Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Podsumowanie

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Streszczenie

Tkankowo specyficzne nerwowe komórki macierzyste (NSC) pozostają aktywne w mózgu ssaków po urodzeniu. Przebywają w wyspecjalizowanych niszach, w których generują nowe neurony i glej. Jedną z takich nisz jest strefa podwyściółkowa (SSE; zwana również strefą komorowo-podkomorową), która znajduje się w poprzek bocznych ścian komór bocznych, przylegając do warstwy komórek wyściółki. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są obficie rozmieszczone w ośrodkowym układzie nerwowym, stanowiąc pulę proliferacyjnych komórek progenitorowych, które mogą wytwarzać oligodendrocyty.

Zarówno NSC, jak i OPC wykazują potencjał samoodnawiania się oraz cykle spoczynku/aktywacji. Ze względu na ich lokalizację, izolacja i badanie eksperymentalne tych komórek odbywa się post mortem. W tym miejscu szczegółowo opisujemy "dojenie mózgu", metodę izolacji NSC i OPC, między innymi, od żywych zwierząt. Jest to dwuetapowy protokół przeznaczony do stosowania u gryzoni i testowany na szczurach. Po pierwsze, komórki są "uwalniane" z tkanki poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie domózgowo-komorowe (i.c.v.) "koktajlu uwalniania". Głównymi składnikami są neuraminidaza, która celuje w komórki wyściółki i indukuje denudację ścian komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów-2. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna, u znieczulonych szczurów bez konieczności nacięcia.

Wyniki przedstawione tutaj pokazują, że izolowane komórki zachowują swój profil endogenny, a NSC SSE zachowują swój spokój. Denudacja warstwy wyściółki jest ograniczona do anatomicznego poziomu iniekcji, a protokół (uwolnienie i pobranie) jest dobrze tolerowany przez zwierzęta. To nowatorskie podejście toruje drogę do prowadzenia badań podłużnych endogennej neurogenezy i glejogenezy u zwierząt doświadczalnych.

Wprowadzenie

Tkankowe komórki macierzyste to częściowo zaangażowane komórki, które mogą dać początek wszystkim populacjom komórek, które tworzą odpowiednie tkanki. Oprócz tego, że są multipotencjalne, są samoodnawiającymi się komórkami i mają kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zdolności regeneracyjnych tkanek¹. Niektóre tkankowo specyficzne komórki macierzyste pozostają w aktywnym, silnie proliferacyjnym stanie, takie jak jelitowe lub krwiotwórcze komórki macierzyste. Inne, takie jak komórki macierzyste mózgu, pozostają w dużej mierze w stanie spoczynku lub uśpienia². W dorosłym mózgu nerwowe komórki macierzyste (NSC) można znaleźć w wyspecjalizowanych obszarach, często nazywanych niszami. Dwa takie dobrze opisane obszary istnieją w strefie podwyściółkowej (SSE) komór bocznych oraz w zakręcie zębatym hipokampa. Nisza SSE generuje największą liczbę komórek, przede wszystkim neuroblastów, które migrują w kierunku opuszki węchowej i przyczyniają się do lokalnej populacji interneuronów; w przeciwieństwie do tego, wygenerowane oligodendroblasty migrują do sąsiedniego ciała modzelowatego (CC)³. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są mitotycznie aktywnymi komórkami, szeroko rozmieszczonymi w ośrodkowym układzie nerwowym, które: i) są zaangażowane w linię oligodendroglialną, ii) mogą migrować do miejsc demielinizacji i iii) mogą różnicować się w mielinizujące oligodendrocyty. OPC wykazują również potencjał samoodnawiania się i spoczynku⁴.

Do tej pory izolacja i badanie NSC i OPC wymagało pośmiertnej dysocjacji wypreparowanej tkanki mózgu i rdzenia kręgowego. Aby obejść to eksperymentalne ograniczenie, opracowaliśmy metodę, która po raz pierwszy pozwala na izolację mózgowych NSC i OPC od żywych zwierząt. Nazywamy tę metodę "dojeniem", ponieważ umożliwia ona wielokrotne pobieranie komórek, ponieważ ich pule nie są wyczerpywane. Protokół został opracowany na szczurach, ze względu na ich duży rozmiar mózgu, ukierunkowany głównie na SSE lub CC i obejmuje dwa główne etapy. Po pierwsze, NSC lub OPC są "usuwane" z tkanki poprzez wstrzyknięcie dożylnie "koktajlu uwalniającego" zawierającego neuraminidazę, toksynę, która indukuje denudację ściany komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2). Koktajl jest stereotaktycznie wstrzykiwany obustronnie do komór bocznych. Jeżeli zamierzonym zastosowaniem jest izolacja NSC, celem są obszary rostralne komór bocznych. Jeśli celem jest czystsze wyizolowanie OPC, koktajl wstrzykuje się doogonowo w obszar fimbrii hipokampa. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z cisterna magna znieczulonych szczurów, bez konieczności nacięcia. Płynną biopsję miesza się z pożywką hodowlaną NSC i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu posiewu.

