Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół szybkiej perfuzji krwi do przygotowania próbek tkanek od afrykańskich żab szponiastych do badań transkryptomicznych i proteomicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skuteczna szybka perfuzja krwi w Xenopus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Xenopus od ponad 100 lat są potężnymi organizmami modelowymi do zrozumienia rozwoju i chorób kręgowców. W tym miejscu zdefiniowano protokół szybkiej perfuzji krwi w Xenopus, mający na celu konsekwentne i drastyczne zmniejszenie ilości krwi we wszystkich tkankach. Perfuzję przeprowadza się poprzez włożenie igły bezpośrednio do komory serca i pompowanie heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez układ naczyniowy. Zabieg można wykonać w około 10 minut na zwierzę. Krew jest zdominowana przez kilka bardzo obfitych białek i typów komórek, co powoduje liczne problemy, ponieważ białka te maskują większość innych cząsteczek i typów komórek. Powtarzalna charakterystyka dorosłych tkanek Xenopus za pomocą proteomiki ilościowej i transkryptomiki pojedynczych komórek przyniesie korzyści dzięki zastosowaniu tego protokołu przed pobraniem próbek narządów. Protokoły pobierania próbek tkanek są określone w dokumentach towarzyszących. Procedury te mają na celu standaryzację praktyk stosowanych w Xenopus dla osób różnej płci, wieku i stanu zdrowia, w szczególności X. laevis i X. tropicalis.
Wprowadzenie
Perfuzja całego ciała jest rutynowo wykonywana w celu zachowania i utrwalenia1,2,3,4,5,6. Procedury te odbywają się jednak w tempie, które ogranicza liczbę świeżych próbek, które można pobrać na zwierzę. Celem tej pracy jest opracowanie skutecznego protokołu perfuzji krwi w Xenopus, przy czym priorytetem jest szybkość techniki. Protokół zajmuje mniej niż 10 minut na zwierzę w przypadku X. tropicalis i mniej niż 15 minut na zwierzę X. laevis. Drugorzędnymi priorytetami są łatwość replikacji i wykorzystanie łatwo dostępnego sprzętu, tak aby wysokiej jakości próbki mogły być szeroko udostępniane między laboratoriami Xenopus.
Żaby Xenopus są szeroko wykorzystywane w badaniach biomedycznych do badania podstawowych procesów biologicznych i patologicznych zachodzących u różnych gatunków. Ten czworonóg ma bliższe ewolucyjne pokrewieństwo ze ssakami niż inne modele wodne, ma płuca, trójkomorowe serce i kończyny z palcami. Społeczność międzynarodowa skutecznie wykorzystuje Xenopus do głębszego zrozumienia chorób u ludzi poprzez dogłębne modelowanie chorób i analizę molekularną funkcji genów związanych z chorobą. Liczne zalety Xenopus jako modelu zwierzęcego sprawiają, że są one nieocenionymi narzędziami do badania molekularnych podstaw rozwoju i chorób człowieka; Do zalet tych należą: duży rozmiar oocytów i zarodków, wysoka płodność, łatwość utrzymania, szybki rozwój zewnętrzny i łatwość manipulacji genomem. Szacuje się, że Xenopus ma ~80% zidentyfikowanych genów chorób u ludzi7.
