Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65276

⸱

29 września 2023

 ,  ,  ,  , 
1Larner College of Medicine, University of Vermont, 2College of Engineering and Mathematical Sciences, University of Vermont

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz

.

Streszczenie

Przeszczep płuc jest często jedyną opcją dla pacjentów w późniejszych stadiach ciężkiej choroby płuc, ale jest to ograniczone zarówno ze względu na dostarczanie odpowiednich płuc dawcy, jak i zarówno ostre, jak i przewlekłe odrzucenie przeszczepu. Opracowanie nowatorskich metod bioinżynieryjnych w celu zastąpienia chorych płuc jest niezbędne do poprawy przeżywalności pacjentów i uniknięcia powikłań związanych z obecnymi metodologiami transplantacji. Alternatywne podejście polega na zastosowaniu pozbawionych komórek całych płuc pozbawionych składników komórkowych, które są zwykle przyczyną ostrego i przewlekłego odrzucenia. Ponieważ płuca są tak złożonym narządem, interesujące jest zbadanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej określonych regionów, w tym układu krwionośnego, dróg oddechowych i tkanki pęcherzykowej. Celem tego podejścia jest ustanowienie prostych i powtarzalnych metod, za pomocą których naukowcy mogą preparować i izolować tkankę specyficzną dla regionu z w pełni pozbawionych komórek płuc. Obecny protokół został opracowany dla płuc świń i ludzi, ale może być również stosowany do innych gatunków. W tym protokole określono cztery regiony tkanki: drogi oddechowe, naczynia krwionośne, pęcherzyki płucne i masową tkankę płucną. Procedura ta pozwala na pobranie próbek tkanek, które dokładniej reprezentują zawartość zdecelularizowanej tkanki płucnej w przeciwieństwie do tradycyjnych metod analizy masowej.

Wprowadzenie

Choroby płuc, w tym przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) i mukowiscydoza (CF), obecnie pozostają bez lekarstwa1,2,3,4. Przeszczep płuc jest często jedyną opcją dla pacjentów w późniejszych stadiach, jednak pozostaje to ograniczoną opcją zarówno ze względu na zaopatrzenie w odpowiednie płuca dawcy, jak i zarówno ostre, jak i przewlekłe odrzucenie przeszczepu3,5,6. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii leczenia. Jednym z obiecujących podejść w bioinżynierii układu oddechowego jest zastosowanie rusztowań pochodzenia tkankowego przygotowanych z pozbawionej komórek natywnej tkanki płucnej. Ponieważ bezkomórkowe rusztowania całych płuc zachowują wiele złożoności składu i bioaktywności natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), były intensywnie badane pod kątem inżynierii całego narządu i jako ulepszone modele do badania mechanizmów chorób płuc7,8,9,10. Równolegle rośnie zainteresowanie wykorzystaniem bezkomórkowych tkanek z różnych narządów, w tym płuc, jako hydrożeli i innych substratów do badania interakcji komórka-komórka i komórka-ECM w modelach organoidów i innych kultur tkankowych11,12,13,14,15,16,17. Dostarczają one bardziej odpowiednich modeli niż dostępne na rynku substraty, takie jak Matrigel, pochodzące ze źródeł nowotworowych. Jednak informacje na temat hydrożeli pochodzących z ludzkich płuc są obecnie stosunkowo ograniczone. Wcześniej opisaliśmy hydrożele pochodzące z decelularnych płuc świń i scharakteryzowaliśmy zarówno ich właściwości mechaniczne, jak i materiałowe, a także wykazaliśmy ich użyteczność jako modeli hodowli komórkowych18,19. Niedawny raport szczegółowo opisywał wstępną mechaniczną i lepkosprężystą charakterystykę hydrożeli pochodzących z decelularyzowanych normalnych i chorych (POChP, IPF) ludzkich płuc20. Przedstawiono również wstępne dane charakteryzujące zawartość glikozaminoglikanu w pozbawionych komórek płucach ludzkich normalnych i POChP, a także ich przydatność do badania interakcji komórka-komórka i komórka-ECM11.

Te przykłady ilustrują moc wykorzystania zdecelularyzowanych ludzkich płuc ECM do celów badawczych. Jednak płuco jest złożonym narządem, a zarówno struktura, jak i funkcja różnią się w różnych regionach płuca, w tym skład ECM i inne właściwości, takie jak sztywność21,22. W związku z tym interesujące jest badanie ECM w poszczególnych obszarach płuc, w tym tchawicy i dużych dróg oddechowych, średnich i małych dróg oddechowych oraz pęcherzyków płucnych, a także dużych, średnich i małych naczyń krwionośnych. W tym celu opracowaliśmy niezawodną i powtarzalną metodę preparowania pozbawionych komórek płuc ludzkich i świń, a następnie izolowania każdego z tych obszarów anatomicznych. Pozwoliło to na szczegółową analizę różnicową regionalnej zawartości białka zarówno w normalnych, jak i chorych płucach21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z IACUC Uniwersytetu Vermont (UVM). Wszystkie ludzkie płuca zostały pozyskane z UVM Autopsy Services, a powiązane badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi IRB UVM.

