakościowej modeli BBB za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i demonstrujemy użycie μSiM do ilościowej oceny funkcji bariery w teście przepuszczalności małych cząsteczek. Przedstawione metody powinny umożliwić użytkownikom stworzenie własnych modeli barierowych na platformie, co przyczyni się do postępu w wykorzystaniu technologii chipów tkankowych do badania tkanek ludzkich.

Wprowadzenie

Żywe tkanki są podzielone na wyspecjalizowane komórki, które tworzą i utrzymują bariery oraz regulują, które komórki i cząsteczki są transportowane z jednego przedziału do drugiego. Niewłaściwa regulacja funkcji bariery może być źródłem zarówno ostrych chorób, jak i chorób przewlekłych. Bariera krew-mózg (BBB) jest najbardziej restrykcyjną barierą tkankową w ludzkim ciele¹. Dysfunkcja bariery krew-mózg leży u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym choroby Alzheimera², choroby Parkinsona^3,4 i stwardnienia rozsianego^5,6. Uraz bariery krew-mózg jest również związany z długotrwałym upośledzeniem funkcji poznawczych w wyniku ostrych zaburzeń, takich jak sepsa⁷, COVID-19⁸ i maja9. Opracowanie leków, które mogą potencjalnie leczyć choroby mózgu, było frustrująco trudne ze względu na wyzwanie polegające na celowym naruszeniu bariery krew-mózg w celu dostarczenia bioaktywnych cząsteczek do celów w mózgu¹⁰. Z tych powodów metody badania funkcji BBB in vitro mają ogromne znaczenie dla zrozumienia i leczenia chorób OUN.

Podstawowe metody pomiaru funkcji bariery in vitro polegają na stworzeniu monowarstwy lub kokultury na półprzepuszczalnej membranie i zmierzeniu oporu wywieranego przez komórki na dyfuzję małych cząsteczek lub małe prądy elektryczne^11,12,13,14. Podczas gdy pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS) stworzyło wiele możliwości modelowania BBB w 3D^15,16, różnorodność geometrii systemów utrudnia porównanie pomiarów przepuszczalności między MPS lub z ustalonymi wartościami literaturowymi. Ustalenie wiarygodnych wartości wyjściowych jest szczególnie ważne w badaniach BBB, w których, ze względu na rozległą regulację bariery przez komórki śródbłonka naczyń krwionośnych mózgu, wartości przepuszczalności in vitro są dokładnie analizowane^12,17,18. Z tych powodów pomiary przepuszczalności w monowarstwach ustanowionych na membranach 2D pozostaną podstawą badań BBB w nadchodzących latach. Dotyczy to również innych barier tkankowych, w tym barier nabłonkowych, w przypadku których bezwzględne wartości przepuszczalności linii bazowej są wykorzystywane do walidacji i porównania modeli in vitro^19,20,21.

Mając na celu stworzenie nowego, wartościowego narzędzia dla społeczności badawczej BBB, wprowadziliśmy²² i zaawansowane^23,24,25,26 mikrourządzenie wyposażone w silicon membrane (μSiM) do wykorzystania w modelowaniu tkanek barierowych w ciągu ostatnich 5 lat. Cechą umożliwiającą platformę jest ultracienka (o grubości <100 nm) membrana z setkami milionów nanoporów^27,28 lub mieszanka nanoporów i mikroporów²⁹. Wolnostojące chipy membranowe są produkowane na krzemowym "chipie" o grubości 300 μm, który stabilizuje ultracienkie struktury³⁰ i umożliwia ich obsługę za pomocą pęsety do montażu urządzenia. Ze względu na ich ultracienką naturę, membrany mają przepuszczalność o dwa rzędy wielkości wyższą niż w przypadku konwencjonalnych membran trawionych ścieżkowo stosowanych w komercyjnych urządzeniach do hodowli membranowej^31,32. W praktyce oznacza to, że przeszkoda membrany w dyfuzji cząsteczek mniejszych niż nanopory (<60 nm) jest znikoma³³. Tak więc, w przypadku barier komórkowych, tylko komórki i zdeponowane przez nie matryce będą określać szybkość transportu małych cząsteczek z przedziałów wierzchołkowych do podstawnych, które są oddzielone błoną³⁴. Konstrukcja urządzenia i ultracienka natura membran zapewniają również wiele korzyści dla mikroskopii optycznej. Należą do nich: 1) możliwość śledzenia żywych kultur za pomocą kontrastu fazowego lub obrazowania w jasnym polu, 2) zdolność do barwienia fluorescencyjnego i obrazowania in situ bez konieczności ekstrakcji i przenoszenia membrany do szkła nakrywkowego oraz 3) fakt, że błony są cieńsze niż "plastry" konfokalne, dzięki czemu bezpośrednie kokultury mają bardziej naturalne odstępy między typami komórek niż można to osiągnąć w przypadku membran trawionych ścieżkowo o grubości 6-10 μm.

Ostatnio rozwinęliśmy platformę do formatu modułowego, aby ułatwić szybki montaż³⁴ i dostosowywanie^35,36. Wykorzystaliśmy format modułowy do dystrybucji komponentów urządzenia między naszymi laboratoriami bioinżynieryjnymi i współpracującymi laboratoriami zajmującymi się barierą mózgową. Następnie wspólnie opracowaliśmy protokoły montażu urządzeń, monokultury i kohodowli, barwienia immunofluorescencyjnego oraz przepuszczalności małych cząsteczek i wykazaliśmy, że metody te są powtarzalne między laboratoriami. Korzystając z tych protokołów, wykazaliśmy również, że modułowa platforma obsługuje zwalidowaną barierę krew-mózg opracowaną przy użyciu metody rozszerzonej hodowli śródbłonka (EECM) do tworzenia mikrokrążopodobnych komórek śródbłonka mózgu (BMEC) z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)³⁷. Celem niniejszego raportu jest bardziej szczegółowy przegląd tych metod i, za pomocą dołączonego filmu, ułatwienie szerszego przyjęcia platformy w społeczności BBB.

Protokół

1. Zespół urządzenia μSiM

UWAGA: Ta metoda opisuje montaż urządzeń. Chip membranowy ma stronę wykopu i płaską stronę, które można montować wykopem w górę lub w dół. Do hodowli komórkowych najczęściej stosuje się urządzenia do kopania.

1. W sterylnym środowisku (np. kapturze bezpieczeństwa biologicznego) przygotuj wszystkie materiały do montażu, w tym osprzęt montażowy, komponenty, chipy membranowe i pęsetę.
2. Umieść chip membrany na środku uchwytu A1 za pomocą pęsety do wiórów. Płaska powierzchnia wióra jest skierowana w dół, a obszar wykopu jest skierowany do góry w przypadku urządzeń do kopania rowów i odwrotnie w przypadku urządzeń do kopania rowów.
   UWAGA: Poniższe kroki montażu są zilustrowane na przykładzie urządzenia do wykopywania rowu, które umożliwia płaski obszar wzrostu w górnej komorze.
3. Połącz komponent 1 z chipem. Najpierw odklej niebieskie warstwy ochronne po obu stronach komponentu 1 za pomocą prostej pęsety i umieść go w uchwycie A1, górną komorą do dołu. Delikatnie dociśnij komponent 1 w dół, aż klej wrażliwy na nacisk (PSA) dotknie chipa.
4. Umieść uchwyt A2 na uchwycie A1 i mocno dociśnij w różnych rogach, aby zapewnić ścisłe dopasowanie wióra i komponentu.
   UWAGA: Pamiętaj, aby nie zdejmować warstwy PSA. Jest to przezroczysta i sztywniejsza warstwa w porównaniu do niebieskich warstw ochronnych.
5. Połącz komponent 2 z komponentem 1 za pomocą chipa. Najpierw przygotuj składnik 2, chwytając jeden róg składnika 2 prostą pęsetą i odklejając go od arkusza. Następnie chwyć "trójkątny" obszar składnika 2 bez PSA i razem usuń grubą, przezroczystą warstwę ochronną i niebieską warstwę składnika 2, odsłaniając powierzchnię PSA. Umieść komponent 2 w uchwycie B1, stroną PSA do góry.
6. Umieść komponent 1 z chipem membranowym w uchwycie B1, górną komorą skierowaną do góry.
7. Umieść uchwyt B2 na elemencie 1 i mocno dociśnij w różnych rogach uchwytu B2.
8. Wyjmij zmontowane urządzenie z oprawy i za pomocą prostej pęsety wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza ze spodu urządzenia i uszczelnij krawędzie kanału, unikając kontaktu z obszarem membrany. Przed użyciem do hodowli komórkowej nowo zmontowane urządzenia należy sterylizować ultrafioletem (UV) przez 20 minut.

