Artykuł metodologiczny

Kulki modyfikowane porfiryną do stosowania jako regulatory kompensacji w cytometrii przepływowej

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65294

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1bioAffinity Technologies

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje, jak koraliki kompensacyjne na bazie porfiryny do cytometrii przepływowej są przygotowywane przez reakcję funkcjonalizowanych aminą kulek polistyrenowych z porfiryną TCPP i odczynnikiem sprzęgającym amid EDC. Procedura filtracji jest stosowana w celu zmniejszenia produktów ubocznych cząstek stałych.

Streszczenie

Cytometria przepływowa może szybko scharakteryzować i określić ilościowo różne populacje komórek na podstawie pomiarów fluorescencji. Komórki są najpierw barwione jednym lub kilkoma odczynnikami fluorescencyjnymi, z których każdy jest funkcjonalizowany inną cząsteczką fluorescencyjną (fluoroforem), która wiąże się z komórkami selektywnie w oparciu o ich cechy fenotypowe, takie jak ekspresja antygenu na powierzchni komórki. Intensywność fluorescencji z każdego odczynnika związanego z komórkami można zmierzyć na cytometrze przepływowym za pomocą kanałów, które wykrywają określony zakres długości fal. Gdy stosuje się wiele fluoroforów, światło z poszczególnych fluoroforów często rozlewa się do niepożądanych kanałów detekcji, co wymaga korekty danych dotyczących intensywności fluorescencji w procesie zwanym kompensacją.

Cząstki kontrolne kompensacji, zazwyczaj koraliki polimerowe związane z pojedynczym fluoroforem, są potrzebne dla każdego fluoroforu użytego w eksperymencie znakowania komórek. Dane z cząstek kompensacyjnych z cytometru przepływowego są wykorzystywane do zastosowania poprawki do pomiarów intensywności fluorescencji. Protokół ten opisuje przygotowanie i oczyszczanie kulek kompensacyjnych polistyrenu kowalencyjnie funkcjonalizowanych odczynnikiem fluorescencyjnym mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfiną (TCPP) oraz ich zastosowanie w kompensacji cytometrii przepływowej. W niniejszej pracy funkcjonalizowane aminami kulki polistyrenowe poddano działaniu TCPP i odczynnika sprzęgającego amid EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu) o pH 6 i w temperaturze pokojowej przez 16 godzin z mieszaniem. Kulki TCPP wyizolowano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze o pH 7 w celu przechowywania. Jako produkt uboczny zaobserwowano cząstki związane z TCPP. Liczbę tych cząstek można zmniejszyć za pomocą opcjonalnego protokołu filtracji. Powstałe w ten sposób kulki TCPP z powodzeniem wykorzystano na cytometrze przepływowym w celu kompensacji w eksperymentach z ludzkimi komórkami plwociny znakowanymi wieloma fluoroforami. Koraliki TCPP okazały się stabilne po przechowywaniu w lodówce przez 300 dni.

Wprowadzenie

Porfiryny są przedmiotem zainteresowania w dziedzinie biomedycyny od wielu lat ze względu na ich właściwości fluorescencyjne i celujące w nowotwory1,2,3. Zastosowania terapeutyczne, takie jak terapia fotodynamiczna (PDT) i terapia sonodynamiczna (SDT), polegają na ogólnoustrojowym podawaniu porfiryny pacjentowi z rakiem, gromadzeniu się leku w guzie i miejscowej ekspozycji guza na światło laserowe o określonej długości fali lub ultradźwiękach. Wystawienie na działanie światła laserowego lub ultradźwięków prowadzi do wytworzenia przez porfirynę reaktywnych form tlenu, a następnie do śmierci komórki4,5. W diagnostyce fotodynamicznej (PDD) fluorescencja porfiryn jest używana do odróżniania komórek nowotworowych od normalnych komórek6. W tym kontekście, protoporfiryna IX, naturalna fluorescencyjna porfiryna, która gromadzi się w guzach po ogólnoustrojowym lub miejscowym wstrzyknięciu jej prekursora, kwasu 5-aminolewulinowego (5-ALA), jest używana do identyfikacji guzów podścielisk przewodu pokarmowego, raka pęcherza moczowego i raka mózgu7,8. Niedawno leczenie 5-ALA było badane jako podejście do wykrywania minimalnej choroby resztkowej w szpiczaku mnogim9. Nasze laboratorium wykorzystuje tetraaryloporfirynę TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksyfenylo)-21,23 H-porfinę) ze względu na jej zdolność do selektywnego barwienia komórek raka płuc i komórek związanych z rakiem w próbkach ludzkiej plwociny, co jest właściwością, która została wykorzystana w testach diagnostycznych opartych na szkiełkach i cytometrii przepływowej10.

