Artykuł metodologiczny

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65280

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Bath

W tym artykule

Podsumowanie

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Streszczenie

Rozmnażanie płciowe u roślin kwitnących wymaga początkowej interakcji między ziarnem pyłku a powierzchnią stygmatyczną, gdzie nawiązywany jest molekularny dialog między oddziałującymi partnerami. Badania na wielu gatunkach wykazały, że szereg molekularnych punktów kontrolnych reguluje interakcję pyłek i znamię, aby zapewnić, że tylko zgodny, ogólnie wewnątrzgatunkowy pyłek jest skuteczny w zapłodnieniu. U gatunków, które posiadają "suche znamię", takich jak roślina modelowa Arabidopsis thaliana, pierwszym punktem kontrolnym zgodności prezygotycznej po zapyleniu jest ustalenie uwodnienia pyłku.

Ta faza zapylania jest ściśle regulowana, dzięki czemu sygnały z ziarna pyłku wywołują uwolnienie wody ze znamienia, umożliwiając w ten sposób nawodnienie pyłku. Możliwość dokładnego pomiaru i śledzenia uwodnienia pyłku w czasie jest kluczem do projektowania eksperymentów mających na celu zrozumienie regulacji tego krytycznego etapu reprodukcji. Opublikowane protokoły często wykorzystują kwiaty, które zostały wycięte z rośliny rodzicielskiej, utrzymywane na pożywkach płynnych lub stałych i zapylane luzem.

Ten artykuł opisuje nieinwazyjny test biologiczny in vivo, który pozwala na śledzenie nawodnienia poszczególnych ziaren pyłku A. thaliana minuta po minucie w wysokiej rozdzielczości. Test jest wysoce powtarzalny, jest w stanie wykryć bardzo subtelne zmiany profili uwodnienia pyłku, a zatem nadaje się do analizy mutantów, które wpływają na szlaki regulujące zapylanie. Chociaż protokół jest dłuższy niż te opisane dla zapylania masowego, precyzja i powtarzalność, które zapewnia, wraz z jego naturą in vivo, sprawiają, że idealnie nadaje się do szczegółowej analizy fenotypów zapylania.

Wprowadzenie

Skuteczna reprodukcja płciowa u roślin okrytoenasiennych opiera się zazwyczaj na przeniesieniu wewnątrzgatunkowych ziaren pyłku z pręcika na znamię słupka, albo w obrębie jednego osobnika, albo między osobnikami (tj. zapylanie). Przeniesienie ziaren pyłku do receptywnego kwiatu jest zazwyczaj zapośredniczone przez zapylacze lub czynniki abiotyczne; w związku z tym w warunkach naturalnych często prowadzi to również do osadzania się pyłku heterospecyficznego. Z kilkoma wyjątkami, przebieg zapylania pyłkiem heterospecyficznym jest niekorzystny ewolucyjnie, co obniża dostosowanie reprodukcyjne poprzez utratę okazji do kopulacji, a większość powstałych potomstw hybrydowych albo nie rozwija się prawidłowo, albo jest sterylna1. W związku z tym wyewoluowały mechanizmy blokujące zapylanie przez „niekompatybilny” pyłek heterospecyficzny2. Szybkie rozpoznanie kompatybilnego pyłku jest zatem prawdopodobnie najważniejszym procesem we wczesnych etapach reprodukcji płciowej u wielu roślin kwitnących.

W rodzinie Brassicaceae, w której zniewody są typu „suchego”, seria punktów kontrolnych na poziomie molekularnym działa na wielu etapach procesu reprodukcyjnego, regulując zapylanie w taki sposób, aby sukces odrodził tylko kompatybilny pyłek. Hydratacja pyłku jest jednym z najważniejszych punktów kontrolnych (Rycina 1), ponieważ pyłek, który nie ulegnie hydratacji, nie może przejść do etapu produkcji rurki pyłkowej, a w konsekwencji dostarczyć plemników do gametofitu żeńskiego. Często ziarna niekompatybilne nie przechodzą tego pierwszego punktu kontrolnego zapylania i w związku z tym nie uzyskują dostępu do wody zniewodowej3. Wśród przedstawicieli rodziny Brassicaceae rozpoznawanie pyłku następuje szybko, a kompatybilność zostaje ustalona w ciągu kilku minut od przyczepienia ziarna pyłku do słupka4,5. W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy i zaczynamy rozumieć mechanizmy molekularne regulujące kluczowe punkty kontrolne zapylania.

