Artykuł metodologiczny

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65306

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Experimental Medicine and Advanced Therapies, The Institute for Obesity Research, Tecnologico de Monterrey, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Preclinical Research Unit, Tecnologico de Monterrey

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do analizy zmian w gęstości mitochondriów i dystrybucji podłużnej za pomocą obrazowania mięśni szkieletowych na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej do skanowania sieci mitochondrialnej.

Streszczenie

Mitochondrium to organella, która może być wydłużana, fragmentowana i odnawiana zgodnie z wymaganiami metabolicznymi komórek. Przebudowa sieci mitochondrialnej pozwala zdrowym mitochondriom sprostać wymaganiom komórkowym; Jednak utrata tej zdolności jest związana z rozwojem lub postępem różnych patologii. W mięśniach szkieletowych zmiany gęstości i rozmieszczenia mitochondriów obserwuje się między innymi w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak ćwiczenia, starzenie się i otyłość. Dlatego badanie sieci mitochondrialnej może zapewnić lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z tymi warunkami.

Tutaj opisany jest protokół obrazowania mitochondriów żywych włókien mięśni szkieletowych od szczurów. Włókna są ręcznie preparowane w roztworze relaksującym i inkubowane za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika obrazowania żywych komórek mitochondriów (ester etylowy tetrametylorodaminy, TMRE). Sygnał mitochondriów jest rejestrowany za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu trybu skanowania XYZ w celu uzyskania obrazów konfokalnych sieci mitochondrialnej międzymiofibrylarnej (IMF). Następnie obrazy konfokalne są przetwarzane przez progowanie i binaryzację. Binaryzowany obraz konfokalny uwzględnia dodatnie piksele mitochondriów, które są następnie zliczane w celu uzyskania gęstości mitochondrialnej. Sieć mitochondrialna w mięśniach szkieletowych charakteryzuje się dużą gęstością populacji IMF, która ma okresowy rozkład podłużny podobny do T-kanalików (TT). Szybka transformata Fouriera (FFT) to standardowa technika analizy wykonywana w celu oceny rozkładu TT, która pozwala znaleźć częstotliwość dystrybucji i poziom ich organizacji. W niniejszym protokole opisano implementację algorytmu FFT do analizy podłużnego rozmieszczenia mitochondriów w mięśniach szkieletowych.

Wprowadzenie

Mitochondria tworzą wysoce dynamiczne sieci, które są głównie regulowane przez równowagę między jego wydłużeniem (fuzją) a fragmentacją (rozszczepieniem)1,2, które są modulowane przez ekspresję i aktywność białek, takich jak Mitofusin 1 i 2 (Mfn1 i Mfn2) oraz Atrofia Białka Wzrokowego 1 (Opa1), które regulują fuzję zewnętrznej błony mitochondrialnej i wewnętrznej błony, odpowiednio1,2. Białko związane z dynaminą (Drp1) głównie reguluje rozszczepienie mitochondriów, gdy jest fosforylowane w klasie Ser6163.

W mięśniach szkieletowych dobrze ustalono, że sieć mitochondrialna jest ułożona w strukturalnie dobrze zdefiniowane subpopulacje na podstawie ich bliskości do różnych regionów komórek (miofibryli, sarkolemma i jądra)4,5. Mitochondria znajdujące się tuż pod sarkolemmą nazywane są mitochondriami subsarkolemmalnymi (SSM), te znajdujące się między włóknami kurczliwymi nazywane są mitochondriami międzymiofibrylarnymi (IMF), a subpopulacja mitochondriów wokół jąder nazywana jest mitochondriami okołojądrowymi (PMN). Co więcej, zasugerowano, że te subpopulacje mitochondrialne mają funkcje specyficzne dla regionu i są wyspecjalizowane metabolicznie4,5.

Utrzymanie homeostazy energii komórkowej, która umożliwia funkcje metaboliczne i kurczliwe, zależy w dużej mierze od interakcji i komunikacji w określonych miejscach poprzez sieć mitochondrialną (np. interakcja IMF i SSM)4,6. Oprócz interakcji sieci mitochondriów, mitochondrium może również wchodzić w interakcje z innymi organellami, tworząc kompleksy strukturalne i funkcjonalne. W związku z tym wykazano, że IMF może znajdować się w sąsiedztwie retikulum sarkoplazmatycznego (SR) i w pobliżu jednostek uwalniających Ca2+ (CRU), utworzonych przez kanaliki poprzeczne (TT)7. Fakt ten jest istotny ze względu na rolę mitochondrialnego wychwytuCa2+ w regulacji syntezy ATP i apoptozy. Ostatnio zasugerowano również potencjalną rolę w regulacji cytozolowych stanów przejściowych Ca2+ 8.

TT to wgłębienia sarcolemmy, które mają okresowy rozkład wzdłuż osi podłużnej kardiomiocytów i włókien mięśni szkieletowych9,10, podobnie jak w dystrybucji IMF5. Zmiany w dystrybucji TT mają ważne implikacje fizjologiczne, biorąc pod uwagę ich rolę w funkcji skurczowej. Jednak zmiany te oceniano głównie w kardiomiocytach. Analiza szybkiej transformaty Fouriera (FFT) umożliwia konwersję sygnałów okresowych z dziedziny odległości do dziedziny częstotliwości, w wyniku czego uzyskuje się widmo FFT, które wskazuje częstotliwość i regularność sygnału11,12,13. Chociaż istnieją dowody na to, że organizacja sieci mitochondrialnej we włóknach mięśni szkieletowych jest niezbędna do adaptacji do różnych warunków metabolicznych, takich jak podczas regeneracji po urazie mięśni14,15, większość analiz jest wykonywana jakościowo.

Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że dysfunkcja mitochondriów została powiązana z kilkoma chorobami związanymi z mięśniami szkieletowymi (np. zanik przy użyciu alkoholu)2 i chorobami niezwiązanymi z mięśniami, szczególnie chorobami metabolicznymi i związaną z tym utratą masy mięśniowej (tj. atrofią)16, ilościowa ocena sieci mitochondrialnej i rozmieszczenia w mięśniach szkieletowych nabiera znaczenia. Ostatnio zaobserwowano istotną różnicę w podłużnym rozmieszczeniu mitochondriów włókien mięśniowych brzuchatego łydki między grupą otyłych (Ob; Szczury Zucker fa/fa) i grupa lean (Lean; Zucker +/+ szczury) został zidentyfikowany przez FFT17. Badanie to wykazało przydatność FFT w analizie dystrybucji mitochondrialnej. W związku z tym w protokole przedstawiono metodologię badania mitochondriów w żywych włóknach mięśni szkieletowych na podstawie obrazów uzyskanych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Gęstość mitochondriów określa się ilościowo za pomocą progowania tła, a także opisano analizę podłużnego rozkładu mitochondriów za pomocą analizy FFT. Schemat przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 1.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały ocenione i zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (CICUAL) Tecnologico de Monterrey (Protokół 2019-007). W badaniu wykorzystano samce szczurów Zucker (+/+ oraz fa/fa) w wieku od 12 do 13 tygodni. Zwierzęta przetrzymywano w standardowych warunkach chowu (cykl oświetlenia 12 h światła/12 h ciemności, wilgotność 40-60%) z nielimitowanym dostępem do pożywienia (standardowa karma dla szczurów) oraz wody ad libitum.

