Artykuł metodologiczny

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65307

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Streszczenie

Zakażenie związane z cewnikiem (CRI) jest częstym zakażeniem szpitalnym wywołanym przez Candida albicans podczas implantacji cewnika. Zazwyczaj biofilmy tworzą się na zewnętrznej powierzchni cewnika i prowadzą do rozsianych infekcji, które są śmiertelne dla pacjentów. W klinikach nie ma skutecznej profilaktyki i leczenia leczenia. W związku z tym pilne jest stworzenie zwierzęcego modelu CRI do przedklinicznych badań przesiewowych nowych strategii zapobiegania i leczenia tej choroby. W tym badaniu cewnik polietylenowy, szeroko stosowany cewnik medyczny, został wprowadzony z tyłu myszy BALB/c po usunięciu włosów. Candida albicans (Candida albicans) ATCC MYA-2876 (SC5314) wykazujący ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji zostało następnie zaszczepione na powierzchni skóry wzdłuż cewnika. Intensywną fluorescencję zaobserwowano na powierzchni cewnika pod mikroskopem fluorescencyjnym 3 dni później. Dojrzałe i grube biofilmy znaleziono na powierzchni cewnika za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Wyniki te wskazywały na adhezję, kolonizację i tworzenie biofilmu Candida albicans na powierzchni cewnika. Przerost naskórka i naciekanie komórek zapalnych w próbkach skóry wskazywały na zmiany histopatologiczne skóry związanej z CRI. Podsumowując, udało się stworzyć mysi model CRI. Oczekuje się, że model ten będzie pomocny w badaniach i rozwoju postępowania terapeutycznego w przypadku CRI związanych z Candida albicans.

Wprowadzenie

W ostatnich latach, wraz z rozwojem i zastosowaniem materiałów biomedycznych, infekcje związane z implantami stają się trudnymi problemami klinicznymi1,2. Dzięki szerokiemu zastosowaniu cewników medycznych w klinikach, liczba związanych z nimi zakażeń i zgonów jest ogromna każdego roku3,4. Typowe drogi infekcji związane z cewnikiem (CRI) obejmują: (1) patogeny na powierzchni skóry przenikają do organizmu i przylegają do zewnętrznej powierzchni cewnika5,6,7; (2) niewłaściwe patogeny pochodzące z operacji aseptycznej atakują, przylegają i kolonizują cewnik; (3) patogeny w krążeniu krwi przylegają i kolonizują cewnik; (4) leki skażone mikroorganizmami chorobotwórczymi.

Candida jest trzecim najczęstszym powodem CRI8,9. Jest bardzo prawdopodobne, że spowoduje zakażenie krwi i inną zagrażającą życiu inwazyjną kandydozę po utworzeniu się biofilmów na powierzchni implantu. Rokowanie jest złe, a śmiertelność wysoka2. Poinformowano, że biofilmy tworzą się na powierzchni cewnika w ciągu 2 tygodni po wprowadzeniu żyły centralnej, a kilka tygodni później w świetle cewnika10,11.

Biofilmy Candida albicans (C. albicans) powstające na cewnikach medycznych wykazują dwuwarstwową sieć złożoną z drożdży, zrębu i grzybni12,13. Tworzenie biofilmów C. albicans jest nie tylko kluczem do odporności na leki i unikania odporności13, ale także ma kluczowe znaczenie dla produkcji rozsianych zarodników, co prowadzi do dalszych infekcji krwiotwórczych2,12 i skutkuje poważniejszymi, a nawet zagrażającymi życiu konsekwencjami. CRI związane z C. albicans jest główną przyczyną klinicznych zakażeń grzybiczych krwi7,14, a u ponad 40% pacjentów z zakażeniem C. albicans w cewniku do żyły centralnej rozwinie się bakteriemia15.

