Artykuł metodologiczny

Ulepszona technika wykrywania trimetyloaminy w medycynie pochodzenia zwierzęcego za pomocą chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas w przestrzeni czołowej

DOI:

10.3791/65291

⸱

10 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd, 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Shimadzu (China) Co., Ltd

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisana jest metoda chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas (HS-GC-MS/MS) odpowiednia do oznaczania trimetyloaminy (TMA) w lekach pochodzenia zwierzęcego. Protokół obejmuje wstępną obróbkę próbki, obróbkę w przestrzeni nad głową, warunki analizy, walidację metodologiczną oraz oznaczanie TMA w lekach pochodzenia zwierzęcego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leki pochodzenia zwierzęcego mają charakterystyczne cechy i znaczące efekty lecznicze, ale większość z nich ma wyraźny rybi zapach, co skutkuje słabym przestrzeganiem zaleceń przez pacjentów klinicznych. Trimetyloamina (TMA) jest jednym z kluczowych składników rybiego zapachu w medycynie pochodzenia zwierzęcego. Trudno jest dokładnie zidentyfikować TMA przy użyciu istniejącej metody wykrywania ze względu na zwiększone ciśnienie w fiolce z przestrzenią nad głową spowodowane szybką reakcją kwasowo-zasadową po dodaniu ługu, co powoduje ucieczkę TMA z fiolki z przestrzenią nad głową, hamując postęp badań nad rybim zapachem medycyny pochodzenia zwierzęcego. W tym badaniu zaproponowaliśmy metodę kontrolowanej detekcji, która wprowadziła warstwę parafiny jako warstwę izolacyjną między kwasem a ługiem. Szybkość produkcji TMA można skutecznie kontrolować poprzez powolne upłynnianie warstwy parafiny poprzez termostatyczne ogrzewanie pieca. Metoda ta wykazała zadowalającą liniowość, precyzyjne eksperymenty i odzyski z dobrą odtwarzalnością i wysoką czułością. Zapewniła wsparcie techniczne w zakresie dezodoryzacji leków pochodzenia zwierzęcego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leczenie chorób ludzkich za pomocą produktów pochodzących z części zwierząt i/lub ich produktów ubocznych (określanych tutaj jako leki pochodzenia zwierzęcego) cieszy się coraz większą uwagą. Odgrywają ważną rolę w leczeniu raka, chorób układu krążenia, marskości wątroby, zapalenia wymienia i innych chorób, z zaletami silnego działania, małych dawek oraz znaczącej i specyficznej skuteczności klinicznej. Jednak leki pochodzenia zwierzęcego mają na ogół wyraźny rybi zapach, który znacznie wpływa na przestrzeganie zaleceń przez pacjentów i jest szczególnie niekorzystny dla dzieci1,2. Rybi zapach pochodzi głównie z białek, aminokwasów, tłuszczów i innych substancji zawartych w leku, które są rozkładane przez utlenianie kwasów tłuszczowych, degradację aminokwasów i inne sposoby wytwarzania różnych substancji o rybim zapachu2,3,4. Wśród nich trimetyloamina (TMA) jest lotnym gazem o rybim zapachu, który powszechnie występuje w gnijącej lub zgniłej żywności pochodzenia zwierzęcego5.