Protokół

Procedury hodowlane, hodowlane i eksperymentalne zwierząt były prowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku, autoryzowane przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych, oraz z Dekretem Prezydenckim 56/2013 Republiki Greckiej, analizowane przez Organy ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki Uniwersytetów w Cambridge i Patras, a także zatwierdzone i kontrolowane przez lokalną Prefekturalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Numer protokołu: 5675/39/18-01-2021). Wykorzystano samce i samice szczurów Sprague-Dawley, Wistar i Long-Evans, w wieku od 2 do 4 miesięcy i o masie ciała od 150 g do 250 g. Protokół jest graficznie podsumowany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie koktajlu

UWAGA: Przygotuj świeże w dniu zabiegu i trzymaj na lodzie. Ilości podane są na 2 μl do wstrzyknięcia dożylnego do każdej komory bocznej. Przygotować dodatkowy 1 μl na każde planowane wstrzyknięcie.

1. Przygotować 0,5 μl neuraminidazy o stężeniu 500 mU z Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   UWAGA: Przechowywać go jako zapas o pojemności 1 μl rozcieńczony w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C. Inne rodzaje neuraminidaz nie zostały przebadane.
2. Przygotować 1 μl zawierający 1 μg przeciwciała blokującego integrynę-β1.
   UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować 0,5 μl zawierającego 0,5 μg zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (rekombinowanego ludzkiego FGF-zasadowego).
   UWAGA: Przechowywać go w postaci bulionu o pojemności 1 μg/μl rozcieńczonego w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C.

2. Wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego

UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 20 minut. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Wyczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.

1. Znieczulić zwierzę doświadczalne przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch rogówkowy, reakcję na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania.
   UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym iniekcyjnym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Znieczulenie głębokie potwierdzono poprzez sprawdzenie odruchu rogówkowego, reakcji na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz trybu oddychania.
2. Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.
3. Zamontuj szczura na ramie stereotaktycznej.
4. Ogol sierść głowy brzytwą i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
5. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w skórze głowy wzdłuż środkowej linii za pomocą sterylnego skalpela.
6. Skrupulatnie oczyść czaszkę za pomocą sterylnych wacików i sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
7. Zidentyfikuj bregmę za pomocą krawędzi igły strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl zamontowanej na urządzeniu stereotaktycznym. Ustaw bregmę jako "punkt 0,0".
   UWAGA: Bregma jest identyfikowana jako punkt przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych. Więcej szczegółów można znaleźć w atlasie mózgów szczurów Paxinos i Watson⁵.
8. Przesuń urządzenie na współrzędne przednio-tylne (AP) = 0,3 mm, boczne (L) = +1,2 mm (aby namierzyć SSE) lub AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (aby namierzyć CC).
9. Wywierć otwór na zadziory o średnicy 1 mm za pomocą wiertła dentystycznego.
   UWAGA: Podczas wiercenia ręcznego należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni kory mózgowej. Nie oczekuje się, że krwotok będzie znaczny. Oczyść krew solą fizjologiczną i uciskaj, aby zatrzymać bardziej uporczywe krwawienie.
10. Załadować 4 μl koktajlu o uwalnianiu do 10 μl strzykawki Hamiltona.
11. Opuścić igłę (najlepiej lub stożkową krawędź) strzykawki Hamiltona, aby uzyskać kontakt z oponą twardą.
12. Wbić igłę na żądaną głębokość (D = 3,5 mm).
    UWAGA: Wlej sól fizjologiczną na powierzchnię opony twardej, aby utrzymać nawodnienie tkanki.
13. Wlać w infuzji 2 μl koktajlu o uwalnianiu z szybkością 1 μl/min.
14. Pozostawić igłę na miejscu przez kolejne 2 minuty przed powolnym pobieraniem, aby uniknąć wypłynięcia koktajlu uwalniającego.
15. Powtórz kroki 2.8-2.14 dla drugiej półkuli na współrzędnych AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (aby celować w SSE) lub AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (aby celować w CC).
16. Zszyj nacięcie nylonem 5-0 (średnica 0,1 mm) i oczyść zszyty obszar środkiem antyseptycznym.
17. Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania pooperacyjnego.
    UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.
    1. Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie współwięźniów z klatki (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.
    2. Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. Przeciwdziałać objawom bólu (chowanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) poprzez podawanie środka przeciwbólowego (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.