figure-introduction-1
Rycina 1: Przegląd kluczowych zdarzeń podczas kompatybilnego zapylania. Etapy te, takie jak hydratacja pyłku i kiełkowanie rurki pyłkowej, stanowią również tzw. „punkty kontrolne” zapylania, które muszą zostać pomyślnie przejść, aby doszło do kompatybilnego zapylenia. Schemat przedstawia znamię typu „suchego”, charakterystyczne dla gatunków z rodziny Brassicaceae2,20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pionierskie badania nad systemem samoniezgodności (SI) u Brassica, w którym pyłek „własny” jest rozpoznawany i odrzucany, ustanowiły paradygmat rozpoznawania pyłku przez znamię w rodzinie Brassicaceae6,7,8,9,10. SI u Brassica i gatunków pokrewnych jest pośredniczone przez białka „rozpoznawania” znajdujące się na powierzchni pyłku oraz w błonie plazmatycznej znamienia, których oddziaływanie prowadzi do odrzucenia pyłku. Odrzucenie pyłku w procesie SI odbywa się poprzez zakłócenie podstawowego systemu kompatybilności pyłek-znamię, który po pełnej aktywacji w wyniku percepcji kompatybilnego pyłku prowadzi do ukierunkowanej sekrecji przez znamię, napędzając tym samym hydratację pyłku (przeglądy mechanizmu kompatybilności pyłku znajdują się w1,12). W przypadku SI ligand niesiony przez pyłek jest małym białkiem bogatym w cysteinę, S-locus cysteine rich (SCR/SP1), a receptorem znamienia jest kinaza receptorowa locus S (SRK).

Niedawno w Arabidopsis thaliana odkryto, że kolejna grupa małych, bogatych w cysteinę białek przenoszonych przez pyłek, białka powłoki pyłkowej klasy B (AtPCP-Bs), są ważnymi regulatorami akceptacji pyłku poprzez aktywację hydratacji pyłku13. Opisano również receptory stygmatyczne dla AtPCP-Bs oraz aspekty downstream ścieżki regulacyjnej14,15. Co ciekawe, badania mutacyjne genów kodujących potencjalne mediatorzy sygnalizacji przenoszone przez pyłek i stygmatyczne w procesie hydratacji pyłku (w tym AtPCP-Bs) nie doprowadziły do uzyskania roślin z całkowitą blokadą punktu kontrolnego hydratacji pyłku. Sugeruje to silnie, że w regulacji hydratacji pyłku rolę odgrywa wiele innych, jeszcze nieodkrytych czynników. Opierając się na metodzie opisanej po raz pierwszy przez Wang i wsp.13, opisujemy tutaj ulepszony bioassay in vivo o wysokiej rozdzielczości, odpowiedni do identyfikacji subtelnych defektów hydratacji pyłku w kandydowanych liniach mutantów A. thaliana.

Protokół

1. Wzrost roślin i przygotowanie kwiatów

  1. Stratyfikuj nasiona A. thaliana w 0,1% agarozie lub sterylnej wodzie przez 3 dni w temperaturze 4 °C lub jako suche nasiona przez 16-24 h w temperaturze -20 °C (uNASC, komunikacja osobista).
  2. Przenieś stratyfikowane nasiona do doniczek z kompostem i umieść w komorze wzrostowej z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi. Hoduj rośliny przy fotoperiodzie 16:8 h (światło:ciemność) zapewnionym przez lampy fluorescencyjne (130 µmol m-2 s-1). Utrzymuj temperaturę 21 ± 2 °C przy względnej wilgotności powietrza około 40%.
  3. Upewnij się, że rośliny dawcy i biorcy pyłku, wraz z innymi odpowiednimi liniami roślin „kontrolnymi”, są wysiewane jednocześnie, aby zapewnić synchroniczne kwitnienie. Hoduj rośliny przez około 6 tygodni, aż kwiatostany zostaną dobrze rozwinięte.
  4. Wybierz pąki kwiatowe w stadium 12 u rośliny biorcy pyłku na 1 dzień przed przeprowadzeniem bioanalizy w celu przeprowadzenia ewmaskulacji16,17 — są to nieotwarte pąki kwiatowe, które zakończą otwieranie się kwiatu i dehiscencję pręcików następnego dnia18.
    UWAGA: Unikaj trzech pierwszych kwiatów wytworzonych na głównym kwiatostanie, ponieważ zazwyczaj wykazują one nietypowe zachowanie rozrodcze. Jeśli są dostępne i odpowiednie do badania, użyj linii rośliny męsko sterilej, takiej jak linia pA9-barnase A. thaliana (ekotyp Col-0), w której pręciki nie dojrzewają19.
  5. Aby przeprowadzić ewmaskulację kwiatów biorcy pyłku, połóż roślinę wraz z doniczką na boku. Przymocuj taśmą łodygę rośliny, w obszarze blisko kwiatów przeznaczonych do ewmaskulacji, do szkiełka przedmiotowego umieszczonego pod stereomikroskopem sekcyjnym.
  6. Za pomocą pęsety z cienkimi końcami ostrożnie rozchyl pąk kwiatowy i usuń wszystkie płatki oraz pręciki. Upewnij się, że słupek nie został uszkodzony, a znamię słupka jest wolne od zanieczyszczeń pyłkiem.
    UWAGA: Linie roślin męsko sterilej nie wymagają ewmaskulacji.
  7. Przenieś rośliny z powrotem do komory wzrostowej i upewnij się, że ewmaskulowane kwiaty nie mają kontaktu z innymi roślinami ani obcymi przedmiotami.

