Artykuł metodologiczny

Mysi model zatrzymania krążenia do obrazowania mózgu i monitorowania fizjologii mózgu podczas niedokrwienia i resuscytacji

DOI:

10.3791/65340

⸱

14 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Anesthesiology and Pain Management, UT Southwestern University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje unikalny mysi model zatrzymania krążenia w asfiksji, który nie wymaga ucisku klatki piersiowej do resuscytacji. Model ten jest przydatny do monitorowania i obrazowania dynamiki fizjologii mózgu podczas zatrzymania krążenia i resuscytacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość osób, które przeżyły zatrzymanie krążenia (CA), doświadcza różnego stopnia deficytów neurologicznych. Aby zrozumieć mechanizmy, które leżą u podstaw uszkodzenia mózgu wywołanego przez CA, a następnie opracować skuteczne metody leczenia, niezbędne są eksperymentalne badania CA. W tym celu stworzono kilka mysich modeli CA. W większości tych modeli myszy są umieszczane w pozycji leżącej na plecach w celu wykonania ucisku klatki piersiowej w celu resuscytacji krążeniowo-oddechowej (RKO). Jednak ta procedura resuscytacji sprawia, że obrazowanie/monitorowanie fizjologii mózgu w czasie rzeczywistym podczas CA i resuscytacji jest wyzwaniem. Aby uzyskać tak krytyczną wiedzę, w niniejszym protokole przedstawiono model CA uduszenia u myszy, który nie wymaga kroku resuscytacji krążeniowo-oddechowej z uciskiem klatki piersiowej. Model ten pozwala na badanie dynamicznych zmian w przepływie krwi, strukturze naczyń krwionośnych, potencjałach elektrycznych i tlenach w tkance mózgowej od linii wyjściowej przed CA do wczesnej reperfuzji po CA. Co ważne, model ten dotyczy myszy w podeszłym wieku. W związku z tym oczekuje się, że ten mysi model CA będzie kluczowym narzędziem do rozszyfrowania wpływu CA na fizjologię mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zatrzymanie akcji serca (CA) pozostaje globalnym kryzysem zdrowia publicznego1. W samych Stanach Zjednoczonych rocznie zgłaszanych jest ponad 356 000 pozaszpitalnych i 290 000 wewnątrzszpitalnych przypadków CA, a większość ofiar CA ma ponad 60 lat. Warto zauważyć, że upośledzenia neurologiczne po CA są powszechne wśród osób, które przeżyły, i stanowią poważne wyzwanie dla zarządzania CA2,3,4,5. Aby zrozumieć zmiany patologiczne mózgu po CA i ich wpływ na wyniki neurologiczne, zastosowano różne techniki monitorowania neurofizjologicznego i monitorowania tkanki mózgowej u pacjentów6,7,8,9,10,11,12. Korzystając ze spektroskopii bliskiej podczerwieni, przeprowadzono również monitorowanie mózgu w czasie rzeczywistym u szczurów CA w celu przewidywania wyników neurologicznych13.

Jednak w mysich modelach CA, takie podejście do obrazowania było skomplikowane ze względu na konieczność uciskania klatki piersiowej w celu przywrócenia spontanicznego krążenia, co zawsze pociąga za sobą znaczny ruch fizyczny, a tym samym utrudnia delikatne procedury obrazowania. Co więcej, modele CA są zwykle wykonywane z myszami w pozycji leżącej, podczas gdy myszy muszą być obrócone do pozycji leżącej w przypadku wielu metod obrazowania mózgu. W związku z tym w wielu przypadkach wymagany jest model mysi z minimalnym ruchem ciała podczas operacji, aby wykonać obrazowanie/monitorowanie mózgu w czasie rzeczywistym podczas całej procedury CA, od pre-CA do po resuscytacji.