3. Płynna biopsja płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)

UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 10 minut. Opisana tutaj płynna biopsja jest wykonywana 3 dni po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego, ale może być wykonana dokładnie w ten sam sposób, gdy jest to wymagane. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Oczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.

1. Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając rogówkę
   odruch, reakcja na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania.
   UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Nie jest to jednak wskazane, ponieważ zabieg jest krótki, zwłaszcza jeśli biopsje będą wykonywane wielokrotnie w ciągu kolejnych dni.
2. Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.
3. Zamontuj zwierzę doświadczalne na ramie stereotaktycznej. Użyj nauszników, aby zamocować głowę bez utrudniania ruchu obrotowego w kierunku przodu i tyłu.
4. Ustabilizuj głowę pod kątem 40° w dół, aby uzyskać dobre przedłużenie tylnej części szyi.
   UWAGA: Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest użycie paska ust urządzenia⁶.
5. Ogol sierść w okolicy szyi za pomocą maszynki do golenia i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem.
6. Opuszkiem palca znajdź obszar depresyjny w kształcie rombu znajdujący się między wypukłością potyliczną a grzbietem atlas⁶.
7. Narysuj znak punktowy (np. za pomocą markera).
8. Zamocuj strzykawkę o pojemności 1 ml lub 0,5 ml na ramce stereotaktycznej.
   UWAGA: Zaleca się używanie strzykawek z nieodłączanymi igłami, ponieważ zapewniają one lepsze ssanie i mają mniejszą objętość martwą.
9. Przysunąć igłę w miejsce kontaktu ze skórą w miejscu oznaczenia.
10. Za pomocą kleszczy unieść skórę, jednocześnie opuszczając strzykawkę przez warstwy skóry.
11. Lekko odkręcić tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce.
12. Wznowić pracę, aby bardzo powoli zanurzać igłę, aż w strzykawce pojawi się płyn (CSF).
13. Ustawić igłę w tej pozycji i pozwolić na powolny przepływ CSF.
    UWAGA: Igłę można lekko obniżyć lub podnieść, jeśli przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest bardzo wolny.
14. Rozpocznij usuwanie płynu mózgowo-rdzeniowego powoli (w krokach co 40 μl/min) do 120 μl.
15. Powoli wyjmować strzykawkę.
16. Dootrzewnowo podać 1 ml normalnej surowicy, aby wspomóc uzupełnianie płynów przez zwierzę doświadczalne.
17. Zmieszać płynną biopsję (CSF) z 400 μl pożywki NSC i utrzymać probówkę do mikrowirówki w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Biopsje płynne należy przetworzyć w ciągu 3 godzin, jeśli nie są zamrożone.
18. Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania po operacji.
    UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.
    1. Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie jego współlokatorów (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.
    2. Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. W przypadku zaobserwowania objawów bólu (ukrywanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) należy podać środek przeciwbólowy (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.

4. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji

1. Zwierzę należy poddać eutanazji przez dosercowy wlew 20 ml lodowatej soli fizjologicznej, a następnie 50 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA; w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej [PBS] o pH = 7,4).
2. Wypreparuj tkankę mózgową.
   1. Oddziel głowę od ciała za pomocą nożyczek, aby wykonać nacięcie w okolicy szyjki macicy. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę, a następnie przetnij kość czaszki wzdłuż strzałkowej linii środkowej, z końcami nożyczek skierowanymi do góry, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej. Staraj się kontynuować cięcie tak bardzo, jak to możliwe, mijając koronalną linię środkową.
   2. Użyj kleszczy, aby usunąć kości, zaczynając od kości nadpotylicznej i ciemieniowej, a na końcu kości czołowych.
   3. Gdy tkanka mózgowa zostanie odsłonięta, użyj kleszczy lub szpatułki, aby wyjąć ją z czaszki. Aby to ułatwić, przetnij nerwy u podstawy mózgu i opuszki węchowe, jeśli nie chcesz.
3. Po utrwaleniu tkanki przez noc w 2% PFA w temperaturze 4 °C.
4. Krioochronę tkanki w 30% sacharozie (w PBS) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C, aż tkanka opadnie na dno.
5. Zamrozić tkankę w temperaturze -80 °C.
6. Pokrój tkankę mózgową na skrawki koronalne o grubości 14 μm za pomocą kriostatu.
7. Barwienie immunofluorescencyjne należy przeprowadzić przy użyciu standardowych protokołów ^3,7
   1. Inkubować skrawki z buforem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,1% Triton X-100, w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   2. Przeprowadzić pobieranie antygenu (gotowanie przez 15 minut w 10 mM buforze cytrynianowym, pH = 6,0, przy użyciu szklanych słoików).
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale konieczny w przypadku antygenów jądrowych.
   3. Doprowadzić do temperatury pokojowej i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP), podwójnej kortynie (Dcx), S100β i β-kateninie (patrz tabela materiałów) w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Inkubować przez 2 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) w celu barwienia przeciwjądrowego w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).
   5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe.

5. Przetwarzanie izolowanych komórek do immunofluorescencji

1. Umieść komórki na 96-dołkowych płytkach kompatybilnych z mikroskopią, pokrytych poli-D-lizyną (100 μg/ml).
2. Utrwal komórki w lodowatym 2% PFA na 10 minut i przemyj 3x PBS.
3. Wykonaj immunofluorescencję przy użyciu standardowych procedur^3,7dla PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 i ID3 (patrz Tabela materiałów).
4. Przechowywać komórki w PBS + NaN₃ (0,1%) w temperaturze 4 °C w ciemności.

6. Mikroskopia i analiza obrazu

1. Wykonywanie zdjęć za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej i zliczanie komórek za pomocą standardowych narzędzi do analizy obrazu, takich jak liczniki komórek.

Wyniki

Wydanie i odbiór NSCs
NSC SSE są oddzielone od płynu mózgowo-rdzeniowego jedynie monowarstwą komórek wyściółki, choć pozostają w bezpośrednim kontakcie z treścią komorową poprzez interkalujące procesy monorzęskowe^8,9. Neuraminidaza działa specyficznie na komórki wyściółki poprzez rozszczepienie reszt kwasu sjalowego i może indukować denudację ściany komory. Prowadzi to do grupowania neuroblastów na powierzchni komory^10,11. Co więcej, zaobserwowano przepływ neuroblastów w płynie mózgowo-rdzeniowym po wstrzyknięciu dożylnie przeciwciała blokującego integrynę-β1, prawdopodobnie z powodu rozluźnienia połączeń międzywyściółkowych komórek ¹². Obserwacje te doprowadziły do opracowania protokołu, który umożliwia izolację komórek macierzystych i progenitorowych mózgu poprzez kontrolowane naruszenie integralności ścian komory bocznej. W pierwszym etapie uwalnianie z miąższu i późniejszy przepływ NSC lub OPC wewnątrz płynu mózgowo-rdzeniowego są indukowane poprzez wstrzyknięcie dożylnie koktajlu uwalniającego. Koktajl jest wstrzykiwany stereotaktycznie z szybkością 1 μL/min, obustronnie (2 μL na wstrzyknięcie) do komór bocznych (współrzędne skierowane do NSC SSE: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; współrzędne skierowane na CC OPC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Drugi etap ("pobranie") polega na wykonaniu płynnych biopsji płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna. Szczury muszą być znieczulone, a biopsję można wykonać za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml. Zastosowanie urządzenia stereotaktycznego pozwala na niemal całkowite udane pobranie około 100 μL płynu mózgowo-rdzeniowego, bez konieczności wykonywania nacięć. Płynną biopsję dodaje się do mrożonej pożywki hodowlanej i utrzymuje w temperaturze 4 °C do czasu posiewu przez <3 godziny (pożywka hodowlana NSC zawiera zmodyfikowaną pożywkę Eagle [DMEM] firmy Dulbecco, suplement B27 [2%], suplement N2 [1%], FGF2 [20 ng/ml] i naskórkowy czynnik wzrostu [EGF; 20 ng/ml]).