2. Test nawilżania pyłku – pozyskiwanie surowych danych

  1. Następnego ranka wyjmij rośliny z komory wzrostowej. Połóż roślinę biorącą pyłek na boku i umieść kwiat na stole mikroskopu odwróconego (Rysunek 2) w taki sposób, aby można było wyraźnie zobrazować znamię słupka.
  2. Ustabilizuj pozycję obrazowanego kwiatu, unieruchamiając łodygę na szkiełku podstawnym za pomocą pasków taśmy maskującej. Utrzymuj temperaturę między 18 °C a 25 °C oraz wilgotność względną poniżej 60%.
    UWAGA: W przypadku linii roślin męsko sterilnych pA9-barnase optymalnie jest przeprowadzić badanie rano, gdy kwiaty się otwierają, a płatki nie ograniczają pola widzenia.
  3. Następnie pobierz zdrowy i świeżo rozwinięty kwiat z rośliny dawcy pyłku. Umieść go pod mikroskopem sekcyjnym i zbierz kilka ziaren pyłku na końcówce czystej pęsety precyzyjnej, delikatnie dotykając pręcików (Rysunek 3A). Skutecznym narzędziem do zbierania i przenoszenia pyłku jest również rzęsa przyklejona do krótkiego pręta (Rysunek 3C).
  4. Usuń nadmiar pyłku z pęsety, lekko dotykając jej o płatki kwiatów, z których pobrano ziarna pyłku, aż do uzyskania monowarstwy ziaren pyłku na końcówce pęsety.
    UWAGA: Monowarstwa ziaren pyłku na końcówce pęsety precyzyjnej znacząco ułatwi transfer pojedynczego ziarna w kolejnych krokach. Tą techniką można również uzyskać pojedyncze ziarno pyłku na pęsecie (Wideo uzupełniające S1).
  5. Wróć do rośliny biorącej pyłek i za pomocą obiektywu o małej powiększeniu (np. obiektyw 10x; Rysunek 3B) ustaw ostrość mikroskopu odwróconego na znamię słupka, które ma zostać zapylone.
  6. Trzymając pęsetę wzdłuż otworu między ramionami (Rysunek 4), ostrożnie zbliż się do niezapylonej („dziewiczej”) komórki papilli znamienia.
    UWAGA: Ustaliliśmy, że taki sposób trzymania pęsety poprawia zręczność i zmniejsza wpływ drżenia rąk. Użytkownicy mniej doświadczeni lub mający trudności z precyzyjnym aplikowaniem pojedynczego ziarna pyłku ręcznie mogą skorzystać z mikromanipulatora.
  7. Wybierz na pęsecie odpowiednio ustawione ziarno pyłku do przeniesienia na znamię. Kontynuuj zbliżanie się do niezapylonej komórki papilli znamienia, aż wybrane ziarno pyłku lekko zetknie się z jej powierzchnią. Powoli wycofaj pęsetę i potwierdź przyczepienie pyłku (Rysunek 5).
    UWAGA: Wideo uzupełniające S1 oraz Wideo uzupełniające S2 demonstrują ten krok w przypadku obecności zarówno pojedynczych, jak i wielu ziaren pyłku na pęsecie.
  8. Upewnij się, że ziarno pyłku jest zorientowane tak, aby jego oś równikowa była wyraźnie widoczna i znajdowała się w ostrym focusie. Natychmiast przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (np. 20x) i wykonaj zdjęcie ziarna pyłku. To pierwsze zdjęcie stanowi punkt T = 0. Kontynuuj wykonywanie kolejnych zdjęć w odstępach 1 min przez łącznie 10 min.
  9. Koryguj ostrość w razie potrzeby, aby dostosować ją do niewielkich ruchów ziarna pyłku lub znamienia. Co 2 min zapisuj temperaturę otoczenia i wilgotność względną w pomieszczeniu, aby umożliwić późniejsze porównania między powtórzeniami eksperymentalnymi.
  10. Po wykonaniu wszystkich zdjęć zapisz je w formacie bezstratnym, takim jak autorski format producenta lub TIFF.
    UWAGA: Dla każdego pobranego ziarna pyłku powstanie 1 obrazów (Rysunek uzupełniający S1). Automatyczne lub ręczne ustawienia akwizycji timelapse w większości autorskich programów do obrazowania są przydatnymi funkcjami ułatwiającymi organizację każdej serii czasowej.
  11. Powtórz kroki od 2.4 do 2.9 dla kolejnych ziaren pyłku. Pozyskaj dane dla zbliżonej liczby zapyleń kontrolnych (typ dziki [WT]) i eksperymentalnych.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Konfiguracja aparatury wykorzystana w bioanalizie hydratacji pyłku. W tym przykładzie rośliną biorcą pyłku była linia męsko sterylna pA9-barnase. Roślina wraz z doniczką została ułożona na boku, a łodyga przymocowana taśmą do szkiełka przedmiotowego umieszczonego na stoliku mikroskopu. Aby zmniejszyć stres mechaniczny i ułatwić pozycjonowanie rośliny, do podparcia doniczki zastosowano regulowaną platformę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Pobieranie ziaren pyłku z kwiatu-donora pyłku. Zdjęcia przedstawiają użycie (A) pęsety z cienkimi końcówkami oraz (C) fragmentu rzęsy. Agregaty pyłku (czerwona strzałka) należy usuwać, delikatnie dotykając ich płatków kwiatów donora, aż do uzyskania monowarstwy ziaren pyłku (zielona strzałka). (B>) Obraz o wysokiej rozdzielczości znamienia niezapylonej linii męskiej sterylnej A. thaliana (Col-0) pA9-barnase, która osiągnęła odpowiedni stopień rozwoju do przeprowadzenia bioanalizy hydratacji pyłku. Pasek skali = 10 µm (B>). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Metoda trzymania pęsety podczas przenoszenia pyłku na zniewiecie odbiorcy. (A) Nieprawidłowa orientacja trzymania pęsety; (B) prawidłowa orientacja trzymania pęsety. Trzymanie pęsety bokiem w tej konfiguracji, co wskazuje położenie kciuka pomiędzy ramionami pęsety, zapewnia większą stabilność, co ułatwia przeniesienie ziaren pyłku na niezapylone brodawki zniewiecia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku z końcówki pęsety na niezapylone („dziewiczą”) komórkę papilli stygmatycznej rośliny męsko sterilej pA9-barnase. (A) Ostrożne zbliżanie się do komórki papilli. (B) Przytwierdzenie odpowiednio ustawionego ziarna pyłku (niebieska strzałka) do komórki papilli (pomarańczowa strzałka). (C) Wycofanie pęsety i wizualne potwierdzenie przytwierdzenia pyłku (fioletowa strzałka). Panele A-C zostały wykonane za pomocą obiektywu 10x (odległość robocza 10,5 mm; apertura numeryczna 0,25) i stanowią klatki pochodzące z klipu wideo przedstawionego w Supplementary Video S1. (D) Przejście na obiektyw 20x (odległość robocza 2,1 mm; apertura numeryczna 0,5) w celu rozpoczęcia rejestracji obrazów w serii czasowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Pomiary w teście hydratacji pyłku