1. Skład roztworu

  1. Przygotować świeży roztwór Relax, mieszając składniki przedstawione w Tabeli 1. Dostosować pH do wartości 7,3 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH).
  2. Obliczyć stężenie wolnego wapnia w roztworze Relax, korzystając z programu symulacyjnego do wyznaczania stężenia wolnych metali.
  3. Przygotować roztwór zapasu 5 mM estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRE) w dimetylosulfotlenku (DMSO) oraz jego kolejne rozcieńczenie do stężenia 0,1 mM w DMSO.

2. Disekcja pęczków włókien mięśnia brzuchatego łydki

  1. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i zamknij pokrywę. Włącz źródło tlenu, ustaw przepływ gazu na 0,5 L/min oraz ustaw parownik na 4% sewofluranu, aby wprowadzić zwierzę w stan znieczulenia.
  2. Gdy szczur zaśnie, wyjmij go z komory i ułóż na plecach, utrzymując znieczulenie. Uciśnij palec u nogi lub ogon, aby zweryfikować brak odruchów.
  3. Za pomocą nożyczek przetnij skórę i mięśnie brzucha. Następnie przetnij klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca.
  4. Aby przeprowadzić kardiektomię, chwyć serce pęsetą za najwyższe żyły i tętnice, a następnie przetnij naczynia krwionośne nożyczkami. Usuń serce.
  5. Bezpośrednio po eutanazji zdezynfekuj kończynę tylną etanolem i ogol ją za pomocą maszynki do golenia.
  6. Przytrzymaj tylną stopę i wykonaj nożyczkami nacięcie skóry na poziomie ścięgna Achillesa.
  7. Przetnij kończynę tylną nożyczkami na poziomie bliższym części kości piszczelowej. Przenieś ją w pozycji grzbietowej do 60 mm szalki Petriego zawierającej 3 mL lodowatego roztworu Relax. Przykryj ją wystarczającą ilością roztworu, aby zapobiec wysychaniu mięśni.
  8. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa, ostrożnie unieś je pęsetą i oddziel mięśnie od kości za pomocą nożyczek irydowych. Od tego etapu sekcji używaj stereomikroskopu.
  9. Zidentyfikuj i oddziel cały mięsień brzuchaty łydki, stanowiący główną masę z tyłu kończyny tylnej.
  10. Wypreparuj i usuń tkankę łączną oraz tłuszczową otaczającą mięsień za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. Przenieś głowę boczną mięśnia do nowej szalki Petriego z lodowatym roztworem Relax (patrz Rysunek 2A).
  11. Delikatnie przytrzymaj mięsień pęsetą za jeden koniec i ostrożnie podziel go na pęczki za pomocą mikronożyczek. Pęczki manipuluj zawsze, delikatnie trzymając je pęsetą za jeden koniec.
    UWAGA: Pęczki mają około 10 mm długości i 2 mm szerokości.
  12. Przenieś pęczki włókien do nowej szalki Petriego z 2 mL lodowatego roztworu Relax. Wybierz tylko te, które mają gładką powierzchnię, są kompletne na całej długości i nie są skrócone (Rysunek 2B).

3. Akwizycja obrazowania żywych komórek mitochondriów w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Inkubować włókna w 2,5 × 10-4 mM TMRE w roztworze Relax przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przy zalecanych stężeniach roboczych TMRE spodziewany jest tryb bezgaszenia (non-quenching mode). Od tego momentu należy chronić próbki przed ekspozycją na światło.
  2. W czasie inkubacji:
    1. Uruchom standardowe oprogramowanie mikroskopu konfokalnego, wybierz konfiguracja struktura, a w ramach konfiguracja sprzętowa wybierz z okna dialogowego laser i sprawdź HeNe 543 opcja
    2. W pozyskać struktura, wybrać akwizycja okno dialogowe, a w tryb akwizycjiwybierz panel XYZ.
    3. W okno dialogowe XYwybierz format 512 x 512, prędkość 400 Hz, i sprawdź panel z otworem wielkości igłyW wyświetlonym oknie dialogowym pinhole wybierz AU dla jednostki i dodaj wartość 3 Airy dla otworu żądłowego.
      UWAGA: Należy rozważyć zmniejszenie otworu pinhole do wartości zbliżonej do optymalnego kryterium 1 Airy, pod warunkiem zachowania odpowiedniego sygnału fluorescencyjnego.
    4. W Ustawienia drogi wiązki okno dialogowe, wybierz obiektyw imersyjny 20x o aperturze numerycznej (NA) 0,7 (20x/0.7 IMM), a następnie wybierz okno długości fali emisji 576–700 nm. Wybierz DD488/543 oraz 15% mocy lasera dla laser 543.
      UWAGA: Do skanowania obrazów żywych komórek zdecydowanie zaleca się stosowanie obiektywu imersyjnego w wodzie (jeśli jest dostępny), ponieważ pozwala to na uzyskanie zbliżonego współczynnika załamania światła medium imersyjnego i medium inkubacyjnego.
  3. Po 20 minutach inkubacji dwukrotnie wymień medium inkubacyjne. Upewnij się, że obrazy konfokalne zostaną pozyskane w ciągu 20–30 minut po inkubacji.
  4. Przygotuj komorę rejestracyjną, używając szkiełka nakrywkowego z borokrzemianowego szkła o grubości 0,15 mm.
    UWAGA: Należy dobrać grubość szkiełka nakrywnego do dostępnej komory rejestracyjnej, przyjmując, że dla uzyskania optymalnych parametrów grubość ta zazwyczaj mieści się w zakresie od 0,15 do 0,22 mm.
  5. Dodaj 200 µL roztworu Relax do komory rejestracyjnej i przenieś pęczki włókien.
  6. W mikroskopie konfokalnym należy użyć trybu jasnego pola, aby zidentyfikować żywe włókna do rejestracji fluorescencyjnej mitochondriów. Włókna żywe są kompletne, niekurczliwe i posiadają nienaruszoną strukturę prążkowania.
  7. Rozdziel od siebie wiązki włókien i wyrównaj je za pomocą pęsety. Wybierz te, które znajdują się najbliżej szkiełka nakrywki.
  8. Przeprowadź skanowanie fluorescencji przy użyciu przycisk na żywo aby dostosować wzmocnienie (gain) oraz przesunięcie (offset) w konsoli Panel sterowania, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Wybierz niskie wartości intensywności fluorescencji dla tła wynoszącego blisko 0 jednostek arbitralnych (A.U.).
    2. Wybierz poziom wzmocnienia w zakresie 100 i 200 j.a. aby uniknąć nasycenia systemu rejestracji. W związku z tym nie należy rejestrować najwyższych poziomów fluorescencji.
    3. Wybierz rozmiar piksela w zakresie 150–190 nm, aby objąć pełną szerokość włókna, dostosowując czynnik powiększenia w XY okno dialogowe
      UWAGA: Należy rozważyć zastosowanie rozmiaru piksela zbliżonego do kryterium Nyquista (90 nm), co umożliwia skanowanie pełnej szerokości włókna.
  9. W oknie dialogowym stosu Z (Z stack) dostosuj odległość Z w celu zarejestrowania sygnału fluorescencji zaczynając od a głębokość włókna z 15 µm (przycisk start) do 22 µm (przycisk końcowy)Wybierz 3 µm jako wielkość kroku w osi Z.
  10. Kliknij Start przycisk do akwizycji obrazów konfokalnych. Należy uzyskać stos Z (Z-stack) składający się z trzech obrazów konfokalnych wykonanych przy 15, 18, i 21 µm z głębokość.