Poprzednio, Zhang et al. opisali mysi model CA, który może być przydatny do obrazowania mózgu14. W ich modelu CA indukowano przez wstrzyknięcia wekuronium i esmololu w bolusie, po których następowało zaprzestanie wentylacji mechanicznej. Wykazali, że po 5 minutach CA można było przeprowadzić resuscytację poprzez podanie mieszaniny do resuscytacji. Warto jednak zauważyć, że zatrzymanie krążenia w ich modelu nastąpiło dopiero około 10 s po wstrzyknięciu esmololu. W związku z tym model ten nie podsumowuje progresji CA wywołanej asfiksją u pacjentów, w tym hiperkapnii i niedotlenienia tkanek w okresie przed zatrzymaniem.

Ogólnym celem obecnej procedury chirurgicznej jest modelowanie klinicznego uduszenia CA u myszy, po którym następuje resuscytacja bez uciskania klatki piersiowej. Ten model CA pozwala zatem na wykorzystanie złożonych technik obrazowania do badania fizjologii mózgu u myszy15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach, a protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Duke Institute (IACUC). Do niniejszego badania wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni.

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Zważ mysz na wadze cyfrowej i umieść ją w pudełku indukcyjnym do znieczulenia z pleksiglasu o wymiarach 4 cale x 4 cale x 7 cali.
  2. Ustaw parownik anestezjologiczny na 5% izofluranu, przepływomierz tlenu na 30, a przepływomierz azotu na 70 (patrz Tabela materiałów).
  3. Wyjmij zwierzę z pudełka indukcyjnego i połóż je w pozycji leżącej na stole operacyjnym, gdy jego częstość oddechów zmniejszy się do 30-40 oddechów na minutę.
  4. Wyciągnij język kleszczami i przytrzymaj go ręką niedominującą. Użyj dominującej ręki, aby włożyć laryngoskop (patrz Tabela materiałów) do ust myszy i uwidocznić strunę głosową.
  5. Użyj ręki niedominującej, aby wprowadzić do jamy ustnej prowadnik i cewnik dożylny 20 G. Delikatnie włóż przewód doprowadzający do tchawicy.
  6. Wepchnij cewnik do tchawicy, aż skrzydełkowa część cewnika zrówna się z końcówką nosa.
    UWAGA: Nie należy intubować myszy, która nie jest w pełni znieczulona, ponieważ może to uszkodzić tchawicę i spowodować krwawienie z dróg oddechowych.
  7. Podłącz zaintubowaną mysz do respiratora dla małych zwierząt (patrz tabela materiałów) i zmniejsz poziom izofluranu do 1,5%.
  8. Wprowadź masę ciała myszy do panelu sterowania respiratora, aby określić objętość oddechową i częstość oddechów.
  9. Trzymaj mysz w pozycji leżącej pod lampą grzewczą i utrzymuj temperaturę w odbycie na poziomie 37 °C za pomocą regulatora temperatury.
  10. Ogolić okolice pachwinowe, zdezynfekować obszar operacyjny co najmniej trzykrotnie jodem i alkoholem (patrz Tabela Materiałów) i przykryć obszar sterylnym obłożeniem chirurgicznym.
  11. Nałóż maść do oczu na oba oczy i podaj 5 mg/kg karprofenu podskórnie przed zabiegiem.
  12. Otwórz sterylne opakowanie narzędzi do operacji. Wykonaj 1 cm nacięcie skóry nożyczkami chirurgicznymi, aby uzyskać dostęp do tętnic udowych po obu stronach. Wyciąć i podwiązać dystalną tętnicę udową za pomocą pojedynczego pasma jedwabnego szwu 4-0 (patrz tabela materiałów) i nałożyć jedną kroplę lidokainy.
  13. Przyłóż klips do tętniaka na bliższej tętnicy udowej i wykonaj małe nacięcie na tętnicy dystalnej do klipsa. Wprowadzić cewnik z polietylenu 10 (PE-10, patrz Tabela materiałów) do lewej i prawej tętnicy udowej.
    UWAGA: Lewa linia tętnicza służy do monitorowania ciśnienia krwi, natomiast prawa służy do pobierania krwi i infuzji mieszaniny resuscytacyjnej.
  14. Wstrzyknąć 50 μl soli fizjologicznej w stosunku 1:10 do każdej linii tętniczej, aby zapobiec zakrzepom w linii.
  15. Obróć mysz do pozycji leżącej i zamontuj ją na stereotaktycznej ramie głowy.
  16. Podłącz trzy elektrody igłowe (czerwoną, zieloną i czarną) do lewego ramienia, lewej nogi i prawego ramienia w celu monitorowania elektrokardiogramu (EKG, patrz tabela materiałów).
  17. Przyklej elastyczną sondę z włókna plastikowego do nienaruszonej czaszki skroniowej przez 0,5 cm nacięcie skóry w celu monitorowania przepływu krwi w mózgu. Ten krok jest opcjonalny.
  18. Ogolić czubek głowy, zdezynfekować obszar operacyjny co najmniej trzykrotnie jodem i alkoholem, a następnie przykryć obszar sterylnym drwalem chirurgicznym.
  19. Wytnij 2,5 cm nacięcie skóry w linii środkowej i użyj czterech małych retraktorów, aby odsłonić całą powierzchnię czaszki w celu obrazowania mózgu.
  20. Umieść kamerę monitorującą (np. laserową kamerę kontrastową, patrz Tabela materiałów) nad głową.
    UWAGA: Do powierzchni czaszki można dodać kilka kropli soli fizjologicznej, aby ułatwić obrazowanie kontrastowe z plamkami laserowymi.