Według Amerykańskiego Towarzystwa Chorób Zakaźnych, zalecane leczenie CRI Candida obejmuje (1) usunięcie zakażonego cewnika; (2) poddanie pacjentów 14-dniowej ogólnoustrojowej terapii przeciwgrzybiczej 8; (3) ponowne wszczepienie nowego cewnika4. Jednak w zastosowaniach klinicznych cewników nie można czasami całkowicie usunąć. Niektórzy pacjenci mogą być leczeni tylko antybiotykami ogólnoustrojowymi i terapią przeciwbakteryjną, którym towarzyszą silne skutki uboczne16,17.

Istniejące modele zwierzęce C. albicans, takie jak model kandydozy ustno-gardłowej, model kandydozy pochwy i model inwazyjnej infekcji ogólnoustrojowej wywołanej przez kandydozę18,19 nie mogą dobrze korelować z klinicznym CRI. Dlatego w tym badaniu ustalono model CRI związany z C. albicans u myszy. Powszechnie stosowane klinicznie cewniki polietylenowe były używane jako implanty podskórne20,21, a C. albicans zaszczepiono na powierzchni skóry, aby symulować przyleganie C. albicans do cewników medycznych i tworzenie biofilmów.

Ten model został z powodzeniem wykorzystany w naszym laboratorium do badania skuteczności anty-biofilmu różnych środków terapeutycznych22. Ponadto, ze względu na opóźnione wykrywanie C. albicans po zakażeniu cewnikiem, szczep C. albicans zawierający wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) został skonstruowany i zaszczepiony myszom, aby ułatwić intuicyjną obserwację kolonii i biofilmów C. albicans na wszczepionym cewniku.

Protokół

Zwierzęta doświadczalne, samce myszy BALB/c (12-16 g), zostały zakupione w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych, Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Xi'an Jiaotong. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Xi'an Jiaotong o numerze licencji SCXK (Shaanxi) 2021-103.

1. Przygotowanie bufora i sprzętu

  1. Transfekcyjne szczepy C. albicans z plazmidem o wysokiej ekspresji pCaExp.
    1. Kup C. albicans (SC5314) od ATCC. Uzyskaj szczep fluorescencyjny o wysokiej ekspresji EGFP22 poprzez transfekcję C. albicans plazmidem o wysokiej ekspresji pCaExp zawierającym pełną otwartą ramkę odczytu genu EGFP (mapa plazmidu jest pokazana w Rysunek 1) i użyj jej do kolejnych eksperymentów.
  2. Hodowla transfekowanych szczepów C. albicans.
    1. Wybrać kolonie monoklonalne fluorescencyjnego szczepu C. albicans z płytki pożywki z dekstrozy peptonowej z ekstraktem drożdżowym (YPD) i hodować przez noc (30 °C i 220 obr./min) w 5 ml płynnej pożywki YPD (YPD + 50 μg/ml karbenicyliny).
    2. Zawiesić C. albicans w roztworze soli fizjologicznej po odwirowaniu w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dostosuj stężenie zawiesiny C. albicans do 1 x 108 komórek/ml, porównując zmętnienie z 0,5 wzorca McFarlanda.
  3. Przygotuj narzędzia chirurgiczne.
    1. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze, kleszcze hemostatyczne, uchwyty do igieł, igły do szwów) są sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121°C przez 30 minut. Stosuje się sterylne cewniki polietylenowe (średnica wewnętrzna: 0,28 mm; średnica zewnętrzna: 0,63 mm).
      UWAGA: Cewniki użyte w tym badaniu zostały wysterylizowane gazowym tlenkiem etylenu, a opakowanie otwarto w ultra czystym stole wystawionym na działanie promieni UV przez ponad 30 minut. Przed implantacją u myszy cewniki zanurzono w 75% etanolu, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

2. Ustanowienie mysiego modelu CRI

UWAGA: Zabieg chirurgiczny jest pokazany w Rysunek 2.

