Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do analizy zmian w gęstości mitochondriów i dystrybucji podłużnej za pomocą obrazowania mięśni szkieletowych na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej do skanowania sieci mitochondrialnej.

Abstract

Mitochondrium to organella, która może być wydłużana, fragmentowana i odnawiana zgodnie z wymaganiami metabolicznymi komórek. Przebudowa sieci mitochondrialnej pozwala zdrowym mitochondriom sprostać wymaganiom komórkowym; Jednak utrata tej zdolności jest związana z rozwojem lub postępem różnych patologii. W mięśniach szkieletowych zmiany gęstości i rozmieszczenia mitochondriów obserwuje się między innymi w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak ćwiczenia, starzenie się i otyłość. Dlatego badanie sieci mitochondrialnej może zapewnić lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z tymi warunkami.

Tutaj opisany jest protokół obrazowania mitochondriów żywych włókien mięśni szkieletowych od szczurów. Włókna są ręcznie preparowane w roztworze relaksującym i inkubowane za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika obrazowania żywych komórek mitochondriów (ester etylowy tetrametylorodaminy, TMRE). Sygnał mitochondriów jest rejestrowany za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu trybu skanowania XYZ w celu uzyskania obrazów konfokalnych sieci mitochondrialnej międzymiofibrylarnej (IMF). Następnie obrazy konfokalne są przetwarzane przez progowanie i binaryzację. Binaryzowany obraz konfokalny uwzględnia dodatnie piksele mitochondriów, które są następnie zliczane w celu uzyskania gęstości mitochondrialnej. Sieć mitochondrialna w mięśniach szkieletowych charakteryzuje się dużą gęstością populacji IMF, która ma okresowy rozkład podłużny podobny do T-kanalików (TT). Szybka transformata Fouriera (FFT) to standardowa technika analizy wykonywana w celu oceny rozkładu TT, która pozwala znaleźć częstotliwość dystrybucji i poziom ich organizacji. W niniejszym protokole opisano implementację algorytmu FFT do analizy podłużnego rozmieszczenia mitochondriów w mięśniach szkieletowych.

Introduction

Mitochondria tworzą wysoce dynamiczne sieci, które są głównie regulowane przez równowagę między jego wydłużeniem (fuzją) a fragmentacją (rozszczepieniem)^1,2, które są modulowane przez ekspresję i aktywność białek, takich jak Mitofusin 1 i 2 (Mfn1 i Mfn2) oraz Atrofia Białka Wzrokowego 1 (Opa1), które regulują fuzję zewnętrznej błony mitochondrialnej i wewnętrznej błony, odpowiednio^1,2. Białko związane z dynaminą (Drp1) głównie reguluje rozszczepienie mitochondriów, gdy jest fosforylowane w klasie Ser6163.

W mięśniach szkieletowych dobrze ustalono, że sieć mitochondrialna jest ułożona w strukturalnie dobrze zdefiniowane subpopulacje na podstawie ich bliskości do różnych regionów komórek (miofibryli, sarkolemma i jądra)^4,5. Mitochondria znajdujące się tuż pod sarkolemmą nazywane są mitochondriami subsarkolemmalnymi (SSM), te znajdujące się między włóknami kurczliwymi nazywane są mitochondriami międzymiofibrylarnymi (IMF), a subpopulacja mitochondriów wokół jąder nazywana jest mitochondriami okołojądrowymi (PMN). Co więcej, zasugerowano, że te subpopulacje mitochondrialne mają funkcje specyficzne dla regionu i są wyspecjalizowane metabolicznie^4,5.

Utrzymanie homeostazy energii komórkowej, która umożliwia funkcje metaboliczne i kurczliwe, zależy w dużej mierze od interakcji i komunikacji w określonych miejscach poprzez sieć mitochondrialną (np. interakcja IMF i SSM)^4,6. Oprócz interakcji sieci mitochondriów, mitochondrium może również wchodzić w interakcje z innymi organellami, tworząc kompleksy strukturalne i funkcjonalne. W związku z tym wykazano, że IMF może znajdować się w sąsiedztwie retikulum sarkoplazmatycznego (SR) i w pobliżu jednostek uwalniających Ca²⁺ (CRU), utworzonych przez kanaliki poprzeczne (TT)⁷. Fakt ten jest istotny ze względu na rolę mitochondrialnego wychwytu^Ca2+ w regulacji syntezy ATP i apoptozy. Ostatnio zasugerowano również potencjalną rolę w regulacji cytozolowych stanów przejściowych Ca^{2+ 8}.

TT to wgłębienia sarcolemmy, które mają okresowy rozkład wzdłuż osi podłużnej kardiomiocytów i włókien mięśni szkieletowych^9,10, podobnie jak w dystrybucji IMF⁵. Zmiany w dystrybucji TT mają ważne implikacje fizjologiczne, biorąc pod uwagę ich rolę w funkcji skurczowej. Jednak zmiany te oceniano głównie w kardiomiocytach. Analiza szybkiej transformaty Fouriera (FFT) umożliwia konwersję sygnałów okresowych z dziedziny odległości do dziedziny częstotliwości, w wyniku czego uzyskuje się widmo FFT, które wskazuje częstotliwość i regularność sygnału^11,12,13. Chociaż istnieją dowody na to, że organizacja sieci mitochondrialnej we włóknach mięśni szkieletowych jest niezbędna do adaptacji do różnych warunków metabolicznych, takich jak podczas regeneracji po urazie mięśni^14,15, większość analiz jest wykonywana jakościowo.

Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że dysfunkcja mitochondriów została powiązana z kilkoma chorobami związanymi z mięśniami szkieletowymi (np. zanik przy użyciu alkoholu)² i chorobami niezwiązanymi z mięśniami, szczególnie chorobami metabolicznymi i związaną z tym utratą masy mięśniowej (tj. atrofią)¹⁶, ilościowa ocena sieci mitochondrialnej i rozmieszczenia w mięśniach szkieletowych nabiera znaczenia. Ostatnio zaobserwowano istotną różnicę w podłużnym rozmieszczeniu mitochondriów włókien mięśniowych brzuchatego łydki między grupą otyłych (Ob; Szczury Zucker fa/fa) i grupa lean (Lean; Zucker +/+ szczury) został zidentyfikowany przez FFT¹⁷. Badanie to wykazało przydatność FFT w analizie dystrybucji mitochondrialnej. W związku z tym w protokole przedstawiono metodologię badania mitochondriów w żywych włóknach mięśni szkieletowych na podstawie obrazów uzyskanych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Gęstość mitochondriów określa się ilościowo za pomocą progowania tła, a także opisano analizę podłużnego rozkładu mitochondriów za pomocą analizy FFT. Schemat przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 1.