Ocena histologiczna obszaru okołokomorowego po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego
Pierwsza kohorta eksperymentów wykazała, że przy wstrzykiwaniu więcej niż 3 μl płynu, komory mogą zostać uszkodzone z powodu niespecyficznego, mechanicznego urazu (Rysunek 2B, C). Powolne wstrzykiwanie 2 μl koktajlu o uwalnianiu doprowadziło do pojawienia się skupisk neuroblastów immunododatnich Dcx na powierzchni komory. Klastry te pozostawały widoczne nawet po 8 miesiącach od wstrzyknięcia (Ryc. 2D). Ponieważ metoda była przeznaczona do badań podłużnych, mających na celu długoterminową obserwację zwierząt, oceniono uszkodzenia tkanek spowodowane przez koktajl uwalniający. Barwienie immunologiczne przeprowadzono na skrawkach mózgu kriostatu o grubości 14 μm pod kątem markerów komórek wyściółki, takich jak S100β i β-katenina¹³, a następnie oceniono ogólną integralność warstwy wyściółki. Miejsca denudacji warstwy wyściółki były obecne tylko blisko poziomu rostrocaudal iniekcji, przy czym stopniowy spadek zaburzeń warstwy wyściółki wykryto w bardziej tylnych i bardziej przednich obszarach SSE (Rysunek 2E,F) i zanikł po odległości ±2 mm od miejsca iniekcji. Powyższe wyniki pokazują, że częściowa denudacja warstwy wyściółki spowodowana wstrzyknięciem i.c.v. koktajlu uwalniającego jest ogniskowa, ograniczona w pobliżu miejsca iniekcji i pozostawia nienaruszoną resztę warstwy wyściółki okołokomorowej.

Profil markera i zachowanie in vitro pobranych komórek
Następnie oceniono zachowanie in vitro i profil markerowy komórek wyizolowanych za pomocą protokołu udojowego. Średnia wydajność komórek w każdej biopsji płynnej wynosi około 300 ± 45 komórek (na biopsję 100 μl)⁷. Biopsje udojowe dały w wyniku posiewów NSC o średnim potencjale pasażowym 3,17 ± 0,45. Komórki wyizolowane od szczurów, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, mogły być pasażowane średnio 1,92 ± 0,76 razy; Natomiast osoby izolowane przez dojenie osiągnęły nawet dziewięć pasaży (p = 0,038, test t) (Rysunek 3A)7. Średnia zdolność pasażowania standardowych pośmiertnych kultur neurosfery pochodzących z SSE jest wyższa niż 12 pasaży w naszych rękach. Ponieważ wykazano, że potencjał ekspansji in vivo NSC SSE, jak wykazały eksperymenty z mapowaniem losu komórek in vivo¹⁴, jest ograniczony, dojenie wytwarza komórki o znacznie innym zachowaniu in vitro niż komórki w standardowych hodowlach, aczkolwiek znacznie bliższe zachowaniu endogennych NSC. Pobrane komórki posiewano na studzienkach pokrytych poli-D-lizyną. gdzie rosły zarówno jako przylegające monowarstwy, jak i rzadziej jako neurosfery (Ryc. 3B). Świeżo wyizolowane komórki (pobrane 3 dni po wstrzyknięciu i utrwalone 24 godziny po posiewie), które były immunododatnie dla markera astroglejowego GFAP, były również immunododatnie dla ID3, markera spoczynku, i miały charakterystyczną dla morfologii dwubiegunowej NSC (Figura 3C). Ponadto, jak donoszono wcześniej⁷, bardziej szczegółowe porównanie immunocytochemiczne komórek pochodzących z biopsji i komórek pochodzących z sekcji pośmiertnej od tych samych zwierząt, po 3 dniach od wstrzyknięcia (w poszukiwaniu astrocytów GFAP+, neuroblastów Dcx+, progenitorów oligodendrocytów PDGFRa+ i komórek SOX2+ linii nerwowej) wykazało, że profil pobranych komórek był podobny do profilu endogennych komórek SSE (Rysunek 3D)). Warto zauważyć, że gdy porównano biopsję i komórki pochodzące z tkanek w różnych warunkach (np. wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego z FGF2 i bez niego), stwierdzono, że czynnik wzrostu spowodował jednoczesny i znaczny wzrost obecności komórek SOX2+, a także znaczny spadek obecności neuroblastów Dcx+ w obu próbkach ( Rysunek 3D). Dane te potwierdziły, że wszelkie zmiany pojawiające się w profilu endogennych populacji NSC znajdują odzwierciedlenie w próbkach komórek wytwarzanych przez dojenie.