  1. Zaaklimatyzuj 30 myszy BALB/c (12-16 g, samiec) w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF) ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia oraz 12 h-12 h naprzemiennym cyklem światła i ciemności.
  2. Losowo podziel 30 myszy BALB/c na trzy grupy (n = 10 myszy / grupę): (A) normalna grupa kontrolna; (B) grupa cewników (cewniki wszczepione bez C. albicans); (C) Grupa modelowa (cewniki z wszczepionym C. albicans).
  3. Znieczulij myszy 1-4% izofluranem i umieść myszy na stole operacyjnym w pozycji leżącej. Utrata odruchu prostowania i brak reakcji na stymulację palców u nóg potwierdza skuteczne znieczulenie. Usuń włosy i wysterylizuj miejsce operacyjne trzema naprzemiennymi rundami peelingów jodoforowych lub chlorheksydynowych i alkoholowych.
  4. Pozostaw myszy w normalnej grupie kontrolnej bez żadnego leczenia i zapewnij swobodny dostęp do jedzenia i wody.
  5. W przypadku myszy w grupie cewnika i grupy modelowej należy utrzymać znieczulenie na poziomie 3% izofluranu. Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.
  6. W przypadku myszy z grupy cewników śródskórnie włóż sterylną igłę strzykawkową o pojemności 1 ml w obszar depilacji wstecznej, aby zrobić otwór. Wprowadzić cewnik (o długości około 1 cm) do otworu po wyjęciu igły ze strzykawki.
  7. W przypadku myszy w grupie modelowej należy pobrać pipetą 20 μl zawiesiny C. albicans na obszar depilacji pleców, aby zasymulować komensalne C. albicans na skórze.
  8. Po wchłonięciu roztworu przez skórę należy wprowadzić cewnik w obszar depilacji grzbietowej, wykonując te same procedury, które opisano w kroku 2.5.
  9. Odpipetować kolejne 20 μl zawiesiny C. albicans wzdłuż cewnika do tkanki, aby zasymulować C. albicans w środowisku zewnętrznym.
  10. Przymocuj cewniki taśmą i gazą i włóż myszy z powrotem do klatek w celu karmienia. Pod koniec leczenia należy wstrzyknąć myszom podskórnie meloksykam (4 mg/kg) w ramach środka przeciwbólowego przez trzy kolejne dni.
    UWAGA: Po operacji myszy były ostrożnie karmione wodą i jedzeniem. Myszy były monitorowane dwa razy dziennie. Myszy zostały poddane eutanazji metodą zatwierdzoną przez IACUC, jeśli doświadczyły trudności z karmieniem, znacznej utraty masy ciała (10-20%) i hipotermii.