Do tej pory chromatografia gazowa (GC), chromatografia cieczowa (LC), chromatografia jonowa, spektrofotometria, chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS) oraz metody sensoryczne były powszechnie używane do wykrywania TMA w środowisku, żywności i moczu6,7,8,9. Ze względu na niskie zanieczyszczenie kolumny GC i systemu iniekcyjnego, a także wysoką czułość, odtwarzalność i niską granicę wykrywalności (0,1-1 mg/kg), do analizy żywności i biologicznej preferowano metodę chromatografii gazowej ze spektrometrią mas w przestrzeni nadpowierzchniowej (HS-GC-MS)8. Obecnie tylko Chiny ustanowiły krajowy standard TMA w żywności, a HS-GC-MS jest pierwszą metodą w standardzie GB5009.179-201610. Dlatego powyższa metoda HS-GC-MS została wybrana do wykrywania TMA w medycynie pochodzenia zwierzęcego. Na wczesnym etapie nasza grupa badawcza odkryła, że standard wykrywania HS-GC-MS TMA w żywności może wykryć rybi zapach w kilku lekach pochodzenia zwierzęcego. W połączeniu z wynikami badań11,12, można udowodnić, że TMA jest powszechną kluczową substancją o rybim zapachu w lekach pochodzenia zwierzęcego. Stwierdzono jednak, że odtwarzalność wyników eksperymentalnych była słaba i występowały problemy, takie jak ucieczka TMA i słaba stabilność, których nie można było zweryfikować za pomocą metodologii. Może to wynikać z faktu, że ług został wstrzyknięty do fiolki z przestrzenią nad głową, a szybka reakcja kwasowo-zasadowa doprowadziła do wzrostu ciśnienia w fiolce, a tym samym TMA uciekło z porów iniekcji, uniemożliwiając stabilne i dokładne wykrycie TMA. W związku z tym w ramach tego badania zaproponowano ulepszoną metodę wykrywania metodą chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas (HS-GC-MS/MS) w celu rozwiązania tych problemów.

Protokół poprawia wstępną obróbkę próbki poprzez separację reagentów kwasowo-zasadowych w procesie wstępnej obróbki za pomocą stałej parafiny, dobrego materiału zmiennofazowego ciało stałe-ciecz. Ponieważ parafina powoli skraplała się wraz ze wzrostem temperatury pieca termostatycznego, TMA był również powoli uwalniany w szczelnie zamkniętej fiolce z przestrzenią nad głową, unikając wzrostu ciśnienia spowodowanego gwałtowną i szybką reakcją kwasowo-zasadową oraz zapewniając stabilne i dokładne wykrywanie TMA. Co więcej, wstrzykiwanie przestrzeni nad powierzchnią w połączeniu z trybami monitorowania wielu reakcji (MRM)) w GC-MS/MS skutecznie stłumiło zakłócenia chemiczne matrycy i zapewniło wiarygodność wyników. Wyniki walidacji metodologicznej dowiodły, że liniowość, precyzja testu i współczynnik odzysku ulepszonej metody wykrywania mogą spełnić wymagania, zapewniając dobrą odtwarzalność i wysoką czułość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje na temat materiałów leczniczych Pheretima, Periplaneta americana i Hirudo. Zostały one zidentyfikowane przez prof. Xu Runchuna z Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu jako wysuszone ciała Pheretima aspergillum (E. Perrier), Periplaneta americana L. i Whitmania pigra Whitman.

1. Pobieranie próbek

  1. Rozdrobnić Pheretima, Periplaneta americana i Hirudo za pomocą młynka do ziół (patrz Tabela Materiałów), przesiać proszek leczniczy przez standardowe sita do leków nr 2 (otwór sita: 0,8 mm) i nr 4 (otwór sita: 0,25 mm) i zebrać proszek między dwoma sitami, aby uzyskać wymaganą próbkę proszku.
    UWAGA: Pheretima po rozdrobnieniu jest puszysta, więc jej proszek nie musi być przesiewany.
  2. Pobrać 1 g proszku (z dokładnością do 0,001 g) do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 20 ml 5% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA) (patrz tabela materiałów) i homogenizować w temperaturze 1,000 rmin-1 przez 1 minutę za pomocą wysokoobrotowego homogenizatora dyspersyjnego.
  3. Po homogenizacji odwirować przy 1,717 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, dodać trochę chłonnej bawełny do szklanego lejka i przefiltrować supernatant do kolby miarowej o pojemności 50 ml.
  4. Powtórzyć powyższy proces ekstrakcji dwukrotnie z 15 ml i 10 ml 5% roztworu TCA. Połączyć filtrat i rozcieńczyć go do 50 ml 5% roztworem TCA.

2. Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotować 20% roztwór wodorotlenku sodu: odważyć 20 g wodorotlenku sodu i użyć wody dejonizowanej do utrwalenia objętości w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.
  2. Przygotować 5% roztwór TCA: zważyć 25 g TCA i użyć wody dejonizowanej do ustalenia objętości w kolbie miarowej o pojemności 500 ml.

3. Przygotowanie roztworu podstawowego wzorca TMA

  1. Przygotować wzorcowy roztwór podstawowy TMA: zważyć 0,0162 g próbki wzorcowej chlorowodorku TMA, rozpuścić ją w 5% roztworze TCA i ustalić objętość do 100 ml, równą stężeniu 100 μg/ml wzorcowego roztworu podstawowego TMA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj roztwór wzorcowy TMA: weź pewną objętość wzorcowego roztworu podstawowego TMA i rozcieńczaj go krok po kroku 5% roztworem TCA do stężeń 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/mL, 5 μg/ml i 10 μg/ml roztworu wzorcowego TMA.

4. Przetwarzanie przestrzeni nad próbką

  1. Dokładnie odważyć 2 ml roztworu wodorotlenku sodu i 0,5 g stałej parafiny (temperatura topnienia: 58-60 °C) w fiolce o pojemności 20 ml (patrz tabela materiałów).
  2. Umieścić fiolkę z przestrzenią nad głową w piekarniku nagrzanym do 70 °C na około 30 minut. Stała parafina całkowicie się topi.
  3. Wyjmij go i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej, aby parafina zastygła. Zestalona parafina uszczelni wodorotlenek sodu.
  4. Weź 2 ml każdego roztworu do ekstrakcji próbki i umieść go na warstwie parafiny, naciśnij nakrętkę i zamknij.
  5. Umieścić szczelnie zapieczętowaną fiolkę z przestrzenią nad głową na maszynie (patrz Tabela materiałów) w celu pomiaru.

5. Ustawienie warunków analizy HS-GC-MS/MS

  1. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami przestrzeni nad głową i warunkami GC-MS.
  2. Informacje o jonach znajdują się w Tabeli 3.

6. Standardowy rysunek krzywej

  1. Zapoznaj się z przetwarzaniem przestrzeni nad powierzchnią próbki w krokach 4.1-4.3, aby przygotować fiolkę z przestrzenią nad głową zawierającą ług i warstwę uszczelniającą parafinę.
  2. Odessać 2 ml roztworu wzorcowego TMA o stężeniu 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml i 10 μg/ml roztworu wzorcowego TMA do fiolki o pojemności 20 ml, zamknąć nakrętkę i zmierzyć na maszynie.

7. Test precyzji

  1. Zapoznaj się z przetwarzaniem przestrzeni nad powierzchnią próbki w krokach 4.1-4.3 w celu przygotowania fiolki z przestrzenią nad głową zawierającej ług i warstwę uszczelniającą parafinę.
  2. Odessać 2 ml 0,1 μg/ml roztworu wzorcowego TMA do fiolki o pojemności 20 ml z przestrzenią nad roztworem i zamknąć nakrętkę. Przeprowadzić sześć równoległych testów w maszynie zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

8. Eksperyment z szybkością odzysku

  1. Weźmy partię Pheretima, Periplaneta Americana i Hirudo (S02, S05, S07; Tabela 1) jako leki reprezentatywne dla eksperymentu dotyczącego wskaźnika odzysku.
  2. Pobrać kilka partii próbki proszku (S02, S05, S07) i piec je w piecu w temperaturze 50 °C przez 72 godziny, aż nie zostanie wykryty TMA.
  3. Zapoznaj się z metodą przygotowania próbki w sekcjach 4-6, aby wykryć zawartość TMA w pieczonym proszku leczniczym.
  4. Weź 1 g upieczonego proszku (z dokładnością do 0,001 g), umieść go w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 μl roztworu wzorcowego TMA.
    UWAGA: Stężenie roztworu wzorcowego TMA wynosi 100 μg/ml, 1000 μg/ml i 10000 μg/ml.
  5. Dodać 20 ml 5% roztworu TCA i homogenizować w temperaturze 1000 obr./min-1 przez 1 min.
  6. Po homogenizacji odwirować przy 1717 x g przez 5 minut, dodać trochę chłonnego bawełniaka do szklanego lejka i przefiltrować supernatant do kolby miarowej o pojemności 50 ml.
  7. Powtórzyć powyższy proces ekstrakcji dwukrotnie z 15 ml i 10 ml 5% roztworu TCA; połączyć filtrat i rozcieńczyć go do 50 ml 5% roztworem TCA.