4. Analiza gęstości mitochondriów

  1. W otwartoźródłowej platformie do analizy obrazów biologicznych18 otwórz plik stosu Z (Z-stack) i obróć obrazy tak, aby włókno znajdowało się poziomo, jak pokazano na Rysunku 3B.
  2. Losowo wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje obszar zajęty przez mitochondria (ROImito). Wybierz rozmiary ROImito w zakresie od 65 do 90 µm dla osi X. W przypadku osi Y rozmiar będzie zależeć od szerokości włókna, tak aby uniknąć jego peryferii.
  3. Powiel stos Z z wybranym ROImito i zapisz go jako nowy stos Z (Mito-stack) w formacie TIFF. Zapisz pozycję ROImito wybraną na oryginalnym stosie za pomocą narzędzia ROI Manager.
  4. Oblicz próg dla odejmowania tła w następujący sposób:
    1. Użyj skrótu command+shift+t, aby otworzyć okno dialogowe Threshold.
    2. Wybierz opcję algorytmu progowania Otsu |B&W | Dark background. Zauważ, że obraz został teraz zbinaryzowany.
    3. W oknie dialogowym Threshold zaobserwuj histogram rozkładu intensywności fluorescencji oraz wyświetloną wartość progu.
      UWAGA: Piksele dodatnie pod kątem mitochondriów mają wartości intensywności fluorescencji większe od progu i pojawiają się jako białe piksele na obrazie binarnym.
    4. Zastosuj próg do stosu obrazów binarnych, wybierając Apply. W wyświetlonym oknie dialogowym Convert Stack to Binary wybierz opcje Calculate threshold for each image, Black background, Create new stack i kliknij OK.
  5. Zauważ, że wygenerowany został stos zawierający trzy obrazy binarne (BinDMito-stack). Zapisz go w formacie TIFF.
  6. Oblicz gęstość mitochondriów w BinDMito-stack w następujący sposób:
    1. Wybierz menu Analyze. Następnie kliknij Histogram. W wyświetlonym oknie dialogowym histogramu kliknij Yes, aby uwzględnić wszystkie obrazy ze stosu w analizie.
    2. W oknie dialogowym Histogram of Stack kliknij List, aby uzyskać dane histogramu. Przenieś dane histogramu do arkusza kalkulacyjnego.
    3. W arkuszu kalkulacyjnym zidentyfikuj Mito-pixels, czyli te o wartości 255. Oblicz gęstość mitochondriów korzystając z równania (1):
      Gęstość mitochondriów = Stosunek liczby Mito-pixels do całkowitej liczby pikseli; wzór matematyczny; zastosowanie edukacyjne w analizie obrazu. × 100     (1)
      Całkowita liczba pikseli jest oznaczona jako N w oknie dialogowym Histogram lub obliczona poprzez zsumowanie w arkuszu liczby pikseli z histogramu.
    4. Aby obliczyć obszar zajęty przez mitochondria (µm2), pomnóż liczbę Mito-pixels ze stosu BinDMito-stack przez rozmiar piksela.

5. Analiza rozkładu mitochondriów za pomocą szybkiej transformaty Fouriera

  1. W platformie open-source do analizy obrazów biologicznych otwórz BinDMito-stack i narysuj prostokątny ROI o szerokości 256 pikseli i wysokości 5 µm. Wyznacz jeden ROI w pozycji centralnej, a drugi w pozycji bocznej, jak pokazano na Rysunku 4A,B.
  2. Użyj narzędzia ROI Manager, aby skonfigurować ROI do analizy FFT, a następnie zapisz zmiany.
    UWAGA: W zależności od potrzeb analizy można wybrać inne ROI w różnych pozycjach i zmodyfikować ich rozmiary. Niemniej jednak, szerokość musi być równa 2n pikselom, aby przeprowadzić FFT (np. 128, 256, 512 pikseli).
  3. Uzyskaj profil wykresu dla ROI za pomocą skrótu command + k i przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego.
  4. W arkuszu kalkulacyjnym wypełnij kolumny B i C danymi uzyskanymi z profilu wykresu. Kolumna B zawiera odległość w µm, a kolumna C odpowiadającą wartość szarości intensywności fluorescencji (A.U.).
  5. Kolumna D odpowiada częstotliwości FFT (zdarzenie/µm), którą należy wypełnić w następujący sposób:
    1. Oblicz częstotliwość próbkowania (Fs): Fs = 1/Δd, gdzie Δd to krok odległości (druga wartość w kolumnie B).
    2. Oblicz ΔFs: ΔFs = Fs/N, gdzie N to liczba punktów danych w kolumnie B (256).
    3. Oblicz wartość graniczną częstotliwości FFT (S): S = (N/2) ×ΔFs.
    4. Wypełnij kolumnę D w następujący sposób:
      1. Pierwsza wartość w kolumnie D jest równa 0.
      2. Zaznacz drugą komórkę w kolumnie D, przejdź do menu Start, wybierz Wypełnij, a następnie kliknij Seria. Wybierz Kolumny. Jako wartość przyrostu wprowadź obliczone Δ Fs. Jako wartość graniczną wprowadź obliczone S.
    5. Następnie wypełnij kolumnę E zespolonymi wartościami FFT w następujący sposób:
      1. Wprowadź 0 w pierwszej komórce kolumny C, ponieważ odległość 0 musi pokrywać się z sygnałem 0 dla obliczeń FFT.
      2. Następnie przejdź do menu Dane, kliknij Analiza danych i wybierz Analiza Fouriera.
      3. W nowym oknie, w zakresie wejściowym, zaznacz zakres punktów danych sygnału fluorescencyjnego opisanych w kolumnie C.
        UWAGA: Liczba punktów danych musi wynosić 2n (np. 256 lub 128 punktów danych sygnału fluorescencyjnego).
      4. Zaznacz odpowiedni zakres w kolumnie E jako zakres wyjściowy.
      5. Zatwierdź przyciskiem Ok, aby zespolone wartości FFT zostały wypełnione automatycznie.
  6. Wypełnij kolumnę F amplitudą FFT w następujący sposób:
    1. Użyj funkcji IMABS, aby zwrócić w kolumnie F wartość bezwzględną z liczby zespolonej w kolumnie E i pomnóż ją przez 2/N w celu normalizacji (równanie (2)):
      amplituda FFT = (IM.ABS (E1…En) × (2/N)     (2)
  7. Wykreśl widmo FFT, używając amplitudy FFT z kolumny F jako funkcji częstotliwości FFT z kolumny D, aż do wartości S. Znajdź punkt maksymalnego piku i odpowiadającą mu częstotliwość FFT.
  8. Przelicz częstotliwość FFT maksymalnego piku na odległość za pomocą równania (3). Obliczona odległość reprezentuje podłużny dystans rozkładu mitochondriów.
    Odległość (µm) = 1/częstotliwość FFT     (3)
    UWAGA: Ze względu na symetrię FFT, nie wykreślaj częstotliwości FFT powyżej wartości S , która odpowiada połowie punktów danych, aby uniknąć duplikacji widma FFT.

