Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Streszczenie

Wysepki trzustkowe Langerhansa, które są małymi zbiorami 3D wyspecjalizowanych komórek endokrynnych i podporowych rozsianych po całej trzustce, odgrywają kluczową rolę w kontroli homeostazy glukozy poprzez wydzielanie insuliny przez komórki beta, co obniża poziom glukozy we krwi, oraz glukagonu przez komórki alfa, co podnosi poziom glukozy we krwi. Wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, w tym te, w których pośredniczy cAMP, mają kluczowe znaczenie dla regulowanego wydzielania hormonów komórek alfa i beta. Struktura 3D wysp trzustkowych, choć niezbędna do skoordynowanej funkcji wysp trzustkowych, stanowi wyzwanie eksperymentalne dla badań mechanistycznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w pierwotnych ludzkich komórkach wysp trzustkowych. Aby przezwyciężyć te wyzwania i ograniczenia, protokół ten opisuje zintegrowaną platformę obrazowania żywych komórek i mikroprzepływową wykorzystującą pierwotne ludzkie pseudowyspy trzustkowe wygenerowane od dawców bez cukrzycy, które przypominają rodzime wyspy trzustkowe pod względem morfologii, składu i funkcji. Te pseudowysepki są kontrolowane pod względem wielkości w procesie dyspersji i reagregacji pierwotnych komórek ludzkich wysp trzustkowych. W stanie rozproszonym można manipulować ekspresją genów komórek wysp trzustkowych; Na przykład można wprowadzić bioczujniki, takie jak genetycznie kodowany bioczujnik cAMP, cADDis. Po uformowaniu pseudowysp wykazujących ekspresję genetycznie kodowanego biosensora, w połączeniu z mikroskopią konfokalną i platformą mikroperyfuzyjną, pozwalają na synchroniczną ocenę dynamiki biosensora fluorescencyjnego oraz profili wydzielania hormonów komórek alfa i beta, aby zapewnić lepszy wgląd w procesy i funkcje komórkowe.

Wprowadzenie

Wysepki Langerhansa to mini organy rozsiane po całej trzustce, których funkcja jest kluczowa dla utrzymania homeostazy glukozy. Insulina jest wydzielana z komórek beta w wyniku metabolizmu glukozy, wzrostu stosunku ATP / ADP, zamknięcia wrażliwych na ATP kanałów potasowych, depolaryzacji błony plazmatycznej i napływu zewnątrzkomórkowego wapnia ¹. Wydzielanie glukagonu z komórek alfa jest mniej zrozumiałe, ale postuluje się, że szlaki wewnątrzkomórkowe i parakrynne przyczyniają się do egzocytozy granulek glukagonu^2,3,4. Zarówno cukrzyca typu 1, jak i typu 2 są związane z dysfunkcją komórek wysp trzustkowych^5,6,7. Dlatego wyjaśnienie wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych pośredniczących w wydzielaniu hormonu wysp trzustkowych jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów fizjologicznych i patologicznych w wyspach trzustkowych.

Sferyczna architektura wysepek stwarza pewne przeszkody dla eksperymentów. Wyzwania te obejmują zmienność wielkości wysepek i naturę 3D wysepek, która zmniejsza transdukcję wirusa w rdzeniu wysepek^8,9. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano system pseudowysepek, w którym pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe są rozpraszane w pojedyncze komórki, adenowijnie transdukowane za pomocą konstruktów kodujących interesujące cele i ponownie agregowane w celu utworzenia kontrolowanych rozmiarów, podobnych do wysepek struktur określanych jako pseudoislets⁷. W porównaniu z rodzimymi wysepkami od tego samego dawcy, które były hodowane równolegle, te pseudowysepki są podobne pod względem morfologii, składu komórek endokrynnych i wydzielania hormonów⁷. Metoda ta pozwala na ekspresję konstruktów w całej pseudowysepce, co oznacza, że pokonuje wcześniejszą barierę dla jednolitej manipulacji genetycznej pierwotnych ludzkich wysepek^7,8,9.

W tym protokole, system pseudowysp jest zintegrowany z urządzeniem mikroprzepływowym do wyrażania biosensorów w pierwotnych ludzkich komórkach wysp trzustkowych i uzyskiwania czasowej rozdzielczości wydzielania hormonu pseudowysp podczas dynamicznej peryfuzji^10,11,12. Pseudowysepki umieszcza się w mikroczipie i wystawia na stały przepływ różnych sekretagogów za pomocą pompy perystaltycznej¹². Mikroczip ma przezroczyste szklane dno i jest zamontowany na mikroskopie konfokalnym w celu rejestrowania dynamiki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej poprzez zmiany intensywności fluorescencji biosensora. Obrazowanie biosensora jest zsynchronizowane z gromadzeniem ścieków z mikroperfuzji w celu późniejszej analizy wydzielania insuliny i glukagonu⁷. W porównaniu z makroperyfuzją, to podejście mikroperyfuzji pozwala na użycie mniejszej liczby pseudowysepek ze względu na mniejszą objętość urządzenia mikroprzepływowego w porównaniu z komorą makroperyfuzyjną⁷.