Niektóre porfiryny są dwufunkcyjne, ponieważ mogą być używane jako środki terapeutyczne i diagnostyczne2,11. W badaniach biomedycznych takie dwufunkcyjne porfiryny są wykorzystywane do oceny, w jaki sposób ich zdolność do selektywnego namierzania i zabijania komórek nowotworowych jest funkcją ich struktury, a także jak wpływa na nią obecność innych związków12,13,14,15,16. Zarówno wychwyt komórkowy porfiryn, jak i ich cytotoksyczność można mierzyć na platformie cytometrii przepływowej w sposób wysokoprzepustowy. Widma absorpcyjne i emisyjne fluorescencyjnych porfiryn są złożone, ale większość platform cytometrii przepływowej jest wyposażona w urządzenia umożliwiające ich prawidłową identyfikację. Widmo absorpcyjne porfiryn fluorescencyjnych charakteryzuje się silnym pasmem absorpcji w zakresie 380-500 nm, znanym jako pasmo Soreta. Dwa do czterech słabszych pasm absorpcji są zwykle obserwowane w zakresie 500-750 nm (pasma Q)17. Niebieski laser o długości fali 488 nm, obecny w większości cytometrów przepływowych, lub laser fioletowy (405 nm) może generować światło o odpowiedniej długości fali do wzbudzenia porfiryn. Widma emisyjne porfiryn zazwyczaj wykazują piki w zakresie 600-800 nm18, co skutkuje bardzo małym pokrywaniem się widmowym z izotiocyjanianem fluoresceiny lub fluoroforami fikoerytryny (PE), ale znacznym nakładaniem się z innymi często stosowanymi fluoroforami, takimi jak allofikocyjanina (APC), a także fluorofory tandemowe, takie jak PE-Cy5 i inne. Dlatego w przypadku stosowania porfiryn w testach wielobarwnej cytometrii przepływowej, kontrole z pojedynczym fluoroforem są niezbędne, aby odpowiednio skorygować rozlanie się fluorescencji w kanałach innych niż ten wyznaczony do pomiaru fluorescencji porfiryny.

Idealnie, kontrole z pojedynczym fluoroforem używane do obliczania matrycy rozlewania dla panelu fluoroforów (zwane również "kontrolami kompensacyjnymi") powinny składać się z tego samego typu komórek co próbka. Jednak wykorzystanie próbki do tego celu nie jest optymalne, jeśli na początku jest bardzo mała próbka lub jeśli populacja docelowa w próbie jest bardzo mała (na przykład, jeśli chce się przyjrzeć minimalnej liczbie chorób resztkowych lub komórek rakowych we wczesnych stadiach choroby). Użyteczną alternatywą dla komórek są kulki sprzężone z tym samym fluoroforem, który jest używany do analizy próbki. Wiele takich koralików jest dostępnych na rynku; Te kulki są albo wstępnie oznaczone pożądanym fluoroforem (wstępnie znakowane kulki specyficzne dla fluoroforu)19,20, albo można do nich dołączyć fluorescencyjnie znakowane przeciwciało (koraliki wychwytujące przeciwciała)20,21. Podczas gdy komercyjne kulki kompensacyjne są dostępne dla wielu fluoroforów, takie kulki są niedostępne dla porfiryn, pomimo ich coraz częstszego stosowania w badaniach podstawowych i klinicznych.

