Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65343

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Yale School of Medicine, 3Department of Pediatrics/Gastroenterology and Hepatology, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 5Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Streszczenie

Podczas korzystania z organoidów do oceny fizjologii i decyzji dotyczących losu komórek, ważne jest, aby używać modelu, który dokładnie odzwierciedla konteksty in vivo. W związku z tym organoidy pochodzące od pacjentów są wykorzystywane do modelowania chorób, odkrywania leków i spersonalizowanych badań przesiewowych leczenia. Organoidy jelitowe myszy są powszechnie wykorzystywane do zrozumienia aspektów zarówno funkcji/fizjologii jelit, jak i dynamiki komórek macierzystych/decyzji dotyczących losu. Jednak w wielu kontekstach chorobowych szczury są często preferowane zamiast myszy jako model ze względu na ich większe podobieństwo fizjologiczne do ludzi pod względem patofizjologii choroby. Model szczurzy był ograniczony przez brak narzędzi genetycznych dostępnych in vivo, a organoidy jelitowe szczurów okazały się kruche i trudne do hodowli w dłuższej perspektywie. W tym przypadku opieramy się na wcześniej opublikowanych protokołach, aby solidnie wygenerować organoidy jelitowe szczura z dwunastnicy i jelita czczego. Przedstawiamy przegląd kilku dalszych zastosowań wykorzystujących organoidy jelitowe szczurów, w tym funkcjonalne testy obrzęku, barwienie całego mocowania, generowanie monowarstw enteroidów 2D i transdukcję lentiwirusową. Model organoidów szczurzych stanowi praktyczne rozwiązanie zapotrzebowania na model in vitro, który zachowuje fizjologiczne znaczenie dla ludzi, może być szybko manipulowany genetycznie i jest łatwo uzyskany bez barier związanych z pozyskiwaniem organoidów jelitowych ludzkich.

Wprowadzenie

Architektura nabłonka jelita cienkiego człowieka i skład komórkowy są złożone, co odzwierciedla ich funkcje fizjologiczne. Podstawową rolą jelita cienkiego jest wchłanianie składników odżywczych z pożywienia przechodzącego przez jego lumen1. Aby zmaksymalizować tę funkcję, powierzchnia jelita jest zorganizowana w przypominające palce wypustki zwane kosmkami, które zwiększają powierzchnię absorpcyjną, oraz przypominające miseczki wgłębienia zwane kryptami, które mieszczą i izolują komórki macierzyste. W obrębie nabłonka generowane są różne wyspecjalizowane typy komórek absorpcyjnych i wydzielniczych, które pełnią różne funkcje1. Ze względu na tę złożoność trudno było modelować tkanki, takie jak jelito, w nieśmiertelnych, przekształconych liniach komórkowych o wysokim pasażowaniu. Jednak badania nad komórkami macierzystymi, zwłaszcza dorosłymi komórkami macierzystymi i mechanizmami ich różnicowania, pozwoliły na opracowanie hodowli organoidów jelitowych 3D. Wykorzystanie modeli organoidowych zmieniło tę dziedzinę, częściowo ze względu na ich rekapitulację niektórych składników architektonicznych i niejednorodność typów komórek znajdujących się w nienaruszonym jelicie. Organoidy jelitowe mogą być hodowane długoterminowo in vitro ze względu na utrzymanie aktywnej populacji komórek macierzystych2.

Organoidy jelitowe szybko stały się elastycznym modelem do badania biologii komórek macierzystych, fizjologii komórki, chorób genetycznych i żywienia3,4, a także narzędziem do opracowywania nowych metod dostarczania leków5. Ponadto organoidy pochodzące od pacjentów są wykorzystywane m.in. do modelowania chorób, odkrywania leków i spersonalizowanych badań przesiewowych leczenia6,7,8,9. Jednak ludzkie organoidy jelitowe nadal stanowią wyzwanie. Dostępność tkanek, wymagania dotyczące zatwierdzenia przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną oraz kwestie etyczne ograniczają powszechne stosowanie próbek od ludzi. Dodatkowo, ludzkie organoidy jelitowe generowane z krypt jelitowych wymagają dwóch odrębnych warunków hodowli w celu utrzymania niezróżnicowanych komórek macierzystych lub indukowania różnicowania typów dojrzałych komórek10. Kontrastuje to z in vivo, gdzie komórki macierzyste i dojrzałe zróżnicowane typy komórek są jednocześnie obecne i stale generowane/utrzymywane1. Z drugiej strony, organoidy jelitowe myszy, które są hodowane w mniej złożonym koktajlu czynników wzrostu, nie wymagają tej zmiany w składzie pożywki i mogą utrzymywać komórki macierzyste i komórki zróżnicowane w tym samym kontekście podłoża2,11. Jednak kluczowe różnice w jelicie myszy w porównaniu z ludźmi mogą w wielu przypadkach sprawić, że organoidy myszy będą nieoptymalnym modelem. Ogólnie rzecz biorąc, wiele organoidów jelitowych od większych ssaków, w tym koni, świń, owiec, krów, psów i kotów, zostało z powodzeniem wygenerowanych w warunkach hodowli bardziej zbliżonych do organoidów jelitowych myszy niż warunków hodowli organoidów jelitowych ludzkich12. Różnice w warunkach czynnika wzrostu między organoidami mysi i ludzi prawdopodobnie odzwierciedlają różnice w składzie nisz komórek macierzystych i różne wymagania dotyczące przeżycia, proliferacji i utrzymania komórek macierzystych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na łatwo dostępny modelowy system organoidowy, który 1) bardzo przypomina skład komórek jelitowych człowieka, 2) zawiera komórki macierzyste o wymaganiach dotyczących czynnika wzrostu, takich jak organoidy jelitowe człowieka, oraz 3) jest zdolny do ciągłego utrzymywania niezróżnicowanych i zróżnicowanych przedziałów. Idealnie byłoby, gdyby system opierał się na powszechnie stosowanym przedklinicznym modelu zwierzęcym, tak aby eksperymenty in vivo i in vitro mogły być ze sobą skorelowane i stosowane w tandemie.