Aby wykorzystać użyteczność tego systemu, biosensor cyklicznego detektora różnic monofosforanu adenozyny (cAMP) in situ (cADDis) został wyrażony w ludzkich pseudowyspach w celu oceny dynamiki cAMP i wydzielania hormonów. Bioczujnik cADDis składa się z kolisto permutowanego białka zielonej fluorescencji (cpGFP) umieszczonego w obszarze zawiasowym białka wymiennego aktywowanego przez cAMP 2 (EPAC2), łącząc jego regiony regulacyjne i katalityczne. Wiązanie cAMP z regionem regulatorowym EPAC2 wywołuje zmianę konformacyjną w obszarze zawiasu, która zwiększa fluorescencję z cpGFP¹³. Przekaźniki wewnątrzkomórkowe, takie jak cAMP, wywołują wydzielanie insuliny i glukagonu po aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G¹⁴. Obrazowanie żywych komórek w połączeniu z mikroperyfuzją pomaga połączyć wewnątrzkomórkową dynamikę cAMP z wydzielaniem hormonu wysp trzustkowych. W szczególności w tym protokole generowane są pseudowysepki z ekspresją cADDis w celu monitorowania odpowiedzi cAMP w komórkach alfa i beta na różne bodźce: niski poziom glukozy (2 mM glukozy; G2), wysoka zawartość glukozy plus izobutylometyloksantyna (IBMX; 20 mM glukozy + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) i niska glukoza plus epinefryna (Epi; 2 mM glukozy + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Ten przebieg leczenia pozwala na ocenę wewnątrzkomórkowej dynamiki cAMP bezpośrednio poprzez 1) hamowanie fosfodiesterazy za pośrednictwem IBMX, które zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom cAMP, zapobiegając jego degradacji, oraz 2) epinefrynę, znany zależny od cAMP stymulator wydzielania glukagonu w komórkach alfa, w którym pośredniczy aktywacja receptora β-adrenergicznego. Kroki konfiguracji aparatu do mikroperyfuzji do eksperymentów obrazowania żywych komórek, ładowanie pseudowysp do mikroprocesora, synchroniczne obrazowanie żywych komórek i mikroperyfuzja oraz analiza śladów biosensora i wydzielania hormonów za pomocą testów hormonalnych na mikropłytkach są szczegółowo opisane poniżej.

Protokół

Ludzkie wyspy trzustkowe (N = 4 preparaty) uzyskano dzięki partnerstwu z Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. i Imagine Pharma. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Vanderbilt nie uważa pozbawionych identyfikacji próbek ludzkiej trzustki za badania kliniczne prowadzone na ludziach. Praca ta nie byłaby możliwa bez dawców narządów, ich rodzin i organizacji zajmujących się pobieraniem narządów. W Tabeli 1 przedstawiono informacje demograficzne dotyczące dawców. Ludzkie wyspy trzustkowe od dawców trzustki bez cukrzycy izolowano po mniej niż 15 godzinach zimnego niedokrwienia.