Rysunek 1: Graficzne podsumowanie doju. Odcinek czołowy jednej półkuli mózgu z głównymi anatomicznymi punktami orientacyjnymi (komora boczna, leżące nad nią ciało modzelowate i spoidło przednie poniżej [drogi istoty białej w kolorze szarym] oraz strefa podwyściółkowa przy ścianach bocznych [na niebiesko]). Koktajl uwalniający jest wstrzykiwany do komory bocznej, co prowadzi do naruszenia integralności tkanki i uwolnienia poporodowych nerwowych komórek macierzystych mózgu w płynie mózgowo-rdzeniowym, z którego można je pobrać za pomocą płynnych biopsji. Skróty: SSE = strefa podwyściółkowa; LV = komora boczna; CSF = płyn mózgowo-rdzeniowy; pbNSC = postnatalne nerwowe komórki macierzyste mózgu; β1-int = integryna beta1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Histologiczna ocena efektów iniekcji dożylnych. (A-D) Obrazy w małym powiększeniu grzbietowej połowy komory bocznej po immunobarwieniu dla Dcx (na czerwono, do oznaczenia neuroblastów). (A) Proste wstrzyknięcie dożylnie strzykawki Hamiltona nie zaburza cytoarchitektury SSE, podczas gdy wstrzyknięcie dożylnie 10 ml (szybkość infuzji 1 ml/min) prowadzi do poważnego uszkodzenia ściany komory niezależnie od jej zawartości. (B) sól fizjologiczna i (C) koktajl uwalniający. (D) Wstrzyknięcie 2 μl koktajlu uwalniającego prowadzi do kontrolowanego uszkodzenia ściany komory, obserwowanego nawet po 8 miesiącach od zabiegu. Szczegóły ściany SSE w większym powiększeniu po 7 i 14 dniach od iniekcji pokazano odpowiednio na (E) i (F). Istnieje zdezorganizowana struktura, z neuroblastami Dcx+ (na zielono) spoczywającymi na powierzchni ściany, a pozostałe komórki niszy (Sox2+, na biało) spoczywającymi głębiej. Tkanka okołokomorowa ulega uszkodzeniu na poziomie ogonowym wstrzyknięcia po 2 miesiącach (w G), podczas gdy tkanka jest nienaruszona na poziomie bardziej ogonowym (w H) u tego samego zwierzęcia. Ścianę komory ocenia się za pomocą barwienia immunologicznego pod kątem markerów wyściółki S100β i β-kateniny. Szczegół typowej architektury muru pokazany jest w (I). Barwienie jądrowe odbywa się za pomocą DAPI (pokazanego na niebiesko). Podziałka = 300 μm (A-C, G, H, wstawki), 150 μm (D), 30 μm (E,F) i 50 μm (I). Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie McClenahan et al.¹³. Skróty: SSE = strefa podwyściółkowa; I.C.V = śródmózgowo-komorowy; Dcx = podwójna kortyna; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ocena komórek wyizolowanych podczas doju. (A) Wykres przedstawiający maksymalną liczbę pasaży uzyskanych na próbkę płynnej biopsji od zwierząt, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną (szare paski, łącznie 12 próbek) lub po udoju (czarne paski, łącznie 29 próbek, koktajl uwalniający z neuraminidazą i przeciwciałem blokującym integrynę-β1). (B) Reprezentatywny obraz w mikroskopii konfokalnej komórek pierwotnych uzyskanych w wyniku doju, 3 dni po wstrzyknięciu, wybarwionych immunologicznie przeciwko GFAP i ID3. (C,D) Obrazy w jasnym polu komórek wyizolowanych 3 dni po wstrzyknięciu, posianych na studzienkach pokrytych poli-D-lizyną i pozostawionych do wzrostu w pożywce proliferacyjnej NSC przez 7 dni. (E) Wykres przedstawiający profil komórek wyizolowanych w wyniku doju w SSE oraz endogennej populacji NSC SSE pochodzących od tych samych zwierząt doświadczalnych. Frakcje SOX2+ i Dcx+ uległy znacznemu zwiększeniu i zmniejszeniu, odpowiednio, po jednoczesnym wstrzyknięciu FGF2. (Jednoczynnikowa analiza ANOVA dla każdego markera, a następnie analiza post hoc; n = 4-6 zwierząt na grupę eksperymentalną). Podziałka = 100 μm (C,D) i 10 μm (B). Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie McClenahan et al.¹³. Skróty: SSE = strefa podwyściółkowa; DPI = dni po wstrzyknięciu; NSC = nerwowe komórki macierzyste; Dcx = podwójna kortyna; GFAP = kwaśne białko fibrylarne glejowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Komórki macierzyste i progenitorowe są stosunkowo rzadkie w tkance mózgowej ssaków. Ponadto NSC znajdują się w miejscach niedostępnych dla łatwych i bezpiecznych biopsji (ściany komór, hipokamp). Dlatego jak dotąd jedynym sposobem na eksperymentalną pracę z takimi komórkami była ich pośmiertna izolacja. Metoda pozwalająca na pojedyncze lub wielokrotne pobieranie NSC i OPC od żywych szczurów, zwana dojeniem, jest opisana tutaj krok po kroku. Metoda opiera się na dwóch kluczowych cechach: i) NSC lub OPC są oddzielone monowarstwą komórek wyściółki od płynu mózgowo-rdzeniowego, przepływającego w układzie komorowym mózgu; ii) Komórki wyściółki i progenitorzy nerwowe utrzymują kontakt między sobą oraz z innymi sąsiednimi typami komórek za pośrednictwem integryn. Dlatego koktajl uwalniający wstrzykiwany w określone obszary komór, aby umożliwić odłączenie NSC lub OPC od miąższu mózgu, zawiera neuraminidazę, toksynę, która specyficznie celuje i zabija komórki wyściółki^10,11, oraz przeciwciało blokujące integrynę-β1. Zawiera również FGF2, ponieważ ten czynnik wzrostu jest niezbędny do przetrwania i utrzymania NSC w niszy i w kulturze^15,16. Wykazano już^wcześniej7, że protokół ten jest dobrze tolerowany przez zwierzęta; W niniejszym raporcie potwierdzono ponadto, że uszkodzenie komórek wyściółki, wywołane przez koktajl uwalniający jako warunek wstępny uwolnienia NSC/OPC w płynie mózgowo-rdzeniowym, jest ograniczone wokół poziomu ostroogonowego wstrzyknięcia. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ protokół powinien zachować homeostatyczną funkcję mózgu, w tym samą niszę komórek macierzystych, i nie powinien zagrażać długoterminowemu dobrostanowi zwierząt. Stereotaktyczne wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego ma łagodne nasilenie i nigdy nie spowodowało śmierci. Co więcej, wykonywanie płynnych biopsji z cisterna magna jest szybką i mało inwazyjną procedurą, którą można powtarzać kilka razy z rzędu.