  1. Zdefiniuj tempo hydratacji pyłku jako zmianę długości półosi mniejszej (Rysunek 6) ziarna pyłku (tj. promienia równikowego) w czasie i przedstaw ją jako zmianę procentową (równanie [1]):
    figure-protocol-5 (1)
  2. Używając oprogramowania do analizy obrazu, zarejestruj wartości półosi mniejszej dla każdego ziarna pyłku w serii eksperymentalnej.
    UWAGA: Nazwa tej opcji pomiaru zależy od oprogramowania, np. „Rotated Ellipse” lub „5-point ellipse”.
  3. Powtórz kroki 3.1-3.2 dla wszystkich pozostałych ziaren pyłku przeznaczonych do pomiaru. Dla zachowania spójności zastosuj ten sam stopień cyfrowego powiększenia oraz to samo podejście do definiowania „granicy pyłku” dla wszystkich pomiarów w zestawach danych.
  4. Po zakończeniu wszystkich pomiarów dla serii czasowej wyeksportuj surowe wartości półosi mniejszej z każdego stosu obrazów do arkusza kalkulacyjnego i przedstaw dane w kolumnach przypisanych do każdego stosu obrazów. Upewnij się, że w analizie dla każdej linii rośliny uwzględniono dane z co najmniej 15 hydratowanych ziaren pyłku (Tabela uzupełniająca S1).
  5. Nie jest niezwykłe, aby niewielka liczba ziaren pyłku nie uległa hydratacji lub hydratowała znacznie wolniej niż oczekiwano. Takie „wadliwe” ziarna mogą być wynikiem słabego kontaktu między ziarnem a komórką papilli lub być związane z żywotnością pyłku. Zidentyfikuj i wyklucz je z zestawu danych, chyba że są one wymagane w projekcie eksperymentalnym.
  6. Oblicz wartości średnie dla każdego punktu czasowego dla danej linii rośliny. Do analizy statystycznej danych o hydratacji linii WT i mutantów w każdym punkcie czasowym zastosuj nieparzyste testy t oraz jednoczynnikową analizę ANOVA. Użyj wielokrotnego testu t do jednoczesnego porównania średnich między liniami WT i mutantami w wielu punktach czasowych.
    UWAGA: Wykresy XY są również bardzo użyteczne do wizualizacji ogólnego trendu hydratacji pyłku pomiędzy porównywanymi liniami roślin.

