Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65328

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Streszczenie

Rozwijające się serce to złożona struktura zawierająca różne komórki progenitorowe kontrolowane przez złożone mechanizmy regulacyjne. Badanie ekspresji genów i stanu chromatyny poszczególnych komórek pozwala na identyfikację typu i stanu komórki. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawniło szereg ważnych cech heterogeniczności sercowych komórek progenitorowych. Jednakże metody te są na ogół ograniczone do świeżych tkanek, co ogranicza badania w różnych warunkach doświadczalnych, ponieważ świeża tkanka musi być przetworzona jednocześnie w tym samym przebiegu w celu zmniejszenia zmienności technicznej. Dlatego w tej dziedzinie potrzebne są łatwe i elastyczne procedury generowania danych z metod takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i test pojedynczego jądra chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (snATAC-seq). W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiej izolacji jąder do kolejnych monojądrowych dualomiki (combined snRNA-seq i snATAC-seq). Metoda ta pozwala na izolację jąder z zamrożonych próbek komórek progenitorowych serca i może być łączona z platformami wykorzystującymi komory mikroprzepływowe.

Wprowadzenie

Wśród wad wrodzonych, najczęściej występują wrodzone wady serca (CHD), występujące u około 1% żywych urodzeń każdego roku1,2. Mutacje genetyczne są identyfikowane tylko w mniejszości przypadków, co sugeruje, że inne przyczyny, takie jak nieprawidłowości w regulacji genów, są zaangażowane w etiologię CHD2,3. Rozwój serca to złożony proces obejmujący różnorodne i oddziałujące na siebie typy komórek, co sprawia, że identyfikacja przyczynowych mutacji niekodujących i ich wpływu na regulację genów jest wyzwaniem. Organogeneza serca rozpoczyna się od komórkowych komórek progenitorowych, które dają początek różnym podtypom komórek serca, w tym komórkom mięśnia sercowego, fibroblastów, nasierdzia i wsierdzia4,5. Genomika pojedynczych komórek staje się kluczową metodą badania rozwoju serca i oceny wpływu heterogeniczności komórkowej na zdrowie i chorobę6. Rozwój metod multiomicznych do jednoczesnego pomiaru różnych parametrów i rozszerzenie potoków obliczeniowych ułatwiło odkrycie typów i podtypów komórek w zdrowym i chorym sercu6. W tym artykule opisano niezawodny protokół izolacji pojedynczego jądra dla zamrożonych komórek progenitorowych serca uzyskanych z zarodków myszy, który jest zgodny z dalszymi sekwencjami snRNA i snATAC-seq (a także połączonymi sekwencjami snRNA i snATAC-seq)7,8,9.

ATAC-seq to solidna metoda, która pozwala na identyfikację regulatorowych otwartych regionów chromatyny i pozycjonowanie nukleosomów10,11. Informacje te są wykorzystywane do wyciągania wniosków na temat lokalizacji, tożsamości i aktywności czynników transkrypcyjnych. Aktywność czynników chromatyny, w tym remodelerów, a także aktywność transkrypcyjna polimerazy RNA, mogą być zatem analizowane, ponieważ metoda jest bardzo czuła do pomiaru ilościowych zmian w strukturze chromatyny1,2. W ten sposób ATAC-seq zapewnia solidne i bezstronne podejście do odkrywania mechanizmów kontrolujących regulację transkrypcji w określonym typie komórki. Protokoły ATAC-seq zostały również zweryfikowane w celu pomiaru dostępności chromatyny w pojedynczych komórkach, ujawniając zmienność w architekturze chromatyny w populacjach komórek10,12,13.

Chociaż w ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w dziedzinie pojedynczych komórek, główną trudnością jest przetwarzanie świeżych próbek potrzebnych do przeprowadzenia tych eksperymentów14. Aby obejść tę trudność, przeprowadzono różne testy w celu przeprowadzenia analiz, takich jak snRNA-seq i snATAC-seq z zamrożoną tkanką lub komórkami serca15,16.

Do analizy danych genomicznych pojedynczych komórek użyto kilku platform17. Szeroko stosowanymi platformami do ekspresji genów w pojedynczej komórce i profilowania ATAC są platformy do enkapsulacji wielu kropel mikroprzepływowych17. Ponieważ platformy te wykorzystują komory mikroprzepływowe, zanieczyszczenia lub agregaty mogą zatkać system, powodując, że dane nie będą nadawały się do użytku. Tak więc powodzenie badań pojedynczych komórek zależy od dokładnej izolacji pojedynczych komórek/jąder.

Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje podobne podejście do ostatnich badań z użyciem snRNA-seq i snATAC-seq w celu zrozumienia wrodzonych wad serca18,19,20,21,22,23. Procedura ta wykorzystuje enzymatyczną dysocjację świeżo wypreparowanej tkanki serca, a następnie kriokonserwację komórek progenitorowych serca myszy. Po rozmrożeniu żywe komórki są oczyszczane i przetwarzane w celu izolacji jądrowej. W tej pracy protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do uzyskania danych snRNA-seq i snATAC-seq z tego samego preparatu jądrowego mysich komórek progenitorowych serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura na zwierzętach przyjęta w tym badaniu została zatwierdzona przez komisje etyczne Uniwersytetu Aix-Marseille (C2EA-14) i została przeprowadzona zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez wyznaczoną krajową komisję etyczną ds. doświadczeń na zwierzętach (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autoryzacja Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Ustawianie krycia czasowego przed sekcją

  1. Aby wygenerować zarodki myszy, należy przeprowadzić krycie w czasie między dorosłymi myszami 9,5 dnia przed izolacją regionu serca. W tej procedurze wykorzystano myszy C57BL/6J typu dzikiego w wieku 2-6 miesięcy, a krycie w czasie przeprowadzono w nocy.
  2. Następnego ranka sprawdź, czy samice myszy mają korek dopochwowy. Za dzień, w którym czop zostanie zidentyfikowany, należy wziąć pod uwagę dzień embrionalny (E) 0,5.

2. Przygotowanie tkanek i izolacja komórek

  1. Eutanazja ciężarnej samicy C57BL/6J w wieku 2-6 miesięcy po zapłodnieniu w 9,5 dniu po zapłodnieniu za pomocą CO2 ze zwiększonym stężeniem, a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Oczyść dolną część brzucha 70% etanolem.
    UWAGA: Nie zaleca się stosowania środków znieczulających przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ naraziłoby to zarodki na zmiany środowiskowe, które mogłyby wpłynąć na późniejsze badania transkryptomiczne i epigenomiczne.
  2. Otwórz brzuch i otrzewną nożyczkami. Wizualizuj rogi macicy i użyj kleszczy, aby wyciąć oba rogi.
  3. Umieść rogi na szalce Petriego zawierającej zimne kompletne podłoże z 1% FBS. Chociaż nie jest wymagana określona objętość, należy zadbać o to, aby zarodki były całkowicie zanurzone w pożywce. Odpowiednia jest przybliżona objętość 10 ml na 10 cm szalki Petriego.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym ustawionym na 5-krotne powiększenie i za pomocą kleszczy usuń tkankę endometrium, łożysko i woreczek żółtkowy z każdego zarodka.
  5. Umieścić zarodki na szalce Petriego z zimnym, kompletnym podłożem z 1% FBS. Wypreparuj obszar serca embrionalnego, jak opisano na schematycznym zarodku zilustrowanym na Rysunek 1, w zimnym, kompletnym podłożu.
  6. Połącz ze sobą obszary serca wycięte z pięciu zarodków myszy w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirówki kubełkowe z funkcją wstępnego schładzania wahliwego do temperatury 4 °C.
  7. Wirować przy 300x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w wirówce z odchylanym kubełkiem. Usunąć sklarowany osad i przemyć tkanki, dodając 1 ml PBS do hodowli tkankowych.
  8. Wirować przy 300 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i powtórzyć etapy mycia, w sumie dwa płukania. Powtórz pranie dwukrotnie, zastępując PBS 0,05% trypsyną/EDTA (1x).
  9. W celu trawienia tkanek dodawać 50 μl 0,25% trypsyny/EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Po 5 minutach zastosuj delikatną dysocjację mechaniczną, wykonując gesty w górę iw dół, używając końcówki filtra o szerokim otworze.
  10. Dezaktywować aktywność trawienia trypsyny poprzez dodanie 350 μl kompletnej pożywki do zdysocjowanych komórek. Przepuścić zawieszone komórki przez sitko o wielkości 40 μm.

3. Liczenie komórek i ocena żywotności

UWAGA: Liczba komórek i żywotność są kluczowymi parametrami dla powodzenia eksperymentów z pojedynczymi komórkami. Podejście snATAC-seq jest wrażliwe na niewielkie zmiany w liczbie komórek. Zbyt mała liczba komórek prowadzi do nadmiernego trawienia chromatyny, co skutkuje większą liczbą odczytów i mapowaniem niedostępnych regionów chromatyny (szumu). Podobnie, posiadanie zbyt wielu komórek generuje fragmenty o dużej masie cząsteczkowej, które są trudne do zsekwencjonowania. W celu dokładnego określenia stężeń komórek i jąder, liczbę komórek i żywotność oceniano za pomocą dwóch różnych metod.

