Artykuł metodologiczny

Mysi model neowaskularyzacji rogówki za pomocą oparzenia alkalicznego

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65289

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Cullen Eye Institute, Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na neowaskularyzacji rogówki wywołanej oparzeniami alkalicznymi u myszy. Metoda ta pozwala na stworzenie powtarzalnego i kontrolowanego modelu choroby rogówki w celu zbadania patologicznej angiogenezy i związanych z nią mechanizmów molekularnych oraz przetestowania nowych środków farmakologicznych zapobiegających neowaskularyzacji rogówki.

Streszczenie

Neowaskularyzacja rogówki (CoNV), patologiczna forma angiogenezy, polega na wzroście naczyń krwionośnych i limfatycznych do beznaczyniowej rogówki z rąbka i niekorzystnie wpływa na przezroczystość i widzenie. Oparzenie alkaliczne jest jedną z najczęstszych form urazu oka, który prowadzi do CoNV. W tym protokole CoNV jest indukowany eksperymentalnie przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu w kontrolowany sposób, aby zapewnić odtwarzalność. Model oparzenia alkalicznego jest przydatny do zrozumienia patologii CoNV i może być rozszerzony o ogólne badanie angiogenezy ze względu na unaczynienie, przezroczystość i dostępność rogówki. W tej pracy CoNV analizowano przez bezpośrednie badanie pod mikroskopem preparacyjnym oraz przez barwienie immunologiczne płaskich rogówek przy użyciu mAb anty-CD31. Limfangiogenezę wykryto na płaskich rogówkach poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu mAb anty-LYVE-1. Obrzęk rogówki uwidoczniono i określono ilościowo za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT). Podsumowując, model ten pomoże udoskonalić istniejące testy neowaskularyzacji i odkryć nowe strategie leczenia patologicznej angiogenezy oka i zewnątrzgałkowej.

Wprowadzenie

Rogówka jest beznaczyniową tkanką, która zachowuje swoją przezroczystość poprzez ustanowienie przywileju angiogennego1,2. Uszkodzenie rogówki może skutkować stanem zapalnym oraz rozwojem naczyń krwionośnych i limfatycznych, a także zwłóknieniem3. Neowaskularyzacja rogówki (CoNV) prowadzi do upośledzenia wzroku i jest drugą najczęstszą przyczyną ślepoty na świecie4. CoNV dotyka około 1,4 miliona ludzi w Stanach Zjednoczonych rocznie5. CoNV może być wywołany przez różne czynniki, w tym oparzenia chemiczne, infekcje, stany zapalne i niedotlenienie3,6. Oparzenia chemiczne są jednym z najczęstszych nagłych przypadków ocznych i stanowią około 13,2% urazów oka i wymagają natychmiastowej oceny i leczenia7. Oparzenia chemiczne mogą być oparzeniami alkalicznymi lub kwasowymi, ale oparzenia alkaliczne powodują poważniejsze obrażenia, ponieważ zasady wnikają głębiej w tkankę8.

Mysie modele oparzeń alkalicznych są powszechnie używane do badania CoNV i gojenia się ran. W porównaniu z modelem angiogenezy kieszeni rogówkowej9,10, modele oparzeń alkalicznych są stosunkowo proste do stworzenia i mogą być również wykorzystywane do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i proliferacji nabłonka. Modele te są również ściślej związane z klinicznymi oparzeniami chemicznymi niż modele angiogenezy szwów rogówkowych11. W przypadku oparzenia zasadowego, w skądinąd beznaczyniowej rogówce rozwijają się naczynia krwionośne z powodu stanu zapalnego i braku równowagi czynników antyangiogennych i proangiogennych1,2. Wadami modeli oparzeń alkalicznych rogówki są trudności w kontrolowaniu obszaru i ciężkości oparzenia alkalicznego, zmienność neowaskularyzacji rogówki oraz niezamierzone spalenie sąsiednich tkanek z powodu nadmiaru roztworu alkalicznego. Celem tego badania jest opisanie kontrolowanego modelu oparzenia zasadowego rogówki u myszy przy użyciu bibuły filtracyjnej wstępnie nasączonej roztworem wodorotlenku sodu. Model ten może być wykorzystany do badania czynników angiogennych, antyangiogennych odczynników terapeutycznych oraz innych czynników i odczynników, które mogą modulować stan zapalny i zwłóknienie.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach, w tym procedury eksperymentalne i eutanazja, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Baylor College of Medicine z numerem protokołu AN-8790.