Oprócz zachowania próbki i odpowiedniej wielkości populacji pozytywnych i negatywnych, inne zalety używania koralików jako kontroli kompensacji to łatwość przygotowania, niska fluorescencja tła i doskonała stabilność w czasie22. Potencjalną wadą stosowania kulek jako kontroli kompensacyjnej jest to, że widmo emisyjne przeciwciała fluorescencyjnego wychwyconego na kulkach może różnić się od widma emisji tego samego przeciwciała, które jest używane do znakowania komórek. Może to mieć szczególne znaczenie w przypadku korzystania z cytometru spektralnego przepływu20. W związku z tym opracowanie kulek jako kontroli kompensacji musi być przeprowadzone na cytometrze przepływowym, który będzie używany do testu, dla którego opracowywane są kulki. Co więcej, opracowanie kulek musi obejmować porównanie z komórkami znakowanymi tym samym fluorescencyjnym odczynnikiem barwiącym.

Tutaj opisujemy przygotowanie funkcjonalizowanych aminami kulek kompensacyjnych z polistyrenu TCPP, których mediana intensywności fluorescencji w kanale detekcji była porównywalna do intensywności komórek znakowanych TCPP w plwocinie, oraz ich użycie jako kontroli kompensacji cytometrii przepływowej. Autofluorescencja równoważnych, niefunkcjonalizowanych kulek była wystarczająco niska, aby można było je stosować jako kontrole z ujemną kompensacją fluorescencji. Ponadto koraliki te wykazały stabilność w przechowywaniu przez prawie 1 rok.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury muszą być wykonywane przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

1. Przygotowanie roztworu podstawowego TCPP, 1,0 mg/ml

UWAGA: To można przygotowywać co miesiąc.

  1. Za pomocą wagi analitycznej, szpatułki i bibuły wagowej odważyć 49,0-50,9 mg TCPP. Zaokrąglij wagę do 1/10 miligrama. Odłóż odmierzoną ilość TCPP na bok, aby chronić przed światłem.
    UWAGA: Użyj pistoletu statycznego, jeśli odczyt masy jest niestabilny.
  2. Określić wymagane ilości oczyszczonej wody i izopropanolu (IPA) z tabeli 1 na podstawie ilości TCPP zważonej w kroku 1.1. Dodać oczyszczoną wodę i izopropanol do szklanej zlewki o pojemności 100 ml i przykryć parafilmem w celu ochrony przed parowaniem.
  3. Określić wymaganą ilość wodorowęglanu sodu z tabeli 1 na podstawie ilości TCPP zważonej w kroku 1.1.
  4. Za pomocą wagi analitycznej, szpatułki i bibuły wagowej zważyć wymaganą ilość wodorowęglanu sodu oznaczoną w kroku 1.3. Zaokrąglić wagę do 1/10 miligrama.
    UWAGA: Użyj pistoletu statycznego, jeśli odczyt masy jest niestabilny.
  5. Dodać wodorowęglan sodu do 100 ml zlewki zawierającej oczyszczoną wodę i izopropanol. Przykryj roztwór parafilmem, aby chronić przed parowaniem.
  6. Umieść roztwór z kroku 1.5 na talerzu do mieszania i mieszaj, aż się rozpuści (ok. 10 min)
  7. Zmierzyć pH, aby upewnić się, że roztwór zawierający wodorowęglan sodu z kroku 1.6 ma pH między 9 a 10.
  8. Powoli dodawać TCPP zważony w kroku 1.1 do roztworu z kroku 1.7 i kontynuować mieszanie, aż się rozpuści (~30 min). Na tym etapie należy chronić przed światłem.
  9. Przechowywać w szklanym lub polipropylenowym pojemniku w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.

2. Przygotowanie roztworu buforowego kwasu 2-(N-morpholino)-etanosulfonowego (MES) i soli hemisodowej, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("bufor MES")

UWAGA: To musi być przygotowane w dniu użycia i przechowywane w temperaturze pokojowej.

  1. Odważ 2,50 g soli hemisodowej MES i dodaj ją do plastikowej butelki o pojemności 150 ml.
  2. Dodać 121 ml oczyszczonej wody i rozpuścić ręcznie, potrząsając, aż nie będzie widać ciała stałego.
  3. Zmierz pH buforu MES, aby upewnić się, że wynosi od 6 do 6,2.
  4. Przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia tego samego dnia.