2. Hodowla komórkowa

UWAGA: Ta metoda opisuje protokoły dla kultur pierwotnych i pochodzących z hiPSC na platformie. Metody opisują monokulturę komórek śródbłonka w górnej komorze urządzenia oraz kohodowlę perycytów i komórek śródbłonka z perycytami w dolnej komorze i komórkami śródbłonka w górnej komorze urządzeń zmontowanych w wykopach. Wymiary i objętości komór znajdują się w tabeli 1. Są to najpopularniejsze formaty; Jednak inne układy kultur komórkowych mogą być używane w zależności od potrzeb użytkownika.

1. Przygotowanie komory do hodowli komórkowych
   1. Zmontuj urządzenia zgodnie z protokołem wyszczególnionym w sekcji 1.
   2. Umieść urządzenia w sterylnych wężach clamps. Przed hodowlą komórkową wysterylizuj zaciski, mocząc je w etanolu przez ≥20 min. Sterylizuj ponownie po każdym eksperymencie w celu ponownego użycia.
   3. Hoduj urządzenia na dużej sterylnej szalce Petriego. Aby uzyskać dodatkową wilgotność, dodaj małą szalkę Petriego lub stożkową pokrywkę probówki o pojemności 50 ml wypełnioną sterylną wodą.
   4. Umyj górną komorę urządzeń dwukrotnie 100 μl sterylnej wody. W przypadku hodowli komórkowej w dolnej komorze należy umyć dolną komorę 20 μl sterylnej wody.
2. Monokultura linii komórkowej hCMEC/D3 (BBB)
   1. Przygotować komorę do hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
   2. Pokryj górne komory 25 μg/^cm2 kolagenu I i 5 μg/^cm2 ludzkiej fibronektyny zmieszanej z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Odstawić na 1-2 godziny w temperaturze 37 °C lub na noc w temperaturze 4 °C.
   3. Usunąć roztwór powlekający i dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki śródbłonkowej zubożonej w czynnik wzrostu (pożywka do oznaczania) do górnej komory i 20 μl do dolnej komory. Aby przygotować pożywkę do oznaczania, wymieszaj 100 ml śródbłonkowej pożywki podstawowej + 400 μl ludzkiego fibroblastycznego czynnika wzrostu + 40 μl hydrokortyzonu + 100 μl siarczanu gentamycyny + 2 ml płodowej surowicy bydlęcej.
   4. Pasaż komórek hCMEC/D3 zgodnie z protokołem producenta; trypsynizować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, a następnie zatrzymać trypsynizację przez dodanie wstępnie podgrzanego podłoża śródbłonka. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce testowej i zasiać komórki w górnych komorach o gęstości 40 000-60 000 komórek/^cm2. Inkubować urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO₂ ) przez 2-4 godziny, aby ułatwić adhezję komórek. Na przykład, aby osiągnąć 40 000 komórek/^cm2 na chipie 0,37^cm2, dodaj 100 μl roztworu komórkowego o stężeniu 150 000 komórek/ml do górnej komory.
      UWAGA: Hodujemy i pasażujemy hCMEC / D3 zgodnie z Hudecz et al.³⁸, używając zmodyfikowanej formuły śródbłonkowego podłoża wzrostu-2 (EGM-2) do utrzymania komórek i "pożywki testowej" o obniżonym współczynniku wzrostu po subkulturze do testów. Inne preparaty pożywek powinny być kompatybilne z urządzeniami, chociaż zalecamy formuły pożywek od Hudecz et al.³⁸, jeśli użytkownicy mają problemy z przeżywalnością hCMEC/D3.
   5. Po 2-4 godzinach w celu adhezji komórek, wymień na świeżą pożywkę testową w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyłączone komórki.
   6. Utrzymywać urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} wymieniając pożywkę testową w obu komorach co 2-3 dni do czasu eksperymentu. Testy są zwykle wykonywane po 2 tygodniach hodowli.
3. Monokultura komórkowa pochodząca z hiPSC podobna do EECM-BMEC
   1. Przygotować komorę do hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
   2. Przygotuj kolagen IV z roztworu ludzkiego łożyska, dodając 5 ml 0,5 mg / ml kwasu octowego do 5 mg kolagenu IV w celu uzyskania roztworu 1 mg / ml. Pozostawić roztwór na ≥4 godziny w temperaturze 4 °C do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór jest stabilny w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
   3. Pokryj górne komory 100 μl kolagenu IV w proporcji 4:1:5, fibronektyny bydlęcej i sterylnej wody. Smażyć w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.
   4. Usunąć roztwór powlekający i dodać 100 μl hECSR o temperaturze pokojowej do górnej komory i 20 μl do dolnej komory.
   5. Pasaż komórek podobnych do EECM-BMEC według Nishihara et al.³⁷; dodać mieszaninę enzymów odłączających komórki do komórek i przenieść do inkubatora o temperaturze 37 °C na 5-8 minut. Odpipetować roztwór komórkowy do pojedynczej i dodać do 4x objętość podłoża śródbłonkowego w probówce wirówkowej. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej; ponownie zawiesić komórki w hECSR i wysiewać w górnych komorach o gęstości 40 000 komórek/^cm2. Inkubować urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2-4 godziny, aby ułatwić adhezję komórek. Na przykład, aby osiągnąć 40 000 komórek/^cm2, dodaj 100 μl roztworu komórkowego przy 150 000 komórek/ml.
   6. Po 2-4 godzinach w celu adhezji komórek, wymień na świeży hECSR w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyłączone komórki.
   7. Utrzymywać urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} wymieniając hECSR w obu komorach co 1-2 dni do czasu eksperymentów. Testy są zwykle wykonywane w 6 dniu hodowli.
4. hCMEC/D3 i pierwotna hodowla perycytów naczyniowych ludzkiego mózgu (HBVP)
