Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tkankowo specyficzne nerwowe komórki macierzyste (NSC) pozostają aktywne w mózgu ssaków po urodzeniu. Przebywają w wyspecjalizowanych niszach, w których generują nowe neurony i glej. Jedną z takich nisz jest strefa podwyściółkowa (SSE; zwana również strefą komorowo-podkomorową), która znajduje się w poprzek bocznych ścian komór bocznych, przylegając do warstwy komórek wyściółki. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są obficie rozmieszczone w ośrodkowym układzie nerwowym, stanowiąc pulę proliferacyjnych komórek progenitorowych, które mogą wytwarzać oligodendrocyty.
Zarówno NSC, jak i OPC wykazują potencjał samoodnawiania się oraz cykle spoczynku/aktywacji. Ze względu na ich lokalizację, izolacja i badanie eksperymentalne tych komórek odbywa się post mortem. W tym miejscu szczegółowo opisujemy "dojenie mózgu", metodę izolacji NSC i OPC, między innymi, od żywych zwierząt. Jest to dwuetapowy protokół przeznaczony do stosowania u gryzoni i testowany na szczurach. Po pierwsze, komórki są "uwalniane" z tkanki poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie domózgowo-komorowe (i.c.v.) "koktajlu uwalniania". Głównymi składnikami są neuraminidaza, która celuje w komórki wyściółki i indukuje denudację ścian komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów-2. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna, u znieczulonych szczurów bez konieczności nacięcia.
Wyniki przedstawione tutaj pokazują, że izolowane komórki zachowują swój profil endogenny, a NSC SSE zachowują swój spokój. Denudacja warstwy wyściółki jest ograniczona do anatomicznego poziomu iniekcji, a protokół (uwolnienie i pobranie) jest dobrze tolerowany przez zwierzęta. To nowatorskie podejście toruje drogę do prowadzenia badań podłużnych endogennej neurogenezy i glejogenezy u zwierząt doświadczalnych.
Wprowadzenie
Tkankowe komórki macierzyste to częściowo zaangażowane komórki, które mogą dać początek wszystkim populacjom komórek, które tworzą odpowiednie tkanki. Oprócz tego, że są multipotencjalne, są samoodnawiającymi się komórkami i mają kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zdolności regeneracyjnych tkanek1. Niektóre tkankowo specyficzne komórki macierzyste pozostają w aktywnym, silnie proliferacyjnym stanie, takie jak jelitowe lub krwiotwórcze komórki macierzyste. Inne, takie jak komórki macierzyste mózgu, pozostają w dużej mierze w stanie spoczynku lub uśpienia2. W dorosłym mózgu nerwowe komórki macierzyste (NSC) można znaleźć w wyspecjalizowanych obszarach, często nazywanych niszami. Dwa takie dobrze opisane obszary istnieją w strefie podwyściółkowej (SSE) komór bocznych oraz w zakręcie zębatym hipokampa. Nisza SSE generuje największą liczbę komórek, przede wszystkim neuroblastów, które migrują w kierunku opuszki węchowej i przyczyniają się do lokalnej populacji interneuronów; w przeciwieństwie do tego, wygenerowane oligodendroblasty migrują do sąsiedniego ciała modzelowatego (CC)3. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są mitotycznie aktywnymi komórkami, szeroko rozmieszczonymi w ośrodkowym układzie nerwowym, które: i) są zaangażowane w linię oligodendroglialną, ii) mogą migrować do miejsc demielinizacji i iii) mogą różnicować się w mielinizujące oligodendrocyty. OPC wykazują również potencjał samoodnawiania się i spoczynku4.