W porównaniu do popularnych modeli ssaków, Xenopus jest szybkim, opłacalnym modelem, z łatwością eliminacji morfolino i dostępnością wydajnych transgeników i ukierunkowanych mutacji genów za pomocą CRISPR8. Ilościowa spektrometria mas i transkryptomika pojedynczych komórek zostały z powodzeniem zastosowane do zarodków Xenopus9,10, ale niedawny atlas komórek z Xenopus laevis pokazuje, że skład większości tkanek jest zdominowany przez typy komórek krwi11. Dzięki opracowaniu techniki, która wykrwawia tkankę w szybkim tempie i użyciu schłodzonych pożywek, perfuzja ma minimalny wpływ na świeżość próbki. Jest to szczególnie ważne w zastosowaniach, w których celem jest profilowanie fizjologicznie niezakłóconej ekspresji mRNA lub białka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
UWAGA: Chociaż opisana podstawowa metoda eutanazji jest uważana za akceptowalną technikę eutanazji przez Amerykańskie Stowarzyszenie Lekarzy Weterynaryjnych12, nie stwierdzono, aby prowadziła do ustania bicia serca13. Nie zapobiega temu nawet często stosowana wtórna metoda podwójnego wbijania, podobnie jak usunięcie serca ze zwierzęcia. Wykrwawienie znieczulonych zwierząt jest uważane za humanitarną i skuteczną metodę udanej eutanazji12. Ponieważ utrzymanie świeżych tkanek poprzez eutanazję jest celem tego protokołu, korzystne jest, aby serce nadal biło przez pierwotną eutanazję z MS-222, a perfuzja sama w sobie jest wtórną metodą eutanazji poprzez wykrwawienie.
1. Przygotowanie
- Upewnij się, że instytucja badawcza zatwierdziła technikę eutanazji i perfuzji opisaną w niniejszym protokole.
- Przygotować roztwór 5 g/l MS-222 (metanosulfonian trikainy) i 5 g/l wodorowęglanu sodu. Objętość powinna być większa niż objętość wymagana do całkowitego pokrycia zwierząt poddawanych eutanazji. Sprawdź pH, aby upewnić się, że wynosi ≥7.
- Przygotować 500 μl 180 j/ml heparyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na X. laevis lub 200 μl na X. tropicalis.
- Przeprowadzić pierwotną eutanazję, umieszczając Xenopus w tym roztworze (od kroku 1.2); zwierzę pozostanie zanurzone łącznie przez 1 godzinę.
- Potwierdź, że Xenopus utracił reakcję na ból, ściskając stopę po 15 minutach eutanazji. Jeśli zwierzę jest reaktywne, należy je umieścić z powrotem w roztworze do eutanazji, aż do utraty tej reakcji.
- Zważyć Xenopus i wykonać wszelkie dodatkowe wymagane pomiary przed pobraniem próbki.
- Za pomocą igły o sile 31 g wstrzyknąć X. laevis 250 μl, a X. tropicalis 100 μl 180 μl heparyny w PBS (od kroku 1.3) do mięśni każdej kończyny przedniej.
- Przygotować roztwór o stężeniu 1 ml/g hemaryny o masie zwierzęcia 54 j/ml w perfuzacie PBS. Osoby bardziej doświadczone w tym protokole mogą stwierdzić, że do zakończenia perfuzji potrzeba mniej pożywki.
- Użyj igły podskórnej 22 G do perfuzji X. laevis i igły podskórnej 25 G do X. tropicalis. Stęp igłę perfuzyjną, odcinając końcówkę nożycami do drutu (Rysunek 1)14.
UWAGA: Zmniejsza to prawdopodobieństwo perforacji igły przez komorę w przypadku przesunięcia. Oprócz stępienia, igła może być lekko zeszlifowana kamieniem lub pilnikiem do ostrzenia, ale nadal pozostaje wystarczająco ostra, aby przebić komorę. - Przygotować pompę, zakładając przyciętą igłę i wprowadzając w obieg 54 U/ml heparynizowanego perfuzatu PBS (od kroku 1.8). Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z rurki, aby wyeliminować możliwość zatorowości powietrznej, która prowadzi do zmniejszenia wydajności perfuzji lub awarii (patrz Tabela 1). Utrzymuj podłoże perfuzyjne na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
- Jeśli pompa nie jest programowalna, z założoną igłą zmierz objętość pompowanej pożywki przy różnych ustawieniach, aby określić, które ustawienia są najbliższe 5 ml/min i 10 ml/min. Te natężenia przepływu będą stosowane niezależnie od gatunku. Jeśli pompa perfuzyjna jest programowalna, skalibruj ją z założoną igłą, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Umieść powierzchnię preparacyjną (tacę lub arkusz pianki) pod nachyleniem w pojemniku wtórnym lub ułóż ją tak, aby ułatwić drenaż krwi.