   1. Przed montażem urządzenia należy pokryć wióry membrany 2 μg/^cm2 poli-L-lizyny (PLL) zmieszanej z PBS. Nałóż 50-80 μL PLL w kropli tylko na stronę, która będzie skierowana w dół w końcowym zespole urządzenia. Proces powlekania należy zakończyć w ciągu 1-2 godzin w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Usuń roztwór do powlekania. Umyj wióry membrany sterylną ultraczystą wodą i pozostaw do wyschnięcia.
   3. Zmontuj urządzenia zgodnie z protokołem wyszczególnionym w sekcji 1 powyżej, stroną pokrytą PLL skierowaną w dół i przygotuj komorę do hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1.
   4. Pokryć górne komory zgodnie z ppkt 2.2.2.
   5. Dodać 50 μl podgrzanej pożywki perycytowej do górnych komór i dodać 20 μl do dolnych kanałów.
   6. Pasaż HBVP zgodnie z protokołem producenta; trypsynizować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, a następnie zatrzymać trypsynizację przez dodanie wstępnie podgrzanej pożywki perycytowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w pożywce perycytowej i wysiać komórki w dolnych komorach o gęstości 14 000-25 000 komórek/^cm2. Odwróć urządzenia, ale utrzymuj interfejs powietrza z górnymi komorami, aby ułatwić wymianę gazową.
      UWAGA: Interfejs powietrza wymagany podczas inwersji można uzyskać, odwracając urządzenia po umieszczeniu ich w wężu clamps i naciskając na wszystkie rogi przed odwróceniem, lub umieszczając urządzenia do góry nogami na równoległych paskach akrylu lub silikonu oddalonych od siebie na tyle daleko, aby górne komory były niezakłócone. Gęstość wysiewu może wymagać optymalizacji dla każdego użytkownika. Aby osiągnąć 14 000 komórek/cm², dodaj 20 μl zawiesiny komórek o temperaturze ~ 590 000 komórek/ml. Należy pamiętać, że 20 μl jest pipetowane do dolnej komory, aby uniknąć pęcherzyków, ale gęstość oblicza się na podstawie objętości dolnej komory wynoszącej 10 μl.
   7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2-4 godziny w pozycji odwróconej, aby ułatwić adhezję komórek.
   8. Po 2-4 godzinach na adhezję komórek odwróć urządzenia do pozycji pionowej i wymień je na świeżą pożywkę perycytową w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyłączone komórki.
   9. Po wysiewie perycytów wysiewaj hCMEC/D3s w górnej komorze, wykonując kroki 2.2.4-2.2.5. Przełącz obie komory na pożywkę testową.
   10. Utrzymywać urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} wymieniając pożywkę testową w obu komorach co 1-2 dni do czasu eksperymentów. Pierwotna kohodowla komórek jest zwykle utrzymywana przez 6-8 dni przed testami.
       UWAGA: Jeśli monokultury HBVP zostaną porównane z monokulturami hCMEC/D3 lub kokulturami hCMEC/D3 i HBVP, należy wymienić pożywkę perycytarną na pożywkę testową 2-3 dni po wysiewie HBVP.
5. Jednoczesna hodowla komórek podobnych do EECM-BMEC pochodzących z hiPSC i komórek podobnych do perycytów mózgu (BPLC)
   1. Przygotować komorę do hodowli komórkowej zgodnie z sekcją 2.1 i pokryć górne komory zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.3.
   2. Usuń roztwór powlekający i dodaj 50 μl Essential 6 Medium + 10% Fetal Bull Serum (E6 + 10% FBS) o temperaturze pokojowej do górnej komory.
   3. Przejść przez BPLC zgodnie z Gastfriend et al.³⁹; dodać mieszaninę enzymów odłączających komórki do komórek i przenieść do inkubatora o temperaturze 37 °C na 5-15 minut, aż ~90% komórek zostanie zaokrąglonych. Odpipetować roztwór komórkowy w celu pojedynczej lokalizacji i dodać 4 razy większą objętość DMEM/F12 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, używając sitka do komórek o pojemności 40 μm do przefiltrowania i pełnej izolacji komórek. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić osad komórkowy w E6 + 10% FBS i zasiać komórki w dolnych komorach o gęstości 14 000-25 000 komórek/cm². Odwróć urządzenia, ale utrzymuj interfejs powietrza z górną komorą, aby ułatwić wymianę gazową.
      UWAGA: Interfejs powietrza wymagany podczas inwersji można uzyskać, odwracając urządzenia po umieszczeniu ich w wężu clamps i dociskając we wszystkich rogach przed odwróceniem, lub umieszczając urządzenia do góry nogami na równoległych paskach akrylu lub silikonu oddalonych od siebie na tyle daleko, aby górne komory były drożne. Gęstość wysiewu może wymagać optymalizacji dla każdego użytkownika. Aby osiągnąć 14 000 komórek/cm², dodaj 20 μl zawiesiny komórek o temperaturze ~ 590 000 komórek/ml. Należy pamiętać, że 20 μl jest pipetowane do dolnej komory, aby uniknąć pęcherzyków, ale gęstość oblicza się na podstawie objętości dolnej komory wynoszącej 10 μl.
   4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2-4 godziny w pozycji odwróconej, aby ułatwić adhezję komórek.
   5. Po 2-4 godzinach na adhezję komórek odwróć urządzenia do pozycji pionowej i wymień na świeży E6 + 10% FBS w obu komorach, aby usunąć martwe lub nieprzyłączone komórki.
   6. Jednego dnia po wysiewie perycytów wysiej komórki podobne do EECM-BMEC w górnej komorze, wykonując kroki 2.3.5-2.3.6. Przełącz obie komory na hECSR.
   7. Utrzymywać urządzenia w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} wymieniając pożywkę testową w obu komorach co 1-2 dni do czasu eksperymentów. Kokultura pochodząca z hiPSC jest zwykle utrzymywana przez 7 dni w przypadku BPLC i 6 dni w przypadku komórek podobnych do EECM-BMEC przed testami.
      UWAGA: Jeśli monokultury BPLC zostaną porównane z monokulturami EECM-BMEC lub kokulturami EECM-BMEC i BPLC, należy wymienić E6 + 10% FBS na hECSR 1 dzień po wysiewie BPLC.