figure-protocol-6
Rycina 6: Ziarno pyłku WT nawadniające się na komórce papilli stygmatu A. thaliana (Col-0; linia męsko sterylna pA9-barnase). (A) Punkt czasowy zero, 0 (0 MAP) oraz (B) 10 MAP. Czerwone koło wokół ziarna pyłku to „granica pyłku” zdefiniowana i narysowana przez operatora przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Zielone i ciemnoczerwone linie wewnątrz pyłku reprezentują odpowiednio oś półmajor i oś półminor. Długość osi półminor jest wykorzystywana do obliczenia stopnia nawodnienia pyłku. Pełną serię czasową tego zbioru danych można znaleźć w Rycinnie uzupełniającej S1. Obraz wykonano za pomocą obiektywu 20x (odległość robocza 2,1 mm; apertura numeryczna 0,5). Paski skali = 50 µm. Skrót: MAP = minuty po zapyleniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono dwa zestawy przykładowych danych dotyczących hydratacji pyłku A. thaliana, zebranych zgodnie z powyższym opisem. Pierwszy zestaw danych składa się z trzech powtórzeń serii czasowej hydratacji pyłku dla roślin WT, przy czym każde powtórzenie zostało wykonane w inny dzień. Każde powtórzenie zawiera co najmniej 18 pomiarów dla poszczególnych ziaren pyłku, co łącznie daje 5 ziaren pyłku we wszystkich trzech powtórzeniach. Wartości minimalne i maksymalne dla średnich między powtórzeniami, dla wszystkich punktów czasowych, mieściły się w granicach 3% (Rysunek 7 oraz Tabela uzupełniająca S1). Te reprezentatywne dane dla zapylenia WT wyraźnie wykazują wysoki stopień spójności, jaki można uzyskać stosując szczegółowo opisaną tutaj metodologię dla stosunkowo niskiej liczby próbek oraz w różnych dniach.

figure-results-1
Rycina 7: Wykres XY wykazujący spójność profili nawodnienia pyłku typu dzikiego A. thaliana w okresie 10 min. Jako rodzic męski wykorzystano ekotyp Col-0 A. thaliana, a jako rodzic żeński linię męsko sterile pA9-barnase A. thaliana (Col-0). Dane reprezentują trzy niezależne zbiory danych zebrane w różne dni i wykazują wysoki stopień spójności. Diagram pudełkowy z wąsami oraz analiza statystyczna średnich dla tych zbiorów danych przedstawione są na Rycini Pomocniczej S2. Liczba zmierzonych ziaren pyłku ('n') dla każdego niezależnego zbioru danych jest wyświetlana obok oznaczenia (WT1/WT2/WT3) na rysunku. Skrót: WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Drugi zestaw danych uzyskano dla linii roślinnej posiadającej insercję T-DNA w genie kodującym białko osłonki pyłku, co wygenerowało mutację typu „knockdown”, zwaną tutaj „mutantem KD”. Pyłek mutantów naniesiono na pręcikowo sterylne znamiona pA9-barnase w celu profilowania nawodnienia, zgodnie z opisem w protokole. Jak wynika z uzyskanych danych (Rysunek 8), pyłek mutantów i WT wykazywał nieodróżnialne profile nawodnienia w ciągu pierwszych 5 min. Jednak 5–10 min po zapyleniu (MAP) średnia zmiana półosi mniejszej dla pyłku mutantów zaczęła odstawać od wartości dla pyłku WT, a różnica ta stała się statystycznie istotna w 10 MAP. Wynik ten nie tylko dowodzi, że to białko osłonki pyłku odgrywa rolę w pośredniczeniu w nawodnieniu pyłku, ale także dobrze ilustruje użyteczność tego wysokorozdzielczego bioanalizy pojedynczych ziaren w śledzeniu nawodnienia pyłku. W tym konkretnym przykładzie jej czułość pozwoliła wykryć subtelny efekt „wyciszenia” genu kodującego białko osłonki pyłku.

