Artykuł metodologiczny

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65280

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Bath

W tym artykule

Podsumowanie

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Streszczenie

Rozmnażanie płciowe u roślin kwitnących wymaga początkowej interakcji między ziarnem pyłku a powierzchnią stygmatyczną, gdzie nawiązywany jest molekularny dialog między oddziałującymi partnerami. Badania na wielu gatunkach wykazały, że szereg molekularnych punktów kontrolnych reguluje interakcję pyłek i znamię, aby zapewnić, że tylko zgodny, ogólnie wewnątrzgatunkowy pyłek jest skuteczny w zapłodnieniu. U gatunków, które posiadają "suche znamię", takich jak roślina modelowa Arabidopsis thaliana, pierwszym punktem kontrolnym zgodności prezygotycznej po zapyleniu jest ustalenie uwodnienia pyłku.

Ta faza zapylania jest ściśle regulowana, dzięki czemu sygnały z ziarna pyłku wywołują uwolnienie wody ze znamienia, umożliwiając w ten sposób nawodnienie pyłku. Możliwość dokładnego pomiaru i śledzenia uwodnienia pyłku w czasie jest kluczem do projektowania eksperymentów mających na celu zrozumienie regulacji tego krytycznego etapu reprodukcji. Opublikowane protokoły często wykorzystują kwiaty, które zostały wycięte z rośliny rodzicielskiej, utrzymywane na pożywkach płynnych lub stałych i zapylane luzem.

Ten artykuł opisuje nieinwazyjny test biologiczny in vivo, który pozwala na śledzenie nawodnienia poszczególnych ziaren pyłku A. thaliana minuta po minucie w wysokiej rozdzielczości. Test jest wysoce powtarzalny, jest w stanie wykryć bardzo subtelne zmiany profili uwodnienia pyłku, a zatem nadaje się do analizy mutantów, które wpływają na szlaki regulujące zapylanie. Chociaż protokół jest dłuższy niż te opisane dla zapylania masowego, precyzja i powtarzalność, które zapewnia, wraz z jego naturą in vivo, sprawiają, że idealnie nadaje się do szczegółowej analizy fenotypów zapylania.

Wprowadzenie

Skuteczna reprodukcja płciowa u roślin okrytonasiennych zazwyczaj opiera się na przenoszeniu wewnątrzgatunkowych ziaren pyłku z pręcika na znamię słupka, albo w obrębie jednego osobnika, albo między osobnikami (tj. zapylaniu). Przenoszenie ziaren pyłku do receptywnego kwiatu jest zazwyczaj pośredniczone przez zapylacze lub czynniki abiotyczne, co w warunkach naturalnych często skutkuje osadzaniem się pyłku heterospecyficznego. Z kilkoma wyjątkami, postęp zapylania przez pyłek heterospecyficzny jest ewolucyjnie niekorzystny i obniża dostosowanie reprodukcyjne poprzez utratę okazji do kopulacji, a większość powstałego w ten sposób potomstwa hybrydowego albo nie rozwija się prawidłowo, albo jest sterylna1. W związku z tym wyewoluowały mechanizmy blokujące zapylanie przez „niekompatybilny” pyłek heterospecyficzny2. Szybkie rozpoznanie kompatybilnego pyłku jest zatem prawdopodobnie najważniejszym procesem we wczesnych etapach reprodukcji płciowej u wielu roślin kwitnących.

W rodzinie Brassicaceae, w której zniewsłupy są typu „suchego”, seria punktów kontrolnych molekularnych działa na wielu etapach procesu reprodukcyjnego, regulując zapylenie w taki sposób, aby tylko kompatybilny pyłek odniósł sukces. Hydratacja pyłku jest jednym z najważniejszych punktów kontrolnych (Rysunek 1), ponieważ pyłek, który nie ulegnie hydratacji, nie może przejść do etapu wytwarzania rurki pyłkowej, a w konsekwencji dostarczyć plemników do gametofytu żeńskiego. Często niekompatybilne ziarna nie przechodzą przez ten pierwszy punkt kontrolny zapylenia i w związku z tym nie uzyskują dostępu do wody zniewsłupowej3. Wśród przedstawicieli rodziny Brassicaceae rozpoznawanie pyłku następuje szybko, a kompatybilność zostaje ustalona w ciągu kilku minut od przyczepienia ziarna pyłku do słupka4,5. W ostatnich latach poczyniono duże postępy i zaczynamy rozumieć molekularne mechanizmy regulujące kluczowe punkty kontrolne zapylenia.