1. Formacja pseudowysepek (szczegółowo opisana w Walker et al.7)

1. Pobrać i ręcznie pobrać pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe za pomocą pipety P200 i mikroskopu laboratoryjnego, zwracając szczególną uwagę, aby nie zanieczyścić końcówki pipety na żadnych powierzchniach poza pożywką hodowlaną wysp trzustkowych (10% FBS, 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny, 2 mM L-glutaminy w CMRL 1066).
2. Przenieść pierwotne wyspy trzustkowe do probówki o pojemności 15 ml i wykonać wszystkie poniższe etapy tworzenia pseudowysp pod kapturem do hodowli tkankowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Powoli dysocjuj pierwotne wyspy trzustkowe przez 7 minut w temperaturze pokojowej za pomocą pipety P1000 w 0,025% trypsyny. Roztwór stanie się nieprzezroczysty, gdy wysepki zaczną się rozpadać.
   1. W tych badaniach 200-300 ręcznie wybieranych pierwotnych wysepek o średnicy około 200 μm rozproszonych w 500 μl 0,025% trypsyny daje od jednej do dwóch 96-dołkowych płytek pseudowysepek; dokładna liczba może się różnić w zależności od średniej wielkości i żywotności wysepek. W przypadku >500 pierwotnych wysepek należy zwiększyć objętość 0,025% trypsyny w stosunku 1:1 (np. 600 μl 0,025% trypsyny na 600 ręcznie wybranych wysepek).
3. Ugasić dyspersję, dodając objętość pożywki Vanderbilt Pseudoislet (VPM) odpowiadającą objętości użytej trypsyny. Następnie przemyj dwa razy 1 ml VPM. Do płukania odwirować rozproszone komórki przy 485 x g przez 2-3 minuty w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej. Ponownie zawieś komórki w określonej objętości VPM (zwykle 1 ml) w celu zliczenia.
   UWAGA: Generowanie pseudowysepek i skład VPM są szczegółowo opisane we wcześniejszej publikacji⁷. Krótko mówiąc, VPM zawiera równe objętości wzbogaconych pożywek CMRL (20% FBS, 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny, 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES w CMRL 1066) i iEC-media (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 butelka suplementu Endothelial Cells Medium). Schemat podsumowujący generowanie pseudowysepek znajduje się w Rysunek 1A.
4. Określić liczbę i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, łącząc 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj zawiesinę komórek, aby zapewnić dokładną liczbę komórek.
5. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej, wirusa i VPM wymaganą dla żądanej liczby pseudowysepek. Oprzyj wszystkie obliczenia na liczbie żywych komórek uzyskanej w kroku 1.4.
   1. W tych badaniach należy przetransdukować rozproszone ludzkie komórki wysp trzustkowych w MOI 500 (N = 1) lub 1,000 (N = 2) za pomocą Ad-CMV-cADDis w całkowitej objętości 500 μl. Jedna płytka transdukowanych pseudowysp (2000 komórek/wysepkę rzekomą) daje trzy kontrpróby techniczne na dawcę (32 pseudowysepki/eksperyment). W tej pracy adenowirus został uzyskany komercyjnie.
6. Połącz obliczone ilości zawiesiny komórkowej, wirusa i VPM w probówce o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj zawartość, pipetując w górę i w dół.
7. Podczas transdukcji inkubować probówki z otwartymi nasadkami i przykryć je sterylną szalką Petriego przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂/95% powietrza.
8. Dodać 500 μl VPM do każdej probówki i umyć komórki, odwirowując je w temperaturze 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Wykonaj jeszcze dwa płukania, co daje w sumie trzy prania. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml VPM.
9. Obliczyć całkowitą objętość wysiewu komórek (200 μl/pseudoislet). Dodaj VPM (obliczona objętość wysiewu komórek minus 2 ml) do stożkowej probówki o odpowiedniej wielkości. Dodaj transdukowaną zawiesinę komórkową z kroku 1.7 do stożkowej probówki. Utrzymuj stożkową rurkę lekko zamkniętą, ale nie szczelnie zamkniętą, aby umożliwić wymianę powietrza dla komórek.
10. Przepłukać probówkę o pojemności 1,5 ml (z kroku 1.7) 1 ml VPM i przenieść zawartość do probówki stożkowej, w którym to momencie probówka stożkowa powinna zawierać całkowitą objętość wysiewu komórek.
11. Dobrze wymieszać zawartość stożkowej probówki, pipetując w górę i w dół za pomocą zmotoryzowanej pipety serologicznej, a następnie przenieść zawartość do sterylnego zbiornika na odczynnik. Jeśli zbiornik nie mieści całej objętości wysiewu komórek, należy wykonać transfery szeregowe i upewnić się, że zawiesina jest dobrze wymieszana na każdym etapie.
12. Za pomocą wielokanałowej pipety P200 odpipetuj zawiesinę komórek w zbiorniku odczynnika 3-4 razy, aby zapewnić jednorodność, a następnie odpipetuj 200 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki płytek mikrodołkowych.
13. Inkubować pseudowysepki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂/95% powietrza przez 6 dni bez zmian pożywki. Do 6 dnia pseudowysepki powinny być w pełni uformowane i gotowe do eksperymentów (Ryc. 1B-D).