figure-results-2
Rycina 8: Profiley nawodnienia pyłku dla typu dzikiego (WT) oraz linii mutanta z obniżoną ekspresją białek otoczki pyłkowej (mutant KD). (A) Profile nawodnienia w odstępie 10 min dla pyłku WT i mutantów. Rodzicielami pyłku były ekotyp Col-0 A. thaliana oraz mutant KD z obniżoną ekspresją białek otoczki pyłkowej (również w tle Col-0). W obu przypadkach rodzicielem słupka była męsko sterylna linia A. thaliana (Col-0) pA9-barnase. (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające stopień nawodnienia pyłku (wyrażony jako procentowa zmiana półosi mniejszej) w 5 MAP i 10 MAP dla zestawów danych pyłku WT i mutantów. Wąsy reprezentują minimalne i maksymalne wartości próbki. Pudełka przedstawiają dolny kwartyl, medianę i górny kwartyl zestawu danych. Białe krzyżyki reprezentują średnią z zestawu danych. Analiza nieparametrycznym testem t Student wykazuje, że średni procent nawodnienia pyłku różni się istotnie między dwiema liniami roślin w 10 MAP. Jeden asterysk oznacza p < 0,05 (nieparametryczny test t). Skróty: WT = wild type (typ dziki); KD = knockdown (obniżona ekspresja); MAP = min-after-pollination (minuty po zapyleniu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca S1: Przecięta seria czasowa bioanalizy hydratacji pyłku, przedstawiająca ziarno pyłku WT hydratujące na komórce papilli stygmatycznej rośliny męsko sterile pA9-barnase w ciągu 10 min. Obrazy wykonano w odstępach 1 min. Obrazy z 0 MAP i 10 MAP zostały wykorzystane w Rycini 6 (dołączonej oddzielnie). Pasek skali = 50 µm. Skróty: WT = typ dziki; MAP = minuty po zapyleniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2: Wykres pudełkowy przedstawiający stopień hydratacji pyłku (wyrażony jako procentowa zmiana półosi mniejszej) w okresie 10 minut dla trzech zestawów danych pyłku WT opisanych w Rycina 7. Rodzicem żeńskim był męsko sterylny pA9-barnase. A. thaliana linia (Col-0). Wąsy reprezentują wartości minimalne i maksymalne próbek. Pudełka przedstawiają dolny kwartyl (dolny zawias), medianę (środkowy zawias) oraz górny kwartyl (górny zawias) zbioru danych. Przedstawiono poszczególne punkty danych. Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazuje, że średnie wartości procentowego nawodnienia pyłku pomiędzy trzema zbiorami danych nie różniły się statystycznie znacząco w ciągu 10-minutowego okresu czasu. Próg istotności wynosi p < 0,05 (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA). Skrót: WT = typ dziki. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Surowe dane dotyczące hydratacji pyłku wykorzystane do przygotowania Rysunku 7 (pyłek A. thaliana WT Col-0 na znamieniu męsko sterile pA9-barnase). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać plik.

Wideo uzupełniające S1: Film demonstrujący przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku WT (eksplikata Col-0) za pomocą pęsety na „dziewiczą” komórkę papilli znamienia (linia męsko sterylna pA9-barnase). Aby ułatwić dostęp do filmu, celowo obniżono jakość obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające S2: Film demonstrujący przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku WT (eksplozywna linia Col-0) z monowarstwy ziaren pyłku znajdującej się na końcówce pęsety do „dziewiczej” komórki papilla prętnika (linia męsko sterylna pA9-barnase). Aby ułatwić dostęp do filmu, celowo obniżono jakość obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W przypadku roślin kwitnących bardzo wczesne etapy rozmnażania płciowego są prawdopodobnie najważniejsze. Na poziomie interakcji pyłek – znamię podejmowane są decyzje molekularne, które określają "zgodność" oddziałujących partnerów. Takie decyzje, jeśli są podejmowane prawidłowo, pozwalają uniknąć marnotrawstwa zasobów, które mogłyby mieć wpływ na sprawność reprodukcyjną21. Tak więc, pozwolenie tylko zgodnemu pyłkowi na zapłodnienie jest jednym z ważnych elementów utrzymania dobrze przystosowanych genotypów, a tym samym ewolucyjnego sukcesu gatunków. Badania przeprowadzone na roślinie modelowej A. thaliana były niezwykle cenne dla pogłębienia naszego zrozumienia tego procesu. Szereg badań przeprowadzonych w ciągu ostatnich kilku dekad ujawniło obecność czynników w okrywie pyłkowej, które działają w pierwszym "punkcie kontrolnym" zgodności, w którym pyłek uzyskuje dostęp do wody stygmatycznej, aby umożliwić nawodnienie pyłku13. Pomimo tych pierwszych spostrzeżeń na temat mechanizmów regulujących zgodność znamion pyłku, nadal istnieje wiele luk w naszym zrozumieniu tego procesu. Do tej pory żadne mutanty ligandów przenoszonych przez pyłek ani receptorów stygmatycznych wpływających na uwodnienie pyłku nie mogą całkowicie zablokować kompatybilnego zapylenia, co sugeruje obecność innych nieodkrytych determinantów uwodnienia pyłku. Dzięki możliwości łatwej obserwacji interesującego nas fenotypu, opisany tutaj test biologiczny uwodnienia pyłku jest jedną z najprostszych technik badania potencjalnych mutantów regulujących zapylanie.

