Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie układów neuroendokrynnych często wymaga dostarczania leków, wirusów lub innych eksperymentalnych środków bezpośrednio do mózgów myszy. Wstrzyknięcie do komory mózgowej (ICV) umożliwia szerokie dostarczanie eksperymentalnego czynnika do całego mózgu (szczególnie w strukturach w pobliżu komór). W tym miejscu opisano metody wykonywania wstrzyknięć ICV z wolnej ręki u dorosłych myszy. Wykorzystując wizualne i dotykowe punkty orientacyjne na głowach myszy, zastrzyki do komór bocznych mogą być wykonywane szybko i niezawodnie. Zastrzyki wykonuje się szklaną strzykawką trzymaną w dłoni eksperymentatora i umieszczaną w przybliżonej odległości od punktów orientacyjnych. W związku z tym technika ta nie wymaga ramy stereotaktycznej. Co więcej, technika ta wymaga jedynie krótkiego znieczulenia izofluranem, co pozwala na późniejszą ocenę zachowania i/lub fizjologii myszy u przytomnych, swobodnie zachowujących się myszy. Wstrzyknięcie ICV z wolnej ręki jest potężnym narzędziem do skutecznego dostarczania środków eksperymentalnych do mózgów żywych myszy i może być łączone z innymi technikami, takimi jak częste pobieranie krwi, manipulacja obwodami neuronalnymi lub rejestracja in vivo w celu zbadania procesów neuroendokrynnych.
Wprowadzenie
Dostarczanie do mózgu czynników eksperymentalnych, takich jak leki1, wirusy2, lub komórki3, do mózgu jest często konieczne do badań neuroendokrynnych. Jeśli środek nie przenika łatwo przez barierę krew-mózg lub celem eksperymentalnym jest specyficzne przetestowanie centralnego działania środka, ważne jest, aby mieć wiarygodną metodę dostarczania zastrzyków do mózgu. Co więcej, wstrzyknięcie do przestrzeni śródmózgowej (ICV) daje możliwość szerokiego rozprowadzenia środka w mózgu i zapewnia duży obszar docelowy, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo udanego wstrzyknięcia2.
Powszechna metoda wykonywania iniekcji ICV polega na umieszczeniu na stałe stałej kaniuli. W tym podejściu rama stereotaktyczna jest niezbędna do umieszczenia dostępnej na rynku lub wykonanej na zamówienie kaniuli, ponieważ kaniula jest klejona lub cementowana na miejscu. Często, po wyzdrowieniu, suprafizjologiczna dawka angiotensyny II jest podawana przez kaniulę, a jeśli natychmiast obserwuje się zachowanie związane z piciem, kaniulę uważa się za prawidłowo umieszczoną4. Takie podejście ma wiele zalet, w tym możliwość wykonywania długotrwałej infuzji i możliwość wielokrotnego wstrzykiwania tego samego zwierzęcia; dodatkowo, jeśli stosuje się angiotensynę II, prawidłowe umieszczenie można potwierdzić przed podaniem eksperymentalnych związków. Istnieją jednak pewne ograniczenia w umieszczaniu kaniuli na stałe, w tym wymóg drogiego sprzętu (rama stereotaktyczna), możliwość uszkodzenia kaniuli po umieszczeniu (np. myszy mogą żuć kaniulę partnera w klatce) oraz możliwość infekcji wokół stałej kaniuli. Pojedyncze iniekcje ICV mogą być wykonywane przy użyciu stereotaktycznego frame3, który, choć skuteczny, wymaga znacznej ekspozycji na znieczulenie, a tym samym może zaciemnić niektóre ostre fizjologiczne i behawioralne skutki leczenia. Dodatkowo, umieszczenie myszy w ramie stereotaktycznej wymaga znacznego treningu, aby osiągnąć stabilne umiejscowienie i zapobiec pęknięciu kanałów słuchowych.
Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania zastrzyków z wolnej ręki u myszy. Ta metoda jest oparta na poprzednich raportach5,6. Zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak rama stereotaktyczna. Jak opisano poniżej, procedura ta polega na manipulowaniu szklaną strzykawką względem punktów orientacyjnych na głowie myszy w celu wykonania zastrzyków, które można wykonać szybko, a zatem wymaga tylko kilku minut znieczulenia gazowego w dniu eksperymentu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Stanowy Kolorado (#3960) oraz Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego, gdzie zebrano reprezentatywne dane (S13235, PI Kellie Breen Church). Dane dotyczące pięciu dorosłych samic i dwóch dorosłych samców myszy C57/BL6 (w wieku 9-16 tygodni) przedstawiono w sekcji danych reprezentatywnych. Samice myszy poddano owariektomii 3-4 tygodnie przed wstrzyknięciem ICV i pobraniem krwi, jak opisano wcześniej7. Przed eksperymentami myszy te były trzymane w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemnego światła i miały swobodny dostęp do paszy i wody zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Wykonywanie kraniotomii
UWAGA: Kraniotomia może być wykonana jeden lub więcej dni przed faktycznym wstrzyknięciem, co przyspiesza proces iniekcji w dniu eksperymentu.
- Przygotuj materiały do kraniotomii zgodnie z poniższym opisem.
- Umieść czystą podkładkę stołową lub materiał do układania na powierzchni roboczej. Przyklej stożek nosowy waporyzatora izofluranu do powierzchni roboczej (blisko, ale odwrócony od eksperymentatora; patrz Rysunek 1A).
- Umieść rurkę silastyczną na końcu sterylnej ostrej igły 18 G tak, aby wystawał ~1 mm końcówki igły. Umieść rurkę silastyczną na końcu sterylnej, igły tak, aby wystawał ~1 mm końcówki igły.
UWAGA: Do każdej myszy należy używać oddzielnych i sterylnych, wstępnie zapakowanych igieł (ostrych i). - Zaopatrz się w golarkę elektryczną, peeling jodowy, sterylną gazę i waciki nasączone alkoholem, aby przygotować miejsce wstrzyknięcia.
- Ćwicz przesuwanie igły 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo, jak opisano poniżej.
- Za pomocą linijki i długopisu zaznacz kartkę papieru punktem początkowym (będzie to bregma), znacznikiem 2 mm w lewo lub w prawo, a następnie kolejnym znakiem 1 mm powyżej ostatniego (będzie to miejsce wstrzyknięcia; patrz Rysunek 1B).
- Ćwiczyć przesuwanie igły od punktu początkowego do oznaczenia punktu 1 do oznaczenia punktu 2 (od bregma do miejsca wstrzyknięcia), aż do upewnienia się, że ruch jest powtarzalny bez prowadnic.
UWAGA: Opisane tutaj współrzędne są skuteczne u dorosłych myszy C57/BL6, ale inne szczepy lub grupy wiekowe mogą wymagać korekty.
- Przygotuj mysz do kraniotomii zgodnie z poniższym opisem.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczul mysz 3%-4% izofluranem w tlenie medycznym. Wraz z praktyką i znajomością procedury, skróć całkowity czas ekspozycji na izofluran do mniej niż 10 minut podczas zabiegu kraniotomii.
UWAGA: Narażenie na izofluran jest niebezpieczne dla zdrowia ludzkiego; Używaj zatwierdzonego i sprawdzonego parownika izofluranu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu za pomocą środków do usuwania gazów odlotowych. - Gdy odruch palców u nóg jest nieobecny, ogol głowę zwierzęcia. Nałóż smar do oczu.
- Umieść mysz na powierzchni roboczej z głową w stożku nosowym, aby utrzymać znieczulenie.
- Podawać lek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg masy ciała myszy, podskórnie), zgodnie z zaleceniami dostawcy.
- Oczyścić miejsce wstrzyknięcia, przecierając głowę sterylną gazą zamoczoną w roztworze jodu (wykonaj trzy peelingi), a następnie przetrzyj nasączonym gazikiem nasączonym alkoholem (wykonaj trzy razy).
UWAGA: Usuń sierść i oczyść skórę wokół miejsca wstrzyknięcia i użyj sterylnych narzędzi i igieł, zgodnie z zaleceniami Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii w celu zapobiegania infekcjom.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczul mysz 3%-4% izofluranem w tlenie medycznym. Wraz z praktyką i znajomością procedury, skróć całkowity czas ekspozycji na izofluran do mniej niż 10 minut podczas zabiegu kraniotomii.
- Mocno chwyć głowę myszy ręką niedominującą. Ustaw głowę tak płasko na powierzchni roboczej, jak to możliwe.