2. Indukcja zatrzymania krążenia

  1. Napełnij plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml 26 μl roztworu wyjściowego koktajlu do resuscytacji.
    UWAGA: Każdy mililitr tego roztworu zawiera 400 μl 1 mg/ml epinefryny, 500 μl 8,4% wodorowęglanu sodu, 50 μl 1,000 U/ml heparyny i 50 μl 0,9% chlorku sodu (patrz tabela materiałów).
  2. Poczekaj, aż temperatura ciała osiągnie 37 °C. Ustaw miernik tlenu na 100%, aby natlenić krew przez 2 minuty.
  3. Pobrać natlenioną krew tętniczą do 200 μl przez prawą tętnicę udową do przygotowanej strzykawki z tworzywa sztucznego zawierającej 26 μl roztworu wyjściowego koktajlu resuscytacyjnego.
  4. Wyłącz tlen i zwiększ ilość azotu do 100%, aby wywołać anoksję.
    UWAGA: Po około 45 s serce przestanie działać, a częstość akcji serca gwałtownie spadnie, co wskazuje na początek CA. Po około 2 minutach niedoboru tlenu monitorowanie EKG wskaże asystolię, a także nie będzie mierzalnego ogólnoustrojowego ciśnienia krwi i znikomego przepływu krwi w mózgu.
  5. Wyłącz wentylator, parownik izofluranu, regulator temperatury i przepływomierz azotu. Dostosuj tlen do 100%, przygotowując się do resuscytacji.

3. Procedura resuscytacji

  1. Włączyć respirator po 8 minutach od wystąpienia CA.
  2. Natychmiast rozpocząć wlew pobranej natlenionej krwi zmieszanej z koktajlem resuscytacyjnym do krążenia krwi przez prawą tętnicę udową w ciągu 1 minuty
    UWAGA: Napar prowadzi do stopniowego wzrostu częstości akcji serca i przywrócenia perfuzji krwi; w końcu osiąga się powrót krążenia spontanicznego (ROSC).