Protocol

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały ocenione i zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (CICUAL) Tecnologico de Monterrey (Protokół 2019-007). Do tego badania wykorzystano samce szczurów Zucker (+/+ i fa/fa) w wieku od 12 do 13 tygodni. Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach hodowlanych (12 h/12 h cykl jasny/ciemny, 40-60% wilgotności) i miały dostęp do pożywienia (standardowa karma dla szczurów) i wody ad libitum.

1. Skład roztworu

1. Przygotować świeży roztwór Relax, mieszając składniki przedstawione w Tabeli 1. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH).
2. Obliczyć stężenie wolnego wapnia w roztworze Relax za pomocą programu symulacyjnego do oznaczania stężenia wolnego metalu.
3. Przygotować 5 mM zapas estru metylowego tetrametylodaminy (TMRE) w dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie rozcieńczyć 0,1 mM w DMSO.

2. Rozwarstwienie wiązek włókien mięśniowych brzuchatego łydki

1. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i zamknij pokrywę. Włącz źródło tlenu, ustaw natężenie przepływu gazu na 0,5 l/min i ustaw parownik na 4% sewofluranu, aby wywołać znieczulenie.
2. Gdy szczur zaśnie, umieść go na zewnątrz komory w pozycji leżącej, utrzymując znieczulenie. Uszczypnij palec u nogi lub ogon, aby sprawdzić brak odruchów.
3. Nożyczkami przetnij skórę i mięśnie brzucha. Następnie przetnij klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca.
4. Aby wykonać kardiektomię, chwyć kleszcze za serce z najwyższych żył i tętnic i przetnij naczynia krwionośne nożyczkami. Usuń serce.
5. Bezpośrednio po eutanazji należy zdezynfekować tylną kończynę etanolem i ogolić ją za pomocą maszynki do golenia.
6. Przytrzymaj tylną stopę i wykonaj nacięcie nożyczkami przez skórę na poziomie ścięgna Achillesa.
7. Przetnij tylną kończynę nożyczkami na poziomie bliższej części kości piszczelowej. Przenieść go na szalkę Petriego o średnicy 60 mm zawierającą 3 ml lodowatego roztworu Relax w pozycji grzbietowej. Przykryj go wystarczającą ilością roztworu, aby zapobiec wysuszeniu mięśni.
8. Zidentyfikuj ścięgno Achillesa, ostrożnie podnieś je kleszczami i wypreparuj mięśnie od kości nożyczkami do tęczówki. Użyj mikroskopu stereoskopowego od tego etapu sekcji.
9. Zidentyfikuj i oddziel cały mięsień brzuchaty łydki, główną masę z tyłu kończyny tylnej.
10. Wypreparuj i odrzuć tkankę łączną i tłuszczową otaczającą mięsień za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Przenieś boczną głowę mięśnia na nową szalkę Petriego z lodowatym roztworem relaksacyjnym (patrz Rysunek 2A).
11. Delikatnie przytrzymaj mięsień kleszczami z jednego końca i ostrożnie podziel go na wiązki za pomocą mikronożyczek. Zawsze manipuluj wiązkami, delikatnie przytrzymując je z jednej strony kleszczami.
    UWAGA: Wiązki mają około 10 mm długości i 2 mm szerokości.
12. Przenieś wiązki błonnika na nową szalkę Petriego z 2 ml lodowatego roztworu Relax. Wybieraj tylko te, które mają gładki wygląd, są kompletne od jednego końca do drugiego i nie są skrócone (Rysunek 2B).

3. Obrazowanie żywych komórek mitochondriów w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Inkubować włókna w 2,5 × ^10-4 mM TMRE w roztworze Relax przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Przy zalecanych stężeniach roboczych TMRE oczekuje się, że będzie on w trybie niehartowanym. Od tego momentu należy chronić przed nasłonecznieniem.
2. W czasie inkubacji:
   1. Otwórz standardowe oprogramowanie mikroskopu konfokalnego, wybierz strukturę konfiguracji, a w oknie dialogowym konfiguracji sprzętu wybierz laser i zaznacz opcję HeNe 543.
   2. W strukturze pozyskiwania wybierz okno dialogowe akwizycji, a następnie w trybie pozyskiwania wybierz panel XYZ.
   3. W oknie dialogowym XY wybierz format 512 x 512, prędkość 400 Hz i sprawdź panel otworkowy. W wyświetlonym oknie dialogowym otworkowym wybierz AU dla jednostki i dodaj wartość 3 Airy dla otworka.
      UWAGA: Rozważ zmniejszenie rozmiaru otworka najbliższego optymalnemu kryterium 1 Airy, jeśli zachowany jest odpowiedni sygnał fluorescencji.
   4. W oknie dialogowym Ustawienia ścieżki wiązki wybierz obiektyw zanurzenia w wodzie 20x i aperturę numeryczną (NA) 0,7 (20x/0,7 IMM), a następnie wybierz okno długości fali emisji 576-700 nm. Wybierz DD488/543 i 15% mocy lasera dla lasera 543.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie do skanowania obrazowania na żywo (jeśli jest dostępna). Ponieważ uzyskuje się podobny współczynnik załamania światła ośrodka zanurzeniowego i ośrodka inkubacyjnego.
3. Po 20 minutach inkubacji należy dwukrotnie wymienić pożywkę inkubacyjną. Upewnij się, że obrazy konfokalne zostały uzyskane w ciągu 20-30 minut po inkubacji.
4. Przygotować komorę zapisu z szkiełkiem nakrywkowym o grubości 0,15 mm ze szkła borokrzemowego.
   UWAGA: Wybierz grubość szkiełka nakrywkowego zgodnie z dostępną komorą nagrywania, biorąc pod uwagę, że grubość zwykle waha się od 0,15 do 0,22 mm w celu uzyskania optymalnej wydajności.
5. Dodaj 200 μl roztworu Relax do komory nagraniowej i przenieś wiązki włókien.
6. W mikroskopie konfokalnym użyj trybu jasnego pola, aby zidentyfikować żywotne włókna do fluorescencyjnego zapisu mitochondriów. Żywotne włókna są kompletne, nie skurczone i mają nienaruszony wzór prążków.
7. Oddziel wiązki włókien od siebie i wyrównaj je za pomocą kleszczy. Wybierz te, które znajdują się najbliżej szkiełka nakrywkowego.
8. Zeskanuj fluorescencję za pomocą przycisku na żywo, aby dostosować wzmocnienie i przesunięcie w konsoli Panelu sterowania, biorąc pod uwagę następujące kwestie:
   1. Wybierz niskie wartości intensywności fluorescencji dla tła składającego się z prawie 0 jednostek arbitralnych (A.U.).
   2. Wybierz poziom wzmocnienia od 100 do 200 A.U., aby uniknąć nasycenia systemu nagrywania. Dlatego nie rejestruj najwyższych poziomów fluorescencji.
   3. Wybierz rozmiar piksela 150-190 nm, aby uzyskać pełną szerokość włókna, dostosowując współczynnik powiększenia w oknie dialogowym XY.
      UWAGA: Rozważ użycie rozmiaru piksela bliższego kryteriom Nyquista (90 nm), który umożliwia skanowanie całej szerokości światłowodu.
9. W oknie dialogowym Stos Z dostosuj odległość Z, aby uzyskać sygnał fluorescencji, zaczynając od głębokości światłowodu od 15 μm (przycisk rozpoczęcia) do 22 μm (przycisk końcowy). Wybierz 3 μm jako rozmiar kroku Z.
10. Kliknij przycisk Start, aby uzyskać obrazy konfokalne. Uzyskaj stos Z złożony z trzech obrazów konfokalnych uzyskanych na głębokości 15, 18 i 21 μm.