Do tej pory izolacja i badanie NSC i OPC wymagało pośmiertnej dysocjacji wypreparowanej tkanki mózgu i rdzenia kręgowego. Aby obejść to eksperymentalne ograniczenie, opracowaliśmy metodę, która po raz pierwszy pozwala na izolację mózgowych NSC i OPC od żywych zwierząt. Nazywamy tę metodę "dojeniem", ponieważ umożliwia ona wielokrotne pobieranie komórek, ponieważ ich pule nie są wyczerpywane. Protokół został opracowany na szczurach, ze względu na ich duży rozmiar mózgu, ukierunkowany głównie na SSE lub CC i obejmuje dwa główne etapy. Po pierwsze, NSC lub OPC są "usuwane" z tkanki poprzez wstrzyknięcie dożylnie "koktajlu uwalniającego" zawierającego neuraminidazę, toksynę, która indukuje denudację ściany komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2). Koktajl jest stereotaktycznie wstrzykiwany obustronnie do komór bocznych. Jeżeli zamierzonym zastosowaniem jest izolacja NSC, celem są obszary rostralne komór bocznych. Jeśli celem jest czystsze wyizolowanie OPC, koktajl wstrzykuje się doogonowo w obszar fimbrii hipokampa. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z cisterna magna znieczulonych szczurów, bez konieczności nacięcia. Płynną biopsję miesza się z pożywką hodowlaną NSC i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu posiewu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury hodowlane, hodowlane i eksperymentalne zwierząt były prowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku, autoryzowane przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych, oraz z Dekretem Prezydenckim 56/2013 Republiki Greckiej, analizowane przez Organy ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki Uniwersytetów w Cambridge i Patras, a także zatwierdzone i kontrolowane przez lokalną Prefekturalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Numer protokołu: 5675/39/18-01-2021). Wykorzystano samce i samice szczurów Sprague-Dawley, Wistar i Long-Evans, w wieku od 2 do 4 miesięcy i o masie ciała od 150 g do 250 g. Protokół jest graficznie podsumowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie koktajlu
UWAGA: Przygotuj świeże w dniu zabiegu i trzymaj na lodzie. Ilości podane są na 2 μl do wstrzyknięcia dożylnego do każdej komory bocznej. Przygotować dodatkowy 1 μl na każde planowane wstrzyknięcie.
- Przygotować 0,5 μl neuraminidazy o stężeniu 500 mU z Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
UWAGA: Przechowywać go jako zapas o pojemności 1 μl rozcieńczony w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C. Inne rodzaje neuraminidaz nie zostały przebadane. - Przygotować 1 μl zawierający 1 μg przeciwciała blokującego integrynę-β1.
UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C. - Przygotować 0,5 μl zawierającego 0,5 μg zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (rekombinowanego ludzkiego FGF-zasadowego).
UWAGA: Przechowywać go w postaci bulionu o pojemności 1 μg/μl rozcieńczonego w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C.
2. Wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego
UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 20 minut. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Wyczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.
- Znieczulić zwierzę doświadczalne przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch rogówkowy, reakcję na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania.
UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym iniekcyjnym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Znieczulenie głębokie potwierdzono poprzez sprawdzenie odruchu rogówkowego, reakcji na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz trybu oddychania. - Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.
- Zamontuj szczura na ramie stereotaktycznej.
- Ogol sierść głowy brzytwą i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
- Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w skórze głowy wzdłuż środkowej linii za pomocą sterylnego skalpela.
- Skrupulatnie oczyść czaszkę za pomocą sterylnych wacików i sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
- Zidentyfikuj bregmę za pomocą krawędzi igły strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl zamontowanej na urządzeniu stereotaktycznym. Ustaw bregmę jako "punkt 0,0".
UWAGA: Bregma jest identyfikowana jako punkt przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych. Więcej szczegółów można znaleźć w atlasie mózgów szczurów Paxinos i Watson5. - Przesuń urządzenie na współrzędne przednio-tylne (AP) = 0,3 mm, boczne (L) = +1,2 mm (aby namierzyć SSE) lub AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (aby namierzyć CC).
- Wywierć otwór na zadziory o średnicy 1 mm za pomocą wiertła dentystycznego.
UWAGA: Podczas wiercenia ręcznego należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni kory mózgowej. Nie oczekuje się, że krwotok będzie znaczny. Oczyść krew solą fizjologiczną i uciskaj, aby zatrzymać bardziej uporczywe krwawienie. - Załadować 4 μl koktajlu o uwalnianiu do 10 μl strzykawki Hamiltona.