Co ważne, próbki NSC wyizolowane podczas udoju ściśle odzwierciedlają endogenną pulę NSC. Na profil komórek progenitorowych SSE może mieć wpływ iniekcja dożylna FGF2. Kiedy tak się dzieje, w ten sam sposób wpływa to na profil komórek pochodzących z doju. Co więcej, wcześniejsze prace eksperymentalne wykazały, że NSC wyizolowane przez dojenie SSE mają ograniczony potencjał samoodnawiania, zachowanie podobne do endogennych NSC, co ujawniono w przypadku transgenicznych strategii losu komórek in vivo ^14,17. Pourodzeniowe NSC mózgu są utrzymywane w stanie spoczynku, rzadko przechodząc w kierunku aktywacji mitotycznej w celu wytworzenia neurogennego i glejowego potomstwa 18,19,20. W tym miejscu przedstawiono dowody na to, że frakcja komórek pochodzących z doju, które wyrażają GFAP i oczekuje się, że będą zawierać NSC działające w dobrej wierze, współwyraża ID3, marker spoczynkowych NSC²¹. Wzbogacona obecność spoczynkowych NSC, które są następnie siane w pożywce NSC zwykle używanej do hodowli NSC izolowanych post mortem, wydaje się ograniczać potencjał ekspansji pobranych NSC (np. proces kluczowy, jeśli komórki miałyby być używane do przeszczepów autologicznych). Dzieje się tak, ponieważ pożywki te są zaprojektowane specjalnie do przetrwania i ekspansji mitotycznej aktywowanych NSC; w związku z tym wygenerowanie protokołów umożliwiających wydajną i szybką mitotyczną aktywację spoczynkowych NSC zwiększy wartość i zakres zastosowania doju.

Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że dojenie umożliwia pobieranie próbek pourodzeniowych NSC i OPC mózgu (w zależności od rostrocaudalnego poziomu wstrzyknięcia koktajlu uwalniającego) od żywych szczurów. Praca ta wskazuje na możliwość przeprowadzania kolejnych biopsji płynnych u tego samego zwierzęcia, nawet w znacznych odstępach czasu po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego (a więc w celu zaplanowania i przeprowadzenia podłużnych badań eksperymentalnych), ponieważ neuroblasty pozostają skupione na ścianach komór nawet po 8 miesiącach od wstrzyknięcia. Takie metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ pozwalają na badanie zdarzeń zachodzących u poszczególnych zwierząt, co skutkuje zmniejszeniem szumu biologicznego generowanego przez zmienność fizjologiczną. To z kolei prowadzi do zwiększenia dokładności i do wdrożenia zasad "3R" (replacement, reduction, and refinement). Przyszły kluczowy krok w kierunku ulepszenia metody będzie polegał na określeniu maksymalnej liczby i ram czasowych, w których można wykonać biopsję płynną po jednej procedurze uwalniania, chociaż w razie potrzeby powinno być wykonalne przeprowadzenie dodatkowych procedur uwalniania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Release cocktail
β Przeciwciało blokujące 1-integryny	BD Biosciences	#555002	oczyszczone NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Każda osoba z aktywnością blokującą powinna być odpowiednia.
Neuraminidaza z Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Neuraminidazy z innych źródeł (np. z Vibrio cholerae) nie zostały przebadane.
Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	przechowywany jako 1 μ g/μ L bulionu, rozcieńczonego w sterylnej wodzie o stempze -20 & deg; C
Zabiegi chirurgiczne
10 &mikro; L Strzykawka	Hamilton	#80330	Model 701 RN, Mała wyjmowana igła, rozmiar 26s, 2 cale, styl punktowy 2
BD Micro-fine 1 mL strzykawki insulinowe	BD biosciences	04085-00	29 G x 12,7 mm
BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenofina 0,3 mg/ml)
Cyfrowy nowy standard stereotaksji, szczurów i myszy	Stoelting	51500D
Homeotermiczny system monitorowania	Aparat Harvarda	55-7020
ISOFLURIN 1,000 mg/g para wziewna, płyn	Vetpharma Zdrowie zwierząt	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Ketamina 100 mg/ml
Nylonowy szew, Ethilon	Ethicon	D9635	Przezroczysty, rozmiar 5-0
Akumulatorowe akumulatorowe trymery chirurgiczne	Stoelting	Pozycja:51472
Ostrza skalpela, sterylne	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8-calowe waciki	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Stereotaktyczna wiertarka szybkoobrotowa	Foredom	1474w / o1464
Stoelting' s Stereotaxic Instrument Kit	Stoelting	Pozycja: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Ksylazyna, 25 mL
Obsługa tkanek i komórek oraz barwienie immunologiczne
96-dołkowe odpowiednie do mikroskopii	Greiner	#655866	Suplement
	do mikropłytki B27 w kształcie gwiazdy ekranowejThermoFisher Scientific	A1486701
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Merck	P06-1391100	Frakcja V, szok termiczny
Cytrynian	Merck	71497	Monozasadowy cytrynian sodu
Kriostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Barwienie jądrowe, Rozcieńczenie: 1/1,000
DMEM	ThermoFisher Naukowe	11995065	Wysokoglukozowy, pirogroniany
anty-kozy osłów	Biotium	20016 lub 20106 lub 20048	Rozcieńczenie: 1/1,000
osła anty-mysie	Biotium	20014 lub 20105 lub 20046	Rozcieńczenie: 1/1,000
osła anty-królik	Biotium	20015 lub 20098 lub 20047	Rozcieńczenie: 1/1,000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (lub bFGF)	Peprotech	100-18B
koza anty-GFAP	Abcam	ab53554	Rozcieńczenie: 1/500
koza anty-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Rozcieńczenie: 1/200
mysz anty-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Rozcieńczenie: 1/200
mysz anty-S100β	Sigma	S2532	Rozcieńczenie: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Podłoże montażowe
Suplement N2	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyd	Merck	158127
Poli-D-lizyna	Merck, roztwór miliporów	A-003-E	, 1,0 mg/ml
króliczego anty-Doublecortyny (DCX)	Abcam	ab18723	Rozcieńczenie: 1/500
królik anty-PDGFRα	Abcam	ab51875	Rozcieńczenie: 1/200
anty-β- katenina królika	Abcam	ab16051	Rozcieńczenie: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Mikroskopia i analiza obrazu
Mikroskop konfokalny	Leica	SP6 i SP8
Analiza obrazu	NIH, USA	ImageJ
Analiza obrazu	Leica	LasX