3. N-(3-dimetanolaminopropylo)-N'-etylokarbodimid (EDC) w proszku

  1. Wyjmij proszek EDC z zamrażarki i pozostaw w temperaturze pokojowej do użycia w kroku 5.

4. Łączenie kulek polistyrenowych funkcjonalizowanych aminami z roztworem TCPP

  1. Dodać 4,3 ml 0,1 M roztworu buforowego MES przygotowanego w kroku 2 do probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  2. Wirować funkcjonalizowaną aminami zawiesinę kulek polistyrenowych (10 μm, 2,5% w/v) przez 60 s z maksymalną prędkością.
  3. Dodaj 288 μl tej świeżo wirowanej zawiesiny perełkowej do bufora MES z kroku 4.1.
  4. Wiruj roztwór MES/ściegu przez 15 sekund z maksymalną prędkością.
  5. Wirować roztwór TCPP o stężeniu 1 mg/ml przygotowany w kroku 1 przez 60 s z maksymalną prędkością.
  6. Dodać 1,20 ml świeżo zawirowanego roztworu podstawowego TCPP do zawiesiny MES/kulek z kroku 4.4.
  7. Obracaj zawieszenie MES/stopka/TCPP przez 15 s z maksymalną prędkością.
  8. Przykryj probówkę folią na czas przygotowywania roztworu EDC.

5. Przygotowanie roztworu podstawowego hydrochololidu (HCl) N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC)

UWAGA: Roztwór EDC łatwo się psuje i powinien być użyty natychmiast po przygotowaniu.

  1. Dodaj 20,0 ml oczyszczonej wody do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Odważyć 200 mg EDC HCl z kroku 3 i dodać go do wody (krok 5.1).
  3. Wiruj EDC HCL przez 15 s z maksymalną prędkością, aby uzyskać klarowny roztwór.

6. Przygotowanie rozwiązania roboczego EDC HCl/MES

UWAGA: Roztwór EDC HCl/MES łatwo się psuje i powinien być użyty natychmiast po przygotowaniu.

  1. Dodaj 54,0 ml roztworu buforowego MES (przygotowanego w kroku 2) do plastikowej butelki o pojemności 150 ml.
  2. Dodać 6,0 ml roztworu podstawowego HCl EDC (przygotowanego w kroku 5) do roztworu buforowego MES i mieszać przez wytrząsanie przez 10 s.

7. Oznaczanie koralików za pomocą TCPP

  1. Dodać 4,5 ml roztworu roboczego EDC (z kroku 6) do 15 ml probówki polipropylenowej zawierającej kulki i TCPP w buforze MES (krok 4.7).
  2. Umieścić rurkę w rotatorze odwracającym przy 35 obr./min na 16 godzin w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
  3. Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut w stężeniu 1 000 × g.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 0,8 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS).
  5. Przenieść roztwór granulek do fiolki z pomarańczowego polipropylenu za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: W tym momencie koraliki są stabilne przez co najmniej 3 miesiące.

8. Kontrola jakości (QC) kulek TCPP za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: QC powinna być skoncentrowana na tym, czy mediana intensywności fluorescencji (MFI) koralików TCPP jest wystarczająco jasna dla ich zamierzonego zastosowania i ilości cząstek generowanych przez procedurę. Więcej informacji można znaleźć w sekcji reprezentatywnych wyników.