Schemat kiełkowania pyłku przedstawiający etapy: dotarcie, przytwierdzenie, hydratacja, kiełkowanie, penetracja.
Rycina 1: Przegląd kluczowych zdarzeń podczas kompatybilnego zapylenia. Etapy te, takie jak hydratacja pyłku i kiełkowanie rurki pyłkowej, są również „punktami kontrolnymi” zapylenia, które muszą zostać pomyślnie przekroczone, aby doszło do kompatybilnego zapylenia. Schemat przedstawia znamię typu „suchego”, które jest charakterystyczne dla gatunków z rodziny Brassicaceae2,20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Pionierskie badania nad Kapustowate system samoniezgodności (SI), w którym pyłek „własny” jest rozpoznawany i odrzucany, ustanowił paradygmat rozpoznawania pyłku przez znoszę w rodzinie kapustowatych (Brassicaceae)6,7,8,9,10SI w Kapustowate a jego krewnych jest pośredniczone przez białka „rozpoznawcze”, które znajdują się na powierzchni pyłku oraz w błonie plazmatycznej stygmatu, których oddziaływanie prowadzi do odrzucenia pyłku. Odrzucenie pyłku w mechanizmie SI polega na zaburzeniu podstawowego systemu kompatybilności pyłek-stygmat, który po pełnej aktywacji poprzez percepcję kompatybilnego pyłku prowadzi do ukierunkowanej sekrecji przez stygmat, napędzając tym samym hydratację pyłku (przeglądy mechanizmu kompatybilności pyłku znajdują się w11,12). W przypadku SI ligand przenoszony przez pyłek jest małym białkiem bogatym w cysteinę, S-locus bogaty w cysteinę (SCR/SP11), a receptorem stygmatycznym jest Skinaza receptorowa locus S (SRK).

Niedawno w Arabidopsis thaliana odkryto, że kolejna grupa małych, bogatych w cysteinę białek przenoszonych przez pyłek, białka otoczki pyłku klasy B (AtPCP-Bs), są istotnymi regulatorami akceptacji pyłku poprzez aktywację hydratacji pyłku13. Niedawno opisano również receptory stygmatyczne dla AtPCP-Bs oraz aspekty downstreamowej ścieżki regulacyjnej14,15. Co ciekawe, badania mutacyjne genów kodujących potencjalne mediatorzy sygnalizacji przenoszone przez pyłek i stygmatyczne w procesie hydratacji pyłku (w tym AtPCP-Bs) nie pozwoliły na uzyskanie roślin z całkowitą blokadą punktu kontrolnego hydratacji pyłku. Silnie sugeruje to, że w regulacji hydratacji pyłku rolę odgrywa wiele innych, jeszcze nieodkrytych czynników. Opierając się na metodzie opisanej po raz pierwszy przez Wang i wsp.13, przedstawiamy tutaj ulepszony wysokorozdzielczy bioassay in vivo, odpowiedni do identyfikacji subtelnych defektów hydratacji pyłku w kandydujących liniach mutantów A. thaliana.

Protokół

1. Wzrost roślin i przygotowanie kwiatów

  1. Stratyfikować nasiona A. thaliana w 0,1% agarozie lub sterylnej wodzie przez 3 dni w temperaturze 4 °C lub jako suche nasiona przez 16-24 h w temperaturze -20 °C (uNASC, komunikacja osobista).
  2. Przenieść stratyfikowane nasiona do doniczek z kompostem i umieścić w komorze wzrostu z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi. Hodować rośliny przy fotoperiodzie 16:8 h światło:ciemność zapewnionym przez lampy fluorescencyjne (130 µmol m-2 s-1). Utrzymywać temperaturę na poziomie 21 ± 2 °C przy wilgotności względnej około 40%.
  3. Upewnić się, że rośliny dawcy pyłku i biorcy pyłku, wraz z wszelkimi innymi odpowiednimi liniami roślin kontrolnymi, są wysiewane razem, aby zapewnić synchroniczne kwitnienie. Hodować rośliny przez około 6 tygodni, aż kwiatostany będą dobrze rozwinięte.
  4. Na 1 dzień przed przeprowadzeniem bioanalizy wybrać na roślinie biorcy pyłku pąki kwiatowe w stadium 12 do ewmaskulacji16,17 — są to nieotwarte pąki kwiatowe, które ukończą otwieranie się kwiatu i dehiscencję pręcików następnego dnia18.
    UWAGA: Unikać trzech pierwszych kwiatów wytworzonych na głównym kwiatostanie, ponieważ zazwyczaj wykazują one nietypowe zachowanie reprodukcyjne. Jeśli są dostępne i odpowiednie dla badania, należy użyć męskiej sterylnej linii roślin, takiej jak linia pA9-barnase A. thaliana (ekotyp Col-0), w której pręciki nie dojrzewają19.
  5. Aby przeprowadzić ewmaskulację kwiatów biorcy pyłku, położyć roślinę wraz z doniczką na boku. Przymoczyć łodygę rośliny, w regionie blisko kwiatów przeznaczonych do ewmaskulacji, taśmą do szkiełka przedmiotowego umieszczonego pod stereomikroskopem sekcyjnym.
  6. Używając pęsety z cienkimi końcówkami, ostrożnie rozdzielić pąk kwiatowy i usunąć wszystkie płatki kwiatowe oraz pręciki. Upewnić się, że słupek nie został uszkodzony i że znamię jest wolne od zanieczyszczającego pyłku.
    UWAGA: Męskie sterylne linie roślin nie wymagają ewmaskulacji.
  7. Przenieść rośliny z powrotem do komory wzrostu i upewnić się, że ewmaskulowane kwiaty nie mają kontaktu z innymi roślinami ani ciałami obcymi.