3. Immunocytochemia

UWAGA: Ta metoda opisuje protokół barwienia immunocytochemicznego i obrazowania komórek hodowanych w górnej i/lub dolnej części błony. Celem tego eksperymentu jest określenie obecności i lokalizacji kluczowych białek, które powinny znajdować się w BBB, takich jak białka adhereny i ścisłe połączenia oraz białka tożsamości komórkowej. Alternatywne metody barwienia i barwienia na żywo są również kompatybilne z platformą.

1. Utrwalanie i barwienie na urządzeniach
   1. Umieść przeciwciała pierwszorzędowe na lodzie do rozmrożenia.
   2. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej (np. rozcieńczyć 16% PFA w 3-krotności objętości PBS) lub schłodzić 100% metanol w temperaturze -20 °C.
   3. Stworzyć odpowiednie rozwiązanie blokujące zgodnie z tabelą 2. Przechowywać na lodzie.
      UWAGA: Wirowanie roztworu może być konieczne do całkowitego rozpuszczenia Triton X-100.
   4. Utrwalić komórki, pipetując 20 μl utrwalacza (np. PFA lub metanolu) do dolnej komory i 50 μl do górnej komory. Inkubować urządzenia przez 10 minut (PFA) lub 2 minuty (metanol) w temperaturze pokojowej.
   5. Myć przez 3 x 5 minut, pipetując 20 μl PBS przez dolną komorę i 100 μl do górnej komory.
   6. Blokować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, dodając 20 μl roztworu blokującego do dolnej komory i 50 μl roztworu blokującego do górnej komory. Sprawdź, czy w dolnej komorze nie ma pęcherzyków.
   7. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało(-a) w roztworze blokującym zgodnie z tabelą 2. Przechowywać na lodzie.
   8. Wybarwić przeciwciałami pierwszorzędowymi, dodając 20 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do dolnej komory i zastępując objętość górnej komory 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Sprawdź, czy w dolnej komorze nie ma pęcherzyków. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   9. Myć przez 3 x 5 minut, pipetując 20 μl PBS przez dolną komorę i 100 μl do górnej komory.
   10. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając przeciwciało(-a) w roztworze blokującym zgodnie z tabelą 2. Przechowywać na lodzie chronionym przed światłem.
   11. Wybarwić przeciwciałami drugorzędowymi, dodając 20 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego do dolnej komory i zastępując objętość górnej komory 50 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego. Sprawdź, czy w dolnej komorze nie ma pęcherzyków. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   12. Myć przez 3 x 5 minut, pipetując 20 μl PBS przez dolną komorę i 100 μl do górnej komory.
   13. Zrób roztwór plamy jądrowej. Rozcieńczyć Hoechst w stosunku 1:10 000 w PBS. Dodać 20 μl roztworu plamy jądrowej do dolnej komory i zastąpić objętość górnej komory 50 μl roztworu barwienia jądrowego. Sprawdź, czy w dolnej komorze nie ma pęcherzyków. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   14. Usuń plamę, dodając 20 μl PBS do dolnej komory i zastępując objętość górnej komory 100 μl PBS. Urządzenia należy natychmiast zobrazować lub przechowywać w temperaturze 4 °C na szalce Petriego owiniętej w parafilm i chronionej przed światłem do czasu, gdy będą gotowe do obrazowania.
2. Obrazowanie konfokalne
   UWAGA: W tej sekcji opisano obrazowanie urządzeń za pomocą mikroskopu konfokalnego z odwróconym wirującym dyskiem i obiektywem 40x o dużej odległości roboczej (LWD) (woda, WD 590-610, apertura numeryczna 1,15) jako przykład. Aby uzyskać informacje na temat odległości roboczych i kompatybilności obiektywów, zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi w McCloskey et al.³⁴. Obrazy całego obszaru membrany są również wykonywane przy użyciu obiektywu 10x, aby zapewnić, że obrazy 40x są reprezentatywne dla całego pola. Są one zwykle wykonywane w szerokim polu.
   1. Włącz mikroskop i otwórz oprogramowanie do obrazowania.
   2. Ustaw kanały zgodnie z właściwościami przeciwciała wtórnego i barwienia jądrowego, korzystając z trybu obrazowania konfokalnego. Zoptymalizuj moc lasera i czas naświetlania, aby upewnić się, że sygnał znajduje się ponad tłem i zmniejsza artefakty obrazowania.
      1. Do barwienia jądrowego Hoechst należy użyć wzbudzenia 405, emisji 450/50 Bandpass (BP), czasu ekspozycji 500 ms, 50% mocy lasera. W przypadku etykiet wykorzystujących przeciwciało drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor (AF) 488 należy użyć wzbudzenia 488, emisji 525/50BP, czasu ekspozycji 500 ms i 50% mocy lasera. W przypadku znaczników wykorzystujących przeciwciało drugorzędowe sprzężone z AF568 należy użyć wzbudzenia 561, emisji 600/50BP, czasu ekspozycji 500 ms i 100% mocy lasera.
   3. Umieść urządzenie w uchwycie szkiełka mikroskopu, górną komorą skierowaną do góry i ustaw w mikroskopie za pomocą uchwytu na szkiełko mikroskopowe. Włącz opcję Na żywo i wybierz kanał dla plamy jądrowej. Znajdź membranę za pomocą niskiego obiektywu, upewniając się, że przezroczysty obszar membrany z azotku krzemu jest wyśrodkowany, ponieważ światło nie będzie przechodzić przez niebieski, stały obszar silikonu. Gdy urządzenie zostanie prawidłowo wyśrodkowane i zostanie znaleziona warstwa komórkowa, przełącz się na obiektyw 40x, zwilż obiektyw i skup się na obszarze błony, używając plamy jądrowej jako przewodnika.
   4. Włącz obrazowanie z-stack i ustaw tryb skanowania na Rozpoczęcie/Koniec. Ustaw rozmiar lub liczbę kroków. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej na mikroskopie ustaw początek skanowania na górze warstwy komórek śródbłonka, używając plamy jądrowej jako przewodnika, a koniec skanowania na dole warstwy perycytów, używając plamy jądrowej jako prowadnicy. Sprawdź wszystkie kanały, aby upewnić się, że wszystko zostanie uchwycone w polu obrazowania.
      UWAGA: Zwykle używamy kroku automatycznego, który wynosi warstwy ~0,2 μm.
   5. Ustaw nazwę obrazu i naciśnij przycisk Pobierz, aby rozpocząć obrazowanie. W razie potrzeby powtórz tę czynność w różnych regionach.
   6. Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą ImageJ⁴⁰ lub Imaris.
      1. Aby przetworzyć w Imaris, przeciągnij plik obrazu do programu, aby otworzyć. Wybierz opcję Przekrój na górnym pasku menu, aby wyświetlić obraz 2D płaszczyzny x-y z odpowiadającymi jej widokami płaszczyzn x-z i y-z. Wybierz Widok 3D na górnym pasku menu, aby wyświetlić obraz 3D. Kliknij obraz i przeciągnij go, aby obrócić. Wybierz Migawka na górnym pasku menu, aby zrobić zdjęcie.

4. Próbkowanie przepuszczalności małych cząsteczek

UWAGA: Ta sekcja opisuje metodologię ilościowych pomiarów właściwości barierowych kultur komórkowych. Celem tego eksperymentu jest wykrycie stężenia małej cząsteczki fluorescencyjnej, która przechodzi przez warstwy komórek i dostaje się do dolnej komory platformy. Dane te są następnie wykorzystywane do obliczania przepuszczalności komórkowej.