4. Odzyskiwanie po CA

  1. Umieść mysz w pozycji leżącej po wyjęciu jej z ramy stereotaktycznej i wyjmij cewniki PE-10 z tętnic udowych.
  2. Nałożyć 0,25% bupiwakainy na nacięcie skóry i zszyć nacięcia skóry za pomocą nylonowego szwu 6-0 (patrz tabela materiałów). Nałóż maść z antybiotykiem na powierzchnię nacięcia skóry.
  3. Odłącz wentylator myszy, gdy zostanie przywrócone spontaniczne oddychanie.
  4. Przenieść mysz do komory odzyskiwania o kontrolowanej temperaturze 32 °C.
  5. Po 2 godzinach rekonwalescencji wykstubuj mysz i wróć do klatki domowej. Wstrzyknij podskórnie 0,5 ml zwykłej soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wywołać CA, mysz została znieczulona 1,5% izofluranem i wentylowana 100% azotem. Ten stan doprowadził do ciężkiej bradykardii w ciągu 45 s (Ryc. 1). Po 2 minutach niedotlenienia tętno dramatycznie spadło (Ryc. 2), ciśnienie krwi spadło poniżej 20 mmHg, a przepływ krwi w mózgu całkowicie ustał (Ryc. 1). Gdy izofluran został wyłączony, temperatura ciała nie była już kontrolowana i powoli spadała do około 32 °C pod koniec CA (Rycina 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W eksperymentalnych badaniach CA w celu wywołania CA 16,17,18,19,20,21,22,23 zastosowano asfiksję, zastrzyki chlorku potasu lub migotanie komór pochodzące z prądu elektrycznego. Zwykle resuscytacja krążeniowo-oddechowa jest wymagana do resuscytacji w tych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Kathy Gage za jej redakcyjne wsparcie. Badanie to było wspierane przez fundusze z Wydziału Anestezjologii (Duke University Medical Center), grantu American Heart Association (18CSA34080277) oraz grantów National Institutes of Health (NIH) (NS099590, HL157354, NS117973 i NS127163).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdrenalinPar PharmaceuticalNDC 42023-159-01
Waciki nasączone alkoholemBD326895
Animal Bio AmpADInstrumentsFE232
BP PrzetwornikADInstrumentsMLT0699
Bridge AmpADInstrumentsFE117
Wstrzyknięcie heparyny sodu, USPFresenius KabiNDC 63323-540-05
IsofluraneCovetrusNDC 11695-6777-2
Laserowy monitor perfuzji dopplerowskiejMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Laserowy system obrazowania plamkowegoRWDRFLSI III
Smar maść do oczuBausch + Lomb339081
Micro clipRobozRS-5431
Mysia sonda doodbytniczaPhysitempRET-3
Elektroda igłowaADInstrumentsMLA121329 Ga, gniazdo 1,5 mm
AzotAirgasUN1066
Włókno optyczne z tworzywa sztucznegoMoor InstrumentsOtoskop POF500
Welchallyn7282,5 mm Wziernik
TlenAirgasUN1072
Rurka PE-10BD427401Rurka polietylenowa
Powidon-jodCVS955338
PowerLab 8/35ADInstruments
Rimadyl (karprofen)Zoetis6100701Do wstrzykiwań 50 mg/ml
Respirator dla małych zwierzątKent ScientificRoVent Jr.
Regulator temperaturyPhysitempTCAT-2DF
Potrójny lek przeciwbiologiczny i przeciwbólowyCVSNDC 59770-823-56
WaporyzatorRWDR583S
HospiraNDC 0409-1159-18
0,9% chrodku soduOIOM MedycznyNDC 0990-7983-03
1 ml plastik strzykawkaBD309659
4-0 szew jedwabnyLookSP116pleciony jedwabny
szew nylonowy 6-0Ethilon1698G
8,4% wodorowęglan sodu Inj., USPHospiraNDC 0409-6625-02
Cewnik dożylny 20 GBD38153420GA 1,6 W
30 G Igła PrecisionGlideBD30510630 G X 1/2
0,25% bupiwakainy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A., Masters, S., Ball, S., Finn, J. The incidence and outcomes of out-of-hospital cardiac arrest in metropolitan versus rural locations: A systematic review and meta-analysis. Resuscitation. 185, 109655(2022).
  2. Amacher, S. A., et al. Predicting neurological outcome in adult patients with cardiac arrest: systematic review and meta-analysis of prediction model performance. Critical Care. 26 (1), 382(2022).
  3. Matsuyama, T., Ohta, B., Kiyohara, K., Kitamura, T. Intra-arrest partial carbon dioxide level and favorable neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest: A nationwide multicenter observational study in Japan (the JAAM-OHCA registry). European Heart Journal of Acute Cardiovascular Care. 12 (1), 14-21 (2023).