2. Analiza hydratacji pyłku – pozyskiwanie surowych danych

  1. Następnego ranka wyjmij rośliny z komory wzrostowej. Połóż roślinę biorcę pyłku na boku i umieść kwiat na stoliku mikroskopu odwróconego (Rycina 2>) w taki sposób, aby znamiona były wyraźnie widoczne w obrazie.
  2. Ustabilizuj pozycję obrazowanego kwiatu, unieruchamiając łodygę na szkiełku przedmiotowym za pomocą pasków taśmy maskującej. Utrzymuj temperaturę w zakresie od 18 °C do 25 °C oraz wilgotność względną poniżej 60%.
    UWAGA: W przypadku linii roślin męsko sterylnych pA9-barnase optymalnym czasem przeprowadzenia analizy jest poranek, kiedy kwiaty się otwierają, a płatki nie ograniczają pola widzenia.
  3. Następnie pobierz zdrowy i świeżo otwarty kwiat z rośliny dawcy pyłku. Umieść go pod mikroskopem stereoskopowym i zbierz kilka ziaren pyłku na końcówkę czystej pęsety precyzyjnej, delikatnie dotykając pręcików (Rycina 3A). Rzęsa przymocowana taśmą do krótkiego pręta jest również skutecznym narzędziem do zbierania i przenoszenia pyłku (Rycina 3C).
  4. Usuń nadmiar pyłku z pęsety, lekko dotykając jej płatków kwiatów, z których pobrano ziarna pyłku, aż na końcówce pęsety utworzy się monowarstwa ziaren pyłku.
    UWAGA: Monowarstwa ziaren pyłku na końcówce pęsety precyzyjnej znacznie ułatwi transfer pojedynczego ziarna w kolejnych krokach. Tą techniką można również uzyskać jedno pojedyncze ziarno pyłku na pęsecie (Supplementary Video S1).
  5. Wróć do rośliny biorcy pyłku i, używając obiektywu o małym powiększeniu (np. obiektywu 10x; Rycina 3B>), ustaw ostrość mikroskopu odwróconego na znamię, które ma zostać zapylone.
  6. Trzymając pęsetę wzdłuż szczeliny między jej ramionami (Rycina 4), ostrożnie zbliż się do niezapylonej („dziewiczej”) komórki papilli znamienia.
    UWAGA: Stwierdziliśmy, że taki sposób trzymania pęsety poprawia zręczność i zmniejsza wpływ drżenia rąk. Użytkownicy mniej doświadczeni lub mający trudności z precyzyjnym aplikowaniem pojedynczego ziarna pyłku ręcznie mogą skorzystać z mikromanipulatora.
  7. Wybierz odpowiednio ustawione ziarno pyłku na pęsecie w celu przeniesienia go na znamię. Kontynuuj zbliżanie się do niezapylonej komórki papilli znamienia, aż wybrane ziarno pyłku lekko dotknie jej powierzchni. Powoli wycofaj pęsetę i potwierdź przyczepienie pyłku (Rycina 5).
    UWAGA: Supplementary Video S1 oraz Supplementary Video S2 demonstrują ten krok w przypadku obecności na pęsecie zarówno pojedynczego, jak i wielu ziaren pyłku.
  8. Upewnij się, że ziarno pyłku jest zorientowane tak, aby jego oś równikowa była wyraźnie widoczna i znajdowała się w ostrości. Natychmiast przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (np. 20x) i wykonaj zdjęcie ziarna pyłku. Jest to pierwsze zdjęcie dla T = 0. Kontynuuj wykonywanie kolejnych zdjęć w odstępach 1 min przez łącznie 10 min.
  9. Koryguj ostrość w razie potrzeby, aby dostosować ją do niewielkich ruchów ziarna pyłku lub znamienia. Co 2 min zapisuj temperaturę otoczenia i wilgotność względną w pomieszczeniu, aby umożliwić przyszłe porównania między powtórzeniami eksperymentalnymi.
  10. Po wykonaniu wszystkich zdjęć zapisz je w formacie bezstratnym, takim jak format własny producenta lub jako pliki TIFF.
    UWAGA: Dla każdego pobranego ziarna pyłku powstanie 11 obrazów (Supplementary Figure S1). Automatyczne lub ręczne ustawienia akwizycji timelapse w większości oprogramowań do obrazowania są przydatnymi funkcjami ułatwiającymi organizację każdej serii czasowej.
  11. Powtórz kroki od 2.4 do 2.9 dla kolejnych ziaren pyłku. Pozyskaj dane dla zbliżonej liczby zapyleń kontrolnych (typ dziki [WT]) i eksperymentalnych.