  1. Wykonać test błękitu trypanowego do zliczania komórek, jak opisano poniżej.
    1. Wirować 0,4% roztwór barwiący błękit trypanowy, wirować przez 10 s w temperaturze pokojowej przy 2,000 x g i przenieść 10 μl do mikroprobówki.
    2. Za pomocą pipety wymieszać zawiesinę komórek i dodać 10 μl zawiesiny do już podanych 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Dokładnie wymieszaj 10 razy pipetą.
    3. Przenieść 10 μl wybarwionych komórek na szkiełko liczące. Umieść szkiełko w liczniku, aby automatycznie obliczyć stężenie komórek i żywotność.
  2. Wykonaj ocenę śmiertelności na podstawie fluorescencji, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Ten test opiera się na użyciu barwników fluorescencyjnych (ethidium homodimer-1, EthD-1 i kalceina AM) do oceny żywotności komórek. Użyto dostępnego na rynku zestawu i postępowano zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi prawidłowego przygotowania i użytkowania.
    1. Przygotować 10 μM roztwór EthD-1, dodając 5 μl dostarczonego 2 mM roztworu podstawowego EthD-1 do 1 ml sterylnego D-PBS klasy hodowli tkankowej i wirować przez 5 sekund, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    2. Przenieść 2,5 μl dostarczonego 4 mM roztworu podstawowego kalceiny AM do już przygotowanego roztworu EthD-1. Wiruj przez 5 sekund, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    3. Dodać 10 μl otrzymanego 10 μM roztworu roboczego EthD-1 i 10 μM kalceiny AM do 10 μl zawiesiny komórek.
      UWAGA: Kalceina jest bardzo podatna na hydrolizę w roztworach wodnych, dlatego należy zużyć ten roztwór roboczy w ciągu 1 dnia.
    4. Przenieść 10 μl wybarwionych komórek na szkiełko liczące. Włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych. Policz aktywne komórki za pomocą filtru GFP, a martwe komórki za pomocą filtru RFP.
      UWAGA: Obie metody liczenia dały podobną liczbę komórek i żywotność, a całkowita liczba świeżo zdysocjowanych komórek została oszacowana średnio na około 20 000 komórek na embrionalny region serca (0,06 mm3).

4. Zamrażanie komórek

  1. Odwirować zawiesinę komórek o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania dna probówki i ponownie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego podłoża do zamrażania.
  2. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonego kriowialu i umieść kriowial we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania.
  3. Umieścić pojemnik w temperaturze -80 ◦C na 4 godziny do 8 godzin. Przenieść kriowial do ciekłego azotu w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów sekwencjonowania jednojądrowego RNA i ATAC.
    UWAGA: Kriowial należy transportować na suchym lodzie przed użyciem. Z naszego doświadczenia wynika, że komórki mogą być przechowywane w ciekłym azocie przez co najmniej 6 miesięcy bez utraty żywotności komórek. Temperatura przechowywania powinna być zawsze utrzymywana poniżej -150 °C, aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu.