3. Ocena modelu CRI

  1. Po 3 dniach znieczulij myszy 3% izofluranem i poświęć je przez zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz cewniki i próbki tkanki skórnej z grzbietu myszy.
  2. Obserwuj C. albicans i biofilmy na cewniku za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
    1. Zanurzyć cewniki w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego w temperaturze 4 °C na 48 godzin. Przepłukać cewniki sterylnym PBS trzy razy.
    2. Utrwalić cewniki 1% kwasem osmowym przez 3 godziny i trzykrotnie przepłukać je sterylnym PBS.
    3. Odwodnić komórki na cewnikach w gradientowym roztworze etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 80%, 90% i 100%, 15 min/gradient).
    4. Zanurz cewniki w alkoholu tert-butylowym trzy razy (za każdym razem 30 minut).
    5. Szybko zamroź cewniki w ciekłym azocie i liofilizuj próbkę w liofilizatorze zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Rozpyl próbki cewnika złotem o długości 10 nm przez osadzanie wiązką jonów.
    7. Obserwuj obecność C. albicans i jego biofilmu na powierzchni cewnika każdej grupy pod skaningowym mikroskopem elektronowym (w warunkach wysokiej próżni 1,5 kV) i rejestruj obrazy w każdej grupie.
  3. Obserwuj C. albicans na cewniku za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Zanurzyć cewniki w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C na 48 godzin.
    2. Obserwuj obecność C. albicans i jego biofilmu na powierzchni cewnika każdej grupy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pod wzbudzeniem 484 nm i zapisz obrazy w każdej grupie.
      UWAGA: Powiększenie wynosi 400x. Fluorescencję Candida albicans można zaobserwować przy wzbudzeniu przy długości fali 490 nm i emisji przy długości fali 510 nm.
  4. Obserwuj C. albicans znajdujący się w skórze myszy.
    1. Zanurzyć tkanki skóry grzbietowej myszy w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.
    2. Odwodnić tkanki skóry grzbietowej w gradientowym roztworze etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 80%, 90% i 100%, 15 min/gradient).
    3. Odwodnione tkanki skóry grzbietowej zanurzyć w parafinie w temperaturze 55-60 °C. Zwróć uwagę na temperaturę, aby uniknąć łamliwości tkanek. Aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń, powtórz ten krok trzy razy (po 30 minut).
    4. Przeciąć tkanki skóry grzbietowej (grubość = 5 μm) za pomocą mikrotomu.
    5. Odwoskować skrawki parafiny, zanurzając szkiełka w ksylenie dwukrotnie na 20 minut.
    6. Ponownie uwodnić sekcje poprzez elucję etanolem gradientowym (etanol absolutny, 90% etanolu, 75% etanolu, woda) przez 5 minut za każdym razem.
    7. Zabarwić skrawki kwasem okresowym, zanurzając skrawek w roztworze kwasu periodycznego na 15 minut przed jednokrotnym umyciem bieżącą wodą i dwukrotnie wodą destylowaną.
    8. Zabarwić sekcje roztworem barwiącym w jodełkę (zgodnie z instrukcjami producenta) przez 30 minut w ciemności i płukać sekcje pod bieżącą wodą przez 5 minut.
    9. Zanurz skrawki w roztworze hematoksyliny na 3-5 minut przed umyciem odpowiednio bieżącą wodą (2-3 min), zróżnicowanym roztworem (5-10 min) i bieżącą wodą.
    10. Zanurz sekcje w etanolu trzy razy ( 5 min każda) i ksylenie dwa razy ( 5 min każda) przed uszczelnieniem sekcji neutralną gumą.
    11. Obserwuj obrazy próbki pod mikroskopem i analizuj pozostałości C. albicans w skórze myszy.
      UWAGA: Powiększenie wynosi 10x dla okularu i 4x lub 10x dla soczewki obiektywu.
  5. Obserwuj zmiany histopatologiczne w tkankach skóry grzbietowej.
    1. Zanurzyć tkanki skóry grzbietowej w 4% roztworze paraformaldehydu w celu utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Odwodnić tkanki skóry grzbietowej w gradientowym roztworze etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 80%, 90% i 100%, 15 min/gradient).
    2. Zanurzyć odwodnione tkanki skóry grzbietowej w parafinie, jak opisano w kroku 3.4.3.
    3. Przeciąć tkanki skóry grzbietowej (grubość = 5 mm) za pomocą mikrotomu.
    4. Odwoskować skrawki parafiny, zanurzając szkiełka w ksylenie dwukrotnie na 20 minut.
    5. Ponownie uwodnić sekcje poprzez elucję etanolem gradientowym (etanol absolutny, 90% etanolu, 75% etanolu, woda) przez 5 minut za każdym razem.
    6. Zabarwić skrawki hematoksyliną przez 4 minuty, a następnie spłukać wodą z kranu, aby usunąć kolor pływaka.
    7. Rozróżnić próbkę za pomocą 1% roztworu kwasu solnego i etanolu przed spłukaniem szkiełek pod bieżącą wodą.
    8. Zanurz próbkę w 85% i 95% etanolu na 5 minut i zabarwij ją roztworem eozyny na 3 minuty.
    9. Odwodnić próbkę, zanurzając ją w gradientowym etanolu (70%, 90%, 95% i 100%) i ksylenie na 2 minuty każdy.
    10. Uszczelnij próbkę neutralną żywicą.
    11. Obserwuj obrazy próbki pod mikroskopem i analizuj zmiany patologiczne.