Układ mikroskopu odwróconego do analizy łodygi rośliny; roślina na regulowanej platformie do badań optycznych.
Rysunek 2: Układ aparatury wykorzystany do bioanalizy hydratacji pyłku. W tym przykładzie biorcą pyłku była linia roślin męsko sterylnych pA9-barnase. Roślinę wraz z doniczką ułożono na boku, a łodygę przymocowano taśmą do szkiełka przedmiotowego umieszczonego na stoliku mikroskopu. Aby zmniejszyć stres mechaniczny i ułatwić pozycjonowanie rośliny, do podparcia doniczki zastosowano regulowaną platformę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy trichomów roślinnych: widok szczegółowy, pasek skali, analiza epidermy.
Rycina 3: Pobieranie ziaren pyłku z kwiatu donora pyłku. Zdjęcia pokazują użycie (A) pęsety z cienkimi końcówkami oraz (C) fragmentu rzęsy. Aglomeraty pyłku (czerwona strzałka) należy usunąć, lekko dotykając ich o płatki kwiatów donora, aż do uzyskania monowarstwy ziaren pyłku (zielona strzałka). (B) Obraz o wysokiej rozdzielczości stygmatu niezapylonej męsko sterylnej linii pA9-barnase A. thaliana (Col-0), która osiągnęła odpowiedni stopień rozwoju do bioanalizy hydratacji pyłku. Pasek skali = 100 µm (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie prawidłowego obchodzenia się z próbką, użycie pęsety na odblaskowej metalowej powierzchni, schemat, przewodnik proceduralny.
Rycina 4: Metoda trzymania pęsety podczas przenoszenia pyłku na znamię biorcy. (A) nieprawidłowa orientacja trzymania pęsety; (B) prawidłowa orientacja trzymania pęsety. Trzymanie pęsety bokiem w tej konfiguracji, co sygnalizuje pozycja kciuka pomiędzy ramionami pęsety, zapewnia większą stabilność, co ułatwia przenoszenie ziaren pyłku na niezapylone papille znamienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Sekwencja obrazów mikroskopowych pokazująca proces przylegania i odrywania się zarodników grzybów od powierzchni.
Rycina 5: Przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku z końcówki pęsety na niezapyloną („dziewiczą”) komórkę papilli znamienia rośliny z męską sterylnością pA9-barnase. (A) Ostrożne zbliżanie się do komórki papilli. (B) Przytwierdzenie odpowiednio ustawionego ziarna pyłku (niebieska strzałka) do komórki papilli (pomarańczowa strzałka). (C) Wycofanie pęsety i wizualne potwierdzenie przytwierdzenia pyłku (fioletowa strzałka). Panele A-C zostały obrazowane przy użyciu obiektywu 10x (odległość robocza 10,5 mm; apertura numeryczna 0,25) i są klatkami pochodzącymi z klipu wideo przedstawionego w Supplementary Video S1. (D) Przejście na obiektyw 20x (odległość robocza 2,1 mm; apertura numeryczna 0,5) w celu rozpoczęcia akwizycji obrazów w serii czasowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Pomiary w teście hydratacji pyłku

  1. Zdefiniuj szybkość hydratacji pyłku jako zmianę długości półosi mniejszej (Rysunek 6) ziarna pyłku (tj. promienia równikowego) w czasie i przedstawić go jako procentową zmianę (równanie [1]):
    Równanie służące do obliczenia zmiany osi półkrótszej pyłku (%), demonstrujące formułę procentową. (1)
  2. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu należy zapisać wartości półosi mniejszej dla każdego ziarna pyłku w serii eksperymentalnej.
    UWAGA: Nazwa tej opcji pomiaru zależy od oprogramowania, np. „Rotated Ellipse” (elipsa obrócona) lub „5-point ellipse” (elipsa 5-punktowa).
  3. Powtórz kroki 3.1-3.2 dla wszystkich pozostałych ziaren pyłku przeznaczonych do pomiaru. Aby zachować spójność, zastosuj ten sam stopień cyfrowego powiększenia oraz to samo podejście do wyznaczania „granicy ziarna pyłku” dla Wszystkie pomiary w zbiorach danych.
  4. Po zakończeniu wszystkich pomiarów dla serii czasowej, wyeksportuj surowe wartości półosi mniejszej dla każdego stosu obrazów do arkusza kalkulacyjnego i przedstaw dane w kolumnach odpowiadających poszczególnym stosom obrazów. Upewnij się, że w analizie dla każdej linii rośliny uwzględniono dane z co najmniej 15 uwodnionych ziaren pyłku (Tabela uzupełniająca S1).
  5. Niezwykłym nie jest fakt, że niewielka liczba ziaren pyłku nie ulega hydratacji lub ulega jej znacznie wolniej, niż oczekiwano. Takie „wadliwe” ziarna mogą być wynikiem słabego kontaktu między ziarnem a komórką papilli lub mogą być związane z żywotnością pyłku. Należy je zlokalizować i wykluczyć z zestawu danych, chyba że są one wymagane w projekcie doświadczalnym.
  6. Oblicz wartości średnie dla każdego punktu czasowego w obrębie każdej linii roślin. Użyj testu dla prób niezależnych t-testy oraz jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) do analizy statystycznej danych dotyczących nawodnienia linii WT i linii mutant w każdym punkcie czasowym. Należy zastosować wielokrotne t– test do jednoczesnego porównania średnich między liniami WT a mutantami w wielu punktach czasowych.
    UWAGA: Wykresy XY są również bardzo przydatne do wizualizacji ogólnego trendu nawadniania pyłku pomiędzy porównywanymi liniami roślin.

Obraz z mikroskopu, pomiar ziarna pyłku; półoś mniejsza, porównanie rozmiarów, skala 50 µm, eksperyment.
Rysunek 6: Hydratacja ziarna pyłku WT na komórce papilary słupka A. thaliana (Col-0; męskosterylna linia pA9-barnase). (A) Punkt czasowy zero, 0 (0 MAP) oraz (B) 10 MAP. Czerwone koło wokół ziarna pyłku to „granica pyłku” zdefiniowana i narysowana przez operatora przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Zielona i ciemnoczerwona linie wewnątrz pyłku reprezentują odpowiednio półoś większą i półoś mniejszą. Długość półosi mniejszej jest wykorzystywana do obliczenia stopnia hydratacji pyłku. Pełna seria czasowa tego zestawu danych znajduje się na Rysunku uzupełniającym S1. Obraz wykonano z użyciem obiektywu 20x (odległość robocza 2,1 mm; apertura numeryczna 0,5). Paski skali = 50 µm. Skrót: MAP = min-after-pollination (minuty po zapyleniu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono dwa zestawy przykładowych danych dotyczących hydratacji pyłku A. thaliana, zebranych zgodnie z powyższym opisem. Pierwszy zestaw danych składa się z trzech powtórzeń szeregów czasowych hydratacji pyłku dla roślin WT, przy czym każde powtórzenie zostało wykonane w innym dniu. Każde powtórzenie zawiera nie mniej niż 18 wartości dla pojedynczych ziaren pyłku, co łącznie daje 55 ziaren pyłku we wszystkich trzech powtórzeniach. Wartości minimalne i maksymalne średnich między powtórzeniami dla wszystkich punktów czasowych mieściły się w granicach 3% (Rysunek 7 oraz Tabela uzupełniająca S1). Te reprezentatywne dane dla zapyleń WT wyraźnie wykazują wysoki stopień spójności, jaki można osiągnąć stosując opisaną tutaj metodologię przy stosunkowo niskiej liczbie próbek i w różne dni.