2. Przygotowanie do obrazowania żywych komórek i mikroperyfuzji (1 dzień przed eksperymentem)

UWAGA: Informacje na temat przygotowania podłoża do mikroperyfuzji są dostępne w zasobach protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Zebrać pseudowysepki za pomocą pipety wielokanałowej, przenosząc je z płytki 96-dołkowej na sterylną szalkę Petriego. Następnie ręcznie wybierz pseudowysepki i przenieś je na inną sterylną szalkę Petriego zawierającą świeży VPM. Pozostawić pseudowysepki do inkubacji w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂/95% powietrza przez noc.
2. Przygotuj 1 l DMEM, dodając 1 g BSA (test radioimmunologiczny), 0,11 g pirogronianu sodu, 0,58 g L-glutaminy, 3,2 g wodorowęglanu sodu, 1,11 g HEPES i 1 butelkę DMEM do 1 l ultra oczyszczonej wody. Przygotować 1 M roztwór podstawowy glukozy w DMEM. Oba roztwory należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Sprawdź przepływ systemu mikroperyfuzji dzień przed eksperymentem. Podłącz wszystkie rurki do uchwytu na wióry zawierającego pusty mikrochip, jak opisano w Rysunek 2A-B. Wykorzystaj ultra oczyszczoną wodę jako ściek, aby potwierdzić natężenie przepływu 100 μl/min w kolektorze frakcji.

3. Dodanie sekretagogów do DMEM (dzień eksperymentu)

1. Dodać 0,07 mg / ml askorbinianu do DMEM i przygotować sekretagogi w DMEM + bufor askorbinianu, używając 1 M zapasu glukozy dla zawierających glukozę.
   UWAGA: Askorbinian służy do stabilizacji epinefryny poprzez zapobieganie jej utlenianiu. Jeśli epinefryna nie jest stosowana, askorbinian można pominąć w DMEM.
2. Przefiltruj sekretagogi dwukrotnie przez filtr porowy 0,22 μm, za każdym razem używając nowego filtra. Podgrzać roztwory do temperatury 37 °C i zmierzyć poziom glukozy za pomocą glukometru, aby potwierdzić pożądane stężenie.

4. Konfiguracja aparatury do mikroperyfuzji

1. Ogrzać komorę środowiskową konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do 37 °C, upewniając się, że wszystkie drzwiczki są zamknięte, a komora utrzymuje stabilną temperaturę. Umieść uchwyt na wióry zawierający mikroczip w komorze, aby się rozgrzał. Sprawdź temperaturę chipa za pomocą pistoletu na podczerwień.
   UWAGA: W tym przypadku komora środowiskowa jest ustawiona na 38.5 °C, co pozwala na osiągnięcie przez chip 37 °C.
2. Podłącz wszystkie rurki do uchwytu na wióry (zgodnie z opisem w Rysunek 2A-B). Płukanie linią z sekretagogiem linii podstawowej przez 5 minut. W tym badaniu linię przepłukano 2 mM glukozy (G2). Zmieniaj membranę pułapki bąbelkowej odbąbelkowca co 8-10 eksperymentów.

5. Wczytywanie pseudowysepek do mikroprocesora

1. Przed załadowaniem mikroczipa należy wykonać obraz w jasnym i ciemnym polu (10-krotne powiększenie) pseudowysepek, który zostanie wykorzystany w eksperymencie do późniejszej kwantyfikacji odpowiedników wysepek (IEQ).
   UWAGA: IEQ służy do normalizacji wydzielania hormonu do zmian liczby wysp trzustkowych w eksperymentach. Ten krok można również wykonać dzień przed eksperymentem.
2. Odessać nadmiar płynu z dolnej i górnej połowy mikroczipa. Górna połowa mikroczipa zawiera uszczelki, które zapewniają odpowiednie uszczelnienie każdej studzienki, podczas gdy dolna połowa mikroczipa zawiera studzienki z dołączonym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Wstępnie zwilż jedną studzienkę w mikrochipie za pomocą 5 μl DMEM. Upewnij się, że pipetujesz wokół zewnętrznych krawędzi studzienki, aby zwilżyć szczeliny.
3. Użyj wstępnie zwilżonej pipety, aby zebrać 30-32 pseudoislet w objętości 23 μl i powoli dozuj pseudoislet do środka studzienki w dolnej części mikroczipa. Sprawdzić, czy na końcówce pipety nie ma pseudowysp, które mogły być przyczepione.
4. Użyj żelowej końcówki ładującej, aby delikatnie manewrować pseudowysepkami w środku studni. Gwarantuje to, że maksymalna liczba pseudowysepek zostanie uchwycona w polu widzenia.
5. Zrób zdjęcie pseudowysepek w mikrochipie na stereoskopie. Liczba ta zostanie wykorzystana do skorygowania obliczonego IEQ dla wszelkich strat pseudowysp podczas tego procesu.
   1. Jeśli wszystkie pseudowysepki z kroku 5.3 nie są załadowane do mikroprocesora, odpowiednio wyreguluj IEQ. Na przykład, jeśli teraz wizualizowanych jest 30 pseudowysepek, ale 32 zostały zwizualizowane w kroku 5.1, oblicz IEQ na obrazach z kroku 5.1, a następnie pomnóż przez 30/32.
6. Umieść dolną część mikroczipa w uchwycie na mikroczip. Ostrożnie umieść górną część mikroczipa zieloną uszczelką skierowaną w dół.
7. Trzymając mikroczip na miejscu, delikatnie zamknij uchwyt mikroczipa, aby clamp mikroczip razem. Staraj się nie wywierać nadmiernego nacisku na mikroczip podczas tego procesu, ponieważ spowoduje to przemieszczenie płynu zawartego w studni i może doprowadzić do utraty pseudowysp. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do studni.