5. Rozmrażanie komórek i usuwanie martwych komórek

  1. Umieść kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1-2 minuty. Usuń je, gdy w kriowiale pozostanie niewielki kryształ.
  2. Dodać 1 ml podgrzanego (37 °C) kompletnego podłoża. Wymieszać pipetą trzy razy. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml ciepłej, kompletnej pożywki.
  3. Przepuścić całą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 30 μm. Przepłukać sitko 1-2 ml ciepłego kompletnego podłoża i zebrać przepływ do tej samej stożkowej probówki.
  4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Przemyć jeden raz PBS i przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  6. Dodaj 100 μl dostarczonych mikrokulek magnetycznych do granulowanych komórek i homogenizuj pięć razy za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  7. W międzyczasie przepłukać kolumnę separacji magnetycznej (pojemność: 1 x 107 do 2 x 108 komórek) 500 μL 1x buforu wiążącego.
  8. Po zakończeniu inkubacji rozcieńczyć zawiesinę komórkową zawierającą mikrogranulki 500 μl 1x buforu wiążącego.
  9. Nanieść zawiesinę komórek (0,6 μl) na przygotowaną kolumnę do separacji magnetycznej. Przepływ to ujemnie wybrana frakcja żywych komórek, a frakcja zatrzymana magnetycznie to dodatnio wybrane martwe komórki.
  10. Zebrać ścieki z żywych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml, która zawierała zawiesinę komórek i kolumnę, 2 ml buforu wiążącego 1x i zebrać ścieki w tej samej probówce o pojemności 15 ml.
  11. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  12. Dodać 1 ml roztworu PBS-BSA i delikatnie wymieszać, pipetując pięć razy za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze. Przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
  13. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  14. Dodać 1 ml PBS-BSA w celu ponownego zawieszenia granulki i powtórzyć etap mycia, co daje w sumie dwa prania.
  15. Zawiesić komórki w 100 μl roztworu PBS-BSA. Delikatnie wymieszać, pipetując 10 razy.
  16. Określić stężenie i żywotność komórek przy użyciu wcześniej opisanych metod (krok 3.1 i krok 3.2). Aby przejść do następnego kroku, upewnij się, że liczba komórek wynosi ≥ 100 000 komórek. Zobacz Rysunek 2 dla reprezentatywnych wyników.
    UWAGA: Kriokonserwacja powoduje utratę około 40% początkowego materiału wyjściowego żywych komórek. W zależności od początkowej liczby komórek, separacja kulek na kolumnie magnetycznej powoduje wysoką żywotność komórek, ale dzieli całkowitą liczbę komórek od dwóch do pięciu razy. Użycie kolumnowego zestawu magnetycznego do usuwania martwych komórek jest zalecane tylko wtedy, gdy dostępna jest wystarczająca ilość materiału wyjściowego.

6. Izolacja jąder

UWAGA: połączenie snATAC i snRNA-seq odbywa się z zawiesiną czystych i nienaruszonych jąder. Zaleca się optymalizację warunków lizy (czas lizy i stężenie NP40) dla zastosowanego typu ogniwa. Optymalny punkt czasowy lizy i stężenie detergentu to takie, które powodują lizę maksymalnej liczby komórek bez zakłócania morfologii jądrowej. Utratę komórek/jąder można zmniejszyć, stosując wirówkę z wahadłowym wiadrem zamiast wirówki o stałym kącie. Aby zminimalizować zatrzymywanie jąder na tworzywach sztucznych, zaleca się stosowanie końcówek do pipet i probówek wirówkowych o niskiej retencji. Może to zwiększyć regenerację jąder. Powlekanie końcówek pipet i probówek wirówkowych 5% BSA jest tańszą, ale bardziej czasochłonną alternatywą.

  1. Oczyść miejsce pracy i materiały 70% etanolem i roztworem do usuwania RNazy.
  2. Wirówki kubełkowe z odchylanym chłodzeniem wstępnym do temperatury 4 °C. Świeżo przygotować bufor do lizy, bufor do rozcieńczania lizy, 0,1x bufor do lizy i bufor do płukania (patrz Tabela 1). Utrzymuj na lodzie.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym kubełkiem. Delikatnie usunąć cały szwanek, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu komórkowego.
  4. Dodać 100 μl schłodzonego 0,1x buforu do lizy. Delikatnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
  5. Dodać 1 ml schłodzonego buforu do płukania i delikatnie wymieszać, pipetując pięć razy. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu jądrowego.
  6. Powtórz pranie ze schłodzonym buforem do mycia, w sumie trzy prania. Przygotować rozcieńczony bufor jąder. Po ponownym wymieszaniu utrzymać roztwór podstawowy jąder na lodzie.

7. Oceny jakości i ilości izolowanych jąder

UWAGA: Na podstawie początkowej liczby komórek i oszacowania około 50% utraty jąder podczas lizy komórek, ponownie umieść odpowiednią liczbę komórek w buforze jąder rozcieńczonych na zimno. Obliczenie objętości ponownego zawieszenia za pomocą schłodzonego, rozcieńczonego buforu jąder opiera się na docelowym odzysku jąder i odpowiadających im stężeniach podstawowych jąder zalecanych w podręczniku użytkownika producenta. Przykład tego obliczenia znajduje się w Protokole Dodatkowym 1.

  1. Opierając się na początkowej liczbie komórek i szacując około 50% utraty jąder podczas lizy komórek, ponownie zawiesić odpowiednią liczbę komórek w buforze jąder rozcieńczonych na zimno.
  2. Określić rzeczywiste stężenie jąder. Zmieszać 2 μl roztworu podstawowego jąder z 8 μl rozcieńczonego buforu jąder i dodać mieszaninę do wstępnie porcjowanych 10 μl roztworu roboczego błękitu trypanowego lub EthD-1/calceinAM. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek. Mniej niż 5% komórek powinno być zdolnych do życia. Zobacz Rysunek 3, aby uzyskać reprezentatywne wyniki.
  3. Obliczyć objętość jądra wyjściowego i objętość rozcieńczonego buforu jąder, aby uzyskać całkowitą objętość 5 μl przy stężeniu zalecanym dla reakcji transpozycji (patrz podręcznik użytkownika producenta). Przejdź natychmiast do reakcji transpozycji zgodnie z instrukcją obsługi17.
    UWAGA: Wszystkie kroki od reakcji transpozycji do budowy bibliotek ATAC i GEX zostały wykonane zgodnie z instrukcją obsługi zestawu używanego do snRNA-seq i snATAC-seq combin17.