Zmiana osi pyłku w czasie; wykres liniowy; porównanie WT; analiza danych; trend wzrostu.
Rysunek 7: Wykres XY wykazujący spójność profilów hydratacji pyłku typu dzikiego A. thaliana w okresie 10 min. Rodzicem pyłkowym był ekotyp Col-0 A. thaliana, a rodzicem słupkowym linia A. thaliana (Col-0) męsko sterile pA9-barnase. Dane reprezentują trzy niezależne zestawy danych zebrane w różne dni i wykazują wysoki stopień spójności. Diagram pudełkowy oraz analiza statystyczna średnich dla tych zestawów danych przedstawione są na Rysunku Uzupełniającym S2. Liczba zmierzonych ziaren pyłku ('n') dla każdego niezależnego zestawu danych jest wyświetlana obok oznaczenia (WT1/WT2/WT3) na rysunku. Skrót: WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Drugi zestaw danych uzyskano dla linii roślinnej z insercją T-DNA w genie kodującym białko otoczki pyłku, co spowodowało powstanie mutacji typu „knockdown”, określanej tutaj jako „mutant KD”. Pyłek mutantów naniesiono na znamiona linii męskiej sterylnej pA9-barnase w celu profilowania nawodnienia, zgodnie z opisem w protokole. Jak wynika z otrzymanych danych (Rysunek 8), pyłek mutantów i WT wykazywał nieodróżnialne profile nawodnienia w ciągu pierwszych 5 min. Jednak 5–10 min po zapyleniu (MAP) średnia zmiana półosi mniejszej dla pyłku mutantów zaczęła być niższa niż dla pyłku WT, a różnica ta stała się statystycznie istotna w 10 MAP. Wynik ten nie tylko dowodzi, że wspomniane białko otoczki pyłku odgrywa rolę w pośredniczeniu w nawodnieniu pyłku, ale także przejrzyście ilustruje użyteczność tego wysokorozdzielczego bioanalizy pojedynczego ziarna w śledzeniu nawodnienia pyłku. W tym konkretnym przykładzie jej czułość pozwoliła wykryć subtelny efekt „knockdownu” genu kodującego białko otoczki pyłku.