4. Analiza gęstości mitochondriów

1. Na platformie open-source do analizy obrazów biologicznych ¹⁸ otwórz plik Z-stack i obróć obrazy, aby umieścić światłowód poziomo, jak pokazano w Rysunek 3B.
2. Losowo wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje obszar zajmowany przez mitochondria (ROI_mito). Wybierz rozmiary_MITO ROI w zakresie od 65 do 90 μm dla X. W przypadku Y rozmiar będzie zależał od szerokości włókna, unikając jego obrzeży.
3. Zduplikuj stos Z z wybranym _mito ROI i zapisz go jako nowy stos Z (Mito-stack) w formacie TIFF. Zapisz pozycję _MITO ROI wybraną na oryginalnym stosie za pomocą narzędzia ROI Manager.
4. Oblicz próg odejmowania tła w następujący sposób:
   1. Użyj skrótu command+shift+t, aby otworzyć okno dialogowe Próg.
   2. Wybierz algorytm progowy Otsu |Czarno-biały | Opcja ciemnego tła. Zauważ, że obraz jest teraz binaryzowany.
   3. W oknie dialogowym Próg obserwuj histogram rozkładu intensywności fluorescencji i wyświetlaną wartość progową.
      UWAGA: Piksele mitochondrialno-dodatnie mają wartości intensywności fluorescencji większe niż próg i pojawiają się jako białe piksele na obrazie binarnym.
   4. Zastosuj próg do stosu obrazów binarnych, wybierając pozycję Zastosuj. W wyświetlonym oknie dialogowym Konwertuj stos na binarny wybierz opcje Oblicz próg dla każdego obrazu, Czarne tło, Utwórz nowy stos i kliknij przycisk OK.
5. Zauważ, że generowany jest stos z trzema obrazami binarnymi (BinDMito-stack). Zapisz go w formacie TIFF.
6. Oblicz gęstość mitochondriów w stosie BinDMito w następujący sposób:
   1. Wybierz menu Analizuj. Następnie kliknij Histogram. W wyświetlonym oknie dialogowym histogramu kliknij przycisk Tak, aby uwzględnić wszystkie obrazy stosu do analizy.
   2. W oknie dialogowym Histogram stosu kliknij przycisk Lista, aby uzyskać dane histogramu. Przenieś dane histogramu do arkusza kalkulacyjnego.
   3. W arkuszu kalkulacyjnym zidentyfikuj piksele Mito, które mają wartość 255. Obliczać Gęstość mitochondrialna za pomocą równania (1):
      Gęstość mitochondriów = × 100 (1)
      Łączna liczba pikseli jest identyfikowana jako N w oknie dialogowym Histogram lub obliczana przez zsumowanie w arkuszu kalkulacyjnym liczby pikseli histogramu.
   4. Aby obliczyć obszar zajmowany przez mitochondria (μm²), pomnóż Mito-piksele stosu BinDMito przez rozmiar piksela.

5. Analiza rozkładu mitochondriów za pomocą szybkiej transformaty Fouriera

1. Na platformie open source do analizy obrazów biologicznych otwórz stos BinDMito i narysuj prostokątny zwrot z inwestycji o szerokości 256 pikseli i wysokości 5 μm. Zlokalizuj ROI w pozycji środkowej, a drugi w pozycji bocznej, jak pokazano na Rysunek 4A,B.
2. Użyj narzędzia ROI Manager, aby skonfigurować ROI dla analizy FFT i zapisać je.
   UWAGA: W zależności od potrzeb analizy, inne ROI można wybrać w różnych pozycjach, a ich rozmiary można modyfikować. Niemniej jednak szerokość musi być równa 2ⁿ pikseli, aby wykonać FFT (np. 128, 256, 512 pikseli).
3. Uzyskaj profil wykresu ROI za pomocą polecenia skrótu + k i przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego.
4. W arkuszu kalkulacyjnym wypełnij kolumny B i C danymi uzyskanymi z profilu wydruku. Kolumna B zawiera odległość w μm, a kolumna C odpowiednią wartość intensywności fluorescencji w odcieniach szarości (A.U.).
5. Kolumna D odpowiada częstotliwości FFT (zdarzenie/μm), która zostanie wypełniona w następujący sposób:
   1. Obliczyć częstotliwość próbkowania (Fs): Fs = 1/Δd, gdzie Δd jest krokiem odległości (druga wartość B).
   2. Oblicz ΔFs: ΔFs = Fs/N, gdzie N to liczba punktów danych B (256).
   3. Obliczyć wartość zatrzymania częstotliwości FFT (S): S = (N/2) ×ΔFs.
   4. Wypełnij kolumnę D w następujący sposób:
      1. Pierwsza wartość kolumny D jest równa 0.
      2. Zaznacz drugą komórkę w kolumnie D, przejdź do menu głównego, wybierz wypełnienie i kliknij serię. Wybierz kolumny. Jako wartość kroku należy użyć obliczonego Δ Fs. Jako wartość zatrzymania użyj obliczonej wartości S.
   5. Następnie wypełnij kolumnę E wartościami złożonymi FFT w następujący sposób:
      1. Wstaw 0 w pierwszej komórce kolumny C, ponieważ odległość 0 musi pokrywać się z sygnałem 0 do obliczenia FFT.
      2. Następnie przejdź do menu Dane, kliknij Analiza danych i wybierz Analiza Fouriera.
      3. W nowym oknie wybierz zakres punktów danych sygnału fluorescencyjnego opisany w kolumnie C dla zakresu wejściowego.
         UWAGA: Liczba punktów danych musi wynosić 2ⁿ (np. 256 lub 128 punktów danych sygnału fluorescencyjnego).
      4. Wybierz odpowiedni zakres E dla zakresu wyjściowego.
      5. Wybierz przycisk Ok i pozwól, aby złożone wartości FFT zostały wypełnione automatycznie.
6. Wypełnij kolumnę F wielkością FFT w następujący sposób:
   1. Użyj funkcji IMABS, aby zwrócić wartość bezwzględną w F z liczby zespolonej w E i pomnóż przez 2/N, aby znormalizować (równanie (2)):
      Wielkość FFT = (IM.ABS (E₁...E_n) × (2/N) (2)
7. Wykreślić widmo FFT, używając wielkości FFT w F, w funkcji częstotliwości FFT w D, aż do S. Znajdź punkt maksymalnego piku i odpowiadającą mu częstotliwość FFT.
8. Przelicz częstotliwość FFT maksymalnego piku na odległość za pomocą równania (3). Ta obliczona odległość reprezentuje odległość podłużną rozkładu mitochondriów.
   Odległość (μm) = 1/FFT częstotliwość (3)
   UWAGA: Ze względu na symetrię FFT nie należy wykreślać częstotliwości FFT poza wartość S, która odpowiada połowie punktów danych, unikając duplikacji widma FFT.