6. Opcjonalne etapy preprocessingu w celu redukcji szumów obrazu przed analizą obrazu

  1. Zastosuj filtr medianowy lub dekonwolucję 2D w następujący sposób:
    1. Dla filtra medianowego:
      1. Wybierz Proces | Filtry i kliknij w Mediana opcja
      2. W wyświetlonym Mediana okno dialogowe, wybierz 2.0 dla Promień i kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Wybierz Tak aby zastosować ten proces do wszystkich obrazów w Mito-stack.
      3. Zaobserwuj redukcję szumów na obrazach.
    2. W przypadku dekonwolucji 2D:
      1. Wygeneruj teoretyczną funkcję rozsyłu punktu (PSF).
      2. Pobierz wtyczkę PSF_Generator.jar i umieść plik w folderze „Plugins”.
      3. W generator PSF okno dialogowe, kliknij opcję Urodzony & Trójwymiarowy model optyczny wilkawprowadź Wartość współczynnika załamania światła cieczy immersyjnej z 1.33 stosowane podczas skanowania konfokalnego, a następnie wybierz Najlepszy dla Obliczanie dokładności opcja
      4. Przechwytywanie 576 nm dla długość fali emisji, the ND z obiektyw zastosowanie 0.7oraz krok w osi Z z 3 000 nm.
      5. Przechwyć rozmiar piksela XY obrazu konfokalnego do dekonwolucji, a także rozmiaru XYZ wskazując liczbę pikseli w osiach X i Y oraz liczbę kroków w osi Z (3 dla niniejszego protokołu).
      6. W Wyświetlacz menu z Generator PSFkliknij opcję liniowywybierz rozdzielczość 8 bitówa następnie wybrać szarości opcja dla tablicy wyszukiwania (LUT).
      7. Uruchom Generator PSF i zapisz teoretyczną funkcję PSF w formacie TIFF.
      8. Wykonaj sumowanie przekrojów PSF utworzonych poprzez otwarcie Projekt Z narzędzie opcji Stosy który znajduje się w Obraz menu
      9. Na wyświetlonym Projekcja Z okno dialogowe, wybierz Suma przekrojów dla Typ projekcji, a następnie kliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Zapisz nową funkcję punktu rozproszenia (PSF) w formacie TIFF.
        UWAGA: Zamiast teoretycznej funkcji PSF można zastosować PSF otrzymaną eksperymentalnie poprzez konfokalne skanowanie fluorescencyjnych mikrokulek o znanej średnicy.
      10. Pobierz wtyczkę „DeconvolutionLab_2.jar”19 i umieść go w folderze z wtyczkami.
      11. Kliknij menu WtyczkiNastępnie kliknij DeconvolutionLab2.
      12. Oddziel obrazy konfokalne od Mito-stack przy użyciu narzędzia Obrazy do ułożenia w stosy z Stosy opcja znajdująca się w Obraz menu i zapisz w formacie TIFF.
      13. W DeconvolutionLab2 okno dialogowe, wybierz jeden z obrazów uzyskanych z Mito-stackWybierz teoretyczna PSF utworzono i wybrano algorytm Richardson-Lucy z 15 iteracji.
      14. Uruchomienie DeconvolutionLab2, zweryfikuj poprawę sygnału oraz redukcję szumów na obrazie, a następnie zapisz go w formacie TIFF.
  2. Przejdź do kroku 4.4 w celu analizy obrazów.
  3. W celu przeprowadzenia progowania obrazów po dekonwolucji, należy przekształcić je w maska 8-bitowa podczas proces progowaniaUtwórz stos z obrazami binarnymi i zdekonwolwowanymi poprzez wybranie Stosowanie obrazów w Stosy narzędzie do Obraz menu
  4. W przypadku analizy FFT obrazów po dekonwolucji profil wykresu zawiera odległość w jednostkach pikseli. Przelicz jednostki pikseli na µm następująco:
    1. W arkuszu kalkulacyjnym, po wykonaniu kroku 5.4, przenieś dane z B do ANastępnie wypełnij B z odległość w µm poprzez pomnożenie wartości każdego piksela przez A przez rozmiar piksela.

Wyniki

Zastosowanie niniejszego protokołu umożliwia analizę gęstości i rozkładu mitochondriów w żywej tkance mięśni szkieletowych. Protokół podzielono na trzy główne etapy: wypreparowanie pęczków mięśni szkieletowych, skanowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz analizę obrazu. Przegląd schematu postępowania przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia cały mięsień brzuchaty łydki szczura w szalce Petriego, z zaznaczoną głową boczną, z której pobierane są włókna, natomiast Rysunek 2B przedstawia pęczki włókien w roztworze Relax. Dzięki mikroskopii konfokalnej można rejestrować mitochondria wzdłuż głębokości żywego włókna mięśnia szkieletowego przy użyciu wskaźnika fluorescencyjnego TMRE. TMRE jest lipofilnym kationowym fluorophorem, który selektywnie gromadzi się w mitochondriach w zależności od potencjału błony mitochondrialnej20.