1. Technika pobierania próbek
   1. Zmontuj urządzenia zgodnie z protokołem wyszczególnionym w sekcji 1 i hoduj żądane linie komórkowe zgodnie z opisem w sekcji 2. Dołącz dodatkowe urządzenie, które będzie służyć jako bezkomórkowe, powlekane urządzenie sterujące do pomiaru przepuszczalności systemu.
      UWAGA: Zalecane są co najmniej trzy powtórzenia techniczne na warunek; Wymagana jest jednak tylko jedna powtórzona powłoka kontrolna.
   2. Przed rozpoczęciem pobierania próbek należy zastąpić pożywkę w dolnej komorze świeżą pożywką. Sprawdź zbieganie się monowarstwy śródbłonka w każdym urządzeniu pod mikroskopem. Zwróć uwagę na wszelkie przerwy w monowarstwach komórek, ponieważ wpłynie to na dyfuzję barwnika do dolnej komory.
      UWAGA: Zdrowa kultura śródbłonka powinna być w 100% zlewna.
   3. Przygotować fluorescencyjny roztwór małych cząsteczek (np. 150 μg/ml Lucyfer Yellow, 457 Da) w pożywce do hodowli komórkowych. Przygotować nadmiar objętości fluorescencyjnego roztworu małych cząsteczek do wykorzystania do przygotowania roztworów wzorcowych, które służą jako odniesienia do obliczenia stężenia małej cząsteczki fluorescencyjnej pobranej z dolnego kanału.
      UWAGA: Zalecamy przygotowanie 400 μL nadmiaru roztworu, który będzie stosowany jako roztwór wzorcowy o najwyższym stężeniu małej cząsteczki fluorescencji.
   4. Zastąp pożywkę w górnej studzience 100 μl fluorescencyjnego roztworu drobnocząsteczkowego.
      UWAGA: Zalecamy użycie pisaka hydrofobowego do narysowania okręgów wokół portów do pobierania próbek i poczekanie, aż atrament hydrofobowy całkowicie wyschnie przed dodaniem roztworu barwnika fluorescencyjnego. Zapobiega to rozprzestrzenianiu się pożywki z dolnego kanału wokół portu pobierania próbek w kroku 4.1.7. Zalecamy rozłożenie w czasie dodawania fluorescencyjnego roztworu małych cząsteczek do górnej części - odczekaj 2 minuty przed dodaniem roztworu fluorescencyjnego do następnego urządzenia lub pracuj w grupach po 3 (dodaj roztwór do trzech urządzeń w tym samym czasie i odczekaj 5 minut, aby dodać kolejne trzy urządzenia).
   5. Inkubować urządzenia w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 1 godzinę.
   6. Podczas trwającej 1 godzinę inkubacji na poprzednim etapie, należy przygotować roztwory wzorcowe, wykonując 2-krotne seryjne rozcieńczenia z fluorescencyjnego roztworu małocząsteczkowego przygotowanego w kroku 4.1.3. Odpipetować 50 μl każdego roztworu do płaskiej czarnej 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach. Jako podstawowy roztwór wzorcowy należy użyć pożywki z ślepej próby hodowli komórkowej.
      UWAGA: Aby przygotować roztwory wzorcowe, zalecamy 11 seryjnych rozcieńczeń w końcowej objętości 200 μl i użycie pożywki do hodowli komórkowych jako próby ślepej do pomiaru wyjściowej intensywności fluorescencji.
      1. Przenieść 200 μl z 400 μl nadmiaru fluorescencyjnego roztworu drobnocząsteczkowego przygotowanego w kroku 4.1.3 do probówki zawierającej 200 μl pożywki, dobrze wymieszać i przenieść 200 μl tego roztworu do następnej probówki zawierającej 200 μl pożywki. Powtarzać rozcieńczenia w stosunku 1:2, aż będzie w sumie 10 probówek. Odmierzyć pipetą 50 μl najbardziej stężonego roztworu wzorcowego do kolumny 1 w trzech egzemplarzach na płytce 96-dołkowej (B1, C1, D1),^{drugi najbardziej} stężony roztwór do kolumny 2 (B2, C2, D2) i tak dalej. Do^dwunastej kolumny na płytce odpipetować 50 μl podłoża zerowego w trzech egzemplarzach (B12, C12, D12).
   7. Wykonaj następujące czynności, aby pobrać próbkę fluorescencyjnego roztworu małych cząsteczek z dolnego kanału.
      1. Usuń fluorescencyjny roztwór małych cząsteczek ze studzienki, aby zatrzymać proces dyfuzji.
      2. Umieść końcówkę zawierającą 50 μl pożywki w górnym porcie, aby służyła jako zbiornik, wkładając końcówkę z 50 μl do portu, podnosząc urządzenie i delikatnie wysuwając końcówkę, trzymając się góry w celu stabilizacji. Odłóż urządzenie. Upewnij się, że na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza lub powietrza na końcówce pipety, aby uniknąć dodawania pęcherzyków do dolnej komory podczas pobierania próbek.
      3. Dodać 50 μl pożywki do górnej studzienki, aby zapobiec przerwaniu monowarstwy komórek podczas pobierania próbek.
      4. W celu pobrania próbki roztworu z dolnego kanału należy popchnąć pipeter z pustą końcówką pipety do pierwszego oporu, włożyć końcówkę do portu pobierania próbek i odwrócić pipetę 50 μl roztworu z dolnego kanału. Przenieść bezpośrednio do czarnej 96-dołkowej płytki płaskodennej zawierającej roztwory wzorcowe.
         UWAGA: Zalecamy sprawdzenie monowarstwy komórek pod mikroskopem natychmiast po pobraniu próbki. Pobieranie mediów z dolnego kanału może czasami powodować przerwanie warstwy komórkowej w górnej studzince, co może powodować niespójne pomiary przepuszczalności. Szybkie wykonywanie kolejnych kroków w wersji 4.1.7 pomoże temu zapobiec.
   8. Zmierz intensywność fluorescencji w czytniku mikropłytek, używając odpowiednich parametrów długości fali wzbudzenia i emisji dla zastosowanej małej cząsteczki fluorescencji. W przypadku Lucifer Yellow należy użyć wzbudzenia 428 nm i emisji 536 nm, z optymalnym wzmocnieniem. Fluorescencję mierzy się od góry płytki. Dodaj płytkę do czytnika płytek, podświetl dołki próbką (w tym krzywą wzorcową) i wybierz Start, aby odczytać płytkę.
2. Obliczanie wartości przepuszczalności (patrz plik uzupełniający 1 dla szablonu)
   1. Odejmij uśrednioną wartość intensywności fluorescencji pożywki ślepej od wszystkich zmierzonych wartości intensywności fluorescencji.
   2. Użyj równania (1), aby obliczyć przepuszczalność systemu P_s:
      (1)
      gdzie [A]_A jest stężeniem małej cząsteczki fluorescencji pobranej z dolnego kanału, V jest objętością, z której pobrano próbkę i którą dodano do płytki (0,050 ml), [A]_L jest stężeniem małej cząsteczki fluorescencyjnej dodanej do górnej studzienki (np. 0,15 mg/ml), t oznacza czas inkubacji (w s lub min w zależności od pożądanych jednostek), a S to pole powierzchni membrany (0,014^cm2).
      1. Obliczyć [A]_A, korzystając z równania otrzymanego przez wykreślenie krzywej wzorcowej na podstawie wyjściowych wartości wyjściowych intensywności fluorescencji i znanych stężeń roztworów wzorcowych. Obliczyć stężenia (x) próbek doświadczalnych, wprowadzając ich wartości intensywności fluorescencji (y) do równania.
         UWAGA: Użyj części krzywej standardowej, która jest liniowa. Zalecamy pomiar powierzchni membrany na podstawie obrazu membrany wykonanego pod mikroskopem, ponieważ powierzchnia membrany może się różnić w zależności od numeru partii i może znacząco wpłynąć na obliczone wartości przepuszczalności, jeśli różnią się one od kontrolnej powłoki.
   3. Użyj równania (2), aby obliczyć przepuszczalność monowarstwy ogniwa P_e:
      (2)
      Gdzie_{P S} oznacza przepuszczalność systemu obliczoną w kroku 4.2.2, a P_C jest wartością przepuszczalności systemu bezkomórkowego, powlekanego urządzenia sterującego.

Wyniki

Montaż urządzenia do kopania rowów jest pokazany w Rysunek 1. Oprawy prowadzą montaż komponentów i chipa membrany. Składnik 1 to przede wszystkim akryl z powierzchnią PSA do przyklejenia do chipa oraz otworem do dolnej komory i portami umożliwiającymi dostęp pipety do dolnej komory. Komponent 2 to warstwa kanałowa i zawiera nieprzylepny, wolny od PSA "trójkąt" w prawym górnym rogu do chwytania. Urządzenia typu trench-down zapewniają płaski obszar wzrostu hodowli komórkowej w górnej komorze, podczas gdy urządzenia do kopania w komorze mają płaską powierzchnię do hodowli komórek w dolnej komorze.

Przeprowadziliśmy monokultury śródbłonka i kokultury komórek hCMEC/D3 i HBVP oraz komórek podobnych do EECM-BMEC i BPLC pochodzących z hiPSC IMR90-4 i BPLC oraz uzyskaliśmy obrazy fazowe za pomocą mikroskopu kontrastowego fazowego Nikon Eclipse Ts2 i obiektywu 10x (Rysunek 2). Pokazano optymalne gęstości wysiewu dla pierwotnej hodowli komórkowej (zdjęcia wykonane 1 dzień po wysiewie), a także niedostatecznie wysiewane HBVP (Rysunek 2A). Końcowe obrazy fazy kokultury i monokultury (6-dniowa hodowla komórek śródbłonka) mogą być trudne do odróżnienia (Rysunek 2C), a potwierdzenie udanej pierwotnej kohodowli komórek może wymagać barwienia immunofluorescencyjnego (patrz sekcja 3 protokołu). Przedstawiono również niskie, wysokie i optymalne gęstości wysiewu BPLC pochodzące z hiPSC (Rysunek 2B). Kokultura pochodząca z hiPSC jest wyraźniejsza do odróżnienia w obrazowaniu z kontrastem fazowym w porównaniu z pierwotnymi kokulturami (Rysunek 2D). Niskie wysiewanie BPLC powoduje słabe pokrycie perycytów i zlepianie się perycytów, podczas gdy nadmierne wysiewanie powoduje złuszczanie się warstwy perycytów z błony. Co więcej, zbyt szybka wymiana pożywki w dolnej komorze może spowodować utratę perycytów, ponieważ komórki te są bardzo wrażliwe na ścinanie. Optymalne pokrycie przez perycyty wynosi ~90% dla modelu BBB, bez luk w warstwie śródbłonka.