Wyniki

Obecność C. albicans oraz biofilmu na cewnikach można było zaobserwować za pomocą SEM. Jak pokazano na Rysunku 322, powierzchnia cewników polietylenowych w grupie cewnikowej była gładka i nie zaobserwowano na niej przylegających drobnoustrojów chorobotwórczych. Jednakże na powierzchni cewników polietylenowych w grupie modelowej widoczne były dojrzałe i gęste biofilmy C. albicans, co wskazuje, że w warunkach doświadczalnych C. albicans mogły skutecznie kolonizować powierzchnię cewnika u myszy i tworzyć na niej biofilm. Co więcej, wyniki mikroskopii fluorescencyjnej dodatkowo potwierdziły powyższe wnioski (Rysunek 4)22. Na powierzchni cewników polietylenowych w grupie cewnikowej nie stwierdzono wyraźnej fluorescencji. Natomiast na powierzchni cewnika w grupie modelowej widoczna była silna fluorescencja emitowana przez przylegające komórki C. albicans. Wskazuje to, że do powierzchni cewników przylgnęła znaczna liczba komórek C. albicans, co świadczy o pomyślnym stworzeniu u myszy modeli CRI związanych z biofilmem C. albicans.

W celu bardziej intuicyjnej weryfikacji zakażenia tkanki skóry myszy przeprowadzono analizę barwienia metodą Schiff-Periodate. Metoda ta wykrywa węglowodany komórek grzybiczych i jest powszechnie stosowana w badaniach klinicznych (Rycina 5)22. Tkanka skóry w grupie kontrolnej oraz grupie z cewnikiem została zabarwiona negatywnie kwasem okresowym i odczynnikiem Schiffa (PAS), co wskazywało na brak komórek C. albicans w tkankach. W grupie modelowej zaobserwowano niewielką liczbę dodatnich komórek C. albicans zabarwionych metodą PAS, co dodatkowo potwierdziło skuteczną symulację inwazji i adhezji związanej z C. albicans.

Następnie za pomocą analizy histopatologicznej oceniono zmiany patologiczne w tkankach skóry myszy wywołane przez C. albicans. Jak pokazano na Rysunku 622, w grupie modelowej warstwa naskórka była znacznie pogrubiona i rozszerzała się w głąb skóry. Widoczna była również infiltracja zapalna, co wskazuje, że zakażenie C. albicans spowodowało wyraźne zmiany patologiczne w tkance skóry myszy. W grupie z cewnikiem warstwa naskórka, warstwa skóry właściwej, gruczoły łojowe, mieszki włosowe oraz inne struktury były wyraźne i kompletne. Podobnie jak w grupie kontrolnej, nie zaobserwowano obrzęku ani infiltracji zapalnej. Wyniki te wskazują, że samo wprowadzenie cewnika nie spowodowało wyraźnych zmian w tkance skóry. Zmiany patologiczne w tkankach grupy modelowej były wynikiem zakażenia wywołanego przez C. albicans. Podsumowując, wyniki potwierdzają pomyślne ustanowienie mysiego modelu CRI związanego z biofilmem C. albicans.

Schemat mapy plazmidu pCaEXP 6225bps do ekspresji genów z promotorem MET3 i genami oporności.
Rycina 1: Atlas plazmidu pCaExp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Oś czasu infekcji Candida albicans z umieszczeniem cewnika; analiza SEM, fluorescencyjna, H&E oraz PAS.
Rysunek 2: Schemat przedstawiający procedurę mysiego modelu CRI wywołanego przez C.albicans. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza mikrostruktury; obrazy SEM powierzchni cewnika i powierzchni modelowej przy powiększeniu 1000× i 5000×.
Rysunek 3: SEM powierzchni cewnika w każdej grupie. (A) Grupa cewnika; (B) Grupa modelowa (1000x, pasek skali = 50 µm; 5000x, pasek skali = 10 µm). Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Mo i wsp.22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna, cewnik vs. model, porównanie mikrografii, skala 100 µm.
Rycina 4: Mikroskopia fluorescencyjna powierzchni cewnika w każdej grupie. (A) Grupa cewnika; (B) Grupa modelu (pasek skali = 100 µm). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Mo et al.22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopowe obrazy histologiczne, cewnik vs model vs kontrola, porównanie tkanek przy 40x i 100x.
Rycina 5: Barwienie H&E skóry grzbietu myszy w każdej grupie. (A) Grupa z cewnikiem; (B) Grupa modelowa; (C) Grupa kontrolna (40x, pasek skali = 400 µm; 100x, pasek skali = 200 µm). Rycina ta została zmodyfikowana za zgodą Mo i wsp.22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna, cewnik, model, grupy kontrolne; porównanie mikroskopowe przy powiększeniu 40× i 100×.
Rycina 6: Barwienie PAS skóry grzbietu myszy w każdej z grup. (A) Grupa z cewnikiem; (B) Grupa modelowa; (C) Grupa kontrolna, (40x, pasek skali = 400 µm; 100x, pasek skali = 200 µm). W grupie modelowej widoczne jest znaczące pogrubienie i rozszerzenie warstwy naskórka w kierunku wewnętrznych części skóry (czerwone prostokąty). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Mo i wsp.22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