Optymalny obraz konfokalny IMF można uzyskać, wybierając odległość Z powyżej 15 µm głębokości wewnątrz włókna (Rysunek 3A). Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne obrazy konfokalne XY mitochondriów obciążonych TMRE, pozyskane wzdłuż odległości Z włókien mięśnia brzuchatego (od 15 do 21 µm). Obrazy konfokalne poddano procesowi progowania (thresholding), aby przekształcić je w obrazy binarne umożliwiające analizę mitochondriów. Rysunek 3B (lewy panel) pokazuje włókno od szczura szczupłego (Lean) po wysiłku. Przedstawia ono spodziewany zapis konfokalny mitochondriów włókna mięśnia szkieletowego, ponieważ wykazuje spójny wzorzec wzdłuż włókna. W przeciwieństwie do tego, wybrano włókno od szczura otyłego (Ob) (Rysunek 3B, prawy panel), które wykazuje znaczne zmiany w zawartości i rozkładzie mitochondriów. Rysunek 3C przedstawia ilościowe określenie powierzchni włókna zajętej przez mitochondria, wyrażone jako gęstość mitochondrialna, uzyskane z każdego zbinaryzowanego obrazu (pokazanego na panelu B). Zgodnie z oczekiwaniami, włókno Ob wykazało niższą gęstość mitochondrialną. Została ona określona w sposób spójny wzdłuż analizowanej odległości Z, co jest również widoczne na Rysunku 3D, gdy gęstość mitochondrialna jest obliczana dla stosu składającego się z trzech obrazów konfokalnych pozyskanych przy 15, 18 i 21 µm.

Podobnie jak w przypadku analizy gęstości mitochondriów, konfokalne skanowanie wskaźnika fluorescencyjnego do obrazowania żywych komórek, takiego jak TMRE, pozwala na badanie organizacji podłużnej mitochondriów w żywej tkance mięśni szkieletowych. IMF wykazuje okresową organizację w prążku I w pobliżu TT7, które można analizować za pomocą FFT w celu określenia częstotliwości sygnału mitochondrialnego oraz stopnia organizacji17. Rysunek 4 przedstawia różnice w organizacji IMF występujących w mięśniu brzuchatym szczurów chudych (Lean) oraz otyłych (Ob) oraz pokazuje, w jaki sposób FFT pozwala na wykrycie zmian w rozkładzie sygnału mitochondrialnego. Rycina 4A,B przedstawiono podłużne obszary zainteresowania (ROI), wybrane w centralnej i bocznej części włókna w celu przeprowadzenia analizy FFT. Przed wykonaniem FFT obliczana jest wartość progu dla odjęcia tła. Następnie obraz jest binaryzowany; procedury te eliminują różnice w poziomach intensywności fluorescencji sygnału mitochondrialnego. Obraz binarny dostarcza profilu rozkładu fluorescencji niezbędnego do przeprowadzenia analizy FFT.

Rysunek 4C, D przedstawia wybrane obszary zainteresowania (ROI) w panelach A i B wraz z ich profilami wykresów (panele górne). Z profili wykresów można zauważyć różnice w rozkładzie fluorescencji pomiędzy włóknami pochodzącymi od szczurów szczupłych (Lean) i otyłych (Ob), a także różnice między poszczególnymi ROI w obrębie tego samego włókna. Dla każdego profilu wykresu przedstawiono odpowiadające mu widmo FFT (panele dolne). Szczyt maksymalnego widma FFT wskazuje częstotliwość FFT (oś X) rozkładu sygnału mitochondrialnego wzdłuż osi podłużnej. Może on zostać przekształcony w wartość odległości bliską 2 µm w bocznych i centralnych ROI u szczura szczupłego. Co istotne, amplituda szczytu FFT jest wskaźnikiem regularności sygnału mitochondrialnego, a zmiany tej amplitudy ujawniają zaburzenia w rozkładzie mitochondriów.

Rysunek 4E,F przedstawiają różnice w widmie FFT pomiędzy włóknami typu Lean i Ob-derived, w których przeanalizowano odpowiednio boczne i centralne ROI. W bocznych ROI (Rysunek 4E) częstotliwość podłużnego rozkładu mitochondriów była podobna w włóknach lean i Ob-derived; niemniej jednak amplituda maksymalnego piku FFT w włóknach Ob-derived była wyższa, co zgadza się z większą regularnością sygnału zaobserwowaną na obrazie na Rysunku 4B. Natomiast w przypadku centralnego ROI (Rysunek 4F) w grupie Ob obserwuje się przykład krytycznej redukcji piku FFT w porównaniu z grupą Lean, gdy występuje istotna zmiana w rozkładzie mitochondriów.

Schemat preparatyki włókien mięśnia brzuchatego łydki, mikroskopii konfokalnej, przetwarzania obrazu i analizy.
Rysunek 1: Schemat analizy mitochondriów w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten schemat podsumowuje główne etapy protokołu w trzech oddzielnych fazach. Pierwsza faza, wycinek pęczków włókien mięśnia brzuchatego łydki, jest podzielona na trzy kolejne kroki: izolację mięśnia brzuchatego łydki, a następnie mechaniczną dyssekcję mięśnia na pęczki, aby w końcowej fazie dokonać wizualnego wyboru tych żywotnych. Druga faza obejmuje obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej, co składa się z inkubacji z fluoroforem (TMRE) przez 20 min w temperaturze pokojowej oraz umieszczenia włókien w komorze. Następnie w mikroskopie ustawia się odpowiednie parametry w celu wykonania akwizycji obrazów konfokalnych. W trzeciej fazie przeprowadzane jest przetwarzanie obrazów konfokalnych i analiza danych. Proces rozpoczyna się od przetwarzania obrazu, gdzie wymagane jest ustalenie progu (threshold) w celu wygenerowania obrazów binarnych, na podstawie których obliczana jest gęstość mitochondriów oraz ich rozkład za pomocą FFT. Skróty: TMRE = tetrametylorodaminy ester etylowy; FFT = szybka transformata Fouriera. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Eksperyment kriokonserwacji: plaster tkanki w szalce Petriego. Badanie metod konserwacji i integralności.
Rysunek 2: Disekcja pęczka mięśnia szkieletowego. (A) Wypreparowana boczna głowa mięśnia brzuchatego szczura (czarna strzałka) w szalce Petriego z roztworem Relax. (B) Reprezentatywny obraz pęczków włókien mięśnia brzuchatego w roztworze Relax przed obciążeniem TMRE. Skrót: TMRE = tetrametylo-rhodaminy ester etylowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat i wykresy analizy gęstości mitochondriów; przekroje poprzeczne włókien mięśniowych, badanie grupy LEAN vs Ob (otyłość).
Rycina 3: Analiza gęstości mitochondriów. (A) Ilustracja przedstawiająca zalecaną odległość Z dla skanowania konfokalnego mitochondriów IMF w włóknach mięśni szkieletowych. (B) Seria obrazów konfokalnych mitochondriów obciążonych TMRE we włóknach mięśni szkieletowych, uzyskanych od szczura Zucker +/+ poddanego ćwiczeniom (Lean) oraz od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob), zarejestrowanych w odległości Z (od 15 do 21 µm głębokości). Obrazy zostały przetworzone poprzez progowanie i przekształcone w obrazy binarne. (C) Obliczona gęstość mito- w przekrojach konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z przedstawionych na panelu B. (D) Gęstość mito- uzyskana ze stosu obrazów przedstawionych na panelu B. Obrazy na panelu B mają wymiary 65 x 50 µm. Pasek skali = 10 µm. Skróty: Mito-density = gęstość mitochondriów; IMF = mitochondria międzymiofibrylarne; Ob = otyły; SSM = mitochondria podsarcolemmalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy mikroskopowe próbek szczupłych i otyłych z fluorescencją, analiza FFT w celu badania strukturalnego.
Rycina 4: Analiza rozmieszczenia mitochondriów za pomocą FFT. Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE, uzyskane z głębokości 21 µm włókien mięśni szkieletowych pobranych od ćwiczącego szczura Zucker +/+ (szczupły, panel A) oraz od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob, panel B). Obrazy poddano procesowi progowania i przekształcono w obrazy binarne. Boczne i centralne obszary ROI z panelu A (panel C) i panelu B (panel D) wraz z ich odpowiednimi profilami wykresów intensywności fluorescencji (wykres górny) i widmem FFT (wykres dolny). FFT obliczono z obszarów ROI o szerokości 256 pikseli, co odpowiada rozmiarowi ROI 39 x 5 µm w panelu A oraz rozmiarowi ROI 50 x 5 µm w panelu B. Panel E przedstawia różnice w widmie FFT stwierdzone pomiędzy mitochondriami pochodzącymi od szczurów szczupłych i otyłych w bocznym obszarze ROI, natomiast panel F pokazuje różnice w widmie FFT dla centralnego obszaru ROI. Pasek skali = 10 µm. Skróty: A.U. = jednostki arbitralne; FFT = szybka transformata Fouriera; ROIs = obszary zainteresowania; Ob = otyły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