Reprezentatywne obrazy immunologicznie wybarwionej kokultury pochodzącej z hiPSC są zilustrowane w Rysunek 3 (6-dniowa hodowla komórek śródbłonka). BPLC pochodzące z IMR90-4 wybarwiono pod kątem markera perycytów PDGFRβ, a komórki podobne do EECM-BMEC pochodzące z IMR90-4 wybarwiono pod kątem markera połączenia adherens VE-kadheryny. Hoechst służył do barwienia jąder. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Spinning Disc przy użyciu 40-krotnego obiektywu LWD z plastrami 0,2 μm i przetworzono za pomocą Imaris. Obie warstwy komórek można uwidocznić, nawet jeśli cienka nanomembrana nie jest widoczna.

Przeprowadziliśmy test przepuszczalności małych cząsteczek oparty na próbkowaniu, używając tych samych warunków eksperymentalnych w dwóch fizycznie odległych laboratoriach na Uniwersytecie w Bernie, Szwajcaria i Uniwersytecie Rochester, NY, USA, aby zademonstrować międzylaboratoryjną powtarzalność wyników (Rysunek 4)³⁴. Komórki podobne do EECM-BMEC pochodzące z hiPSC IMR90-4 hodowano w urządzeniu μSiM przez 2, 4 lub 6 dni oraz na filtrach transwell przez 6 dni. Test przeprowadzono przy użyciu 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) w obu laboratoriach. Duża zmienność przepuszczalności komórek śródbłonka hodowanych przez 2 dni w urządzeniu wskazuje, że 2 dni hodowli były niewystarczające do dojrzewania bariery. Nie stwierdzono istotnych różnic w przepuszczalności między laboratoriami po dojrzewaniu bariery - od 4 dni. Wykazaliśmy również, że przepuszczalność komórek śródbłonka hodowanych w filtrach μSiM i transwell przez 6 dni odpowiadała wcześniej opublikowanym ⁴⁰.

Rysunek 1: Etapy montażu μSiM. (A) Przygotuj chip, umieszczając go na uchwycie A1. Umieść rów wiórowy do góry, aby uzyskać końcowe urządzenie do kopania. Umieść rów wiórowy w dół, aby uzyskać końcowe urządzenie do wykopu. (B) Przymocuj komponent 1 do chipa, zdejmując maski ochronne z elementu 1 i umieszczając go stroną zadrukowaną w FA1. Spaj, dociskując uchwyt A2. (C) Połączyć składnik 2 i składnik 1, usuwając składnik 2 z arkusza i odrywając górne warstwy ochronne. Umieść kanał w górę w uchwycie B1 i umieść komponent 1 na górze komponentu 2 stroną zadrukowaną do góry. Spaj, wywierając nacisk za pomocą uchwytu B2. Skróty: FAn = oprawa An; FBn = fixture Bn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat kokultury i reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego hodowli komórkowej w urządzeniach. (A) Lokalizacja wysiewu komórek perycytów i śródbłonka. (B) Schemat rozmieszczenia komórek w widoku z boku w poprzek wykopu chipa membrany. (C) Reprezentatywne obrazy niskich i optymalnych gęstości wysiewu dla pierwotnej linii komórkowej śródbłonka mózgu HBVP i hCMEC/D3. Obrazy uzyskano 1 dzień po wysiewie (HBVP) i 2 godziny po wysiewie (hCMEC/D3). (D) Reprezentatywne obrazy niskich, wysokich i optymalnych gęstości wysiewu dla komórek podobnych do perycytów mózgu pochodzących z hiPSC. Obrazy zostały uzyskane 1 dzień po wysiewie. (E) Reprezentatywne obrazy końcowej kokultury HBVP i hCMEC/D3 oraz monokultury hCMEC/D3. Obrazy uzyskano 8 dni po wysiewie HBVP i 7 dni po wysiewie hCMEC/D3. (F) Reprezentatywne obrazy nieudanej i udanej kohodowli komórkowej podobnej do BPLC i EECM-BMEC oraz monokultury komórkowej podobnej do EECM-BMEC. Obrazy uzyskano 7 dni po wysiewie BPLC i 6 dni po wysiewie EECM-BMEC. Niedostatecznie wysiewane kultury BPLC nie mają wystarczającego pokrycia, podczas gdy nadmiernie wysiewane kultury BPLC będą nadmiernie zlewać się i zaczną się zbrylać/cofać. Podziałka = 100 μm (C-F). Skróty: HBVPs = perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu; hiPSC = ludzka indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta; BPLC = komórki podobne do perycytów mózgu pochodzące z hiPSC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy kohodowli komórek pochodzących z hiPSC w urządzeniach. Komórki wybarwiono pod kątem markera komórek śródbłonka VE-kadheryny (zielony), markera perycytów PDGFRβ (czerwony) i barwnika jądrowego (niebieski). W bliskiej odległości można zobaczyć dwie warstwy komórek, oddzielone jedynie cienką nanomembraną azotku krzemu (biała strzałka oznacza położenie błony na zdjęciu po lewej). Podziałka = 50 μm. Skróty: hiPSC = human induced pluripotent stem cell; PDGFRβ = receptor beta-płytkowego czynnika wzrostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Test przepuszczalności małych cząsteczek oparty na próbkowaniu. (A) Schemat eksperymentalnego przepływu pracy. (B) Demonstracja międzylaboratoryjnej odtwarzalności między dwoma fizycznie odległymi laboratoriami na Uniwersytecie w Bernie (UniBe) w Szwajcarii i Uniwersytecie w Rochester (UR), NY, USA: Komórki śródbłonka pochodzące z hiPSC hodowano w urządzeniu μSiM przez 2, 4 lub 6 dni oraz w filtrach transwell przez 6 dni. Test przepuszczalności przeprowadzono przy użyciu 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da). Czerwony pasek wskazuje wcześniej opublikowane dane dotyczące przepuszczalności fluoresceiny sodu (376 Da) dla tych samych komórek śródbłonka pochodzących z hiPSC, hodowanych przez 6 dni w filtrach transwell⁴⁰. N = 4-16 na grupę. Zastosowano dwukierunkową ANOVA z testem post hoc Tukeya, a porównania wyświetlono tylko dla odpowiednich p < 0,05. (C) Wykazanie odpowiedzi cytokinowej przy użyciu komórek podobnych do EECM-BMEC pochodzących z hiPSC, hodowanych w μSiM przez 2 dni; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IU/mL IFNγ) lub pożywkę kontrolną (niestymulowaną, NS) dodano do górnej komory na 20 godzin przed testem przepuszczalności przy użyciu 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 na grupę. Test t-Studenta, p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Powierzchnia wysiewu w górnej komorze	Górna objętość studni	Powierzchnia wysiewu w dolnej komorze	Głośność dolnego kanału
~37 mm2	100 μL (może pomieścić ≥115 μL)	~42 mm2	10 μL (odpipetować 20 μL, aby uniknąć pęcherzyków)

Tabela 1: Krytyczna powierzchnia i objętości μSiM.

jedn. jedn. powiedział: jedn. jedn.

cel	Utrwalacz	Rozwiązanie blokujące	Rozcieńczeniu
VE-kadheryna	4% PFA lub 100% MeOH	5% GS + 0,4% Tx-100 lub 10% GS + 0,3% Triton X-100	1:50
Płyta CD31	4% PFA lub 100% MeOH	5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100	1:100
Claudin-5	100% MeOH	5-10% GS + 0,3% Triton X-100	1:200
ZO-1	100% MeOH	5-10% GS + 0,3% Triton X-100	1:200
Okludyna	100% MeOH	5-10% GS + 0,3% Triton X-100	1:50
PDGFRβ	4% PFA	5% GS + 0,4% Triton X-100	1:100
Zobacz materiał NG2	4% PFA	5% GS + 0,4% Triton X-100	1:100
Kozia α-mysz IgG Alexa Fluor 488			1:200
Kozia α-mysz IgG Alexa Fluor 568			1:200

Tabela 2: Przeciwciała i metody barwienia zatwierdzone dla immunocytochemii kohodowlanej w urządzeniach μSiM. Skróty: PFA = paraformaldehyd; MeOH = metanol; GS = kozia surowica.