Analiza wzrostu komórek; wykres i wykres pudełkowy; linie roślin WT vs mutant KD; dane dotyczące zmiany osi pyłku.
Rycina 8: Profile hydratacji pyłku dla WT oraz linii mutanta z wyciszonym białkiem otoczki pyłkowej (mutant KD). (A) Profile hydratacji w okresie 10 min dla pyłku WT i mutanta. Rodzicami pyłku były ekotyp Col-0 A. thaliana oraz mutant KD białka otoczki pyłkowej (również w tle Col-0). W obu przypadkach rodzicem żeńskim była linia A. thaliana (Col-0) pA9-barnase, sterylna męsko. (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające zakres hydratacji pyłku (wyrażony jako procentowa zmiana półosi mniejszej) w 5 MAP i 10 MAP dla zestawów danych pyłku WT i mutanta. Wąsy reprezentują minimalne i maksymalne wartości próby. Pudełka przedstawiają kwartyl dolny, medianę i kwartyl górny zbioru danych. Białe krzyżyki reprezentują średnią zbioru danych. Analiza testem t dla prób niezależnych wykazuje, że średni procent hydratacji pyłku różni się istotnie między dwiema liniami roślin w 10 MAP. Jeden asterysk oznacza p < 0,05 (test t dla prób niezależnych). Skróty: WT = typ dziki; KD = knockdown (wyciszenie); MAP = minuty po zapyleniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca S1: Przycięta seria czasowa bioanalizy hydratacji pyłku ziarna WT hydratującego na komórce papilli stygmatu rośliny męsko sterylnej pA9-barnase w ciągu 10 min. Obrazy wykonano w odstępach 1 min. Obrazy z 0 MAP oraz 10 MAP zostały wykorzystane w Rycini 6 (dołączonej oddzielnie). Pasek skali = 50 µm. Skróty: WT = typ dziki; MAP = minuty po zapyleniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Wykres pudełkowy przedstawiający zakres hydratacji pyłku (wyrażony jako procentowa zmiana półosi mniejszej) w okresie 10 min dla trzech zestawów danych pyłku WT opisanych na Rysunku 7. Rodzicem żeńskim była linia męsko sterylna A. thaliana (Col-0) pA9-barnase. Wąsy reprezentują minimalne i maksymalne wartości próbek. Pudełka przedstawiają dolny kwartyl (dolny zawias), medianę (środkowy zawias) oraz górny kwartyl (górny zawias) zestawu danych. Przedstawiono poszczególne punkty danych. Jednoczynnikowa analiza ANOVA wykazuje, że średnie wartości procentowe hydratacji pyłku dla trzech zestawów danych nie różniły się statystycznie istotnie od siebie w całym 10-minutowym okresie. Próg istotności wynosi p < 0,05 (jednoczynnikowa ANOVA). Skrót: WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Surowe dane dotyczące hydratacji pyłku użyte do przygotowania Rysunku 7 (pyłek A. thaliana WT Col-0 na męsko sterile prętniku pA9-barnase). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający S1: Film demonstrujący przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku WT (akcesja Col-0) za pomocą pęsety na „dziewiczą” komórkę papilli znamionowej (linia męsko sterile pA9-barnase). Aby ułatwić dostęp do filmu, celowo obniżono jego jakość obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające S2: Film demonstrujący przeniesienie pojedynczego ziarna pyłku WT (ekcesja Col-0) z monowarstwy ziaren pyłku znajdującej się na końcówce pęsety do „dziewiczej” komórki papilli prętnika (linia męsko sterylna pA9-barnase). Aby ułatwić dostęp do filmu, celowo obniżono jego jakość obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W przypadku roślin kwitnących bardzo wczesne etapy rozmnażania płciowego są prawdopodobnie najważniejsze. Na poziomie interakcji pyłek – znamię podejmowane są decyzje molekularne, które określają "zgodność" oddziałujących partnerów. Takie decyzje, jeśli są podejmowane prawidłowo, pozwalają uniknąć marnotrawstwa zasobów, które mogłyby mieć wpływ na sprawność reprodukcyjną21. Tak więc, pozwolenie tylko zgodnemu pyłkowi na zapłodnienie jest jednym z ważnych elementów utrzymania dobrze przystosowanych genotypów, a tym samym ewolucyjnego sukcesu gatunków. Badania przeprowadzone na roślinie modelowej A. thaliana były niezwykle cenne dla pogłębienia naszego zrozumienia tego procesu. Szereg badań przeprowadzonych w ciągu ostatnich kilku dekad ujawniło obecność czynników w okrywie pyłkowej, które działają w pierwszym "punkcie kontrolnym" zgodności, w którym pyłek uzyskuje dostęp do wody stygmatycznej, aby umożliwić nawodnienie pyłku13. Pomimo tych pierwszych spostrzeżeń na temat mechanizmów regulujących zgodność znamion pyłku, nadal istnieje wiele luk w naszym zrozumieniu tego procesu. Do tej pory żadne mutanty ligandów przenoszonych przez pyłek ani receptorów stygmatycznych wpływających na uwodnienie pyłku nie mogą całkowicie zablokować kompatybilnego zapylenia, co sugeruje obecność innych nieodkrytych determinantów uwodnienia pyłku. Dzięki możliwości łatwej obserwacji interesującego nas fenotypu, opisany tutaj test biologiczny uwodnienia pyłku jest jedną z najprostszych technik badania potencjalnych mutantów regulujących zapylanie.

Istniejące metodologie pomiaru nawodnienia pyłku często wykorzystują zapylenia masowe i podają mniej punktów czasowych 14,22,23, a zatem mogą pomijać ważne subtelne fenotypy profilu nawodnienia. Na przykład badanie przeprowadzone przez Wang i wsp.13, wraz z pracami nad innymi mutantami białek płaszcza pyłkowego w naszym laboratorium (niepublikowane obserwacje), ujawniło intrygujące różnice w profilach nawodnienia między mutantami. Takie subtelne różnice mogą stanowić ważne wskazówki dotyczące mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw zgodnego zapylania.

Opisana tutaj metoda koncentruje się na pozyskiwaniu stosunkowo niewielkiej liczby pomiarów między liniami roślin ze mutantami a WT, z naciskiem na precyzję metodologiczną w celu zmniejszenia zmienności w zbiorach danych. Chociaż metoda ta jest wysoce powtarzalna (jak pokazano na rysunku 7), zakładając, że temperatura i wilgotność są odpowiednio kontrolowane, ważne jest zebranie danych dotyczących nawodnienia dla prawie równej liczby WT i zmutowanego pyłku w tym samym dniu, aby jeszcze bardziej zmniejszyć potencjał zmienności. W razie potrzeby dane można następnie łączyć z różnych dni. Ponadto wybór odpowiednich roślin kontrolnych WT ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników nawodnienia. W przypadku biorcy pyłku ta sama linia roślin powinna być używana do otrzymywania zarówno ziaren pyłku WT, jak i zmutowanych.