  1. Oznacz jedną probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml jako "Kulki ujemne TCPP"
    UWAGA: Koraliki ujemne różnią się od kulek funkcjonalizowanych aminami używanych do etykietowania. Zobacz tabelę materiałów.
  2. Oznacz inną rurkę jako "Koraliki dodatnie TCPP".
  3. Oznacz inną tubę jako "Tęczowe koraliki".
  4. Porcjować 300 μl lodowatego HBSS do probówek oznaczonych "Kulki ujemne TCPP" i "Kulki dodatnie TCPP".
  5. Dodaj 500 μl lodowatego HBSS do probówki oznaczonej jako "Tęczowe koraliki".
  6. Krótko przemieszaj niefunkcjonalizowaną zawiesinę kulek polistyrenowych (nieoznakowanych) z maksymalną prędkością (2-3 s) i dodaj 10 μl do probówki oznaczonej "Kulki ujemne TCPP".
  7. Krótko przemieszać zawiesinę kulek oznaczoną TCPP (zakończoną w kroku 7.5) z maksymalną prędkością i dodać 3 μl do probówki "TCPP dodatnie kulki".
  8. Krótko wymieszaj zawieszenie Rainbow Bead z maksymalną prędkością i dodaj dwie krople do rurki "Rainbow beads".
  9. Trzymaj wszystkie probówki na lodzie, przykryte i chronione przed światłem.
  10. Zainicjuj odpowiednie codzienne procedury uruchamiania cytometru przepływowego i wykonaj kontrolę jakości, aby zweryfikować optymalne płyny i wyrównanie lasera.
    UWAGA: W tej części protokołu zakłada się, że operator jest przeszkolony w zakresie korzystania z dostępnego cytometru przepływowego, w tym procedur standaryzacji rozproszenia światła i intensywności fluorescencji, a także podstawowych zasad obliczania prawidłowej macierzy kompensacji.
  11. Uruchom koraliki tęczowe i koraliki TCPP bez zmiany ustawień napięcia między różnymi przebiegami.
    1. Uruchom i zbierz 10 000 wydarzeń z tęczowymi koralikami.
    2. Wykonaj płukanie wodą i zbierz 10 000 zdarzeń koralików TCPP-ujemnych.
    3. Wykonaj płukanie wodą i zbierz 10 000 zdarzeń koralików TCPP-dodatnich.
    4. Wykonaj 1-minutowe płukanie wodą.
      UWAGA: Ważne jest, aby po uruchomieniu koralików TCPP wykonać płukanie wodą. Jeśli TCPP nie zostanie wypłukany z linii w cytometrze, istnieje możliwość, że resztki TCPP mogą oznaczyć komórki w następnej probówce, która ma zostać pobrana.
    5. Wykonaj odpowiednie protokoły czyszczenia i wyłączania zgodne z instrukcjami producenta cytometru.
      UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zobacz Rysunek 1.

9. Filtracja perełkowa

UWAGA: Jeśli kontrola jakości kulek za pomocą cytometrii przepływowej (krok 8) wykazuje wysoki udział cząstek stałych (70% lub więcej), rozważ przefiltrowanie zawiesiny kulek za pomocą poniższego protokołu (Rysunek 2).

  1. Dodać 3,20 ml lodowatego HBSS do 0,8 ml zawiesiny kulek TCPP zakończonej w kroku 7.5 (tworząc pięciokrotne rozcieńczenie).
  2. Wirować rozcieńczoną zawiesinę stopki z maksymalną prędkością przez 15 s.
  3. Wyjąć tłok z jednorazowej strzykawki o pojemności 5 ml.
  4. Wyposażyć strzykawkę w filtr z końcówką z włókna szklanego (5 μm, średnica 13 mm).
  5. Dodać 4 ml HBSS do strzykawki.
  6. Dodać 0,5 ml rozcieńczonej zawiesiny perełek (krok 9.2).
  7. Za pomocą tłoka przefiltrować zawiesinę przez zestaw strzykawka/filtr z prędkością około 2 kropli/s.
  8. Przemyć kulki, pobierając 5 ml świeżego HBSS do strzykawki przez filtr w ilości około 2 kropli/s.
  9. Wypchnij HBSS z powrotem do pojemnika na odpady z prędkością około 2 kropli/s.
  10. Aby usunąć kulki z filtra, należy pobrać kolejne 5 ml świeżego HBSS do strzykawki przez filtr.
  11. Ostrożnie wyjąć filtr ze strzykawki.
  12. Wysunąć zawiesinę kulek ze strzykawki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  13. Umieścić filtr z powrotem na strzykawce i powtórzyć kroki 9.10-9.12 jeszcze cztery razy. Następnie wyrzuć filtr i strzykawkę.
  14. Powtarzaj kroki 9.2-9.13, aż wszystkie koraliki z kroku 9.1 zostaną przefiltrowane. Za każdym razem używaj nowej strzykawki i filtruj.
  15. Odwirować przefiltrowane zawiesiny kulek przez 10 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze pokojowej.
  16. Odessać supernatant z każdej probówki o pojemności 50 ml i delikatnie zawiesić kulki, łącząc je w 0,5 ml świeżego HBSS.
  17. Przenieść kulki za pomocą mikropipety p1 000 do nowej fiolki z bursztynem, szkłem lub polipropylenem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  18. Powtórz krok 8, aby określić, czy udział cząstek stałych związanych z TCPP w przefiltrowanej zawiesinie kulek zmniejszył się. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zobacz Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten protokół do oznaczania koralików TCPP jest stosunkowo szybki i wydajny. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywny wynik procesu znakowania koralików TCPP, określony przez cytometrię przepływową. Rysunek 1A pokazuje ustandaryzowany profil koralików tęczowych, wykryty w odpowiednim kanale do wykrywania TCPP. Kulki te służą jako kontrola jakości do standaryzacji napięć laserowych do wykrywania TCPP przez cytometr przepływowy. Rysunek 1B p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo wielu zastosowań porfiryn w diagnostyce i terapii nowotworów2, istnieje ograniczona literatura na temat ich potencjalnego zastosowania jako odczynnika cytometrii przepływowej do identyfikacji populacji komórek nowotworowych i nienowotworowych w pierwotnych tkankach ludzkich 24,25,26. Nasze badania nad analizą cytometrii przepływowej ludzkiej plwociny24,27