1. Przygotowanie 1 N NaOH

  1. Dodaj 4 ml sterylnej wody dejonizowanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odważyć 400 mg wodorotlenku sodu (NaOH) i ostrożnie dodać do probówki.
  2. Rozpuścić NaOH, powoli mieszając roztwór za pomocą szklanej pałeczki. Uzupełnić objętość do 10 ml, dodając sterylną wodę dejonizowaną do probówki, a następnie ponownie wymieszać, delikatnie obracając probówkę w górę i w dół. Zamknij szczelnie nakrętkę i przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej.
  3. Świeży roztwór należy przygotowywać co miesiąc, ponieważ stężenie roztworu NaOH może być zmniejszone przez roztwór absorbujący dwutlenek węgla z powietrza.
  4. Zawsze delikatnie wymieszaj roztwór NaOH przed użyciem.
    UWAGA: Przygotuj roztwór w kapturze chemicznym i noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).

2. Przygotowanie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA)

  1. Dodaj 30 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do szklanej zlewki. Odważyć 4 g paraformaldehydu (PFA) i dodać go do zlewki.
  2. Przechowywać zlewkę na gorącym talerzu w temperaturze 60 °C, mieszając. Dodawać kroplami 1 N roztwór NaOH, aby podnieść pH, aż roztwór się klaruje.
  3. Sprawdź i dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1 N kwasu solnego (HCl). Dostosuj końcową objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.
  4. Ostudzić i przefiltrować roztwór. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przygotuj roztwór w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.

3. Przygotowanie koktajlu ketamina/ksylazyna

  1. Przygotuj koktajl ketamina/ksylazyna, dodając 0,8 ml ketaminy (stężenie podstawowe: 100 mg/ml) i 0,16 ml ksylazyny (stężenie podstawowe: 100 mg/ml) do 9,4 ml soli fizjologicznej.
  2. Koktajl należy przechowywać w sterylnych butelkach do wstrzykiwań w temperaturze pokojowej (RT).

4. Oparzenie alkaliczne na rogówce myszy

  1. Meloksykam (4-6 mg/kg masy ciała) należy wstrzyknąć podskórnie 30 minut przed zabiegiem w celu złagodzenia bólu. Znieczulić myszy (C57BL/6J, 6-8 tygodni, samiec) za pomocą iniekcji dożylnej koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina 80 mg/kg i ksylazyna 16 mg/kg masy ciała).
  2. Sprawdź reakcję odruchową (wycofanie pedału), ściskając palce myszy i potwierdź brak odruchu. Nałóż jedną kroplę znieczulenia miejscowego, 0,5% proparakainy, na powierzchnię rogówki jednego oka i kroplę sztucznych łez na drugie oko.
  3. Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm wybij papierowe krążki filtracyjne Whatmana.
  4. Dodać 2 μl 1N NaOH do czystej szalki Petriego. Umieść krążek z bibuły filtracyjnej o średnicy 2 mm na kropli 1 N NaOH i pozwól mu moczyć się przez 15 sekund.
  5. Podnieś bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków i nałóż bibułę filtracyjną na oko potraktowane proparakainą w środku rogówki przez 30 s.
    UWAGA: Bibuła filtracyjna musi dotykać tylko środka rogówki i należy zachować ostrożność, aby uniknąć przesuwania się bibuły filtracyjnej po umieszczeniu, ponieważ przesuwanie bibuły filtracyjnej może spowodować oparzenia sąsiednich tkanek.
  6. Przepłukać oko przez przepłukanie 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w sterylnej strzykawce.
    UWAGA: Należy zadbać o to, aby rogówka wraz z workiem spojówkowym została dokładnie umyta, aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu rogówki lub otaczającej tkanki. Mycie worka spojówkowego dodatkowo zapobiegnie symblefaronowi.
  7. Delikatnie wytrzyj nadmiar soli fizjologicznej z oczu i okolic za pomocą jednorazowych miękkich chusteczek. Następnie trzymaj myszy w klatce regeneracyjnej na ciepłej poduszce grzewczej do czasu rozpoczęcia chodzenia.
    UWAGA: Myszy są monitorowane codziennie po oparzeniu alkaliów przez 3 dni. W przypadku zaobserwowania objawów bólu lub stresu meloksykam (4-6 mg/kg masy ciała) podaje się podskórnie.