Na przykład, używamy męskiej sterylnej linii roślinnej pA9-barnazy, która jest również przedstawiona w protokole wideo, jako biorcy pyłku zarówno dla WT (kontrolnego), jak i zmutowanego (eksperymentalnego) pyłku podczas badania zmutowanych linii pyłku T-DNA (takich jak mutant "KD" opisany na rycinie 8). Należy unikać mieszania danych z takiej męskiej sterylnej linii, które nie muszą być wykastrowane, z danymi zebranymi z ręcznie wykastrowanej linii kontrolnej, ponieważ te stygmaty prawdopodobnie będą zachowywać się inaczej. Podobnie, wykastrowane linie mutantów powinny być używane w połączeniu z wykastrowaną linią WT (kontrolną), gdy tylko jest to możliwe. Taką samą ostrożność należy zachować również przy rozważaniu tła genetycznego badanych roślin. Podczas gdy najpopularniejsze kolekcje mutantów T-DNA zostały wygenerowane na tle Col-0, inne, takie jak kolekcja FLAG z Institut national de la Recherche Agronomique (INRA), są dostępne w tle genetycznym Wassilewskija (WS)24,25. W takich przypadkach zaleca się użycie linii instalacji WT danego ekotypu jako elementów sterujących.

Chociaż tutaj skupiliśmy się na uwodnieniu pyłku w ciągu pierwszych 10 minut interakcji pyłek i znamię, metodę tę można również dostosować do profili nawodnienia, które obejmują dłuższy okres czasu. Kluczową cechą protokołu jest to, że kwiaty pozostają przyczepione do rośliny macierzystej – opublikowane protokoły zazwyczaj wymagają wycięcia słupka i umieszczenia w pożywce w celu podtrzymania tkanki na czas trwania eksperymentu 14,18,26. Chociaż nie ma bezpośrednich dowodów sugerujących, że takie podejście częściowo in vivo wpływa na uwodnienie pyłku lub rzeczywiście zmienia regulację tego procesu in vivo, można sobie wyobrazić, że wycięcie kwiatów z rośliny rodzicielskiej może mieć wpływ na zapylanie. W ten sposób protokół ten zapewnia prawdziwe środowisko in vivo do badania interakcji pyłek i znamię, w którym zachowana jest integralność strukturalna rośliny.

Przenoszenie pojedynczych ziaren pyłku do "dziewiczych" brodawek stygmatycznych jest prawdopodobnie jedną z najtrudniejszych operacji opisanych w tym protokole. Nierzadko zdarza się, że skupiska ziaren pyłku są przenoszone w wyniku błędu. Jednak prawdopodobieństwo wystąpienia tego zjawiska można znacznie zmniejszyć, upewniając się, że na kleszczach znajduje się tylko jedna warstwa pyłku (ryc. 3A) (lub nawet tylko pojedyncze ziarno pyłku; Ryc. 5) i/lub wykorzystując ziarna pyłku, które są już zorientowane w taki sposób, że "wystają" z innych na czubku kleszczy. Odkryliśmy, że doświadczony operator może z powodzeniem zakończyć transfer pojedynczego pyłku do komórki brodawki stygmatycznej w ciągu około 3 minut i zarejestrować dane dla maksymalnie pięciu ziaren pyłku w ciągu 1 godziny. W ten sposób w ciągu 2-4 dni można zgromadzić wystarczającą ilość danych do miarodajnej analizy statystycznej badanych linii roślin.

Błąd ludzki jest potencjalnie największym źródłem zmienności w analizie zestawów danych pochodzących z badań wykorzystujących ten protokół. Na przykład definicja "granicy pyłku" podczas analizy obrazu sprowadza się do oceny indywidualnego badacza. W związku z tym istnieje możliwość, że pomiary wykonane przez różnych badaczy, nawet na tym samym zbiorze danych, mogą generować różnice. Tam, gdzie to możliwe, pojedynczy badacz powinien przeprowadzać pomiary, aby zminimalizować błędy próbkowania. Ponadto sprzężenie analizy zbiorów danych dotyczących WT i mutantów przez tego samego operatora neguje potencjalnie subiektywną definicję "granicy pyłku" i zmienności międzyoperatorskiej.

Podsumowując, opisano wyrafinowaną, ale dokładną metodę pomiaru profili uwodnienia pyłku w organizmie modelowym A. thaliana . Wykazaliśmy, że wykorzystując ten protokół, można łatwo uzyskać wysoce spójne dane dotyczące nawodnienia pyłku dla A. thaliana . Trzy niezależne partie danych dotyczących zapyleń WT uzyskanych w różnych dniach wykazały stałe małe odchylenia wynoszące <3% we wszystkich punktach czasowych (Rysunek 7 i Tabela Uzupełniająca S1). Chociaż przedstawiony tutaj test biologiczny jest nieco bardziej złożony niż większość istniejących protokołów, rozdzielczość generowanych danych jest lepsza i odpowiednia do identyfikacji i charakterystyki nowych mutantów, które wpływają na szlaki regulujące kompatybilne zapylanie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez stypendia podyplomowe Uniwersytetu w Bath (University of Bath, Bath, UK, BA2 7AY) dla Y.-L.L. i L.W. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com (https://biorender.com/).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia pA9-barnaseUniversity of BathDzięki uprzejmości prof. Roda ScottaMęski sterylny Arabidopsis thaliana odpowiednik typu dzikiego ekotypu Columbia-0
Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cmFisherDumont 500342Pęseta służy do przenoszenia ziarna pyłku
GraphPad Prsim (wersja 8.0.2)PryzmatDotmaticsKompleksowe oprogramowanie do analizy danych, wykresów i statystyk
JMP (wersja 17)JMP Statistical Discovery LLCJMP 17Oprogramowanie do analizy statystycznej
Levington F2S nasiona i kompost modułowy (z piaskiem)LevingtonLEV75F2SMSKompost ogólnego przeznaczenia do wzrostu roślin
MikromanipulatorSinger instrument Co. LTD.Mikromanipulator SingerMikromanipulator wspomagający przenoszenie ziaren pyłku
Nikon Celownik cyfrowy DS-U1NikonDS-U1Aparat mikroskopowy (sprzężony z SMZ1500)
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TE2000-S Nikon TE2000-SMikroskop odwrócony
Nikon SMZ1500 Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ1500Mikroskop
stereoskopowy Aparat mikroskopowy Nikon DS-Fi3NikonDS-Fi3(sprzężony z TE2000-S)
Nikon NIS-Elements Badania podstawoweNikonNIS-Elements BROprogramowanie do pozyskiwania i analizy obrazów (dla DS-Fi3)
Nikon NIS-Elements FNikonNIS-Elements FOprogramowanie do pozyskiwania i analizy obrazów (dla DS-U1)
Linia zakładów WT Col-0uNASCN70000Dziki typ Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia-0
Aparat mikroskopowy