Szczury są powszechnie używanym modelem przedklinicznym do badań fizjologii jelit i farmakologii ze względu na ich bardzo podobne fizjologię i biochemię jelit do ludzi13, szczególnie w odniesieniu do przepuszczalności jelit14. Ich stosunkowo większy rozmiar w porównaniu do myszy sprawia, że są bardziej podatne na zabiegi chirurgiczne. Podczas gdy czasami używane są duże modele zwierzęce, w tym świnie, szczury są bardziej przystępnym cenowo modelem, wymagają mniej miejsca do hodowli i mają łatwo dostępne na rynku standardowe szczepy15. Wadą stosowania modeli szczurzych jest to, że zestaw narzędzi genetycznych do badań in vivo nie jest dobrze rozwinięty w porównaniu z myszami, a generowanie nowych linii szczurów, w tym knockoutów, knock-inów i transgeników, jest często zbyt kosztowne. Opracowanie i optymalizacja solidnego modelu organoidów jelitowych szczurów pozwoliłaby na manipulację genetyczną, leczenie farmakologiczne i badania o wyższej przepustowości w dostępnym modelu, który zachowuje kluczowe znaczenie fizjologiczne dla ludzi. Jednak zalety jednego modelu organoidów gryzoni w porównaniu z innym są w dużym stopniu zależne od konkretnego badanego procesu lub genu; Niektóre geny znalezione u ludzi mogą być pseudogenami u myszy, ale nie u szczurów16,17. Dodatkowo, specyficzne dla gatunku podtypy komórek są coraz częściej odkrywane przez jednokomórkowy RNAseq18,19,20. Wreszcie, modele chorób jelit szczurów i myszy często wykazują znaczne różnice w fenotypach21,22 tak, że model, który dokładniej podsumowuje objawy i proces chorobowy obserwowany u ludzi, musi zostać wybrany do dalszych prac. Stworzenie modelu organoidu jelita szczura zapewnia badaczom dodatkową elastyczność i wybór w wyborze systemu modelowego najbardziej odpowiedniego dla ich sytuacji. W tym przypadku istniejące protokoły23,24 są rozszerzone o generowanie organoidów jelitowych szczurów i przedstawiono protokół generowania i utrzymywania organoidów jelitowych szczurów z dwunastnicy lub jelita czczego. Ponadto opisano kilka dalszych zastosowań, w tym zakażenie lentiwirusowe, barwienie całej góry i testy obrzęku forskoliny.

Protokół

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe powinny być obsługiwane przy użyciu odpowiedniej techniki aseptyki w kapturze do hodowli tkankowej. Wszystkie prace na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Yale.

1. Przygotowanie odczynników do hodowli komórkowych

  1. Przygotować pożywkę kondycjonowaną R-spondyną 1 zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować kondycjonowaną pożywkę Wnt3a zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj AdDMEM+ zgodnie z opisem w Tabeli 1.
  2. Zawiesić gastrynę w sterylnym dH2O, aby przygotować wywar o objętości 100 μM. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zawiesić N-acetylocysteinę w sterylnej wodzie, aby przygotować 100 mM zapasu. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Zawiesić rekombinowaną ludzką Noggin w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu przygotowania bulionu o sile 250 μg/ml. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zawiesić rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu myszy (EGF) w PBS + 0,1% BSA, aby przygotować zapas 100 μg/ml. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Rozcieńczyć rekombinowany ludzki IGF-1 w PBS + 0,1% BSA, aby przygotować zapas 100 μg/ml. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zawiesić rekombinowany ludzki FGF-2 w 5 mM Tris, pH 7,6, w celu przygotowania zapasu o stężeniu 100 μg/ml. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Dla wszystkich czynników wzrostu należy użyć pośredniego rozcieńczenia w PBS + 0,1% BSA, aby 100-krotność końcowego stężenia w pożywce hodowlanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Ustanowienie organoidów w jelicie cienkim szczura

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany z dwóch wcześniej opublikowanych protokołów dla organoidów jelitowych szczurów23,24.