6. Opcjonalne kroki wstępnego przetwarzania w celu zmniejszenia szumu obrazu przed analizą obrazu

1. Zastosuj filtr mediany lub dekonwolucję 2D w następujący sposób:
   1. Dla filtra mediany:
      1. Wybierz punkt menu Process (Proces) | Filtry i kliknij opcję Mediana.
      2. W wyświetlonym oknie dialogowym Mediana wybierz 2.0 dla opcji Promień i kliknij przycisk OK. Wybierz opcję Tak, aby zastosować proces do wszystkich obrazów w stosie Mito.
      3. Obserwuj redukcję szumów na obrazach.
   2. Do dekonwolucji 2D:
      1. Wygeneruj teoretyczną funkcję rozpiętości punktów (PSF).
      2. Pobierz PSF_Generator.jar wtyczki i umieść plik w folderze "Wtyczki".
      3. W oknie dialogowym Generator PSF kliknij opcję Model optyczny 3D Born & Wolf, wprowadź wartość zanurzenia w indeksie refrakcyjnym 1,33 używaną podczas skanowania konfokalnego i wybierz opcję Najlepsza dla opcji Obliczanie dokładności.
      4. Uchwyć 576 nm dla długości fali emisji, NA użytej soczewki obiektywu 0,7 i krok Z 3,000 nm.
      5. Uchwyć rozmiar piksela XY obrazu konfokalnego, który ma zostać zdekonwoluowany, a także rozmiar XYZ wskazujący liczbę pikseli X i Y oraz liczbę kroków Z (3 dla tego protokołu).
      6. W menu Wyświetlanie generatora PSF kliknij opcję liniowa, wybierz rozdzielczość 8 bitów, a następnie wybierz opcję szarości dla tabeli przeglądowej (LUT).
      7. Uruchom generator PSF i zapisz teoretyczny plik PSF utworzony w formacie TIFF.
      8. Utwórz sumę wycinków PSF utworzonego przez otwarcie narzędzia Projekt Z opcji Stosy, która znajduje się w menu Obraz.
      9. W wyświetlonym oknie dialogowym ZProjection wybierz opcję Suma wycinków dla Typ rzutowania i kliknij przycisk OK. Zapisz nowy plik PSF w formacie TIFF.
         UWAGA: Zamiast teoretycznych PSF można użyć PSF otrzymanego eksperymentalnie przez konfokalne skanowanie fluorescencyjne mikrogranulek o znanej średnicy.
      10. Pobierz wtyczkę "DeconvolutionLab_2.jar"¹⁹ i umieść ją w folderze wtyczki.
      11. Kliknij menu Wtyczki. Następnie kliknij DeconvolutionLab2.
      12. Oddziel obrazy konfokalne od stosu Mito za pomocą narzędzia Obrazy do układania w stos z opcji Stosy znajdującej się w menu Obraz i zapisz je w formacie TIFF.
      13. W oknie dialogowym DeconvolutionLab2 wybierz jeden z obrazów uzyskanych ze stosu Mito. Wybierz utworzony teoretyczny PSF i wybierz algorytm Richardsona-Lucy'ego z 15 iteracjami.
      14. Uruchom DeconvolutionLab2, sprawdź poprawę sygnału i redukcję szumów na obrazie, a następnie zapisz go w formacie TIFF.
2. Przejdź do kroku 4.4, aby przeprowadzić analizę obrazu.
3. Aby określić próg zdekonwoluowanych obrazów, przekonwertuj je na maskę 8-bitową podczas procesu progowania. Utwórz stos z obrazami binarnymi i zdekonwoluowanymi, wybierając opcję Obrazy do ułożenia w stos w narzędziu Stosy w menu Obraz.
4. W przypadku analizy FFT obrazów zdekonwolucyjnych profil wydruku zawiera odległość w jednostkach pikseli. Przekształć jednostki pikseli w μm w następujący sposób:
   1. W arkuszu kalkulacyjnym, po wykonaniu kroku 5.4, przenieś dane z B do A. Następnie wypełnij B odległością w μm, mnożąc każdy numer piksela od A przez rozmiar piksela.

Results

Zgodnie z obecnym protokołem, można przeprowadzić analizę gęstości i rozmieszczenia mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych. Protokół jest podzielony na trzy główne etapy: rozwarstwienie pęczka mięśni szkieletowych, mikroskopia konfokalna i analiza obrazu. Przegląd przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 1. Rysunek 2A pokazuje cały mięsień brzuchaty łydki szczura na szalce Petriego, oznaczając boczną głowę, z której pochodzą włókna, podczas gdy Rysunek 2B pokazuje wiązki włókien w roztworze Relax. Za pomocą mikroskopii konfokalnej mitochondria można rejestrować wzdłuż głębokości żywych włókien mięśni szkieletowych za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika TMRE. TMRE jest lipofilowym kationowym fluoroforem, który jest selektywnie gromadzony w mitochondriach zgodnie z potencjałem błony mitochondrialnej²⁰.