- Zlokalizować miejsce wstrzyknięcia.
- Użyj przygotowanej ostrej igły 18 G, aby najpierw zidentyfikować bregmę; w tym celu przeciągnij igłę po skórze głowy wzdłuż linii środkowej, poruszając się w płaszczyźnie rostralno-ogonowej. Wyobraźmy sobie trójkąt równoboczny, w którym dwa wierzchołki to oczy, a trzeci wierzchołek to przybliżone położenie bregmy (patrz Rysunek 1C).
- Z bregmy przesunąć igłę 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo do miejsca wstrzyknięcia.
- Trzymając igłę pionowo, mocno wepchnij igłę przez skórę i kość, aż rurka zrówna się ze skórą.
- Wycofać igłę, obrócić igłę i ponownie przecisnąć się przez skórę i kość. Powtarzaj proces, aż w kości utworzy się mały otwór.
- Użyj igły, aby sprawdzić, czy w kości została wykonana wystarczająca. Staraj się zrobić otwór w kości wystarczająco duży, aby igła mogła przez niego przejść.
- Wyjmij mysz ze stożka nosowego, oczyść krew z miejsca wstrzyknięcia sterylną gazą i umieść mysz w klatce na podgrzewaczu do czasu przebudzenia. Ponieważ otwór wykonany przez kraniotomię jest mały (igła 18 G), miejsce to nie musi być zamykane szwem lub klipsami do ran.
UWAGA: Otwór wykonany w tym miejscu jest mały (18 G), dlatego wiele instytucji uważa tę procedurę za zastrzyk, a nie operację. Co więcej, chociaż przez skórę i kości do mózgu powstaje otwór, utrzymywanie napiętej skóry powoduje, że otwory nie są wyrównane, co prawdopodobnie pomaga w zapobieganiu kontaktowi flory skórnej lub ściółki klatki z mózgiem.
2. Wykonanie iniekcji
- Przygotować materiały do wstrzyknięcia zgodnie z poniższym opisem.
- Umieść czystą podkładkę stołową lub materiał do układania na powierzchni roboczej. Przyklej stożek nosowy waporyzatora izofluranu do powierzchni roboczej (blisko, ale odwrócony od eksperymentatora; patrz Rysunek 1A).
- Założyć igłę o długości 10 mm i nachylenie 27° do szklanej strzykawki o pojemności 5 μl. Umieścić rurkę silastyczną na igle tak, aby wystawało 3,5 mm końcówki igły; użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować rurkę do korpusu strzykawki (patrz Rysunek 1D).
- Przygotować podłoże do wstrzykiwań (lek, wirus lub inny płyn do wstrzykiwań) w probówce. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki w tym badaniu, wstrzyknięto sterylną izotoniczną sól fizjologiczną.
UWAGA: Wybierz probówkę, która umożliwia dostęp szklaną strzykawką i igłą, taką jak probówka do mikrowirówki o pojemności 2 ml. - Pobrać 3 μl pożywki do wstrzykiwań do szklanej strzykawki. Najpierw należy pobrać więcej niż żądana objętość i wyrzucać, aż w strzykawce pozostanie 3 μl.
- Zebrać peeling jodowy, jałową gazę i waciki nasączone alkoholem w celu przygotowania miejsca wstrzyknięcia.
- Uruchom minutnik laboratoryjny w trybie odliczania i umieść minutnik tak, aby był widoczny dla eksperymentatora podczas wykonywania zastrzyków.
- Ćwicz przesuwanie igły 2 mm bocznie i 1 mm ogonowo, tak jak poprzedniego dnia.
- Przygotować mysz do wstrzyknięcia w sposób opisany poniżej.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulij ją izofluranem. Gdy odruch palców u nóg zniknie, nałóż smar do oczu i umieść mysz na powierzchni roboczej z głową w stożku nosowym.
- Oczyścić miejsce wstrzyknięcia trzema chusteczkami nasącymi z jodu i alkoholu. Zidentyfikować miejsce wstrzyknięcia za pomocą igły 18 G (lub igły) zgodnie z opisem w punkcie 1.8. powstała podczas kraniotomii powinna być wykrywalna.