5. Badanie i ocena neowaskularyzacji i zmętnienia

  1. U znieczulonych myszy zbadaj oczy pod mikroskopem preparacyjnym w 10 dniu po oparzeniu i uzyskaj obrazy za pomocą kamery dołączonej do lunety sekcyjnej, aby ocenić zmętnienie i neowaskularyzację.
    UWAGA: Wystarczy zwykła luneta sekcyjna z dołączoną kamerą.
  2. Obserwując rogówkę przez mikroskop preparacyjny, oceń krycie po oparzeniu w oparciu o następującą skalę12:
    0 = brak krycia; przezroczysta rogówka
    1 = łagodne zmętnienie; lekkie zamglenie tęczówki i źrenic; Dobrze widoczna tęczówka i źrenica
    2 = umiarkowane krycie; tęczówka i źrenica ledwo widoczna
    3 = Silne zmętnienie; tęczówka lub źrenica niewidoczna
    4 = Nieprzezroczysta rogówka; tęczówka i źrenica niewidoczne
  3. Obserwując rogówkę przez mikroskop preparacyjny, oceń CoNV na podstawie następującej skali12:
    0 = Brak neowaskularyzacji; Brak nowych statków z limbus
    1 = łagodna neowaskularyzacja; Nowe statki pochodzące z limbus
    2 = umiarkowana neowaskularyzacja; Naczynia krwionośne wychodziły z rąbka i rosły w kierunku środka rogówki
    3 = ciężka neowaskularyzacja; naczynia krwionośne wychodzące z rąbka rogówki i sięgające i/lub przecinające środek rogówki
  4. Użyj testu t-Studenta, aby statystycznie porównać wyniki zmętnienia i neowaskularyzacji między oparzeniami alkalicznymi a zdrowymi grupami oczu.
  5. Poddaj myszy eutanazji w 10 dniu przez ekspozycję na izofluran w dawce 5% do 1 minuty po zatrzymaniu oddychania, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobranie rogówki do obrazowania płaskiego.

6. Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii (OCT)

  1. Wykonaj zdjęcia OCT przedniego odcinka oczu u znieczulonych myszy w 10 dniu po oparzeniu. Wykonaj akwizycję obrazu OCT jako skanowanie woluminu w trybie IR + OCT z polem widzenia 30° i intensywnością 100% podczerwieni.
  2. Określ ilościowo grubość rogówki za pomocą oprogramowania ImageJ.
  3. Aby zmierzyć grubość, użyj narzędzia Zaznaczanie linii w oprogramowaniu ImageJ, aby utworzyć linię prostą między przednią i tylną powierzchnią na centralnej rogówce.
  4. Kliknij opcję Analizuj > Mierz w narzędziach programowych, aby przenieść wartości do okna danych.
  5. Skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego i porównaj statystycznie grubość rogówki między oparzeniami alkalicznymi a zdrowymi grupami oczu za pomocą testu t-Studenta.
    UWAGA: Grubość rogówki to odległość od punktu na przedniej powierzchni rogówki do najbliższego punktu na tylnej powierzchni rogówki w środku rogówki.