6. Synchroniczne obrazowanie żywych komórek i mikroperifuzja

1. Przenieś sekretagogi, pompę i mikroczip w uchwycie do komory środowiskowej zamontowanej w mikroskopie konfokalnym. Skierować rurkę wypływającą z komory do kolektora frakcji.
   1. Umieścić w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z otworami wywierconymi w ich nasadkach. Otwory te zapobiegają wydostawaniu się rurki zbiorczej z rurki.
   2. Wkręcając rurkę do odbąbelkowca, oddziel nakrętkę i tulejkę, a następnie wkręć w odbąbelk. Zapobiega to skręcaniu się żyłki.
2. Ustaw kolektor frakcji tak, aby obracał się co 2 minuty. Załaduj odpowiednią liczbę probówek do kolektora frakcji, uwzględniając płukanie i frakcje eksperymentalne. Do tych eksperymentów wykorzystano 15 probówek do płukania (łącznie 30 minut mycia) i 28 probówek do zbierania frakcji.
3. Uruchomić pompę, aby dostarczyć podłoże podstawowe (zawierające wyjściowe stężenie glukozy) z prędkością 100 μl/min (2-minutowy zbiór przy natężeniu przepływu 100 μl/min daje 200 μl ścieków na każdą probówkę frakcji). To natężenie przepływu zostało dobrane tak, aby ograniczyć samo naprężenie wysp rzekomych i zapobiec znacznemu ruchowi wysp rzekomych podczas obrazowania na żywo.
   1. Podczas przepływu płynu przez urządzenie należy zwrócić uwagę na następujące elementy:
      1. Uważaj na kropelki na końcu wylewki kolektora frakcji, które wskazują przepływ przez system.
      2. Zwróć uwagę na zmniejszenie wypływu z systemu; jeśli w probówkach zbiorczych znajduje się <200 μl, oznacza to, że w systemie może być zablokowany lub nieszczelny. W Tabeli 2 znajduje się lista potencjalnych przyczyn zmniejszonej objętości ścieków, roztwory i wskazówki dotyczące zapobiegania.
4. Gdy z rurki wypływowej będzie wypływał stały przepływ medium, obróć głowicę kolektora frakcji, aby dozować do rurek, i uruchom kolektor frakcji. Zbierz pierwsze 15 frakcji (30 min) jako płukanie, aby umożliwić wyrównanie pseudowysepek. Użyj tych pierwszych 15 frakcji, aby zapewnić ciągły i dokładny przepływ medium przez system. Następnie wyrzuć te frakcje.
5. Podczas 30-minutowego mycia należy ustawić mikroskop do obrazowania żywych komórek zgodnie z następującymi parametrami: soczewka obiektywu: U Plan Fluorite 20x z 1-krotnym zoomem; kanały fluorescencyjne: EGFP (emisja = 510 nm, długość fali lasera = 488, długość fali detekcji = 500-600 nm); szeregi czasowe: obraz uzyskiwany co 2 s przez cały eksperyment (tj. 56 min); prędkość próbkowania: 2 μs/piksel.
   1. Zidentyfikuj dolną część pseudowysepek w polu view i ustaw płaszczyznę ogniskowej na 15 μm powyżej tej pozycji. Jest to rama, która będzie używana przez cały czas trwania eksperymentu obrazowego.
6. Po zakończeniu 30-minutowego prania rozpocznij zbieranie frakcji i akwizycję obrazu.
   UWAGA: Przed tym krokiem należy dołożyć wszelkich starań, aby zidentyfikować i naprawić wszelkie problemy. Po rozpoczęciu zbierania danych wszelkie przerwy w eksperymencie lub nadmierna ekspozycja na sekretagogi mogą niekorzystnie wpłynąć na wyniki.
7. Kontynuować peryfuzję wysp rzekomych pożywką podstawową przez czas trwania pierwszego pobrania linii podstawowej, zbierając ścieki do probówek o pojemności 1,5 ml. Ręcznie przełącz rurkę z bufora linii podstawowej na nową rurkę buforową bodźca, gdy czas jest odpowiedni dla eksperymentu.
   1. Standardowa sekwencja mikroperyfuzji jest przedstawiona w tabeli 3.
   2. Po zebraniu ~10 frakcji umieść wszystkie frakcje w lodówce o temperaturze 4 °C do końca eksperymentu, aby zapobiec degradacji hormonów, zwłaszcza glukagonu.
   3. Kontynuuj monitorowanie przepływu systemu przez cały czas trwania eksperymentu, sprawdzając objętość ścieków w każdej rurze.
8. Po zakończeniu eksperymentu przełącz się z powrotem na podłoże podstawowe i pozwól pompie pracować przez 5 minut, aby wypłukać bodziec za pomocą pożywki podstawowej (w tym przypadku 2 mM glukozy).
9. Zatrzymaj pompę i odłącz rurkę uchwytu mikroczipa od odbarwiacza i kolektora frakcji, aby wyjąć uchwyt mikroczipa z komory środowiskowej. Zamknij wszystkie drzwi po wyjęciu mikroczipa, aby utrzymać temperaturę.
10. Przechowywać peryfuzaty w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy hormonalnej.