Optymalny obraz konfokalny IMF można uzyskać, wybierając odległość Z powyżej 15 μm głębokości wewnątrz włókna (Rysunek 3A). Rysunek 3B pokazuje reprezentatywne obrazy konfokalne XY mitochondriów załadowanych TMRE, uzyskane wzdłuż odległości Z włókien mięśniowych brzuchatego łydki (15 do 21 μm). Obrazy konfokalne zostały przetworzone przez progowanie w celu przekształcenia ich w obrazy binarne, aby umożliwić analizę mitochondrialną. Rysunek 3B (lewy panel) pokazuje włókno od ćwiczonego szczura lean. Reprezentuje oczekiwany zapis konfokalny mitochondriów włókien mięśni szkieletowych, ponieważ ma spójny wzór wzdłuż włókna. W przeciwieństwie do tego, wybraliśmy włókno od szczura Ob (Rysunek 3B, prawy panel), które wykazuje znaczne zmiany w zawartości i dystrybucji mitochondriów. Rysunek 3C pokazuje kwantyfikację obszaru włókien zajmowanego przez mitochondria, wyrażoną jako gęstość mitochondriów, uzyskaną z każdego binaryzowanego obrazu (pokazanego w panelu B). Zgodnie z oczekiwaniami, włókno Ob charakteryzowało się niższą gęstością mitochondriów. Został on określony ilościowo konsekwentnie wzdłuż analizowanej odległości Z, co jest również obserwowane w Rysunek 3D, gdy gęstość mitochondriów jest obliczana na stos zgodnie z trzema obrazami konfokalnymi uzyskanymi przy 15, 18 i 21 μm.

Podobnie jak w przypadku analizy gęstości mitochondriów, konfokalne skanowanie wskaźnika fluorescencyjnego do obrazowania żywych komórek, takiego jak TMRE, pozwala na badanie podłużnej organizacji mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych. IMF przedstawia okresową organizację w paśmie I zbliżoną do TT⁷, która może być analizowana przez FFT w celu ilościowego określenia częstotliwości sygnału mitochondrialnego i poziomu organizacji¹⁷. Rysunek 4 pokazuje różnice w organizacji IMF znalezione u szczurów mięsnych i łydnych oraz jak FFT pozwala znaleźć zmiany w dystrybucji sygnału mitochondrialnego. Rysunek 4A,B pokazuje podłużne ROI wybrane w środkowej i bocznej pozycji w światłowodzie do analizy FFT. Przed wykonaniem FFT obliczane jest próg odejmowania tła. Następnie obraz jest binaryzowany; Procedury te eliminują różnice w poziomach intensywności fluorescencji sygnału mitochondrialnego. Obraz binarny przedstawia profil wykresu rozkładu fluorescencji niezbędny do wykonania FFT.

Rysunek 4C,D pokazuje wybrane ROI w panelach A i B wraz z ich profilami wykresu (górne panele). Na podstawie profili wykresów można zaobserwować różnice w rozkładzie fluorescencji między włóknami pochodzącymi od szczurów chudych i ob, a także różnice między ROI w obrębie tego samego włókna. Dla każdego profilu wykresu prezentowane jest odpowiednie widmo FFT (dolne panele). Szczyt maksymalnego widma FFT wskazuje częstotliwość FFT (oś X) rozkładu sygnału mitochondrialnego wzdłuż osi podłużnej. Można go przekształcić w wartość odległości bliską 2 μm w bocznych i centralnych ROI od szczura Lean. Warto zauważyć, że wielkość FFT piku jest wskaźnikiem regularności sygnału mitochondrialnego, a zmiany tej amplitudy ujawniają zmiany w rozmieszczeniu mitochondriów.

Rysunek 4E,F pokazuje różnice w widmie FFT między włóknami pochodzącymi z Lean i Ob, gdzie analizowano odpowiednio boczne i centralne ROI. W bocznych ROI (Rysunek 4E) częstotliwość podłużnego rozkładu mitochondriów była podobna w chudych włóknach i pochodzących z Ob; niemniej jednak amplituda maksymalnego piku FFT we włóknach pochodzących od Obu była wyższa, co zgadza się z wyższą regularnością sygnału obserwowaną na obrazie w Rysunek 4B. Niemniej jednak, centralny ROI (Rysunek 4F) Ob jest obserwowany jako przykład krytycznego zmniejszenia piku FFT w porównaniu z Lean, gdy występuje istotna zmiana rozkładu mitochondriów.