  4. Takahagi, M., Sawano, H., Moriyama, T. Long-term neurological outcome of extracorporeal cardiopulmonary resuscitation for out-of-hospital cardiac arrest patients with nonshockable rhythms: A single-center, consecutive, retrospective observational study. The Journal of Emergency Medicine. 63 (3), 367-375 (2022).
  5. Mork, S. R., Botker, M. T., Christensen, S., Tang, M., Terkelsen, C. J. Survival and neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest treated with and without mechanical circulatory support. Resuscition Plus. 10, 100230(2022).
  6. Koenig, M. A., Kaplan, P. W., Thakor, N. V. Clinical neurophysiologic monitoring and brain injury from cardiac arrest. Neurologic Clinics. 24 (1), 89-106 (2006).
  7. Cavazzoni, E., Schibler, A. Monitoring of brain tissue oxygen tension and use of vasopressin after cardiac arrest in a child with catecholamine-induced cardiac arrhythmia. Critical Care & Resuscitation. 10 (4), 316-319 (2008).
  8. Topjian, A. A., et al. Multimodal monitoring including early EEG improves stratification of brain injury severity after pediatric cardiac arrest. Resuscitation. 167, 282-288 (2021).
  9. Beekman, R., et al. Bedside monitoring of hypoxic ischemic brain injury using low-field, portable brain magnetic resonance imaging after cardiac arrest. Resuscitation. 176, 150-158 (2022).
  10. Sinha, N., Parnia, S. Monitoring the brain after cardiac arrest: A new era. Current Neurology Neuroscience Report. 17 (8), 62(2017).
  11. Reis, C., et al. Pathophysiology and the monitoring methods for cardiac arrest associated brain injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 129(2017).
  12. Zhou, H., Lin, C., Liu, J., Wang, X. Continuous monitoring of brain perfusion by cerebral oximetry after spontaneous return of circulation in cardiac arrest: A case report. BMC Neurology. 22 (1), 365(2022).
  13. Takegawa, R., et al. Real-time brain monitoring by near-infrared spectroscopy predicts neurological outcome after cardiac arrest and resuscitation in rats: A proof of concept study of a novel prognostic measure after cardiac arrest. Journal Clinical Medicine. 11 (1), 131(2021).
  14. Zhang, C., et al. Invasion of peripheral immune cells into brain parenchyma after cardiac arrest and resuscitation. Aging and Disease. 9 (3), 412-425 (2018).
  15. Duan, W., et al. Cervical vagus nerve stimulation improves neurologic outcome after cardiac arrest in mice by attenuating oxidative stress and excessive autophagy. Neuromodulation. 25 (3), 414-423 (2022).
  16. Liu, H., et al. Novel modification of potassium chloride induced cardiac arrest model for aged mice. Aging and Disease. 9 (1), 31-39 (2018).
  17. Shen, Y., et al. Aging is associated with impaired activation of protein homeostasis-related pathways after cardiac arrest in mice. Journal of American Heart Association. 7 (17), e009634(2018).
  18. Wang, P., et al. Manganese porphyrin promotes post cardiac arrest recovery in mice and rats. Biology. 11 (7), 957(2022).
  19. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. Journal of American Heart Association. 10 (11), e019142(2021).
  20. Li, R., et al. Activation of the XBP1s/O-GlcNAcylation pathway improves functional outcome after cardiac arrest and resuscitation in young and aged mice. Shock. 56 (5), 755-761 (2021).
  21. Shen, Y., et al. Activation of the ATF6 (activating transcription factor 6) signaling pathway in neurons improves outcome after cardiac arrest in mice. Journal American Heart Association. 10 (12), e020216(2021).
  22. Jiang, M., et al. MCC950, a selective NLPR3 inflammasome inhibitor, improves neurologic function and survival after cardiac arrest and resuscitation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 256(2020).
  23. Zhao, Q., et al. Cardiac arrest and resuscitation activates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and results in severe immunosuppression. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (5), 1091-1102 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model asfiksji u myszym zgowy przep yw krwiutlenowanie m zgufunkcja neurologicznastruktura naczyniowamonitorowanie reanimacjieksperymentalne badania nad zatrzymaniem kr enia

Powiązane artykuły