- Gdy żaba znajduje się w roztworze przez 1 godzinę, pierwotna eutanazja została zakończona. Usuń żabę i ponownie sprawdź utratę reakcji na ból, wykonując uszczypnięcie stopy.
- Połóż żabę na grzbiecie i przypnij każdą kończynę (Rysunek 2). Jeśli wymagane jest zachowanie tkanki kończyn, cienkie szpilki można umieścić w palcach lub zszywkach w kształcie litery U wokół kończyn.
- Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę, w górę linii środkowej, a następnie bocznie, tworząc dwie klapy. (Rysunek 2)
- Użyj kleszczy, aby chwycić kresę białą i odciągnąć ją od jamy celomicznej (Ryc. 3). Ostrożnie użyj nożyczek, aby przeciąć mięśnie. Wykonaj dwie klapy ze ściany wnęki i odetnij lub przypnij wszystkie klapki.
- Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć kości krucze i odciąć nadmiar tkanki, aby uzyskać lepszy dostęp do serca (Ryc. 3).
- Serce powinno nadal bić. Jeśli serce przestało bić przed perfuzją, należy zauważyć, że świeżość próbki została zagrożona.
2. Perfuzja
- Zidentyfikuj żołądek i delikatnie przesuń go tak, aby znalazł się na lewym płacie wątroby (po prawej stronie widza), z widocznym unaczynieniem przez cały czas trwania zabiegu. Zidentyfikuj płuco i chwyć je za końcówkę za pomocą kleszczy tkankowych. Wyciągnij płuco na zewnątrz jamy celomicznej i przełóż je przez końcówkę (Rysunek 4). Rób to delikatnie, ponieważ uszkodzone naczynia krwionośne nie ulegają dobrej perfuzji. Zwróć uwagę, czy krew jest widoczna w płacie, ponieważ wpłynie to na zdolność do określenia zakończenia procedury.
- Zrób zdjęcie jamy celomicznej, aby lepiej ocenić wydajność perfuzji i potencjalnie zidentyfikować nieprawidłowe tkanki w późniejszym terminie.
- Zidentyfikuj cienkie osierdzie i pociągnij je za pomocą kleszczyków tkankowych (Ryc. 5). Delikatnie przedziurawić osierdzie za pomocą końcówki nożyczek do irydektomii, uważając, aby nie przeciąć leżących pod nią tkanek. Obierz osierdzie z dala od trzech komór serca.
- Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić komorę za jej wierzchołek. Zastosuj ograniczony nacisk, aby między powierzchniami trakcyjnymi kleszczy było wystarczająco dużo miejsca, aby igła perfuzyjna mogła przejść (Rysunek 6).
- Wbić igłę przez zamknięcie kleszczyków do komory komory, uważając, aby nie przebić się przez komorę (Rysunek 7). Zacisnąć kleszczyki tkankowe na miejscu za pomocą uchwytu na igłę za pomocą hemostat.
UWAGA: Ta technika stabilizuje pozycję igły, która jest nadal ostra. Zaciśnięcie igły bezpośrednio na komorze również spowoduje niepotrzebne uszkodzenie, co utrudni ponowne zaciśnięcie, jeśli będzie to wymagane (patrz Tabela 1). - Uruchomić przepływ pompy przy około 5 ml/min. Trzy komory serca i pnia tętniczego będą nabrzmiewać (Ryc. 8; patrz Tabela 1).
- Nożyczkami ostrożnie nakłuj prawą małżowinę uszną (po lewej stronie widza), a wyleje się krew. Ustaw natężenie przepływu na 5 ml/min lub zwiększ je do 10 ml/min.
- Kontynuuj, aż układ naczyniowy żołądka zblednie (patrz Tabela 1), a następnie nakłuj lewą małżowinę uszną serca (po prawej stronie widza). Jeśli natężenie przepływu nadal wynosi 5 ml/min, zwiększ je do około 10 ml/min.
- Za pomocą pipety transferowej przepłukać jamę celomiczną w podłożu perfuzyjnym, aby pomóc w utrzymaniu widoczności i lepszej ocenie koloru perfuzatu wypływającego z małżowin usznych.