Istniejące metodologie pomiaru nawodnienia pyłku często wykorzystują zapylenia masowe i podają mniej punktów czasowych 14,22,23, a zatem mogą pomijać ważne subtelne fenotypy profilu nawodnienia. Na przykład badanie przeprowadzone przez Wang i wsp.13, wraz z pracami nad innymi mutantami białek płaszcza pyłkowego w naszym laboratorium (niepublikowane obserwacje), ujawniło intrygujące różnice w profilach nawodnienia między mutantami. Takie subtelne różnice mogą stanowić ważne wskazówki dotyczące mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw zgodnego zapylania.

Opisana tutaj metoda koncentruje się na pozyskiwaniu stosunkowo niewielkiej liczby pomiarów między liniami roślin ze mutantami a WT, z naciskiem na precyzję metodologiczną w celu zmniejszenia zmienności w zbiorach danych. Chociaż metoda ta jest wysoce powtarzalna (jak pokazano na rysunku 7), zakładając, że temperatura i wilgotność są odpowiednio kontrolowane, ważne jest zebranie danych dotyczących nawodnienia dla prawie równej liczby WT i zmutowanego pyłku w tym samym dniu, aby jeszcze bardziej zmniejszyć potencjał zmienności. W razie potrzeby dane można następnie łączyć z różnych dni. Ponadto wybór odpowiednich roślin kontrolnych WT ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników nawodnienia. W przypadku biorcy pyłku ta sama linia roślin powinna być używana do otrzymywania zarówno ziaren pyłku WT, jak i zmutowanych.

Na przykład, używamy męskiej sterylnej linii roślinnej pA9-barnazy, która jest również przedstawiona w protokole wideo, jako biorcy pyłku zarówno dla WT (kontrolnego), jak i zmutowanego (eksperymentalnego) pyłku podczas badania zmutowanych linii pyłku T-DNA (takich jak mutant "KD" opisany na rycinie 8). Należy unikać mieszania danych z takiej męskiej sterylnej linii, które nie muszą być wykastrowane, z danymi zebranymi z ręcznie wykastrowanej linii kontrolnej, ponieważ te stygmaty prawdopodobnie będą zachowywać się inaczej. Podobnie, wykastrowane linie mutantów powinny być używane w połączeniu z wykastrowaną linią WT (kontrolną), gdy tylko jest to możliwe. Taką samą ostrożność należy zachować również przy rozważaniu tła genetycznego badanych roślin. Podczas gdy najpopularniejsze kolekcje mutantów T-DNA zostały wygenerowane na tle Col-0, inne, takie jak kolekcja FLAG z Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), są dostępne w tle genetycznym Wassilewskija (WS)24,25. W takich przypadkach zaleca się użycie linii instalacji WT danego ekotypu jako elementów sterujących.

Chociaż tutaj skupiliśmy się na uwodnieniu pyłku w ciągu pierwszych 10 minut interakcji pyłek i znamię, metodę tę można również dostosować do profili nawodnienia, które obejmują dłuższy okres czasu. Kluczową cechą protokołu jest to, że kwiaty pozostają przyczepione do rośliny macierzystej – opublikowane protokoły zazwyczaj wymagają wycięcia słupka i umieszczenia w pożywce w celu podtrzymania tkanki na czas trwania eksperymentu 14,18,26. Chociaż nie ma bezpośrednich dowodów sugerujących, że takie podejście częściowo in vivo wpływa na uwodnienie pyłku lub rzeczywiście zmienia regulację tego procesu in vivo, można sobie wyobrazić, że wycięcie kwiatów z rośliny rodzicielskiej może mieć wpływ na zapylanie. W ten sposób protokół ten zapewnia prawdziwe środowisko in vivo do badania interakcji pyłek i znamię, w którym zachowana jest integralność strukturalna rośliny.

Przenoszenie pojedynczych ziaren pyłku do "dziewiczych" brodawek stygmatycznych jest prawdopodobnie jedną z najtrudniejszych operacji opisanych w tym protokole. Nierzadko zdarza się, że skupiska ziaren pyłku są przenoszone w wyniku błędu. Jednak prawdopodobieństwo wystąpienia tego zjawiska można znacznie zmniejszyć, upewniając się, że na kleszczach znajduje się tylko jedna warstwa pyłku (ryc. 3A) (lub nawet tylko pojedyncze ziarno pyłku; Ryc. 5) i/lub wykorzystując ziarna pyłku, które są już zorientowane w taki sposób, że "wystają" z innych na czubku kleszczy. Odkryliśmy, że doświadczony operator może z powodzeniem zakończyć transfer pojedynczego pyłku do komórki brodawki stygmatycznej w ciągu około 3 minut i zarejestrować dane dla maksymalnie pięciu ziaren pyłku w ciągu 1 godziny. W ten sposób w ciągu 2-4 dni można zgromadzić wystarczającą ilość danych do miarodajnej analizy statystycznej badanych linii roślin.