Rysunek 1: Schemat analizy mitochondrialnej w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Schemat ten podsumowuje główne kroki protokołu w trzech oddzielnych fazach. Pierwsza faza, rozbiór wiązek włókien mięśniowych brzuchatego łydki, jest podzielona na trzy kolejne etapy, izolację mięśni brzuchatych łydki, a następnie mechaniczne rozwarstwienie mięśni na wiązki, aby ostatecznie dokonać wizualnej selekcji tych zdolnych do życia. Druga faza polega na akwizycji żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej, która polega na inkubacji z fluoroforem (TMRE) przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu umieszczenia włókien w komorze. Następnie w mikroskopie dokonuje się odpowiednich ustawień w celu przeprowadzenia akwizycji obrazów konfokalnych. W trzeciej fazie przeprowadzane jest konfokalne przetwarzanie obrazu i analiza danych. Począwszy od przetwarzania obrazu, gdzie wymagany jest próg do wygenerowania obrazów binarnych, na podstawie których wykonywane są obliczenia gęstości mitochondrialnej i rozkładu mitochondriów za pomocą FFT. Skróty: TMRE = ester etylowy tetrametylorodaminy; FFT = szybka transformata Fouriera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rozwarstwienie pęczka mięśni szkieletowych. (A) Wypreparowana boczna głowa mięśnia brzuchatego łydki szczura (strzałka) na szalce Petriego z roztworem Relax. (B) Reprezentatywny obraz wiązek włókien mięśniowych brzuchatego łydki w roztworze Relax przed załadowaniem TMRE. Skrót: TMRE = ester etylowy tetrametylorodaminy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza gęstości mitochondriów. (A) Ilustracja przedstawiająca odległość Z zalecaną do konfokalnego skanowania mitochondriów IMF we włóknach mięśni szkieletowych. (B) Seria konfokalnych obrazów mitochondriów obciążonych TMRE we włóknach mięśni szkieletowych, uzyskanych od ćwiczonego szczura Zuckera +/+ (Lean) i od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob) zarejestrowanych w odległości Z (od 15 do 21 μm głębokości). Obrazy zostały przetworzone przez progowanie i przekształcone w obrazy binarne. (C) Obliczona mitogęstość warstw konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z obserwowanych w panelu B. (D) Gęstość mitologiczna uzyskana ze stosu złożonego z obrazów zaobserwowanych w panelu B. Obrazy w panelu B mają wymiary 65 x 50 μm. Podziałka = 10 μm. Skróty: Mito-gęstość = Gęstość mitochondrialna; IMF = mitochondria międzymięśniowe; Ob = Otyły; SSM = mitochondria subsarkolemmalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza rozkładu mitochondriów przez FFT. Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE uzyskane na głębokości 21 μm włókien mięśni szkieletowych uzyskane od ćwiczonego szczura Zucker +/+ (Lean, panel A) i od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob, panel B). Obrazy zostały przetworzone przez progowanie i przekształcone w obrazy binarne. Boczne i środkowe ROI z panelu A (panel C) i panelu B (panel D) wraz z odpowiednimi profilami wykresu intensywności fluorescencji (górny wykres) i widma FFT (dolny wykres). FFT obliczono na podstawie ROI o szerokości 256 pikseli, co odpowiada rozmiarowi ROI 39 x 5 μm w panelu A i rozmiarowi ROI 50 x 5 μm w panelu B. Panel E pokazuje różnice w spektrum FFT znalezione między mitochondriami pochodzącymi od szczurów Lean i Ob w bocznym ROI, podczas gdy panel F pokazuje różnice widma FFT centralnego ROI. Podziałka = 10 μm. Skróty: A.U. = Jednostki Arbitralne; FFT = szybka transformata Fouriera; ROI = regiony zainteresowania; Ob = Otyły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnik	Końcowe stężenie w 100 ml	skład
K-asparaginian	100 mM
Kcl	20 mM
HEPESY	20 mM
Kwas L-glutaminowy	3 mM
kwas jabłkowy	3 mM
EGTA (EGTA)	0,1 mM	10 mM
MgCl2	1 mM wolne Mg2+
CaCl2	0,00002 mM wolnego Ca2+
Fosfokreatyna di-Na	5 mM	500 mM
Fosfokinaza kreatynowa	5 j./ml	200 U/ml
MgATP (MgATP)	5 mM
pH 7,3 (z NaOH)

Tabela 1: Odczynniki do relaksacji roztworu i jego stężenie.

Rysunek uzupełniający S1: Wpływ metod wstępnego przetwarzania obrazów. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE uzyskane na głębokości 18 μm we włóknach mięśni szkieletowych uzyskane od ćwiczonego szczura Zucker +/+ (Lean, górny panel) i od otyłego szczura Zuckera fa/fa (dolny panel), wraz z ich odpowiednimi obrazami uzyskanymi po wstępnym przetworzeniu przy użyciu progowania Otsu, filtra mediany i progowania Otsu', oraz dekonwolucja 2D i progowanie Otsu. (B) Wykreśl profil mito-gęstości uzyskany z obrazów konfokalnych (panel A) po wstępnym przetworzeniu różnymi metodami. Obrazy w panelu A mają wymiary 65 x 50 μm. Podziałka = 10 μm. Skróty: 2D-Decon = dekonwolucja 2D; Gęstość mito = gęstość mitochondrialna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Mitochondria to organelle o dużej zdolności przebudowy. Ich zawartość, gęstość i dystrybucja mogą być szybko modyfikowane poprzez aktywację mechanizmów fuzji i rozszczepienia mitochondriów, znanych jako dynamika mitochondriów1, oraz równowagę między mechanizmami obrotu mitochondrialnego: biogenezą mitochondriów i wyspecjalizowanym szlakiem degradacji mitochondriów, mitofagią^21,22. Zawartość i morfologia mitochondriów może się różnić w zależności od typu komórki i etapu rozwoju oraz może być przebudowywana pod wpływem różnych bodźców fizjologicznych i patologicznych 17,22,23,24. Dlatego badania nad morfologią mitochondriów są istotne od ponad pół wieku²⁵. Warto zauważyć, że analiza mitochondriów za pomocą mikroskopii elektronowej była standardową techniką stosowaną w wielu badaniach²⁶.

Badania fluorescencyjne za pomocą mikroskopii konfokalnej zyskały na znaczeniu w ciągu ostatnich kilku lat ze względu na ich zdolność do obrazowania żywych komórek mitochondriów na różnych głębokościach włókien, co może pomóc w lepszym zrozumieniu roli mitochondriów w mięśniach szkieletowych w różnych warunkach adaptacyjnych i nieadaptacyjnych²⁷. W pracy opisano metodologię analizy gęstości i rozmieszczenia mitochondriów we żywych włóknach mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednym z głównych wyzwań związanych z pracą z żywymi włóknami mięśni szkieletowych jest uniknięcie skurczu w wyniku procesów izolacji aż do mitochondrialnego zapisu konfokalnego. Aby osiągnąć ten cel, stosuje się roztwór Relax¹⁷ o wysokiej zawartości Mg i ATP, aby utrzymać włókna w stanie zrelaksowanym przez co najmniej 2 godziny, co daje wystarczająco dużo czasu na przeprowadzenie procesu izolacji włókien, obciążenia fluoroforem i uzyskania sygnału mitochondrialnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Krytycznym punktem protokołu jest mechaniczne pozyskiwanie włókien, ponieważ wymaga to dużej precyzji i świeżej tkanki; Możliwe jest jednak uzyskanie żywotnych wiązek włókien z mięśni szczura za pomocą tej wcześniej stosowanej i opisanej techniki²⁸. Uzyskanie nienaruszonych włókien pozwala na zachowanie sarkolemmy i środowiska wewnątrzkomórkowego, przy zachowaniu metabolicznego i funkcjonalnego przesłuchu między strukturami komórkowymi^28,29.

W przeciwieństwie do pracy z tkankami lub komórkami stałymi, akwizycja obrazów fluorescencyjnych obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu różnych warunków eksperymentalnych. Obecny protokół może być wykorzystany do badania zmian w gęstości i dystrybucji mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz do badania różnic między grupami eksperymentalnymi, takich jak przedstawione tutaj przykłady między włóknami pochodzącymi z chudego i ob (ryc. 3 i ryc. 4). Należy zawsze brać pod uwagę, że obrazowanie żywych komórek oznacza standaryzację optymalnych warunków pracy przy niewielkim uszkodzeniu komórek. Czas pracy, jakość stosowanych roztworów, parametry akwizycji i naświetlanie laserów muszą być precyzyjnie kontrolowane. W związku z tym poniżej wymieniono podstawowe kwestie.