OdczynnikStężenie końcowe w 100 mlRoztwór macierzysty 
K-asparaginian100 mM
KCl20 mM
HEPES20 mM
Kwas L-glutaminowy3 mM
Kwas jabłkowy3 mM
EGTA0,1 mM10 mM
MgCl₂21 mM wolnego Mg2+
CaCl220,00002 mM wolnego Ca2+
fosfokreatyna di-Na5 mM500 mM
Kinaza kreatynowa5 U/ml200 U/ml
MgATP5 mM
pH 7,3 (za pomocą NaOH)

Tabela 1: Odczynniki i stężenia roztworu relaksacyjnego.

Rycina dodatkowa S1: Wpływ metod wstępnego przetwarzania obrazu. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE, pozyskane z głębokości 18 µm w włóknach mięśni szkieletowych szczura Zucker +/+ po ćwiczeniach (szczupły, górny panel) oraz z otyłego szczura Zucker fa/fa (dolny panel), wraz z odpowiednimi obrazami uzyskanymi po wstępnym przetwarzaniu z zastosowaniem progowania metodą Otsu, filtra medianowego i progowania metodą Otsu, oraz dekonwolucji 2D i progowania metodą Otsu. (B) Wykres profilu gęstości mitochondriów uzyskany z obrazów konfokalnych (panel A) po wstępnym przetwarzaniu różnymi metodami. Obrazy w panelu A mają wymiary 65 x 50 µm. Pasek skali = 10 µm. Skróty: 2D-Decon = dekonwolucja 2D; Mito-density = gęstość mitochondriów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Mitochondria to organelle o dużej zdolności przebudowy. Ich zawartość, gęstość i dystrybucja mogą być szybko modyfikowane poprzez aktywację mechanizmów fuzji i rozszczepienia mitochondriów, znanych jako dynamika mitochondriów1, oraz równowagę między mechanizmami obrotu mitochondrialnego: biogenezą mitochondriów i wyspecjalizowanym szlakiem degradacji mitochondriów, mitofagią21,22. Zawartość i morfologia mitochondriów może się różnić w zależności od typu komórki i etapu rozwoju oraz może być przebudowywana pod wpływem różnych bodźców fizjologicznych i patologicznych 17,22,23,24. Dlatego badania nad morfologią mitochondriów są istotne od ponad pół wieku25. Warto zauważyć, że analiza mitochondriów za pomocą mikroskopii elektronowej była standardową techniką stosowaną w wielu badaniach26.

Badania fluorescencyjne za pomocą mikroskopii konfokalnej zyskały na znaczeniu w ciągu ostatnich kilku lat ze względu na ich zdolność do obrazowania żywych komórek mitochondriów na różnych głębokościach włókien, co może pomóc w lepszym zrozumieniu roli mitochondriów w mięśniach szkieletowych w różnych warunkach adaptacyjnych i nieadaptacyjnych27. W pracy opisano metodologię analizy gęstości i rozmieszczenia mitochondriów we żywych włóknach mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednym z głównych wyzwań związanych z pracą z żywymi włóknami mięśni szkieletowych jest uniknięcie skurczu w wyniku procesów izolacji aż do mitochondrialnego zapisu konfokalnego. Aby osiągnąć ten cel, stosuje się roztwór Relax17 o wysokiej zawartości Mg i ATP, aby utrzymać włókna w stanie zrelaksowanym przez co najmniej 2 godziny, co daje wystarczająco dużo czasu na przeprowadzenie procesu izolacji włókien, obciążenia fluoroforem i uzyskania sygnału mitochondrialnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Krytycznym punktem protokołu jest mechaniczne pozyskiwanie włókien, ponieważ wymaga to dużej precyzji i świeżej tkanki; Możliwe jest jednak uzyskanie żywotnych wiązek włókien z mięśni szczura za pomocą tej wcześniej stosowanej i opisanej techniki28. Uzyskanie nienaruszonych włókien pozwala na zachowanie sarkolemmy i środowiska wewnątrzkomórkowego, przy zachowaniu metabolicznego i funkcjonalnego przesłuchu między strukturami komórkowymi28,29.

W przeciwieństwie do pracy z tkankami lub komórkami stałymi, akwizycja obrazów fluorescencyjnych obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu różnych warunków eksperymentalnych. Obecny protokół może być wykorzystany do badania zmian w gęstości i dystrybucji mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz do badania różnic między grupami eksperymentalnymi, takich jak przedstawione tutaj przykłady między włóknami pochodzącymi z chudego i ob (ryc. 3 i ryc. 4). Należy zawsze brać pod uwagę, że obrazowanie żywych komórek oznacza standaryzację optymalnych warunków pracy przy niewielkim uszkodzeniu komórek. Czas pracy, jakość stosowanych roztworów, parametry akwizycji i naświetlanie laserów muszą być precyzyjnie kontrolowane. W związku z tym poniżej wymieniono podstawowe kwestie.