Plik uzupełniający 1: Szablon do obliczania wartości przepuszczalności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chociaż wióry membranowe zostały zaprojektowane z myślą o stabilności, mogą pękać lub pękać, jeśli są nieprawidłowo obsługiwane podczas montażu. Dlatego tak ważne jest, aby chwycić chip w nacięciach pęsety do wiórów i delikatnie umieścić go w uchwycie. Podczas ogólnego obchodzenia się z urządzeniami należy podjąć dodatkowe środki ostrożności, aby nie uderzyć ani nie upuścić urządzeń. Podczas łączenia chipa membranowego z uchwytem A1, chip musi być ułożony płasko i wyśrodkowany na filarze uchwytu A1, aby uniknąć pękania membrany podczas łączenia z elementem 1. Ponadto po zdjęciu masek ochronnych należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z odsłoniętymi warstwami PSA. Podczas obchodzenia się z komponentem 2 po zdjęciu masek ochronnych zaleca się trzymanie go wzdłuż krawędzi elementu i użycie pęsety w celu złapania trójkątnego rogu, który jest wolny od PSA.

Podczas gdy opisano protokoły hodowli komórkowych dla możliwych modeli BBB, opisany tutaj model kohodowli BMEC/perycytów BBB może być wystarczający lub niewystarczający w zależności od kontekstu fizjologicznego i interesujących pytań. Na przykład transport komórek odpornościowych zachodzi głównie w żyłkach pozakapilarnych mózgu^41,42. W tych regionach przestrzeń okołonaczyniowa oddziela barierę BMEC/perycytów od granic glejowych ustanowionych przez astrocyty. Tak więc w żyłkach pozakapilarnych jednostka nerwowo-naczyniowa (NVU) składa się z dwóch fizycznie oddzielonych barier połączonych szeregowo, a astrocyty stopy końcowe nie stykają się bezpośrednio z barierą krwi BMEC / perycytów, która jest dobrze reprezentowana przez obecny model. Jeśli celem jest model NVU, który uwzględnia wpływ czynników wydzielanych przez astrocyty na barierę krwi, do urządzenia można dodać przedział astrocytów, który umożliwia wymianę rozpuszczalnych czynników przez przestrzeń okołonaczyniową. Przykład ten został zilustrowany wcześniej³⁴ i może zostać rozszerzony o inne komórki, takie jak mikroglej i neurony, w przedziale "mózgu" 3D. Modułowa architektura platformy umożliwia wykorzystanie prostych strategii montażu w celu osiągnięcia tych rekonfiguracji, dzięki czemu platforma jest tak prosta lub złożona, jak to jest potrzebne do rozwiązania istniejących hipotez. Każda konfiguracja hodowli komórkowej; Musi być jednak zoptymalizowany pod kątem nowych linii komórkowych i wielokultur. Na przykład, ze względu na właściwości membran z azotku krzemu, może być konieczne dostosowanie roztworów powlekających w porównaniu z płytkami do hodowli tkankowych. Włączenie fibronektyny zazwyczaj pomaga w przyczepianiu się komórek i przetrwaniu. Co więcej, użytkownicy mogą hodować komórki śródbłonka i perycyty w przeciwnych kierunkach. W takim przypadku konieczna może okazać się modyfikacja np. sposobu wykonywania i interpretacji pomiarów przepuszczalności. Przedstawienie kroków dla tego typu kultury wykracza jednak poza zakres tego artykułu.

Innym wyzwaniem, które można napotkać podczas hodowli komórkowej, jest szybkie odparowanie pożywki, ponieważ urządzenia mogą być bardziej wrażliwe na zmiany w środowisku w porównaniu ze standardowymi płytkami i kolbami do hodowli tkankowych. Jeśli zaobserwuje się nadmierne parowanie lub spowolnienie wzrostu komórek, należy zmierzyć wszystkie krytyczne parametry inkubatora, aby zapewnić dokładne ustawienia. Do nasadki tkankowej lub małej szalki Petriego umieszczonej w komorze hodowli komórkowej można dodać więcej wody lub należy częściej wymieniać pożywkę. Ponadto bąbelki mogą dostać się do dolnego kanału i utknąć w wykopie dla urządzeń do kopania. Chociaż można je usunąć, najłatwiej jest unikać dodawania bąbelków w pierwszej kolejności. W tym celu należy sprawdzić, czy na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza ani czy na końcu końcówki pipety nie ma pęcherzyków powietrza, zanim doda się media do dolnej komory. Ponadto parowanie mediów w kanale może prowadzić do powstania szczeliny między powierzchnią nośnika a górną częścią portu. Niewielka objętość nośnika może być pipetowana do jednego portu, aż nośnik dotrze do powierzchni przeciwległego portu, po czym nośnik może być wymieniany w tym przeciwległym porcie. Podczas gdy pożywki hECSR i E6 + 10% FBS nie powinny być podgrzewane w łaźni wodnej, inne media można wstępnie podgrzać, aby ograniczyć tworzenie się pęcherzyków. Jeśli pęcherzyk dostanie się do dolnej komory, można go usunąć, szybko pipetując 100 μl przez kanał. Jednak ta metoda może prowadzić do zanieczyszczenia między komorami lub mediów rozlanych po powierzchni urządzenia. Może również zaburzać warstwy komórkowe. Alternatywnie pożywkę można najpierw wyjąć z kanału, a następnie ponownie wprowadzić w objętości 50 μl. Usunięcie nośnika w pierwszej kolejności może jednak spowodować powstawanie większej ilości pęcherzyków w kanale. Jeśli pęcherzyk nie znajduje się bezpośrednio pod obszarem błony, można go pozostawić w kanale bez wpływu na hodowlę komórkową.

Przyczepianie i wzrost perycytów, jak pokazano na rycinie 2, może być trudne. Zastosowanie zoptymalizowanej gęstości wysiewu jest niezbędne do utworzenia warstwy o fizjologicznie istotnym stosunku komórek perycytów do śródbłonka. Ponadto, ponieważ perycyty są wrażliwe na ścinanie, cała wymiana pożywki w kanale powinna odbywać się bardzo powoli, aby chronić komórki. W przypadku hodowli BPLC lepsze przyleganie można uzyskać, pokrywając dolną komorę 800 μg/ml kolagenu typu IV lub 100 μg/ml fibronektyny.

Immunocytochemia w opisywanych tu urządzeniach umożliwia jakościową analizę zdrowia i funkcji komórek. Metody barwienia na płytkach do hodowli tkankowych lub innych platformach powinny być bezpośrednio przekładalne na platformę. W przypadku hodowli komórkowej tylko w górnej komorze, po utrwaleniu, PBS można dodać do dolnej komory i pozostawić na pozostałe etapy, z blokowaniem i barwieniem wykonanym tylko w górnej komorze. Minimalizuje to ryzyko pęknięcia membran lub dostania się pęcherzyków do dolnej komory. Do barwienia kokultur zalecamy stosowanie obu komór na wszystkich etapach. Ważne jest, aby pamiętać, że lepkość utrwalacza i PBS różni się od lepkości pożywki. W związku z tym dodawanie pęcherzyków powietrza do dolnej komory może być łatwiejsze i należy zachować szczególną ostrożność, aby przed pipetowaniem do dolnej komory sprawdzić, czy na końcówkach pipet znajduje się powietrze na końcu końcówki.