- Trzymać igłę na miejscu, aż perfuzat wypływający z małżowin usznych stanie się czysty (patrz Tabela 1), a płuco utraci swój czerwony odcień (patrz Tabela 1; Rysunek 9).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po pomyślnej perfuzji wszystkie tkanki (z wyjątkiem wątroby u pigmentowanych Xenopus) będą wyraźnie jaśniejsze i mniej nasycone krwią. Główne naczynia krwionośne staną się mniej widoczne (Rysunek 10), a tkanki (z wyjątkiem wątroby) będą wypłukiwać się czysto w buforze po pobraniu próbek. Choć pomyślne wykonanie protokołu można ostatecznie potwierdzić jedynie na podstawie jakości danych z próbek tkanek odkrwawionych, w tabeli rozwiązywania problemów (Tabela 1 oraz
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje tradycyjne techniki preparacji w celu uzyskania dostępu do jamy celomicznej. Inne techniki są również dopuszczalne, pod warunkiem, że powodują minimalne uszkodzenia tkanek, serce jest dostępne, a płuca i żołądek są widoczne. Podobnie, większość wymienionych narzędzi preparacyjnych można łatwo zastąpić porównywalnymi przedmiotami.
Chociaż podjęto próby optymalizacji skuteczności tej procedury, wyniki mogą się różnić w zależności od doświadczenia i zmienności między poszczeg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez OD031956 grantowe NIH OD R24 i HD073104 grantowe NICHD R01. Dziękujemy Darcy Kelly za pomocne dyskusje i wstępny wkład w ten protokół. Chcielibyśmy również podziękować Samancie Jalbert, Jill Ralston i Wilowi Ratzanowi za ich pomoc i wsparcie, a także naszym trzem anonimowym recenzentom za ich opinie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5x Szkło powiększające z oświetleniem LED i podstawą | amazon.com | B08QJ6J8P1 światło nie może wytwarzać ciepła | |
| Jednorazowe pipety przesyłowe | VWR | em>414004-036 | |
| Kleszcze preparacyjne drobno spiczaste | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Nożyczki preparacyjne ostre, proste 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Taca preparcyjna | Fisher Scinetific | 14-370-284 | arkusze styropianu są akceptowalną alternatywą |
| pojemnik do eutanazji | US Plastic | Item 2860 | alternatywnych nieprzezroczystych pojemników dopuszczalne |
| pokrywy pojemnika do eutanazji | US Plastic | Item 3047 | |
| Drobne szpilki preparacyjne | Living Systems Oprzyrządowanie | PIN-#3 | |
| Igły podskórne ogólnego zastosowania, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | do X. laevis |
| Igły podskórne ogólnego zastosowania, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | do X. tropicalis |
| Heparyna, błona | śluzowa jelit świńNożyczki | 37-505-410MG | |
| 6" | vwr | 470018-938 | nożyczki do irysów są akceptowalną alternatywą |
| Adapter Luer-to-Barb męski Luer z pierścieniem blokującym | amazon.com B09PTX6M2Z | rozmiar będzie zależał od węża używanej pompy | |
| Uchwyt na igły Mayo-Hegar | Fisher Scinetific | 08-966 | są akceptowalną alternatywą |
| MS-222: Syncaina (dawniej trikaina) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Perystaltyczna pompa dozująca ciecz 5– 100 ml/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | dowolna pompa perystaltyczna zdolna do pompowania 5-10 ml / min jest dopuszczalna |
| Kamień do ostrzenia | VWR | 470150-112 | opcjonalnie; do matowienia igieł |
| Wodorowęglan sodu, proszek, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Kleszczyki do próbek, ząbkowane | VWR | 82027-442 | |
| Kołki teowe do preparowania | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultracienkie krótkie strzykawki insulinowe, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Przecinaki do drutu, 6-calowe ultra ostre i mocne boczne maszynki do strzyżenia | amazon.com B087P191LP |
Bibliografia
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