- Opuścić igłę (najlepiej lub stożkową krawędź) strzykawki Hamiltona, aby uzyskać kontakt z oponą twardą.
- Wbić igłę na żądaną głębokość (D = 3,5 mm).
UWAGA: Wlej sól fizjologiczną na powierzchnię opony twardej, aby utrzymać nawodnienie tkanki. - Wlać w infuzji 2 μl koktajlu o uwalnianiu z szybkością 1 μl/min.
- Pozostawić igłę na miejscu przez kolejne 2 minuty przed powolnym pobieraniem, aby uniknąć wypłynięcia koktajlu uwalniającego.
- Powtórz kroki 2.8-2.14 dla drugiej półkuli na współrzędnych AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (aby celować w SSE) lub AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (aby celować w CC).
- Zszyj nacięcie nylonem 5-0 (średnica 0,1 mm) i oczyść zszyty obszar środkiem antyseptycznym.
- Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania pooperacyjnego.
UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.- Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie współwięźniów z klatki (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.
- Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. Przeciwdziałać objawom bólu (chowanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) poprzez podawanie środka przeciwbólowego (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.
3. Płynna biopsja płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)
UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 10 minut. Opisana tutaj płynna biopsja jest wykonywana 3 dni po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego, ale może być wykonana dokładnie w ten sam sposób, gdy jest to wymagane. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Oczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.
- Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając rogówkę
odruch, reakcja na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania.
UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Nie jest to jednak wskazane, ponieważ zabieg jest krótki, zwłaszcza jeśli biopsje będą wykonywane wielokrotnie w ciągu kolejnych dni. - Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.
- Zamontuj zwierzę doświadczalne na ramie stereotaktycznej. Użyj nauszników, aby zamocować głowę bez utrudniania ruchu obrotowego w kierunku przodu i tyłu.
- Ustabilizuj głowę pod kątem 40° w dół, aby uzyskać dobre przedłużenie tylnej części szyi.
UWAGA: Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest użycie paska ust urządzenia6. - Ogol sierść w okolicy szyi za pomocą maszynki do golenia i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem.
- Opuszkiem palca znajdź obszar depresyjny w kształcie rombu znajdujący się między wypukłością potyliczną a grzbietem atlas6.
- Narysuj znak punktowy (np. za pomocą markera).
- Zamocuj strzykawkę o pojemności 1 ml lub 0,5 ml na ramce stereotaktycznej.
UWAGA: Zaleca się używanie strzykawek z nieodłączanymi igłami, ponieważ zapewniają one lepsze ssanie i mają mniejszą objętość martwą. - Przysunąć igłę w miejsce kontaktu ze skórą w miejscu oznaczenia.
- Za pomocą kleszczy unieść skórę, jednocześnie opuszczając strzykawkę przez warstwy skóry.
- Lekko odkręcić tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce.
- Wznowić pracę, aby bardzo powoli zanurzać igłę, aż w strzykawce pojawi się płyn (CSF).
- Ustawić igłę w tej pozycji i pozwolić na powolny przepływ CSF.
UWAGA: Igłę można lekko obniżyć lub podnieść, jeśli przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest bardzo wolny. - Rozpocznij usuwanie płynu mózgowo-rdzeniowego powoli (w krokach co 40 μl/min) do 120 μl.
- Powoli wyjmować strzykawkę.
- Dootrzewnowo podać 1 ml normalnej surowicy, aby wspomóc uzupełnianie płynów przez zwierzę doświadczalne.
- Zmieszać płynną biopsję (CSF) z 400 μl pożywki NSC i utrzymać probówkę do mikrowirówki w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
UWAGA: Biopsje płynne należy przetworzyć w ciągu 3 godzin, jeśli nie są zamrożone. - Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania po operacji.
UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.- Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie jego współlokatorów (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.
- Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. W przypadku zaobserwowania objawów bólu (ukrywanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) należy podać środek przeciwbólowy (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.
4. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji
- Zwierzę należy poddać eutanazji przez dosercowy wlew 20 ml lodowatej soli fizjologicznej, a następnie 50 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA; w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej [PBS] o pH = 7,4).
- Wypreparuj tkankę mózgową.
- Oddziel głowę od ciała za pomocą nożyczek, aby wykonać nacięcie w okolicy szyjki macicy. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę, a następnie przetnij kość czaszki wzdłuż strzałkowej linii środkowej, z końcami nożyczek skierowanymi do góry, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej. Staraj się kontynuować cięcie tak bardzo, jak to możliwe, mijając koronalną linię środkową.
- Użyj kleszczy, aby usunąć kości, zaczynając od kości nadpotylicznej i ciemieniowej, a na końcu kości czołowych.
- Gdy tkanka mózgowa zostanie odsłonięta, użyj kleszczy lub szpatułki, aby wyjąć ją z czaszki. Aby to ułatwić, przetnij nerwy u podstawy mózgu i opuszki węchowe, jeśli nie chcesz.
- Po utrwaleniu tkanki przez noc w 2% PFA w temperaturze 4 °C.
- Krioochronę tkanki w 30% sacharozie (w PBS) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C, aż tkanka opadnie na dno.
- Zamrozić tkankę w temperaturze -80 °C.
- Pokrój tkankę mózgową na skrawki koronalne o grubości 14 μm za pomocą kriostatu.
- Barwienie immunofluorescencyjne należy przeprowadzić przy użyciu standardowych protokołów 3,7
- Inkubować skrawki z buforem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,1% Triton X-100, w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Przeprowadzić pobieranie antygenu (gotowanie przez 15 minut w 10 mM buforze cytrynianowym, pH = 6,0, przy użyciu szklanych słoików).
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale konieczny w przypadku antygenów jądrowych. - Doprowadzić do temperatury pokojowej i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP), podwójnej kortynie (Dcx), S100β i β-kateninie (patrz tabela materiałów) w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
- Inkubować przez 2 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) w celu barwienia przeciwjądrowego w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).
- Zamontuj szkiełka nakrywkowe.
5. Przetwarzanie izolowanych komórek do immunofluorescencji
- Umieść komórki na 96-dołkowych płytkach kompatybilnych z mikroskopią, pokrytych poli-D-lizyną (100 μg/ml).
- Utrwal komórki w lodowatym 2% PFA na 10 minut i przemyj 3x PBS.
- Wykonaj immunofluorescencję przy użyciu standardowych procedur3,7dla PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 i ID3 (patrz Tabela materiałów).
- Przechowywać komórki w PBS + NaN3 (0,1%) w temperaturze 4 °C w ciemności.
6. Mikroskopia i analiza obrazu
- Wykonywanie zdjęć za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej i zliczanie komórek za pomocą standardowych narzędzi do analizy obrazu, takich jak liczniki komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Uwalnianie i zbieranie NSC
NSC strefy podkomorkowej (SEZ) są oddzielone od płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) jedynie jednowarstwą komórek ependymalnych, mimo że pozostają w bezpośrednim kontakcie z zawartością komór mózgowia. poprzez interkalujące wypustki jednorzęskowate8,9Neuraminidaza działa specyficznie na komórki nabłonka oponiki. poprzez odszczepienie reszt kwasu sjalowego i może prowadzić do denudacji ściany komory. Pro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Komórki macierzyste i progenitorowe są stosunkowo rzadkie w tkance mózgowej ssaków. Ponadto NSC znajdują się w miejscach niedostępnych dla łatwych i bezpiecznych biopsji (ściany komór, hipokamp). Dlatego jak dotąd jedynym sposobem na eksperymentalną pracę z takimi komórkami była ich pośmiertna izolacja. Metoda pozwalająca na pojedyncze lub wielokrotne pobieranie NSC i OPC od żywych szczurów, zwana dojeniem, jest opisana tutaj krok po kroku. Metoda opiera się na dwóch kluczowych cechach: i) NSC lub OPC są oddzielone monow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, o których mogliby zadeklarować.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant Action Medical Research (UK) (GN2291) dla R.J.M.F. i I.K. Prace badawcze były również częściowo wspierane (koszty zwierząt i wsparcie dla doktora) przez Grecką Fundację Badań i Innowacji (H.F.R.I.) w ramach "Pierwszego zaproszenia do składania projektów badawczych H.F.R.I. w celu wsparcia pracowników naukowych i badaczy oraz uzyskania grantu na kosztowną aparaturę badawczą" (numer projektu: 3395).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Release cocktail | |||