Mitochondria włókien mięśniowych nie mogą być zarejestrowane całkowicie podłużnie za pomocą mikroskopii konfokalnej ze względu na rozmiar włókna i uszkodzenia włókna, które mogą być spowodowane długą ekspozycją na laser. Niemniej jednak reprezentatywna próbka włókna jest rejestrowana w tej technice. Chociaż możliwe jest zarejestrowanie całej grubości włókna mięśni szkieletowych szczura za pomocą mikroskopii konfokalnej, oznacza to dłuższy czas rejestracji i ekspozycję na wiązkę laserową. W przypadku szczurów kontrolnych nie napotkano problemów z tymi nagraniami. Jednak włókna pochodzące ze stanów patologicznych mogą być bardziej podatne na uszkodzenia, co zaobserwowano we włóknach od szczurów Ob. W związku z tym preferowane jest uzyskanie stosu reprezentatywnych obrazów konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z. Gdy rejestrowany jest tylko odcinek grubości włókna, zaleca się pobranie stosu na tej samej głębokości na wszystkich badanych włóknach, ponieważ rozmieszczenie i gęstość mitochondriów mogą się różnić w zależności od ich położenia we włóknie. Rejestracja sygnału na głębokości powyżej 15 μm jest zalecana w celu uzyskania reprezentatywnych obrazów konfokalnych IMF, unikając populacji SSM, które znajdują się blisko peryferii.

Podczas akwizycji konfokalnej należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Po pierwsze, wybór soczewki obiektywu immersyjnego z uwzględnieniem powiększenia, wysokiego NA i ośrodka immersyjnego. Ponieważ komórki są utrzymywane w hydrofilowym podłożu inkubacyjnym, współczynnik załamania światła pożywki inkubacyjnej i zanurzeniowej musi być podobny, aby uzyskać dobry sygnał i zeskanować w głąb tkanki. Zwykle osiąga się to za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie. Obrazy konfokalne z rysunku 3 i rysunku 4 zostały wykonane za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie 20x, 0,7 NA. Obiektyw ten pozwala na rejestrację światłowodu na całej jego głębokości, ale zdecydowano się na skanowanie przy 15, 18 i 21 μm, ponieważ reprezentatywne obrazy konfokalne IMF można uzyskać przy sygnale o wysokiej intensywności fluorescencji i niewielkim uszkodzeniu światłowodu. Inne powiększenia, takie jak 40x i olej jako medium immersyjne, mogą być brane pod uwagę, ale muszą zostać ocenione.

Po drugie, rozmiar piksela do akwizycji obrazu jest obliczany zgodnie z twierdzeniem Nyquista, które pozwala na wybór odpowiedniego rozmiaru piksela, który pozwala uniknąć nadpróbkowania (wyższa ekspozycja lasera) i niedopróbkowania (prowadzi do mniejszej rozdzielczości)³⁰. Obliczenia zależą od charakterystyki wybranej soczewki obiektywu i długości fali (~90 nm). Można go regulować za pomocą zoomu; Dlatego tylko jedno ustawienie powiększenia zapewnia optymalny rozmiar piksela³⁰. Niemniej jednak w praktyce powiększenie zależy również od obszaru analizowanej próbki. W ten sposób znalezienie równowagi umożliwia pracę z rozmiarem piksela, który jest najbliższy kryterium Nyquista i który pasuje również do analizowanego obszaru. Rysunek 3 i Rysunek 4 zostały pozyskane z rozmiarem piksela 150 i 190 nm, co pozwoliło na analizę pełnej szerokości światłowodu, która wynosi ~50-80 μm.

Po trzecie, należy zastosować odpowiednią średnicę otworu, która zapobiega przedostawaniu się nieostrego światła do detektora. Zazwyczaj 1 Airy jest uważany za optymalny rozmiar otworka, ponieważ pozwala na wykrycie ~80% fotonów pochodzących z płaszczyzny ostrości³⁰. Niemniej jednak niektóre barwione próbki biologiczne, które wykazują niski poziom fluorescencji, wymagają zwiększenia otworu³⁰. Obrazy konfokalne z Rysunku 3 i Rysunku 4 zostały uzyskane z otworkiem o rozmiarze 3 Airy ze względu na słaby sygnał uchwycony za pomocą dolnego Airy. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że wzrost intensywności sygnału wynikający ze zwiększenia rozmiaru otworka prowadzi do zmniejszenia rozdzielczości z powodu zwiększonego nieostrego przechwyconego światła. Z tego powodu zalecamy użycie otworka o rozmiarze jak najbardziej zbliżonym do 1 airy.

Po odpowiednim pozyskaniu obrazy konfokalne mogą być przetwarzane w celu uzyskania ilościowych informacji na temat gęstości i rozmieszczenia mitochondriów. Niezależnie od tego, przed analizą należy wykonać krytyczny etap przetwarzania obrazu progowania, aby poprawić kwantyfikację sygnału. Podczas tego kluczowego kroku określana jest wartość intensywności fluorescencji, która oddziela dodatnie piksele mitochondriów od pikseli tła. Próg można zdefiniować za pomocą dopasowania Gaussa piku reprezentującego mitochondria, gdy histogram obrazu wyświetla dwa szczyty, jeden odpowiadający tłu, a drugi mitochondriom. Jednak rozkład bimodalny nie zawsze jest osiągany na każdym z obrazów, dlatego konieczne jest zastosowanie innych metod progowania.