Bibliografia

  1. Rieseberg, L. H., Willis, J. H. Plant speciation. Science. 317 (5840), 910-914 (2007).
  2. Hiscock, S. J., Allen, A. M. Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus. New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).
  3. Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. E. Pollen pistil interactions and developmental regulation of pollen-tube growth in Arabidopsis. Development. 120 (12), 3405-3418 (1994).
  4. Bosch, M., Wang, L. Pollen-stigma interactions in Brassicaceae: complex communication events regulating pollen hydration. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2465-2468 (2020).
  5. Rozier, F., et al. Live-cell imaging of early events following pollen perception in self-incompatible Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 71 (9), 2513-2526 (2020).
  6. Dickinson, H. Dry stigmas, water and self-incompatibility in Brassica. Sexual Plant Reproduction. 8, 1-10 (1995).
  7. Takasaki, T., et al. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature. 403 (6772), 913-916 (2000).
  8. Schopfer, C. R., Nasrallah, M. E., Nasrallah, J. B. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science. 286 (5445), 1697-1700 (1999).
  9. Takayama, S., et al. Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature. 413 (6855), 534-538 (2001).
  10. Shiba, H., et al. A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology. 125 (4), 2095-2103 (2001).
  11. Broz, A. K., Bedinger, P. A. Pollen-pistil interactions as reproductive barriers. Annual Review of Plant Biology. 72 (1), 615-639 (2021).
  12. Cheung, A. Y., Duan, Q., Li, C., James Liu, M. -C., Wu, H. -M. Pollen-pistil interactions: It takes two to tangle but a molecular cast of many to deliver. Current Opinion in Plant Biology. 69, 102279(2022).
  13. Wang, L. D., et al. PCP-B class pollen coat proteins are key regulators of the hydration checkpoint in Arabidopsis thaliana pollen-stigma interactions. New Phytologist. 213 (2), 764-777 (2017).
  14. Liu, C., et al. Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide-receptor kinase gating mechanism for pollination. Science. 372 (6538), 171-175 (2021).
  15. Bordeleau, S. J., Sanchez, L. E. C., Goring, D. R. Finding new Arabidopsis receptor kinases that regulate compatible pollen-pistil interactions. Frontiers in Plant Science. 13, 1022684(2022).
  16. Suwabe, K., et al. Double-locking mechanism of self-compatibility in Arabidopsis thaliana: the synergistic effect of transcriptional depression and disruption of coding region in the male specificity gene. Frontiers in Plant Science. 11, 576140(2020).
  17. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  18. Lee, H. K., Macgregor, S., Goring, D. R. A toolkit for teasing apart the early stages of pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. Pollen and Pollen Tube Biology. 2160, 13-28 (2020).
  19. Dilkes, B. P., et al. The maternally expressed WRKY transcription factor TTG2 controls lethality in interploidy crosses of Arabidopsis. PLoS Biology. 6 (12), 2707-2720 (2008).
  20. Riglet, L., et al. KATANIN-dependent mechanical properties of the stigmatic cell wall mediate the pollen tube path in Arabidopsis. eLife. 9, e57282(2020).
  21. Zhou, L. Z., Dresselhaus, T. Friend or foe: Signaling mechanisms during double fertilization in flowering seed plants. Plant Development and Evolution. 131, 453-496 (2019).
  22. Gao, X. -Q., et al. The Arabidopsis KINβγ subunit of the SnRK1 complex regulates pollen hydration on the stigma by mediating the level of reactive oxygen species in pollen. PLoS Genetics. 12 (7), e1006228(2016).
  23. Lee, H. K., Goring, D. R. Two subgroups of receptor-like kinases promote early compatible pollen responses in the Arabidopsis thaliana pistil. Journal of Experimental Botany. 72 (4), 1198-1211 (2021).
  24. O'Malley, R. C., Barragan, C. C., Ecker, J. R. A user's guide to the Arabidopsis T-DNA insertion mutant collections. Pollen and Pollen Tube Biology. 1284, 323-342 (2015).
  25. Samson, F., et al. FLAGdb++: a database for the functional analysis of the Arabidopsis genome. Nucleic Acids Research. 32, D347-D350 (2004).
  26. Doucet, J., et al. Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 19 (1), 549(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bioanaliza in vivokompatybilność pyłek-stygmabioanaliza zapylaniabiałka otoczki pyłkupowierzchnia stygmyanaliza pojedynczych ziarensekcja pąka kwiatowegoanaliza obrazu
Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.