UWAGA: Decelularyzacja płuc świń i ludzi została wcześniej opisana przez naszą grupę7,8,9,10, 21. Krótko mówiąc, całe płaty płuc są decelularyzowane poprzez sekwencyjną perfuzję dróg oddechowych i naczyń krwionośnych serią 2 litrowych roztworów detergentów i enzymów za pomocą pompy perystaltycznej: 0,1% Triton-X 100, 2% deoksycholan sodu, 1 M chlorek sodu, 30 μg/ml DNazy/1,3 mM MgSO4/2 mM CaCl2, 0,1% kwasu nadoctowego/4% etanolu, i płukanie wodą dejonizowaną. Standardowe metody potwierdzania skutecznej decelularyzacji obejmują oznaczanie resztkowego dwuniciowego DNA o stężeniu <50 ng/mg w pozbawionych komórek płucach i brak fragmentów DNA za pomocą elektroforezy żelowej oraz barwienie jądrowe za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E)9,21.

1. Konfiguracja

  1. Przed użyciem zbierz cały niezbędny sprzęt wymagany do przeprowadzenia procedury preparacji, w tym szklane naczynie żaroodporne, dwie pary pęset chirurgicznych, jedną parę kleszczy i jedną parę nożyczek chirurgicznych oraz autoklaw.
  2. Zdobądź fragment płuca, umieść go w szklanym naczyniu żaroodpornym i ustaw tak, aby górny koniec dróg oddechowych był wyraźnie widoczny.
  3. Zidentyfikuj proksymalny koniec układu krwionośnego i utrzymuj go w stanie nienaruszonym do późniejszych kroków. Koniec układu krwionośnego powinien być wyraźnie widoczny i całkowicie nieprzezroczysty w kolorze białym.
  4. Za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych usuń opłucną, która może wyściełać zewnętrzną część płuca i wyrzuć.

2. Odsłanianie dróg oddechowych

  1. Stosując technikę rozprowadzania za pomocą nożyczek chirurgicznych, delikatnie pracuj, aby odsłonić dodatkowe drogi oddechowe.
    1. Zlokalizuj największą drogę oddechową, która zwykle będzie miała średnicę około 2-4 cm. Innym sposobem identyfikacji dróg oddechowych jest obserwacja pierścieni chrzęstnych, które można wykryć wizualnie lub poprzez badanie palpacyjne tkanki.
    2. Za pomocą kleszczy zbadaj palpacyjnie wzdłuż drogi oddechowej, aby określić położenie niewidocznej drogi oddechowej na głębokość około 1 in.
      UWAGA: Wyściełane pierścieniami chrzęstnymi drogi oddechowe są charakterystycznie twardsze niż inne tkanki płucne. W związku z tym znalezienie i badanie palpacyjne niewidocznych dróg oddechowych powinno być stosunkowo proste.
    3. Trzymając nożyczki chirurgiczne równolegle do dróg oddechowych, włóż zamknięte końcówki do tkanki bezpośrednio otaczającej niewidoczne drogi oddechowe.
    4. Powoli otwórz nożyczki chirurgiczne, aby delikatnie rozsunąć otaczającą błonę. Następnie wyjmij nożyczki chirurgiczne i unikaj przecinania jakichkolwiek tkanek.
    5. Powtarzaj ten proces z przerwami przez całą procedurę preparacji, aby kontynuować odsłanianie dróg oddechowych.
  2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć drogi oddechowe w punktach rozgałęzień i niezależnie wyciąć wzdłuż każdej gałęzi.
    UWAGA: Punkt rozgałęzienia to miejsce, w którym jedna droga oddechowa rozdziela się na dwie oddzielne drogi oddechowe.
  3. Odetnij obszary dróg oddechowych, gdy masz pewność, że nienaruszone końce pozostaną możliwe do zidentyfikowania i łatwe do zlokalizowania w celu dalszej sekcji.
  4. Umieść odcięte obszary dróg oddechowych w odpowiedniej rurce. Rozmiar odciętych obszarów będzie się różnił w zależności od próbki, ale generalnie będzie miał od 1 do 5 cm długości. Szerokość różni się w zależności od względnego położenia wzdłuż drzewa dróg oddechowych, przy czym obszary dystalne zachowują mniejszą szerokość niż obszary bardziej proksymalne.