UWAGA: Jeśli kraniotomia nie została wykonana wcześniej lub jeśli otwór w czaszce nie jest wykrywalny, kraniotomię można wykonać tutaj.
- Wstrzyknięcie należy wykonać szklaną strzykawką w sposób opisany poniżej.
- Mocno chwyć głowę myszy ręką niedominującą. Ustaw głowę tak płasko na powierzchni roboczej, jak to możliwe.
- Umieścić igłę szklanej strzykawki przez otwór w czaszce, aż rurka umieszczona na igle przygotowanej w kroku 2.1.2 spocznie na skórze myszy.
- Trzymać strzykawkę tak pionowo, jak to możliwe, zwracając uwagę zarówno na płaszczyznę czołową, jak i strzałkową. Powoli wstrzykiwać pożywkę przez 1 minutę.
- Trzymać strzykawkę i igłę na miejscu przez kolejną minutę po zakończeniu wstrzyknięcia, aby zminimalizować przepływ wsteczny. Powoli wycofaj igłę z główki myszy.
- Wyjmij mysz ze stożka nosowego, oczyść krew z miejsca wstrzyknięcia sterylną gazą (jeśli jest obecna) i umieść mysz w klatce na podgrzewaczu do czasu przebudzenia.
3. Potwierdzanie miejsca wstrzyknięcia
- Głęboko znieczulij i przeprowadź perfuzję myszy solą fizjologiczną i 4% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), jak wcześniej opisano8. Przechowuj mózg w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, aż mózg zatonie (zwykle 2 dni).
- Wytnij 20-50 μm przekroje koronalne na kriostacie, jak opisano wcześniej9. Podczas cięcia należy obserwować drogę iniekcji w bloku tkankowym. Odnotować, czy droga iniekcyjna wyraźnie przecina komorę boczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe wykonanie tej techniki pozwala na szybkie wprowadzenie czynnika eksperymentalnego do układu komorowego. Profil pulsacji hormonu luteinizującego (LH) u myszy po owariektomii, która otrzymała wtrysk ICV 3 µL sterylnej soli fizjologicznej (nośnika wielu związków farmakologicznych), przedstawiono na Rysunku 2A. Przykład ten pokazuje, że krótka ekspozycja na anestezję gazową oraz samo wstrzyknięcie 3 µL płynu do układu komorowego nie zmieniły pulsacyjnego wydzielania LH. W 3 h po wtrys...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisano prosty i skuteczny sposób wykonywania zastrzyków ICV u myszy. Ponieważ technika ta nie wymaga ramy stereotaktycznej, to podejście do centralnego dostarczania leków i środków eksperymentalnych jest dostępne dla większej liczby badaczy. Dodatkowo takie podejście charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością, ponieważ procedurę przygotowania i iniekcji można przeprowadzić szybko.
Ponieważ procedura ta wymaga ręcznego manipulowania igłami i szklaną strzykawką przy użyciu przyb...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Kellie Breen Church, Panu Michaelowi Kreisman i Pani Jessice Jang za ich wkład w zbieranie danych pokazanych w reprezentatywnych wynikach. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igły 18G | SAI Infusion | B18-150 | |
| Igły o rozmiarze 18 BD | Medical | 305195 | |
| Wkładki nasączone alkoholem | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Podkładka pod ławkę | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Roztwór betadyny | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorfina | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Substancja kontrolowana |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Szklana strzykawka | Hamilton | 7634-01 | |
| Igła do wstrzykiwań | Hamilton | 7803-01 | o rozmiarze 27, Mała igła Hub RN, styl punktowy: 4, Długość igły: 10 cm, Kąt: 45 |
| Izofluran | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Waporyzator izofluranowy | Vet Equip | V-10 | |
| Taśma laboratoryjna | VWR | 89098-128 | |
| Tlen klasy medycznej | Airgas OX USPEA | ||
| Paraformaldehyd | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Fisher Scientific | J67802. K2 | |
| PulsaR | Software Open source, University of Otago | Patrz ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Rurki Silastic (0,040" ID) | DOW | 508-005 | |
| Rurki krzemiastyczne (średnica wewnętrzna 0,078") | DOW | 508-009 | |
| Sterylny sól fizjologiczna | VWR | 101320-574 | |
| Sacharoza | Fisher Scientific | S5-500 |
Bibliografia
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