Błąd ludzki jest potencjalnie największym źródłem zmienności w analizie zestawów danych pochodzących z badań wykorzystujących ten protokół. Na przykład definicja "granicy pyłku" podczas analizy obrazu sprowadza się do oceny indywidualnego badacza. W związku z tym istnieje możliwość, że pomiary wykonane przez różnych badaczy, nawet na tym samym zbiorze danych, mogą generować różnice. Tam, gdzie to możliwe, pojedynczy badacz powinien przeprowadzać pomiary, aby zminimalizować błędy próbkowania. Ponadto sprzężenie analizy zbiorów danych dotyczących WT i mutantów przez tego samego operatora neguje potencjalnie subiektywną definicję "granicy pyłku" i zmienności międzyoperatorskiej.

Podsumowując, opisano wyrafinowaną, ale dokładną metodę pomiaru profili uwodnienia pyłku w organizmie modelowym A. thaliana . Wykazaliśmy, że wykorzystując ten protokół, można łatwo uzyskać wysoce spójne dane dotyczące nawodnienia pyłku dla A. thaliana . Trzy niezależne partie danych dotyczących zapyleń WT uzyskanych w różnych dniach wykazały stałe małe odchylenia wynoszące <3% we wszystkich punktach czasowych (Rysunek 7 i Tabela Uzupełniająca S1). Chociaż przedstawiony tutaj test biologiczny jest nieco bardziej złożony niż większość istniejących protokołów, rozdzielczość generowanych danych jest lepsza i odpowiednia do identyfikacji i charakterystyki nowych mutantów, które wpływają na szlaki regulujące kompatybilne zapylanie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez stypendia podyplomowe Uniwersytetu w Bath (University of Bath, Bath, UK, BA2 7AY) dla Y.-L.L. i L.W. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com (https://biorender.com/).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia pA9-barnaseUniversity of BathDzięki uprzejmości prof. Roda ScottaMęski sterylny Arabidopsis thaliana odpowiednik typu dzikiego ekotypu Columbia-0
Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cmFisherDumont 500342Pęseta służy do przenoszenia ziarna pyłku
GraphPad Prsim (wersja 8.0.2)PryzmatDotmaticsKompleksowe oprogramowanie do analizy danych, wykresów i statystyk
JMP (wersja 17)JMP Statistical Discovery LLCJMP 17Oprogramowanie do analizy statystycznej
Levington F2S nasiona i kompost modułowy (z piaskiem)LevingtonLEV75F2SMSKompost ogólnego przeznaczenia do wzrostu roślin
MikromanipulatorSinger instrument Co. LTD.Mikromanipulator SingerMikromanipulator wspomagający przenoszenie ziaren pyłku
Nikon Celownik cyfrowy DS-U1NikonDS-U1Aparat mikroskopowy (sprzężony z SMZ1500)
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TE2000-S Nikon TE2000-SMikroskop odwrócony
Nikon SMZ1500 Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ1500Mikroskop
stereoskopowy Aparat mikroskopowy Nikon DS-Fi3NikonDS-Fi3(sprzężony z TE2000-S)
Nikon NIS-Elements Badania podstawoweNikonNIS-Elements BROprogramowanie do pozyskiwania i analizy obrazów (dla DS-Fi3)
Nikon NIS-Elements FNikonNIS-Elements FOprogramowanie do pozyskiwania i analizy obrazów (dla DS-U1)
Linia zakładów WT Col-0uNASCN70000Dziki typ Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia-0
Aparat mikroskopowy

Bibliografia

  1. Rieseberg, L. H., Willis, J. H. Plant speciation. Science. 317 (5840), 910-914 (2007).
  2. Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
  3. Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
  4. Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
  5. Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
  6. Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
  7. Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
  8. Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
  9. Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
  10. Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
  11. Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
  12. Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279(2022).
  13. Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
  14. Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
  15. Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684(2022).
  16. Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140(2020).
  17. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  18. Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
  19. Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
  20. Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282(2020).
  21. Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
  22. Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228(2016).
  23. Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
  24. O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
  25. Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
  26. Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bioanaliza in vivokompatybilno py ek stygmabioanaliza zapylaniabia ka otoczki py kupowierzchnia stygmyanaliza pojedynczych ziarensekcja p ka kwiatowegoanaliza obrazu
Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.