7. Barwienie immunologiczne CoNV na płaskich rogówkach

  1. Myszy należy poddać eutanazji w 10 dniu po oparzeniu alkalicznym i wyłuszczeniu oczu przez rozwarstwienie.
  2. Rozsuń powieki kciukiem i palcem wskazującym, a następnie umieść kleszcze pod gałką oczną. Zamknij kleszcze i delikatnie oderwij gałkę oczną od oczodołu.
  3. Umieść gałki oczne w 1x PBS. Dla każdej gałki ocznej usuń rogówkę z gałki ocznej, wykonując najpierw nacięcie za pomocą igły 30 G poniżej obszaru rąbka.
  4. Przetnij obszar rąbka za pomocą mikronożyczek rogówki, z nacięciem jako punktem wyjścia, i powoli oddziel rogówkę i rąbek od gałki ziemskiej.
  5. Delikatnie oczyść rogówki za pomocą cienkiego pędzla, aby usunąć tęczówkę. Utrwal rogówki w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę.
  6. Umyj rogówki trzy razy po 20 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Inkubować w buforze blokującym (1x PBS uzupełniony 0,1% Triton-X 100 i 5% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Przenieść rogówkę do roztworu przeciwciała zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe. Przygotuj roztwór przeciwciała w 1x PBS uzupełniony 1% BSA, 0,1% Triton-X 100, mAb anty-CD31 sprzężonym z Dylight550 (1:100) i anty-LYVE-1 mAb sprzężonym z Alexa Fluor488 (1:100).
  9. Inkubować przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Umyć rogówki w 1x PBS trzy razy po 20 minut każda.
  10. Jądra należy barwić roztworem barwnika Hoechst (1:1 000) przez 5 minut w ciemności.
  11. Spłaszcz rogówki za pomocą promienistych nacięć i zamontuj je na wstępnie oczyszczonym szkiełku podstawowym za pomocą podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i wysusz szkiełka przez noc w ciemności przed analizą za pomocą mikroskopii konfokalnej.
  12. Zobrazuj płasko zamontowane rogówki za pomocą mikroskopii konfokalnej, łącząc pojedyncze obrazy stosu Z; użyj obiektywu 10x, laserów 488 nm i 561 nm oraz rozdzielczości 512 pikseli x 512 pikseli na plaster na nierezonansowych skanerach galwanowych.
  13. Określ ilościowo gęstość naczyń krwionośnych CD31+ i limfatycznych LYVE-1+ za pomocą oprogramowania ImageJ.
  14. Aby określić gęstość naczyniową, przekonwertuj obrazy konfokalne na obraz 8-bitowy.
  15. Wybierz Gęstość naczyń krwionośnych z wtyczek.
  16. Wybierz obszar zainteresowania na obrazie i kliknij OK. Pomiary otworzą się w nowym oknie danych.
  17. Skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego i porównaj statystycznie gęstość naczyniową między oparzeniami zasadowymi a zdrowymi grupami oczu za pomocą testu t-Studenta.
    UWAGA: CD31, zwana również cząsteczką adhezyjną komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM-1), jest cząsteczką adhezyjną komórek biorącą udział w angiogenezie i ulega silnej ekspresji w komórkach śródbłonka wczesnych i dojrzałych naczyń krwionośnych13. LYVE-1 (receptor hialuronowy śródbłonka naczyń limfatycznych-1) jest markerem powierzchni komórki na komórkach śródbłonka limfatycznego i może być stosowany jako marker limfangiogenezy14.

Wyniki

Niniejsze badanie opisuje metodę indukowania angiogenezy rogówki w oku myszy poprzez oparzenie zasadami. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu sekcyjnego (Rycina 1A,B) wykazały znacznie podwyższony stopień neowaskularyzacji i zmętnienia rogówek w grupie z oparzeniem zasadami (P < 0,05; Rycina 1C,D). Rogówki pobrane w 10. dniu poddano następnie barwieniu immunohistochemicznemu odpowiednio z użyciem przeciwciała mAb przeciwko CD31 dla naczyń krwionośnych oraz mAb przeciwko LYVE-1 dla naczyń limfatycznych (Rycina 2A-I). W grupie z oparzeniem zasadami po 10 dniach odnotowano znacznie wyższą gęstość naczyń krwionośnych i limfatycznych (odpowiednio P < 0,001 oraz P < 0,05; Rycina 2J,K). Zaobserwowano, że grubość rogówki, obrazowana i ilościowo oznaczana przy użyciu OCT (Rycina 3A,B), była znacznie większa w grupie z oparzeniem zasadami (P < 0,01; Rycina 3C).