7. Ekstrakcja etanolu kwasem pseudoislet

1. Ostrożnie otwórz uchwyt na mikroczip i zdejmij górną część mikroczipa. Użyj pipety i mikroskopu stołowego, aby pobrać pseudowysepki ze studzienki i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml. W razie potrzeby należy upewnić się, że zebrano wszystkie pseudowysepki za pomocą mikroskopu laboratoryjnego.
   1. Wykonaj końcowe zdjęcie pseudowysp w mikrochipie przed usunięciem z dołka, aby dostosować IEQ ekstraktu z wysp trzustkowych, podobnie jak w kroku 5.5.
2. Przemyć dwa razy 500 μl PBS. Wirować pseudowysepki przez 1 minutę w temperaturze 94 x g między każdym płukaniem i odessać supernatant.
3. Po wyjęciu ostatniego prania dodać 200 μL kwaśnego etanolu (5,5 ml 95% etanolu + 50 μL 12 N HCl). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Następnego dnia odwirowywać ekstrakty przez 10 minut w temperaturze 15 989 x g i w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność 45 μl do trzech nowych probówek. Przechowywać w temperaturze -80 °C w celu analizy zawartości hormonów. Jako alternatywa dla normalizacji wydzielania hormonu do IEQ, wydzielanie hormonu może być również znormalizowane do zawartości hormonu pseudoislet mierzonej z ekstraktów.

8. Dodatkowe eksperymenty i porządki

1. Powtórz kroki 5-7 z kolejnymi grupami pseudowysepek, aby uzyskać dodatkowe powtórzenia techniczne.
2. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów z mikroperyfuzją, przepuść 10% wybielacz przez mikrochip i rurkę przez 5 minut, a następnie ultra oczyszczoną wodę przez 30 minut, aby zdezynfekować rurkę.

9. Analiza danych

UWAGA: Obrazowanie żywych komórek zostało wykonane przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Obrazy analizowano za pomocą pakietu oprogramowania do obrazowania związanego z mikroskopem. Poniższe wytyczne są ogólnymi, ale mogą się różnić w zależności od producenta mikroskopu i oprogramowania do akwizycji obrazu.