9. Wyznaczanie granic wykrywalności (LOD) i kwantyfikacji (LOQ)

  1. Określić LOD na podstawie odpowiedniego stężenia, gdy stosunek sygnału do szumu (S/N) = 3.
  2. Określić granicę oznaczalności przez odpowiednie stężenie, gdy S/N = 10.

10. Oznaczanie zawartości próbki TMA

  1. Weź około 1 g drobnego proszku odpowiednio Pheretima, Periplaneta americana i Hirudo, wyekstrahuj próbkę zgodnie z powyższą metodą i oznacz ją na maszynie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematy ideowe zasady wstępnego przetwarzania i działania tego protokołu są pokazane odpowiednio w Rysunek 1 i Rysunek 2. Szczytowy czas TMA wynosił 2,3 minuty, z ostrym kształtem piku i bez zakłóceń ze strony innych zanieczyszczeń (Rysunek 3). Mierząc zakres liniowy 0,1-10 μg/ml roztworu wzorcowego TMA, ze stężeniem TMA jako odciętą i powierzchnią piku jako rzędną, narysowano krzywą wzorcową. Równanie regresji liniowej uzyskano jako y = 252...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leki pochodzenia zwierzęcego pochodzą z całego ciała, narządów lub tkanek, produktów fizjologicznych lub patologicznych, wydalin lub wydzielin oraz produktów przetworzonych pochodzenia zwierzęcego. TMA jest ważnym źródłem rybiego zapachu w lekach pochodzenia zwierzęcego; Jest to typowa substancja o nieprzyjemnym zapachu o bardzo niskim progu węchowym (0,000032 × 10-6 V/V) i silnym rybim zapachu13. Obecnie powszechnie stosowana metoda HS-GC-MS nie jest w stanie stabilnie i dokładnie wykr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82173991) oraz Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WirówkaBeckman Coulter Trading (Chiny) Co.SSC-2-0213
Młynek do chińskiej medycyny ziołowejZhejiang Yongkang Xi'an Fabryka sprzętu i farmaceutykówHX-200K
Piec konwekcyjnySanyo Electric Co., LtdMOV-112F
Decapper do aluminiowych nasadek 20 mmANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncV1750004
Waga elektronicznaShimadzu Corporation Japan
Chromatografia gazowa Spektrometria masShimadzu Corporation JapanTQ-8050 NX
Fiolka z przestrzenią nad powierzchniąTechnologie laboratoryjne ANPEL (Szanghaj) Inc
Fabryka biaomo w SzanghajuFJ200-SH
Wstępnie zmontowana nasadkaANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncL4150050
Próbka sitoFabryka sit Zhenxing/
SH-lotna aminaChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
Wodorotlenek soduChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Stały wosk parafinowySzanghaj Hualing Fabryka aparatów Kangfu20221112
Kwas trichlorooctowyChengdu Chron Chemicals Co., Ltd
Chlorowodorek trimetyloaminyChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
System ultraczystej wodySichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T
AUW220D Homogenizator 25760200 2022102001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50(2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318(2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062(2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009. 179-2016. , 12(2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. Odor olfactory measurement. , Japan Association on Odor Environment. Tokyo. (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Tagi

Analiza zapachu rybiegoparafina jako warstwa izolacyjnaprzygotowanie pr bekekstrakcja kwasem tr jchlorooctowymeksperyment dotycz cy odzyskuanaliza lek w zio owych

Powiązane artykuły