Neowaskularyzacja rogówki, efekt oparzenia alkalicznego, wykresy porównawcze, zdrowie oczu, analiza mikroskopowa.
Rycina 1: Neowaskularyzacja i zmętnienie rogówki wywołane oparzeniem alkalicznym. (A,B) Neowaskularyzacja rogówki rozwijająca się z naczyń limbalnych w kierunku centrum rogówki w (B) oku myszy po oparzeniu alkalicznym (A) w porównaniu do zdrowego oka 10 dni po urazie. (C,D) Ilościowe określenie (C) neowaskularyzacji rogówki oraz (D) zmętnienia na panelach A i B (± SEM; t-test; *P < 0.05; n = 3 oczu, 1 oko/mysz). Czerwone strzałki wskazują limbus, a żółta strzałka wskazuje rozwijające się nowe naczynia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunofluorescencja CD31, LYVE oraz wykresy ilustrujące porównanie gęstości naczyń krwionośnych i limfatycznych.
Rycina 2: Neowaskularyzacja i limfangiogeneza rogówki wywołana oparzeniem alkalicznym. Immunohistochemia wykazała obecność naczyń krwionośnych (A,D,G) i limfatycznych (B,E,H) z zastosowaniem odpowiednio przeciwciał mAb anty-CD31 i anty-LYVE-1. (A-C) Zdrowa rogówka myszy. (D-I) Rogówka po oparzeniu alkalicznym 10 dni po urazie. (C,F,I) Nałożone na siebie obrazy sygnałów CD31 i LYVE-1. (G-I) Powiększone obrazy dla paneli D-F. Paski skali = (A-F) 200 µm oraz (G-I) 500 µm. (J,K) Ilościowe oznaczenie gęstości naczyń krwionośnych i limfatycznych w panelach A-F, zgodnie z oznaczeniami (± SEM; t-test; *P < 0.05; ***P < 0.001; n = 3 oczy, 1 oko/mysz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Porównanie grubości rogówki w OCT. Schemat z wykresem słupkowym pokazujący wyniki dla grupy zdrowej i po oparzeniu zasadą.
Rysunek 3: Zwiększenie grubości rogówki spowodowane oparzeniem zasadą. (A) Obraz OCT zdrowego oka myszy. (B) Obraz OCT rogówki myszy 10 dni po oparzeniu zasadą. (C) Ilościowe określenie grubości rogówki na panelach A i B, pomiar wykonany w centrum rogówki (± SEM; t-test; **P < 0.01; n = 3 oczy, 1 oko/mysz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Rogówka jest doskonałą tkanką do badania angiogenezy i stanu zapalnego, ponieważ jest dostępna i unaczyniona, co oznacza, że neowaskularyzację można wygodnie wykryć i udokumentować. Oparzenie rogówki u królików, szczurów i myszy wykorzystano do badania angiogenezy rogówki, stanu zapalnego i zmętnienia, owrzodzenia, perforacji rogówki i zwłóknienia 15,16,17. Co więcej, mysi model oparzenia rogówki jest cenny dla testowania różnych strategii terapeutycznych w zakresie angiogenezy i stanu zapalnego, ponieważ myszy mają układ odpornościowy ściśle spokrewniony z układem odpornościowym ludzi. Dostępność technik genetycznej manipulacji genomem myszy sprawia, że gatunek ten jest również doskonałym wyborem do tegotypu badań. Wyzwaniem w tych badaniach było opracowanie metody spalania rogówki, która zapewnia spójną, powtarzalną patofizjologię.

Model oparzeń alkalicznych jest szczególnie przydatny w farmakologicznych badaniach przesiewowych leków, które modulują angiogenezę, stan zapalny i zwłóknienie. Minimalne wymagania dotyczące odczynników i zasobów, prostota wykonywania spalania alkalicznego oraz korzyści płynące z krótkiego czasu trwania protokołu i bezpośredniej obserwacji wyników sprawiają, że oparzenie alkaliczne rogówki myszy jest podstawowym wyborem do badań przesiewowych leków farmakologicznych. Jednak podczas wykonywania tej procedury należy wziąć pod uwagę kilka środków ostrożności, aby zapewnić spójność i odtwarzalność. Po pierwsze, bibułę filtracyjną należy umieścić na środku rogówki, aby uniknąć poparzenia innych obszarów oka, zwłaszcza rąbka, powiek i spojówki; po drugie, objętość i stężenie NaOH powinny być odpowiednie, aby uzyskać spójne wyniki spalania alkalicznego na rogówce. Filtr nie może być mokry, ale powinien być namoczony w roztworze NaOH. Rozmiar i typ filtra oraz normalność i objętość roztworu stosowanego w tej metodzie są zoptymalizowane w celu uniknięcia przepełnienia NaOH. Użycie bibuły filtracyjnej o innym rozmiarze lub większej lub mniejszej objętości NaOH spowodowałoby niespójności w neowaskularyzacji. Po trzecie, ważne jest, aby zapobiec absorpcji CO2 przez roztwór NaOH w powietrzu w pomieszczeniu poprzez natychmiastowe dokręcenie nakrętki rurki roztworu po użyciu i zmniejszenie stosunku powietrze/roztwór. Należy zachować ostrożność, aby używać świeżych roztworów alkalicznych, aby zapobiec niespójnościom w neowaskularyzacji i uniknąć owrzodzenia rogówki. Na koniec konieczne jest dokładne przemycie całego roztworu NaOH z oka i spojówki solą fizjologiczną, aby zapobiec dalszym uszkodzeniom rogówki i otaczających tkanek oka. Dokładne umycie rogówki i sąsiednich tkanek również zapobiegnie symblepharonowi.