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy bioAffinity Technologies.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Rodriguezowi za pomoc w przygotowaniu figury oraz Precision Pathology Services (San Antonio, TX) za korzystanie z cytometru przepływowego Navios EX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki z tworzywa sztucznego bursztynowego, 2 mL, dno w kształcie litery U, polipropylenResearch Products International   ZC1028-500
Kulki usieciowane z polistyrenu polistyrenowego (PS/DVB) z funkcjonalizacji aminy, 10,6 i mu; m średnica, 2,5% w/v zawiesina wodna, 3,82 x 107 kulki/ml, 7,11 x 1011 grupy aminowe/ kulkaSpherotechAPX-100-10Średnica spec. 8,0-12,9 um, zawiesina 2,5% w/v 3,82 x 107 koraliki/ml, 7,11 x 1011 grupy aminowe/ koralik
Rurki stożkowe, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Wirówkaz odpowiednim rotorem
Jednorazowa butelka polistyrenowa z nakrętką, 150 mlFisher Scientific09-761-140
EDC (chlorowodorek N- (3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu), ≥ 98%Sigma03450-1GNr CAS:  25952-53-8
Oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek FlowJo (v10.6.1)BD
Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Filtry strzykawkowe z włókna szklanego (Finneran, 5 i mikro; m, średnica 13 mm)Thomas Scientific1190M60
Szkiełka mikroskopowe, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Izopropanol, klasa ACSFisher ScientificAC423830010
Pipeta mechaniczna, 1-kanałowa, 100-1000 uL z końcówkamiEppendorf
MES (kwas 22- (N-mopholino)-N'-etanosulfonowy, sól hemifosdowaSigmaM0164Nr CAS:  117961-21-4
Cytometr przepływowy Navios EXMikroskop Beckman Coulter
Olympus BX-40 z kamerą DP73 i obiektywem 40X z oprogramowaniem cellSensOlympuslub podobne
pipety Pasteura, szklane, 5,75"Fisher Miernik pH Scientific13-678-6B
(UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Kontroler pipet (Drummond)Pipete.comDP101
, 5 mlFisher Scientific14955452
Cząsteczki polistyrenu (niefunkcjonalizowane), SPHERO,  2,5% w/v, 8,0-12,9 i mikro; mSpherotechPP-100-10 
Rurki polipropylenowe, 15mL, stożkoweFisher Scientific14-959-53A Rurki
polistyrenowe, okrągłe dno Fisher Scientific14-959-2A
Tęczowe koraliki (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Pipety serologiczne, jednorazowe - 10 mlFisher Scientific07-200-574
Pipety serologiczne, jednorazowe - 25 mlFisher Scientific07-200-576
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS6014Nr CAS:  144-55-8
TCPP (mezo-tetra(4-karboksyfenylo)porfina)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68Nr CAS:  14609-54-2
Czytnik płytek zapłonowych Tecan (lub podobny)Tecan Life Sciences
Thermo Fisher88881001
Mikser VortexFisher Scientific2215365
3123000918 Plastikowa strzykawka Rewolwer/rotator rurowy

Bibliografia

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669(2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303(2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943(2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478(2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046(2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002(2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069(2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785(2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kuleczki TCPPintensywno fluorescencjikuleczki polistyrenowekuleczki funkcjonalizowane aminsprz ganie EDCfiltrowanie kuleczekprze wit fluoroforu

Powiązane artykuły