1. Określanie całkowitych ekwiwalentów wysepek (IEQ) dla normalizacji danych
   1. Otwórz program i kliknij kartę Akwizycja w prawym górnym rogu okna. Nagrywanie wsadowe wszystkich obrazów w ciemnym polu polega na wybraniu funkcji Nagranie wsadowe w Menedżerze makr (Wyświetl > narzędziowe Windows > Menedżer makr).
      1. Aby nagrać wiele obrazów jednocześnie, kliknij przycisk Przełącz tryb wsadowy przed kliknięciem przycisku Uruchom w Menedżerze makr. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wybrać lokalizację obrazu źródłowego i lokalizację docelową dla nagranych obrazów. Jako typ pliku obrazu wybierz opcję Tagged Imagine File Format (*.tif).
   2. Aby wykonać pomiar IEQ, otwórz spaloną wersję obrazu 10-krotnego ciemnego pola wykonanego w kroku 5.1. Kliknij kartę Count and Measure (Zliczanie i mierzenie) u góry i wybierz przycisk Manual HSV Threshold (Ręczny próg HSV) po lewej stronie.
      1. Użyj funkcji zakraplacza, aby dodać/usunąć obszar dodatni (na czerwono), aż każda pseudowysepka zostanie podświetlona na czerwono, nie wychodząc poza granicę pseudowysepki. Kliknij Policz i zmierz.
   3. Użyj funkcji automatycznego lub ręcznego podziału, aby podzielić pseudowysepki, które zostały ze sobą połączone.
      1. Aby ręcznie podzielić pseudowysepki, wybierz funkcję ręcznego podziału, kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować linię oddzielającą pseudowysepki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć linię. Aby automatycznie podzielić, wybierz funkcję automatycznego podziału i kliknij zgrupowane pseudowysepki, które Cię interesują. Następnie potwierdź poprawny automatyczny podział.
   4. W przypadku obrazów wypalonych wsadowo podziałka liniowa i tekst powiększenia mogą być oznaczone jako dodatnie. Usuń te obiekty, aby uzyskać dokładne zliczenie, podświetlając tekst i pasek skali za pomocą myszy i naciskając klawiatury Delete.
   5. Włączaj i wyłączaj filtr, aby potwierdzić, że wszystkie pseudowysepki są zliczane. Plik można również otworzyć poza programem w celu tworzenia odniesień. Po zakończeniu kliknij Eksportuj do Excela.
   6. Otwórz arkusz kalkulacyjny i zmodyfikuj go w następujący sposób.
      1. Usuń informacje o liczbie, średniej i sortowaniu u dołu. Sortuj obiekty na podstawie ich średniej średnicy. Wstawić kolumnę po średniej średnicy i nadać jej nazwę "Liczba pseudowysepek".
      2. Liczba wysepek jest określana na podstawie liczby pseudowysepek o średnich średnicach, które mieszczą się w każdym z poniższych wskaźników. Pomnóż liczbę pseudowysepek na indeks przez odpowiedni współczynnik konwersji IEQ i zsumuj te wartości, aby określić całkowity IEQ. Wykonaj obliczenia IEQ na obrazach uzyskanych przed każdym eksperymentem. Użyj następujących indeksów i współczynników konwersji IEQ:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1,685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6,315
         301-350 μm: × 10,352
      3. Aby zapoznać się z przykładowym arkuszem kalkulacyjnym służącym do określania liczby IEQ, zobacz Plik uzupełniający 1.
2. Kwantyfikacja obrazowania żywych komórek w oprogramowaniu
   1. Otwórz żądany plik (.oir) w cellSens.
   2. Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) w następujący sposób.
      1. Użyj narzędzi do rysowania, aby wyznaczyć ROI (tj. każdą pseudowysepkę). Jeśli używasz opcji rysowania odręcznego, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zamknąć kształt.
      2. Podświetl wszystkie ROI, używając strzałki i przeciągając ją, aby objąć wszystkie ROI na obrazie. Po podświetleniu wszystkich ROI kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Konwertuj na dynamiczny zwrot z inwestycji w czasie
      3. Odtwórz plik XYT, aby potwierdzić, że zwrot z inwestycji jest dokładny w czasie. Jeśli zwrot z inwestycji nie jest dokładny w określonym okresie, popraw jego rozmiar/lokalizację w tym okresie. Oprogramowanie będzie stopniowo dostosowywać rozmiar/lokalizację zwrotu z inwestycji, aby dopasować się do tych zmian. Powtarzaj te kroki, aż zwrot z inwestycji będzie dokładny przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania.
   3. Wykonaj pomiary intensywności dla każdego zwrotu z inwestycji w następujący sposób.
      1. Na pasku narzędzi kliknij Zmierz profil intensywności. Podkreśl zwrot z inwestycji do przeanalizowania; użyj shift + kliknij, aby wybrać wiele ROI.
         UWAGA: Chociaż w oprogramowaniu może być otwartych wiele plików jednocześnie, analizuj zwrot z inwestycji tylko z jednego pliku na raz.
      2. Aby uwzględnić szum tła, wybierz stałą wartość, którą chcesz odjąć od każdej wartości intensywności, lub wyznacz jeden zwrot z inwestycji jako tło. Kliknij Wykonaj.
      3. Na pasku narzędzi Profil intensywności kliknij Eksportuj do Excela, aby wyeksportować dane.
      4. Znormalizuj wszystkie punkty danych do średniej intensywności mierzonej od 7 do 8 minut (tj. ostatniej minuty pierwszej peryfuzji ośrodka bazowego). Te znormalizowane wartości w każdym punkcie czasowym są definiowane jako względna intensywność cADDis. Przykładowy arkusz kalkulacyjny przedstawiający analizę i normalizację danych obrazowania znajduje się w Pliku uzupełniającym 2.
3. Zmierz wydzielanie hormonu w każdej frakcji i ekstrakcie z wysp trzustkowych. W tych eksperymentach stężenia insuliny i glukagonu mierzono metodą ELISA. Znormalizować wydzielanie hormonu w każdej frakcji do objętości wysp rzekomych, stosując pomiary IEQ określone w kroku 9.1 lub zawartość hormonu ekstraktu.