CRI jest jednym z najczęstszych zakażeń szpitalnych w praktyce klinicznej23. Patogeny w przydatkach skóry, takie jak naskórek, gruczoły łojowe i mieszki włosowe, są możliwymi przyczynami CRI23,24. Candida jest trzecim co do wielkości patogenem wywołującym CRI, w którym Candida albicans była najczęstszym rodzajem infekcji biofilmem25,26. W związku z tym naszym celem było zbudowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego CRI związanego z biofilmem Candida albicans, aby wspomóc leczenie i zapobieganie pokrewnym CRI.

Aby skonstruować model CRI, niewielka ilość C. albicans została dodana do skóry grzbietowej myszy, co symuluje sytuację kliniczną, w której część C. albicans nie może zostać całkowicie wyeliminowana w tkankach głębokich i przydatkach skóry przez rutynową sterylizację. Po wszczepieniu cewnika C. albicans został ponownie zaszczepiony, aby naśladować obecność C. albicans w środowisku zewnętrznym podczas operacji.

W tym badaniu wybrano 3-dniowy punkt czasowy do budowy modelu, który jest niższy niż w przypadku tradycyjnych modeli zwierzęcych związanych z biofilmem C. albicans 18,27 ze względu na trudności w tworzeniu biofilmu. Po zakażeniu na powierzchni cewnika w tym modelu widoczne było zrost C. albicans i tworzenie się biofilmu, co udowodniono wynikami SEM i mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 3 i ryc. 4). Może to wynikać z faktu, że stężenie C. albicans w tym badaniu wynosiło 1 × 108 CFU/ml, które było znacznie wyższe niż w innych modelach zwierzęcych18,27. Poza tym skóra wokół cewnika jest w stałym kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym. Aby zasymulować ekstremalne warunki, z którymi może się zetknąć CRI, C. albicans został ponownie zaszczepiony po operacji.

Nawrót infekcji jest często spowodowany przez patogeny, które pozostają w otaczających tkankach 23,28,29. Dlatego obecność lub brak patogenów w tkankach jest ważna dla CRI. W niniejszej pracy przeprowadzono barwienie PAS w celu zbadania pozostałości C. albicans w tkankach skóry. Metoda ta może być również wykorzystana do oceny efektu klirensu nowych leków terapeutycznych lub metod leczenia CRI.

Podsumowując, szczep Candida albicans z eGFP wykorzystano do skonstruowania mysiego modelu CRI, aby ułatwić intuicyjną obserwację kolonizacji Candida albicans na cewnikach. Szczep ten może być również używany do oceny interakcji między Candida albicans a komórkami gospodarza, na przykład inwazji i adhezji Candida albicans do gospodarza, działania terapeutycznego przeciwko Candida albicans oraz odpowiedzi immunologicznej. Poza tym zastosowano dwuetapową metodę inokulacji w celu symulacji patogenów pochodzących ze środowiska zewnętrznego i organizmu. Warto zauważyć, że nie przeprowadzono kolejnej hodowli drobnoustrojów po zakażeniu. Obecność biofilmów jest ważnym czynnikiem wpływającym na niską wrażliwość kultur 30,31,32. Wcześniejsze doniesienia sugerują, że hodowla drobnoustrojów po zakażeniu miała niską czułość, swoistość i dokładność 30,31,32,33,34. Zamiast tego obecność biofilmów na implancie jest bardziej wiarygodnym wskaźnikiem. Dlatego w tym badaniu wykorzystano SEM i mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i identyfikacji Candida albicans tworzących biofilmy.