| β Przeciwciało blokujące 1-integryny | BD Biosciences | #555002 | oczyszczone NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Każda osoba z aktywnością blokującą powinna być odpowiednia. |
| Neuraminidaza z Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidazy z innych źródeł (np. z Vibrio cholerae) nie zostały przebadane. |
| Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | przechowywany jako 1 μ g/μ L bulionu, rozcieńczonego w sterylnej wodzie o stempze -20 & deg; C |
| Zabiegi chirurgiczne | |||
| 10 &mikro; L Strzykawka | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Mała wyjmowana igła, rozmiar 26s, 2 cale, styl punktowy 2 |
| BD Micro-fine 1 mL strzykawki insulinowe | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12,7 mm |
| BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/ml) |
| Cyfrowy nowy standard stereotaksji, szczurów i myszy | Stoelting | 51500D | |
| Homeotermiczny system monitorowania | Aparat Harvarda | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g para wziewna, płyn | Vetpharma Zdrowie zwierząt | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Ketamina 100 mg/ml |
| Nylonowy szew, Ethilon | Ethicon | D9635 | Przezroczysty, rozmiar 5-0 |
| Akumulatorowe akumulatorowe trymery chirurgiczne | Stoelting | Pozycja:51472 | |
| Ostrza skalpela, sterylne | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-calowe waciki | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaktyczna wiertarka szybkoobrotowa | Foredom | 1474w / o1464 | |
| Stoelting' s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Pozycja: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Ksylazyna, 25 mL |
| Obsługa tkanek i komórek oraz barwienie immunologiczne | |||
| 96-dołkowe odpowiednie do mikroskopii | Greiner | #655866 | Suplement |
| do mikropłytki B27 w kształcie gwiazdy ekranowejThermoFisher Scientific | A1486701 | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Merck | P06-1391100 | Frakcja V, szok termiczny |
| Cytrynian | Merck | 71497 | Monozasadowy cytrynian sodu |
| Kriostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Barwienie jądrowe, Rozcieńczenie: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Naukowe | 11995065 | Wysokoglukozowy, pirogroniany |
| anty-kozy osłów | Biotium | 20016 lub 20106 lub 20048 | Rozcieńczenie: 1/1,000 |
| osła anty-mysie | Biotium | 20014 lub 20105 lub 20046 | Rozcieńczenie: 1/1,000 |
| osła anty-królik | Biotium | 20015 lub 20098 lub 20047 | Rozcieńczenie: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (lub bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| koza anty-GFAP | Abcam | ab53554 | Rozcieńczenie: 1/500 |
| koza anty-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Rozcieńczenie: 1/200 |
| mysz anty-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Rozcieńczenie: 1/200 |
| mysz anty-S100β | Sigma | S2532 | Rozcieńczenie: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Podłoże montażowe |
| Suplement N2 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyd | Merck | 158127 | |
| Poli-D-lizyna | Merck, roztwór miliporów | A-003-E | , 1,0 mg/ml |
| króliczego anty-Doublecortyny (DCX) | Abcam | ab18723 | Rozcieńczenie: 1/500 |
| królik anty-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Rozcieńczenie: 1/200 |
| anty-β- katenina królika | Abcam | ab16051 | Rozcieńczenie: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Mikroskopia i analiza obrazu | |||
| Mikroskop konfokalny | Leica | SP6 i SP8 | |
| Analiza obrazu | NIH, USA | ImageJ | |
| Analiza obrazu | Leica | LasX |
Bibliografia
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