Wyniki

Ludzkie pseudowysepki wykazujące ekspresję biosensorów zostały stworzone poprzez dostarczenie adenowirusowe konstruktów kodujących biosensor cAMP cADDis (Rysunek 1A). Rysunek 1B pokazuje reagregację transdukowanych ludzkich komórek wysp trzustkowych w czasie, z w pełni uformowanymi pseudowyspami obserwowanymi po 6 dniach hodowli. Komórki zaczęły wykazywać widoczną fluorescencję cADDis w ciągu 48 godzin, a pod koniec okresu hodowli w transdukowanych komórkach wyst...

Dyskusja

Integracja systemu mikroperyfuzji, pseudowysp trzustkowych z ekspresją biosensorów i laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej pozwala na synchroniczną ocenę wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych i dynamicznych profili wydzielania hormonów. Dynamiczny system mikroperyfuzji może dostarczać szereg dobrze zdefiniowanych bodźców do wysp pseudowyspowych i pozwala na zbieranie ścieków, w których stężenia insuliny i glukagonu można zmierzyć za pomocą dostępnego na rynku testu ELISA. Równocześnie, obrazowanie żywych ko...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AD-CMV-cADDis	Welgen	Nie dotyczy
0,01" Rurki FEP	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Wzbogacony CMRL Składnik mediów
1,5 ml i rurki stożkowe	Dowolne	10
μ m Filtr PTFE	Cole-Parmer	SK-21940-41	Zmieniaj co 8-10
przebiegów 100 mM Pirogronian sodu	Thermo Scientific	11360070	Wzbogacony CMRL Składnik mediów
190 proof Etanol	Decon labs	2816	Kwaśny składnik etanolowy
200 mM Suplement GlutaMAX-I	Gibco	35050061	Wzbogacony CMRL Składnik mediów
Askorbinian	Sigma	A5960	Składnik bufora peryfuzyjnego DMEM
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7888	Składnik bufora peryfuzyjnego DMEM
Pułapka bąbelkowa	Omnifit	006BT
Nośnik komórkowy ULA  96-dołkowe mikropłytki	Perkin Elmer	6055330
cellSens oprogramowanie do analizy	Olympus	v3.1	Oprogramowanie używane do analizy danych
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Wzbogacony CMRL Komponent Adapter
stożkowy (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Składnik buforu glukozy
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Składnik buforowy peryfuzji
Komora środowiskowa	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Składnik buforowy stymulacji
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie	Sigma	12306C	Wzbogacony CMRL Składnik pożywki
Glukagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Zestaw glukagonu HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Dowolny		dowolny składnik kwasu etylowego
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Składnik buforowy peryfuzyjny
iCell Śródbłonek Średni suplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Składnik mediów
Idex Derlin nakrętka i skuwka 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulina ELISA	Mercodia	10-1113-01
Izobutylometylonina (IBMX)	Sigma	I5879	Składnik bufora stymulacji
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Olympus	FV3000
L-glutamina	Sigma	G8540	buforowy do perfuzji DMEM
(Uniwersytet w Miami, FP-3W)	Uniwersytet w Miami	Uchwyt
	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Kolektor frakcji	Biorad	7318122
pipety i końcówki P10, P200 i P1000	Dowolna	dowolna
penicylina/streptomycyna	Gibco	15140-122	Wzbogacony CMRL Składnik podłoża
Pompa perystaltyczna	Instech	P720
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Gibco	14190-144	Wash Islets
Naczynia Sarstedt	Sarstedt	zależy od średnicy
Wodorowęglan sodu	Sigma	S6014	DMEM Składnik buforowy peryfuzyjny
Pirogronian sodu	Sigma	P2256	Komponent bufora peryfuzyjnego DMEM
Stereoskop	Olympus	SZX12
Filtr steriflip (0,22 μ m)	Millipore	SCGP00525	Dwukrotnie filtruj wszystkie
VascuLife VEGF Medium Kompletny zestaw	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component