Model ten nie symulował jednak interakcji między osłabioną odpornością pacjenta a zakażeniem Candida albicans obserwowanym w klinikach. Gdyby model mógł uwzględnić leczenie obniżoną odpornością (takie jak ciągłe wstrzykiwanie glikokortykosteroidów)35 przed szczepieniem Candida albicans , możliwe byłoby lepsze symulowanie zakażeń występujących w sytuacjach klinicznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Shaanxi (numer grantu 2021SF-118) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (granty o numerach 81973409, 82204631).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
2,5% roztwór utrwalający aldehyd glutarowyXingzhi Biotechnology Co., LtdDF015
4 ° C lodówkaElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Wagi analityczneShimadzuATX124
Autoklawy SterylizatorSANYOMLS-3750
ButanolTianjin Chemio Reagent Co., Ltd200-889-7
KarbenicylinaPionowy mikroskop optyczny AmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon NikonEclipse Ts2-FL
Glukoza Macklin 
Pierścień do zaszczepianiaThermo Scientific251586
IsofluraneRWD20210103
ParaformaldehydBeyotime BiotechnologyP0099
PAS zestaw barwnikówServicebioG1285
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Cewnik polietylenowyShining Plastic MallPE100
RWD R550 wielokanałowy aparat do znieczulania małych zwierząt RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Inkubator temperaturyShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generator wody ultraczystejHeal ForceNW20VF
UltrasonografDo-ChromDS10260D
XyleneSinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd10023428
Ekstrakt drożdżowyThermo Scientific  OxoidLP0021B
D823520