Protokół opisany dla testu przepuszczalności małych cząsteczek pozwala na funkcjonalną i ilościową ocenę funkcji barierowej komórek śródbłonka hodowanych w urządzeniu μSiM. Jednym z problemów, który może wystąpić podczas tego testu, jest wciąganie pęcherzyków powietrza do pipety podczas pobierania próbki z dolnego kanału na kroku protokołu 4.1.7.4. Aby uniknąć tego problemu, ważne jest, aby upewnić się, że końcówka jest uszczelniona w porcie przed rozpoczęciem pobierania próbki, a próbka nie powinna być pobierana zbyt szybko. Jeśli to nie rozwiąże problemu, rozmiar użytych końcówek może być zbyt mały lub zbyt duży, aby zmieścić się w portach; skorzystaj ze wskazówek podanych w Tabeli materiałów. W przypadku zmierzenia nieoczekiwanie wysokich wartości przepuszczalności pomimo zdrowo wyglądającej zlewającej się monowarstwy, należy sprawdzić integralność monowarstwy pod kątem zakłóceń podczas pobierania próbki. Zalecamy, aby zawsze sprawdzać monowarstwę pod mikroskopem natychmiast po pobraniu próbki. Jeśli monowarstwa nadal wydaje się nienaruszona i zdrowa, próbkę można utrwalić i ocenić biologiczne markery funkcji bariery, na przykład poprzez barwienie immunologiczne białek połączeniowych. I odwrotnie, w przypadku pomiaru nieoczekiwanie niskich wartości przepuszczalności, ważne jest, aby upewnić się, że próbka 50 μl pożywki jest pobierana z dolnego kanału bez pęcherzyków powietrza. Jeżeli pożywka wydostaje się z portu do pobierania próbek zaraz po umieszczeniu końcówki zbiornika, należy ją zebrać przed włożeniem pipety do portu do pobierania próbek, ponieważ większość małych cząsteczek fluorescencyjnych będzie obecna w początkowej objętości 10 μl pobranej z dolnego kanału. Rysowanie okręgów wokół portów za pomocą pisaka hydrofobowego lub umieszczenie taśmy hydrofobowej z otworem wokół portu zapobiega rozprzestrzenianiu się pasywnie pompowanych mediów. Jeżeli podczas pobierania próbek zostaną usunięte pęcherzyki powietrza lub nie zostanie usunięta cała próbka o objętości 50 μl, próbki nie wolno używać. Alternatywnie można określić dokładną objętość i wykorzystać ją w obliczeniach przepuszczalności; należy to jednak zrobić tylko wtedy, gdy usunięta objętość wynosi ≥40 μl, co odpowiada ~98-99% odzysku barwnika³⁴.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała
CD31 Przeciwciało poliklonalne	Thermo Fisher Scientific	PA5-32321
Mysie przeciwciało IgG Claudin-5, 4C3C2	Thermo Fisher Scientific	35-2500
Koza &alfa;-Mysz IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11001
Koza &alfa;-Królik IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11011
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
NG2, mysz IgG2a, 9.2.27	Millipore
Mysie przeciwciało IgG Occlludin, OC-3F10	Thermo Fisher Scientific	33-1500
PDGFRβ, przeciwciało IgG królika, 28E1	Technologia sygnalizacji komórkowej	3169
VE-kadheryna mysz IgG2B Klon # 123413	R& D Systems	MAB9381
królicze przeciwciało IgG ZO-1, poliklonalne	Thermo Fisher Scientific	40-2200
Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane
100% Metanol	VWR	101443-718	Można zastąpić podobnymi produktami
16% Paraformaldehyd	Thermo Fisher Scientific	28908	Może być zastąpiony podobnymi produktami
: Accutase	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	695092
suplement B27	Thermo Fischer Scientific	17504044
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Kolagen IV z ludzkiego łożyska	Sigma-Aldrich	C5533
Kolagen, roztwór typu I z ogona szczura	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	Można zastąpić podobnymi produktami
DMEM/Szynka" s F12	Thermo Fisher Scientific	11320033
EGM-2 Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Essential 6 medium	Thermo Fisher Scientific	A1516401
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Szczytowa surowica	PS-FB1
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	F1141
Fibronektyna białko ludzkie, osocze	ThermoFisher Scientific	33016015	Można zastąpić podobnymi produktami
hESFM	Thermo Fisher Scientific	11111044
Lucifer Yellow CH sól dilitowa	Sigma-Aldrich	861502
Normalna surowica kozia	Thermo Fisher Scientific	500627	Może być zastąpiony podobnymi produktami
PBS bez wapń, magnez	Cytiva	SH30256.01	Może być zastąpiony podobnymi produktami
Pericyte Medium	ScienCell	1201	Użyj kompletnego zestawu (zawiera suplementy)
Poli-L-lizyna, 10 mg/ml	ScienCell	0413
Triton X-100	JT Baker	X198-05	Może być zastąpiony podobnymi produktami
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz	Invitrogen&handel;	10977015	Może być zastąpiony podobnymi produktami
Modele eksperymentalne: Linie komórkowe< / silna>
bariera krew-mózg linia komórkowa hCMEC/D3	Sigma-Aldrich	SCC066
Perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu	ScienCell	1200
iPS(IMR90)-4 ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste	WiCell	RRID:CVCL_C437
Wyroby szklane i plastikowe
150 mm Naczynie do hodowli komórkowych z siatką 20 mm	Falcon	353025
Płytki do hodowli tkankowych Corning (6-dołkowe)	Corning	3506
Płaskie 96-dołkowe niewiążące mikropłytki	Greiner Bio-One	655900
Uchwyt na szkiełko mikroskopowe	SiMPore	USIM-SB	Wymiary kompatybilne z uchwytami do szkiełek mikroskopowych
Nunc 15 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe	Thermo Fischer Scientific	339651
Nunc 50 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki	wirówkowe Thermo Fischer Scientific	339653	Nasadki do probówek można napełnić wodą do hodowli komórkowych
Końcówki do pipet P20-200	VWR	76322-516	Alternatywne marki mogą nie uszczelniać tak skutecznie
portów Filtry Transwell (12 dołków, 12 mm, 0,4 i mu; m wielkość porów, PC)	CoStar	3401
Instruments
10X Obiektyw (dla Andor)	Nikon Instruments Inc.	MRD00105	Powietrze; szerokość szer.: 4 mm; Obiektyw NA 0.45
10X (dla Nikona)	Nikon Instruments Inc.	MRP40102	Powietrze; szerokość szerokość: 6,2 mm; NA 0.25
Obiektyw 40X (LWD) (dla Andor)	Nikon Instruments Inc.	MRD77410	Zanurzenie w wodzie; Szerokość szerokość: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem	Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Mikroskop z kontrastem fazowym	Nikon Instruments Inc.		Może być zastąpiony podobnymi produktami
TECAN Infinite M200	TECAN		Może być zastąpiony podobnymi produktami
Inne
			2 mm
Zestaw montażowy z uchwytami	SiMPore	USIM-JIGSET	W tym mocowanie A1, A2, B1 i B2
Adapter do aparatu fotograficznego do mikroskopów:	AmScope	CA-CAN-SLR, Canon SLR / D-SLR	Φ 23.2 - Φ Adapter 30 pasuje do Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera	Canon	EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001	Można zastąpić podobnymi produktami
Sitko do komórek, 40 i mikro; m	Millipore Sigma (Corning)	CLS431750
Składnik 1	SiMPore	USIM-C1
Składnik 2	SiMPore	USIM-C2
Chipy membranowe	SiMPore	NPSN100-1L	Dostępne są inne formaty chipów
Pęseta do obsługi SMD pod podwójnym kątem	Techni-Tool	758TW003	"Pęseta do wiórów"
Nierdzewny stalowa precyzyjna pęseta GG	Techni-Tool	758TW534	"Pęseta prosta"
Oprogramowanie
Fiji	ImageJ		Do przetwarzania obrazu
Fusion	Oxford Instruments, Andor		Instrukcje dla wersji 2.3.0.44
i-control	TECAN		Instrukcje dla wersji 2.0
Imaris	Oxford Instruments		Do przetwarzania obrazu. Instrukcje dla wersji 9.9.0