8. Analiza jakości bibliotek snRNA-seq i snATAC-seq

  1. Przed przystąpieniem do sekwencjonowania nowej generacji należy zweryfikować jakość i rozkład wielkości końcowych bibliotek snATAC-seq i ekspresji genów GEX. Oceń jakość i ilość sekwencji zidentyfikowanych w bibliotekach za pomocą systemów analizy fragmentów. Zobacz Rysunek 4 dla reprezentatywnych wyników oceny jakości.
    UWAGA: Końcowy ślad bibliotek snATAC-seq powinien pokazywać okresowość nawijania nukleosomów, a rozmiary powinny wynosić od 200 pz do kilku Kbp, podczas gdy rozmiary w bibliotece ekspresji genów powinny wynosić od 300 pz do 600 pz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W porównaniu do przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek dla podejść jednokomórkowych, przygotowanie zawiesin pojedynczych jąder jest znacznie bardziej wymagające i wymaga wyższego stopnia rozdzielczości oraz przetworzenia. Kluczowym czynnikiem dla sukcesu połączonej analizy snRNA-seq i snATAC-seq jest czysta i nienaruszona zawiesina jąder. Protokół efektywnej izolacji jąder musi być dostosowany do każdego rodzaju tkanki i stanu (świeżego lub zamrożonego). W niniejszym opracowaniu opisano zoptymalizowany protokół iz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analiza składu komórkowego rozwijającego się serca za pomocą połączonych badań snRNA-seq i snATAC-seq zapewnia głębsze zrozumienie pochodzenia wrodzonych wad serca26. Kilka laboratoriów badawczych badało wpływ kriokonserwacji tkanek serca na snRNA-seq27. Przeprowadzanie sekwencji snRNA-seq i snATAC-seq przy użyciu świeżej mikrowypreparowanej tkanki z mysich modeli chorób ludzkich może być logistycznie trudne przy porównywaniu różnych warunków eksperymentalnych. Dla danego e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez ERA-CVD-2019 i ANR-JCJC-2020 do SS. Dziękujemy Zakładowi Genomiki i Bioinformatyki (GBiM) z laboratorium U 1251/Marseille Medical Genetics oraz anonimowym recenzentom za cenne uwagi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2100 Bioanalizator InstrumentAgilentNr katalogowy
5M Chlorek sodu (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Zestaw pojedynczych komórek, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Jednokomórkowy Multiome ATAC + pakiet odczynników do ekspresji genów, 4 rxns (w tym bufor jąder 20X)10X Genomics1000285
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283
Hrabina IIIFL ThermofisherBrak numeru katalogowego
Digitonina (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
Probówki DNA LoBind Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094sterylny i wolny od RNaz
zestaw podwójnego indeksu TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml Fisher Naukowy 
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml Fisher Naukowy 
HI-FBSThermofisherA3840001Inaktywowany termicznie
zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksycznościThermofisherL3224
MACS Zestaw do usuwania martwych komórek: Mikrokulki Romoval z martwymi komórkami, bufor wiążący 20XMiltenyi Biotec130-090-101
Inteligentne filtry siatkowe MACS (30 &mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-458
Chlorek magnezu (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaBrak numeru katalogowego
Penicylina Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µ mPluriSelectV-PM15-2021-12
Inhibitor skałEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Zestaw pojedynczych indeksów N Zestaw A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm szalka Petriego SterilinThermofisher101R20
Sterylna woda podwójnie destylowanaThermofisherR0582
Chlorowodorek Trizma roztwór (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0,4%)InvitrogenT10282
Trypsyna 0,05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Końcówki do pipet z filtrem o szerokim otworze 200 μ lLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSBrak numeru katalogowego
35209610788561

Bibliografia

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124(2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480(2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810(2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820(2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

sekwencjonowanie RNA pojedynczych j dersekwencjonowanie ATAC pojedynczych j derprofilowanie dual omiczneprotok dla tkanek zamro onychocena ywotno ci kom rekseparacja magnetycznadost pno chromatynyrozw j serca
Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.