Opisany tutaj protokół jest skuteczną i wiarygodną metodą badania patofizjologii angiogenezy rogówki. Protokół ten może być dalej wykorzystywany do badania zapalenia rogówki, zwłóknienia i gojenia się ran.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, oraz nieograniczony grant instytucjonalny od Research to Prevent Blindness (RPB) dla Wydziału Okulistyki, Baylor College of Medicine. W.L. jest wspierany przez The Knights Templar Eye Foundation Endowment in Ophthalmology.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwańHospiraKL-7302
30 G IgłaMcKesson16-N3005
A1R Konfokalneinstrumenty Nikon
Novus BiologicalsNB100-1642R
Anti-LYVE-1Life technologies53-0443-82
Moduł ASMHeidelberg InżynieriaObiektyw przedniego odcinka
Stempel do biopsjiMcKesson16-1309
BSAThermoscientific9048-46-8
Szkiełko nakrywkoweVWR International22X22-1-601640G
Mikroskop preparacyjnyAmScopeSM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-GMikroskopia elektronowa Sciences17984-25
KleszczeNarzędzia do nauki15000-02
KleszczeNarzędzia do nauki11049-10
KleszczeFisherbrand12-000-157
Kleszcze RobozRS-4905
Hypromeloza Gonak Akorn17478006412
GraphPad Prism 9GraphPad Sotware, Inc
Poduszka grzewczaK& H Produkty dla zwierząt 100213018
HoeschtLife Technologies62249
HRA + OCT SpectralisHeidelberg Engineering
insulinowaMckesson102-SN310C31516P
KimwipeKimberly Clark Professional34155
Szkło z mikro osłonąVWR48366-067
Nożyczki mikroskopoweRobozRS-5110
Szkiełko mikroskopoweFisherbrand12-550-15
NaOHSigma Aldrich55881-500G
Siarczany neomycyny i polimyksyny B oraz deksametazon Bausch & Lomb24208-0795-35
Normalna surowicaJackson Immuno008-000-121
ParaformaldehydSigma Aldrich158127-500G
PBSGibco20012-027
Proparakaina HClBausch & Lomb24208073006
SalineHenry Schein1531042
SMZ125Nikon Instruments
10 mlMcKesson16-S10C
Triton X-100Sigma AldrichTX1568-1
Whatmann Bibułafiltracyjna CytivaWHA1003323
Anti-CD31 Strzykawka Strzykawka

Bibliografia

  1. Ellenberg, D., et al. Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).
  2. Azar, D. T. Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).
  3. Rolfsen, M. L., et al. Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies. Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).
  4. Skobe, M., Dana, R. Blocking the path of lymphatic vessels. Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).
  5. Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. Ocular neovascularization: An epidemiologic review. Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).
  6. Su, W., et al. Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).
  7. Lasagni Vitar, R. M., et al. Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study. Frontiers in Medicine. 8, 733538(2021).
  8. Said, D. G., Dua, H. S. Chemical burns acid or alkali, what's the difference. Eye. 34, 1299-1300 (2020).
  9. Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).
  10. Kenyon, B. M., et al. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).
  11. Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation. Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).
  12. Yoeruek, E., et al. penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  13. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  14. Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  15. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  16. Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound. Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).
  17. Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. Corneal neovascularization. Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).
  18. Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity. Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021(2019).
  19. vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism. Genome Biology. 12 (6), 224(2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model oparzenia alkalicznegorog wka myszyangiogeneza ocznauszkodzenie wodorotlenkiem soduimmunobarwienie rog wkioptyczna koherentna tomografiadetekcja limfangiogenezybarwienie naczy krwiono nychobrz k rog wki

Powiązane artykuły