W tym protokole opisano implementację progowania Otsu, które jest nieparametryczną i nienadzorowaną metodą przeznaczoną do znajdowania wartości progowej, gdy dwa piki nie są oddzielone lub występują inne piki³¹. Otsu można łatwo zastosować za pomocą platformy open source do analizy obrazów biologicznych; Można jednak przetestować inne metody progowania. Ta sama metoda progowania musi być zastosowana do wszystkich obrazów konfokalnych i musi być obliczana niezależnie dla każdego obrazu konfokalnego. Zastosowanie progu do całego stosu prowadzi do nieprawidłowych wyników. Po uzyskaniu obrazów binarnych po procesie progowania, analizę gęstości mitochondriów i FFT można łatwo przeprowadzić, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w tym protokole. Należy jednak zachować ostrożność podczas wykonywania obu analiz, aby uniknąć uwzględnienia jąder i naczyń włosowatych, ponieważ prowadziłoby to do błędów ilościowych. Jeśli chodzi o gęstość, wystarczy odjąć piksele, czyli obszar zajmowany przez jądra lub naczynia włosowate, od pikseli lub całkowitej powierzchni, która ma być analizowana. Ponadto podczas wykonywania analizy FFT należy sprawdzić, czy sygnał mitochondriów jest prosty. I odwrotnie, gdy sygnał mitochondriów jest nachylony, może wytwarzać profile, które nie reprezentują podłużnego rozkładu mitochondriów, dając nieprawidłowe dane dotyczące widma FFT. Ponadto można zastosować etap przetwarzania wstępnego w celu zmniejszenia szumów na obrazach. W tym protokole opisano dwa opcjonalne kroki przetwarzania wstępnego przy użyciu filtru mediany i dekonwolucji 2D. Wpływ tych metod wstępnego przetwarzania na obraz i zawartość gęstości mitochondriów przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że chociaż te wstępne procesy mogą poprawić jakość obrazu, mogą również spowodować utratę niektórych szczegółów obrazu. Dlatego należy ich używać z ostrożnością i konsekwentnie stosować do wszystkich analizowanych obrazów.

Pomimo swoich zalet, mikroskopia konfokalna jest ograniczona rozdzielczością boczną (XY) 180-250 nm, gdy spełnione są optymalne warunki do akwizycji³². Średnica mitochondriów wynosi ~ 200-700 nm, blisko granicy dyfrakcji mikroskopii konfokalnej; w związku z tym struktury submitochondrialne nie mogą być odpowiednio wykryte³³ i nie mogą być oceniane za pomocą analiz gęstości i FFT przedstawionych w tym protokole. Inne techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), nanoskopia ze zmuszonym zubożeniem emisji (STED) lub mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mogą być badane w celu rozwiązania struktur submitochondrialnych³². W tym protokole obrazy konfokalne mitochondriów uzyskuje się za pomocą fluoroforu TMRE, który zależy od potencjału błony mitochondrialnej. Dlatego intensywność fluorescencji mitochondriów może się różnić w zależności od ich potencjału błonowego. Przed analizą danych wykonywany jest proces progowania, aby przezwyciężyć ten problem. Wszystkie piksele powyżej zdefiniowanego progu są uważane za dodatnie dla sygnału mitochondrialnego, niezależnie od ich wartości fluorescencji. Niemniej jednak należy zauważyć, że mitochondria o bardzo niskim potencjale błonowym nie mogą być rozwiązane tą techniką. W związku z tym zaleca się uzupełniające badania ilościowe zawartości białek mitochondrialnych. Zaletą stosowania TMRE jest to, że obrazy konfokalne mogą być również wykorzystywane do analizy potencjału błony mitochondrialnej, ale konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli za pomocą środków rozprzęgających, takich jak p-trifluorometoksyfenylohydrazon karbonylocyjanku (FCCP). Ponadto instrukcje dotyczące analizy gęstości i dystrybucji mitochondriów można uzyskać za pomocą zielonych wskaźników fluorescencyjnych dla mitochondriów, które obciążają mitochondria niezależnie od ich potencjału błonowego, ale strategia inkubacji i ustawienia akwizycji konfokalnej muszą być ustandaryzowane.

Biorąc pod uwagę, że struktura mitochondriów jest związana z podstawowymi funkcjami mitochondrialnymi i komórkowymi, opisany tutaj protokół może dostarczyć cennych informacji na temat ich przebudowy podczas choroby lub przez szczególne znieważenie stresowe. Może to przyczynić się do lepszego zrozumienia kluczowych funkcji mięśni szkieletowych zarządzanych przez mitochondria, takich jak produkcja energii, lub w których mitochondria odgrywają ważną rolę w interakcji z innymi organellami, takimi jak sprzężenie skurczu i metabolizmu. Postępowanie zgodnie z instrukcjami protokołu pozwala na oszacowanie gęstości i rozmieszczenia mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych. Etapy protokołu są podzielone na trzy główne etapy skoncentrowane na rozwarstwieniu pęczka mięśni szkieletowych, skanowaniu mikroskopią konfokalną i analizie obrazu, gdzie zawarte są szczegółowe instrukcje i ważne kwestie. Warto zauważyć, że protokół można dodatkowo zoptymalizować, aby zbadać dodatkowe kroki Z w celu pełnej rekonstrukcji mitochondriów w obrębie włókna zgodnie z potrzebami użytkownika. Na przykład można przetestować obrazy konfokalne i etapy analizy w celu zbadania struktur komórkowych o podobnym rozmieszczeniu, takich jak TT w żywych i stałych próbkach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu	Sigma-Aldrich	A6419
Szkiełko nakrywkowe ze szkła borokrzemianowego	Warner Instruments	64-0709
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670
Mikroskop konfokalny	Oprogramowanie do	TCS SP5
Pakiet aplikacji Leica	Leica	2.7.3.9723
Fosfokinaza kreatynowa	Sigma-Aldrich	C3755
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)	Biomedical Imaging Group, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Asparaginowy kwas potasowy półwodny	Sigma-Aldrich	11240
Glikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&ostry glikol etylenowy; Kwas N&aostry-tetraoctowy	Sigma-Aldrich	E4378
Kleszcze	Miltex	MH-18
HC PL APO 20x/ 0,7 IMM obiektyw	Leica	506517
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Nożyczki do przysłony	Miltex	5-304
Kwas L-(-)-jabłkowy	Sigma-Aldrich	M7397
Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego	Sigma-Aldrich	G1626
Sześciowodny chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M2393
Maxchelator	UC Davis Health	https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm
Mikronożyczki	Miltex	18-1633
Platforma open-source do biologicznej analizy obrazu Fidżi	Publiczne, utrzymywane przez grupę Eliceiri/LOSI, grupę Jug i laboratorium Tomancak. Fidżi	https://fiji.sc/
Fosfokreatyna sól disodowa hydrat	Sigma-Aldrich	P7936
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333
Generator PSF (PSF_Generator.jar)	Grupa Obrazowania Biomedycznego, EPFL	http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/
Komora nagraniowa	Warner Instruments	RC-27N
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881
Arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel	Microsoft
Mikroskop stereoskopowy	Zeiss	Stemi 508
Tetrametylorodamina, ester etylowy	Invitrogen	T669