Mitochondria włókien mięśniowych nie mogą być zarejestrowane całkowicie podłużnie za pomocą mikroskopii konfokalnej ze względu na rozmiar włókna i uszkodzenia włókna, które mogą być spowodowane długą ekspozycją na laser. Niemniej jednak reprezentatywna próbka włókna jest rejestrowana w tej technice. Chociaż możliwe jest zarejestrowanie całej grubości włókna mięśni szkieletowych szczura za pomocą mikroskopii konfokalnej, oznacza to dłuższy czas rejestracji i ekspozycję na wiązkę laserową. W przypadku szczurów kontrolnych nie napotkano problemów z tymi nagraniami. Jednak włókna pochodzące ze stanów patologicznych mogą być bardziej podatne na uszkodzenia, co zaobserwowano we włóknach od szczurów Ob. W związku z tym preferowane jest uzyskanie stosu reprezentatywnych obrazów konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z. Gdy rejestrowany jest tylko odcinek grubości włókna, zaleca się pobranie stosu na tej samej głębokości na wszystkich badanych włóknach, ponieważ rozmieszczenie i gęstość mitochondriów mogą się różnić w zależności od ich położenia we włóknie. Rejestracja sygnału na głębokości powyżej 15 μm jest zalecana w celu uzyskania reprezentatywnych obrazów konfokalnych IMF, unikając populacji SSM, które znajdują się blisko peryferii.

Podczas akwizycji konfokalnej należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Po pierwsze, wybór soczewki obiektywu immersyjnego z uwzględnieniem powiększenia, wysokiego NA i ośrodka immersyjnego. Ponieważ komórki są utrzymywane w hydrofilowym podłożu inkubacyjnym, współczynnik załamania światła pożywki inkubacyjnej i zanurzeniowej musi być podobny, aby uzyskać dobry sygnał i zeskanować w głąb tkanki. Zwykle osiąga się to za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie. Obrazy konfokalne z rysunku 3 i rysunku 4 zostały wykonane za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie 20x, 0,7 NA. Obiektyw ten pozwala na rejestrację światłowodu na całej jego głębokości, ale zdecydowano się na skanowanie przy 15, 18 i 21 μm, ponieważ reprezentatywne obrazy konfokalne IMF można uzyskać przy sygnale o wysokiej intensywności fluorescencji i niewielkim uszkodzeniu światłowodu. Inne powiększenia, takie jak 40x i olej jako medium immersyjne, mogą być brane pod uwagę, ale muszą zostać ocenione.

Po drugie, rozmiar piksela do akwizycji obrazu jest obliczany zgodnie z twierdzeniem Nyquista, które pozwala na wybór odpowiedniego rozmiaru piksela, który pozwala uniknąć nadpróbkowania (wyższa ekspozycja lasera) i niedopróbkowania (prowadzi do mniejszej rozdzielczości)30. Obliczenia zależą od charakterystyki wybranej soczewki obiektywu i długości fali (~90 nm). Można go regulować za pomocą zoomu; Dlatego tylko jedno ustawienie powiększenia zapewnia optymalny rozmiar piksela30. Niemniej jednak w praktyce powiększenie zależy również od obszaru analizowanej próbki. W ten sposób znalezienie równowagi umożliwia pracę z rozmiarem piksela, który jest najbliższy kryterium Nyquista i który pasuje również do analizowanego obszaru. Rysunek 3 i Rysunek 4 zostały pozyskane z rozmiarem piksela 150 i 190 nm, co pozwoliło na analizę pełnej szerokości światłowodu, która wynosi ~50-80 μm.

Po trzecie, należy zastosować odpowiednią średnicę otworu, która zapobiega przedostawaniu się nieostrego światła do detektora. Zazwyczaj 1 Airy jest uważany za optymalny rozmiar otworka, ponieważ pozwala na wykrycie ~80% fotonów pochodzących z płaszczyzny ostrości30. Niemniej jednak niektóre barwione próbki biologiczne, które wykazują niski poziom fluorescencji, wymagają zwiększenia otworu30. Obrazy konfokalne z Rysunku 3 i Rysunku 4 zostały uzyskane z otworkiem o rozmiarze 3 Airy ze względu na słaby sygnał uchwycony za pomocą dolnego Airy. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że wzrost intensywności sygnału wynikający ze zwiększenia rozmiaru otworka prowadzi do zmniejszenia rozdzielczości z powodu zwiększonego nieostrego przechwyconego światła. Z tego powodu zalecamy użycie otworka o rozmiarze jak najbardziej zbliżonym do 1 airy.

Po odpowiednim pozyskaniu obrazy konfokalne mogą być przetwarzane w celu uzyskania ilościowych informacji na temat gęstości i rozmieszczenia mitochondriów. Niezależnie od tego, przed analizą należy wykonać krytyczny etap przetwarzania obrazu progowania, aby poprawić kwantyfikację sygnału. Podczas tego kluczowego kroku określana jest wartość intensywności fluorescencji, która oddziela dodatnie piksele mitochondriów od pikseli tła. Próg można zdefiniować za pomocą dopasowania Gaussa piku reprezentującego mitochondria, gdy histogram obrazu wyświetla dwa szczyty, jeden odpowiadający tłu, a drugi mitochondriom. Jednak rozkład bimodalny nie zawsze jest osiągany na każdym z obrazów, dlatego konieczne jest zastosowanie innych metod progowania.

W tym protokole opisano implementację progowania Otsu, które jest nieparametryczną i nienadzorowaną metodą przeznaczoną do znajdowania wartości progowej, gdy dwa piki nie są oddzielone lub występują inne piki31. Otsu można łatwo zastosować za pomocą platformy open source do analizy obrazów biologicznych; Można jednak przetestować inne metody progowania. Ta sama metoda progowania musi być zastosowana do wszystkich obrazów konfokalnych i musi być obliczana niezależnie dla każdego obrazu konfokalnego. Zastosowanie progu do całego stosu prowadzi do nieprawidłowych wyników. Po uzyskaniu obrazów binarnych po procesie progowania, analizę gęstości mitochondriów i FFT można łatwo przeprowadzić, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w tym protokole. Należy jednak zachować ostrożność podczas wykonywania obu analiz, aby uniknąć uwzględnienia jąder i naczyń włosowatych, ponieważ prowadziłoby to do błędów ilościowych. Jeśli chodzi o gęstość, wystarczy odjąć piksele, czyli obszar zajmowany przez jądra lub naczynia włosowate, od pikseli lub całkowitej powierzchni, która ma być analizowana. Ponadto podczas wykonywania analizy FFT należy sprawdzić, czy sygnał mitochondriów jest prosty. I odwrotnie, gdy sygnał mitochondriów jest nachylony, może wytwarzać profile, które nie reprezentują podłużnego rozkładu mitochondriów, dając nieprawidłowe dane dotyczące widma FFT. Ponadto można zastosować etap przetwarzania wstępnego w celu zmniejszenia szumów na obrazach. W tym protokole opisano dwa opcjonalne kroki przetwarzania wstępnego przy użyciu filtru mediany i dekonwolucji 2D. Wpływ tych metod wstępnego przetwarzania na obraz i zawartość gęstości mitochondriów przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że chociaż te wstępne procesy mogą poprawić jakość obrazu, mogą również spowodować utratę niektórych szczegółów obrazu. Dlatego należy ich używać z ostrożnością i konsekwentnie stosować do wszystkich analizowanych obrazów.