3. Odsłanianie i wycinanie obszarów naczyń krwionośnych

  1. Delikatnie uciskaj naczynia krwionośne i powoli odsuń się od dróg oddechowych. Pozwól, aby naczynia krwionośne lekko się rozciągnęły i użyj nożyczek chirurgicznych, aby jeszcze bardziej oddzielić naczynia krwionośne od dróg oddechowych.
    UWAGA: Zbyt duży nacisk spowoduje rozdarcie układu krwionośnego. Jeśli układ krwionośny pęknie, po prostu umieść tę część układu krwionośnego w odpowiedniej oznakowanej rurce i zidentyfikuj jej nienaruszony koniec.
  2. Kiedy punkt rozgałęzienia w drzewie naczyniowym został odsłonięty, użyj nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby odsłonić bardziej dolne obszary układu krwionośnego.
    1. Zacznij od włożenia zamkniętych końcówek nożyczek chirurgicznych tuż poniżej punktu rozgałęzienia i między dwoma odpowiadającymi im obszarami naczyniowymi.
    2. Powoli otwórz nożyczki, aby rozsunąć leżące pod spodem tkanki.
    3. Z przerwami użyj pęsety, aby usunąć tkankę, która została rozsunięta za pomocą nożyczek chirurgicznych, a także wszelkie inne tkanki bezpośrednio otaczające naczynia krwionośne.
  3. Gdy układ naczyniowy zakrywa obszary dróg oddechowych lub staje się uciążliwy dla któregokolwiek kroku procedury rozwarstwienia, przeciąć naczynia krwionośne w punkcie rozgałęzienia i dalej ciąć wzdłuż dowolnej gałęzi niezależnie.
  4. Odetnij obszary układu krwionośnego, gdy masz pewność, że nienaruszone końce pozostaną możliwe do zidentyfikowania i łatwe do zlokalizowania w celu dalszej sekcji.

4. Identyfikacja i wycinanie tkanki pęcherzykowej

  1. Za pomocą kleszczy lub pęsety uszczypnij, a następnie delikatnie oderwij małe obszary tkanki pęcherzykowej.
    1. Zlokalizuj obszar tkanki, który nie znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie dróg oddechowych lub naczyń krwionośnych.
    2. Za pomocą pęsety uszczypnij niewielki obszar tkanki, który wydaje się być pozbawiony jakichkolwiek naczyń krwionośnych lub dróg oddechowych.
    3. Oderwij ściśnięty obszar tkanki od płuca.
  2. Obserwuj obszar usuniętej tkanki i sprawdź, czy jest to tkanka wyrostka zębodołowego.
    UWAGA: Tkanka wyrostka zębodołowego jest obecna w całym płucu, więc może i powinna być usuwana podczas procedury preparacji. Każda tkanka, której nie można łatwo zidentyfikować jako głównie pęcherzyki płucne, naczynia krwionośne lub drogi oddechowe, powinna zostać sklasyfikowana jako tkanka masowa i umieszczona w odpowiedniej oznakowanej probówce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Po opanowaniu techniki regionalna sekcja zdecelularyzowanej tkanki płuc jest łatwo powtarzalna. Kluczowe dla powodzenia procedury sekcji jest prawidłowe określenie kategorii każdego wyciętego fragmentu tkanki. Tkanka naczyniowa jest znacznie bardziej elastyczna niż drogi oddechowe, dlatego użycie pęsety do rozciągnięcia tkanki często stanowi silny wskaźnik tego, czy dana próbka jest naczyniem czy drogą oddechową. Zazwyczaj tkanka naczyniow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pozbawione komórek tkanki pochodzące od ludzi i innych gatunków są często wykorzystywane jako biomateriały do badania składu ECM, a także interakcji komórka-ECM w modelach hodowli ex vivo, w tym hydrożelach 3D12,13. Podobnie jak inne narządy, pozbawione komórek płuca były wcześniej wykorzystywane do określania różnic w składzie ECM w zdrowych i chorych (tj. rozedma płuc i IPF) i są coraz częściej wykorzystywane jako hydrożele do badania dynamiki ECM i in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują służbom autopsyjnym UVM za pobranie ludzkich płuc oraz dr Robertowi Pouliotowi za wkład w ogólne techniki sekcji. Badania te były wspierane przez R01 HL127144-01 (DJW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bonn NożyczkiNarzędzia do nauki14184-09
Dumont #5 - Kleszcze do drobnych narzędzinaukowych11254-02
Kleszcze, zakrzywione, S/S,, ząbkowane - 130mmCellPathN/A
Hartowane drobne nożyczkiNarzędzia do nauki14090-11
Kleszcze Moria IrisNarzędzia do nauki pięknej11373-22
Naczynie żaroodporne ze szkła pyrexCole-Parmer3175-10

Bibliografia

  1. López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
  2. Raherison, C., Girodet, P. -O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
  3. Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
  4. Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
  5. DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252(2021).
  6. Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
  7. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  8. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  9. Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
  10. Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
  11. Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
  12. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  13. Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658(2019).
  14. Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
  15. Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
  16. Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888(2022).
  17. Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
  18. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  19. Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
  20. de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
  21. Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960(2023).
  22. Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja p ucaizolacja specyficzna dla regionumacierz zewn trzkom rkowadisekcja dr g oddechowychizolacja naczy krwiono nychtkanka p cherzykowain ynieria tkankowaanaliza proteomicznamodel ludzkiego p uca

Powiązane artykuły