Bibliografia

  1. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. microbiology reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  2. Giri, S., Kindo, A. J. A review of Candida species causing blood stream infection. Indian Journal of Medical Microbiology. 30 (3), 270-278 (2012).
  3. Weinstein, R. A., Darouiche, R. O. Device-associated infections: A macroproblem that starts with microadherence. Clinical Infectious Diseases. 33 (9), 1567-1572 (2001).
  4. Mermel, L. A., et al. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections. Clinical Infectious Diseases. 32 (9), 1249-1272 (2001).
  5. Seidler, M., Salvenmoser, S., Müller, F. -M. C. In vitro effects of micafungin against Candida biofilms on polystyrene and central venous catheter sections. International Journal of Antimicrobial Agents. 28 (6), 568-573 (2006).
  6. Chaves, F., et al. Diagnosis and treatment of catheter-related bloodstream infection: Clinical guidelines of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology and (SEIMC) and the Spanish Society of Spanish Society of Intensive and Critical Care Medicine and Coronary Units (SEMICYUC). Medicina Intensiva. 42 (1), 5-36 (2018).
  7. Raad, I. I., Bodey, G. P. Infectious complications of indwelling vascular catheters. Clinical Infectious Diseases. 15 (2), 197-208 (1992).
  8. Paul DiMondi, V., Townsend, M. L., Johnson, M., Durkin, M. Antifungal catheter lock therapy for the management of a persistent Candida albicans bloodstream infection in an adult receiving hemodialysis. Pharmacotherapy. 34 (7), e120-e127 (2014).
  9. Bouza, E., Guinea, J., Guembe, M. The role of antifungals against candida biofilm in catheter-related candidemia. Antibiotics (Basel). 4 (1), 1-17 (2014).
  10. Raad, I., et al. Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement. The Journal of Infectious Diseases. 168 (2), 400-407 (1993).
  11. Yousif, A., Jamal, M. A., Raad, I. Biofilm-based central line-associated bloodstream infections. Advances in Experimental Medicine and Biology. 830, 157-179 (2015).
  12. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  13. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  14. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  15. Anaissie, E. J., Rex, J. H., Uzun, O., Vartivarian, S. Predictors of adverse outcome in cancer patients with candidemia. The American Journal of Medicine. 104 (3), 238-245 (1998).
  16. Fujimoto, K., Takemoto, K. Efficacy of liposomal amphotericin B against four species of Candida biofilms in an experimental mouse model of intravascular catheter infection. Journal of Infection and Chemotherapy. 24 (12), 958-964 (2018).
  17. Shuford, J. A., Rouse, M. S., Piper, K. E., Steckelberg, J. M., Patel, R. Evaluation of caspofungin and amphotericin B deoxycholate against Candida albicans biofilms in an experimental intravascular catheter infection model. The Journal of Infectious Diseases. 194 (5), 710-713 (2006).
  18. Koh, A. Y., Köhler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).
  19. Tucey, T. M., et al. Glucose homeostasis is important for immune cell viability during candida challenge and host survival of systemic fungal infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  20. Lawrence, E. L., Turner, I. G. Materials for urinary catheters: a review of their history and development in the UK. Medical Engineering & Physics. 27 (6), 443-453 (2005).
  21. Schumm, K., Lam, T. B. Types of urethral catheters for management of short-term voiding problems in hospitalized adults: a short version Cochrane review. Neurourology and Urodynamics. 27 (8), 738-746 (2008).
  22. Mo, F., et al. Development and evaluation of a film forming system containing myricetin and miconazole nitrate for preventing candida albicans catheter-related infection. Microbial Drug Resistance. 28 (4), 468-483 (2022).
  23. Balikci, E., Yilmaz, B., Tahmasebifar, A., Baran, E. T., Kara, E. Surface modification strategies for hemodialysis catheters to prevent catheter-related infections: A review. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 109 (3), 314-327 (2021).
  24. María, L. T., Alejandro, G. S., María Jesús, P. G. Central venous catheter insertion: Review of recent evidence. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 35 (1), 135-140 (2021).
  25. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  26. He, Y., et al. Retrospective analysis of microbial colonization patterns in central venous catheters, 2013-2017. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 8632701(2019).
  27. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  28. Cantón-Bulnes, M. L., Garnacho-Montero, J. Practical approach to the management of catheter-related bloodstream infection. Revista Espanola de Quimioterapia. 32 Suppl 2 (Suppl 2), 38-41 (2019).
  29. Böhlke, M., Uliano, G., Barcellos, F. C. Hemodialysis catheter-related infection: prophylaxis, diagnosis and treatment. The Journal of Vascular Access. 16 (5), 347-355 (2015).
  30. Fang, X., et al. Effects of different tissue specimen pretreatment methods on microbial culture results in the diagnosis of periprosthetic joint infection. Bone & Joint Research. 10 (2), 96-104 (2021).
  31. Naumenko, Z. S., Silanteva, T. A., Ermakov, A. M., Godovykh, N. V., Klushin, N. M. Challenging diagnostics of biofilm associated periprosthetic infection in immunocompromised patient: A clinical case. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (5), 786-790 (2019).
  32. Cai, Y., et al. Metagenomic next generation sequencing improves diagnosis of prosthetic joint infection by detecting the presence of bacteria in periprosthetic tissues. International Journal of Infectious Diseases. 96, 573-578 (2020).
  33. Samanipour, A., Dashti-Khavidaki, S., Abbasi, M. R., Abdollahi, A. Antibiotic resistance patterns of microorganisms isolated from nephrology and kidney transplant wards of a referral academic hospital. Journal of Research in Pharmacy Practice. 5 (1), 43-51 (2016).
  34. Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
  35. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zakażenie cewnikiemmodel zakażenia u myszytworzenie biofilmubiofilm na cewnikucewnik polietylenowymikroskopia fluorescencyjnaskaningowa mikroskopia elektronowahistopatologia skóryinfiltracja komórek zapalnych
Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.