Pomimo swoich zalet, mikroskopia konfokalna jest ograniczona rozdzielczością boczną (XY) 180-250 nm, gdy spełnione są optymalne warunki do akwizycji32. Średnica mitochondriów wynosi ~ 200-700 nm, blisko granicy dyfrakcji mikroskopii konfokalnej; w związku z tym struktury submitochondrialne nie mogą być odpowiednio wykryte33 i nie mogą być oceniane za pomocą analiz gęstości i FFT przedstawionych w tym protokole. Inne techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), nanoskopia ze zmuszonym zubożeniem emisji (STED) lub mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mogą być badane w celu rozwiązania struktur submitochondrialnych32. W tym protokole obrazy konfokalne mitochondriów uzyskuje się za pomocą fluoroforu TMRE, który zależy od potencjału błony mitochondrialnej. Dlatego intensywność fluorescencji mitochondriów może się różnić w zależności od ich potencjału błonowego. Przed analizą danych wykonywany jest proces progowania, aby przezwyciężyć ten problem. Wszystkie piksele powyżej zdefiniowanego progu są uważane za dodatnie dla sygnału mitochondrialnego, niezależnie od ich wartości fluorescencji. Niemniej jednak należy zauważyć, że mitochondria o bardzo niskim potencjale błonowym nie mogą być rozwiązane tą techniką. W związku z tym zaleca się uzupełniające badania ilościowe zawartości białek mitochondrialnych. Zaletą stosowania TMRE jest to, że obrazy konfokalne mogą być również wykorzystywane do analizy potencjału błony mitochondrialnej, ale konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli za pomocą środków rozprzęgających, takich jak p-trifluorometoksyfenylohydrazon karbonylocyjanku (FCCP). Ponadto instrukcje dotyczące analizy gęstości i dystrybucji mitochondriów można uzyskać za pomocą zielonych wskaźników fluorescencyjnych dla mitochondriów, które obciążają mitochondria niezależnie od ich potencjału błonowego, ale strategia inkubacji i ustawienia akwizycji konfokalnej muszą być ustandaryzowane.

Biorąc pod uwagę, że struktura mitochondriów jest związana z podstawowymi funkcjami mitochondrialnymi i komórkowymi, opisany tutaj protokół może dostarczyć cennych informacji na temat ich przebudowy podczas choroby lub przez szczególne znieważenie stresowe. Może to przyczynić się do lepszego zrozumienia kluczowych funkcji mięśni szkieletowych zarządzanych przez mitochondria, takich jak produkcja energii, lub w których mitochondria odgrywają ważną rolę w interakcji z innymi organellami, takimi jak sprzężenie skurczu i metabolizmu. Postępowanie zgodnie z instrukcjami protokołu pozwala na oszacowanie gęstości i rozmieszczenia mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych. Etapy protokołu są podzielone na trzy główne etapy skoncentrowane na rozwarstwieniu pęczka mięśni szkieletowych, skanowaniu mikroskopią konfokalną i analizie obrazu, gdzie zawarte są szczegółowe instrukcje i ważne kwestie. Warto zauważyć, że protokół można dodatkowo zoptymalizować, aby zbadać dodatkowe kroki Z w celu pełnej rekonstrukcji mitochondriów w obrębie włókna zgodnie z potrzebami użytkownika. Na przykład można przetestować obrazy konfokalne i etapy analizy w celu zbadania struktur komórkowych o podobnym rozmieszczeniu, takich jak TT w żywych i stałych próbkach.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Szkołę Medyczną i Instytut Badań nad Otyłością w Tecnologico de Monterrey. Rysunek 3A został stworzony za pomocą oprogramowania Scientific Image and Illustration.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanuSigma-AldrichA6419
Szkiełko nakrywkowe ze szkła borokrzemianowegoWarner Instruments64-0709
Chlorek wapniaSigma-AldrichC5670
Mikroskop konfokalnyOprogramowanie doTCS SP5
Pakiet aplikacji Leica Leica2.7.3.9723
Fosfokinaza kreatynowaSigma-AldrichC3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)Biomedical Imaging Group, EPFLhttp://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
DimethylsulfoxideSigma-AldrichD2650
DL-Asparaginowy kwas potasowy półwodnySigma-Aldrich11240
Glikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&ostry glikol etylenowy; Kwas N&aostry-tetraoctowySigma-AldrichE4378
KleszczeMiltexMH-18
HC PL APO 20x/ 0,7 IMM obiektyw Leica506517
HEPESSigma-AldrichH3375
Nożyczki do przysłonyMiltex5-304
Kwas L-(-)-jabłkowySigma-AldrichM7397
Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowegoSigma-AldrichG1626
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM2393
MaxchelatorUC Davis Healthhttps://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm 
MikronożyczkiMiltex18-1633
Platforma open-source do biologicznej analizy obrazu Fidżi Publiczne, utrzymywane przez grupę Eliceiri/LOSI, grupę Jug i laboratorium Tomancak. Fidżihttps://fiji.sc/
Fosfokreatyna sól disodowa hydratSigma-AldrichP7936
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333
Generator PSF (PSF_Generator.jar)Grupa Obrazowania Biomedycznego, EPFLhttp://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ 
Komora nagraniowaWarner InstrumentsRC-27N
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881
Arkusz kalkulacyjny Microsoft ExcelMicrosoft 
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 508
Tetrametylorodamina, ester etylowyInvitrogenT669
mikroskopu konfokalnego Leica

Bibliografia

  1. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35(2014).
  2. De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357(2021).
  3. Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
  4. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).
  5. Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
  6. Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).
  7. Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
  8. Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).
  9. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
  10. Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).
  11. Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
  12. Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700(2021).
  13. Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  14. Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
  15. Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
  16. Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
  17. Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965(2020).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
  19. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  20. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  21. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).
  22. Meinild, L. A. -K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
  23. Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
  24. Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
  25. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  26. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610(2016).
  27. Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).
  30. Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer, Boston, MA. (2006).
  31. Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  32. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  33. Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dystrybucja mitochondriówsieć mitochondrialnaprogowanie obrazuszybka transformata Fourierabarwienie TMREobrazowanie Z-stackizolacja włókien mięśniowych
Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.