  1. Przygotować organoidowe podłoża z jelit szczurów (rIOM) zgodnie z tabelą 2 i ustawić łaźnię wodną na temperaturę 37 °C. To kompletne podłoże jest stabilne przez 5 dni w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 10 ml 3 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie. Rozmrozić 250 μl ekstraktu z macierzy zewnątrzkomórkowej (EME) na lodzie.
  3. Pościć szczura przez noc z dostępem do wody ad libitum. Poddaj szczura eutanazji zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. W tym protokole dorosłe samce szczurów Sprague Dawley (o wadze ~200 g) zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie CO2 (tabela materiałów). Zwichnięcie szyjki macicy było stosowane jako wtórna metoda eutanazji.
  4. Do sekcji używaj sterylnych autoklawowanych kleszczy i nożyczek preparacyjnych. Umieść uśpionego szczura na powierzchni preparacji brzuszną stroną do góry. Ściśnij warstwę skóry kleszczami; Poniższe nacięcia należy wykonać na poziomie powierzchni, tak aby przecinały tylko tę warstwę skóry, a nie na tyle głęboko, aby uszkodzić narządy wewnętrzne.
  5. Aby otworzyć jamę brzuszną, za pomocą dużych, ostrych nożyczek preparacyjnych przeciąć warstwę skóry w dużym, podłużnym, powierzchniowym nacięciu pośrodku brzucha. Następnie, wychodząc z tego cięcia, wykonaj dwa krótsze poziome cięcia, po jednym z każdej strony. Użyj kleszczy, aby odkleić skórę, aby odsłonić jamę brzuszną. Przeciąć błonę otrzewną, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne w jamie brzusznej z łatwym dostępem do jelita.
  6. Za pomocą nożyczek i kleszczy zlokalizuj żołądek i zidentyfikuj dwunastnicę około 2-3 cm dystalnie do niej, która pojawia się jako żółtawy segment. Bliższe jelito czcze znajduje się około 4-5 cm dystalnie do więzadła Treitza, które służy jako punkt orientacyjny między dwunastnicą a jelitem czczym.
  7. Umieść wyizolowany fragment jelita na 10-centymetrowej szalce Petriego. Oczyść pożądany odcinek jelita krezki tak bardzo, jak to możliwe. Przepłukać 10 ml lodowatego PBS, aż zostanie oczyszczony z zawartości światła. Na ręczniku papierowym pokrój odcinek jelitowy na kawałki o długości ~2 cm. Otwórz każdy kawałek jelita wzdłużnie, aby odsłonić nabłonek.
  8. Za pomocą szklanego szkiełka mikroskopowego zeskrob odsłoniętą powierzchnię światła, aby usunąć kosmki. Umieść kawałki jelit w przygotowanym roztworze EDTA na lodzie. Obracaj w temperaturze 4 °C przez 30 minut na rewolwerze rurowym ustawionym na 10 obr./min.
  9. Pod mikroskopem preparacyjnym wlej zawartość stożkowej rurki na 10-centymetrową szalkę Petriego. Dodaj dodatkowe ~5 ml lodowatego PBS.
  10. Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj odcinek jelita i energicznie potrząśnij. Będzie można zobaczyć, jak nabłonek uwalnia się do PBS. Na początku PBS będzie zawierał przede wszystkim kosmki.
  11. Kontynuuj potrząsanie. Okresowo wyrzucaj PBS zawierający kosmki i dodaj 10 ml świeżego, lodowatego PBS do fragmentów jelita. Kontynuuj potrząsanie fragmentami i powtarzaj ten etap mycia, aż kosmki przestaną być uwalniane do PBS, ale zamiast tego PBS zawiera głównie krypty. Nie przekraczaj 15 minut w celu odizolowania krypty, aby żywotność komórek nie była zagrożona.
  12. Wyrzuć pozostałe fragmenty jelita. Wzbogać pozostały PBS na szalce Petriego dla krypt jelitowych. W kapturze do hodowli tkankowej zebrać krypty zawierające PBS i przefiltrować przez sitko do komórek o wielkości 70 μm (tabela materiałów).
  13. Wirować przy 250 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml AdDMEM+. Ponownie odwirować przy 250 x g przez 5 min.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie wirówki z obracanym wirnikiem kubełkowym.
  14. Usunąć supernatant, pozostawiając ~50 μL pożywki z osadem. Zawiesić osad w pozostałym podłożu i dodać do podwielokrotności EME na lodzie. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby zawiesić krypty równomiernie w całym EME. Unikaj wprowadzania bąbelków.
  15. Umieścić 50 μl kopułek EME w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i inkubować przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  16. Dodać 2 ml rIOM (Tabela 2) zawierającego 10 μM Y27632 i 10 μM CHIR99021 (Tabela 3). Po przejściu Y27632 i CHIR99021 można przerwać.
  17. Zmieniaj rIOM co 2-3 dni. Pasaż w razie potrzeby, zwykle od 3 do 7 dni, w zależności od początkowej liczby organoidów, wielkości i tempa wzrostu.

3. Pasżujące organoidy jelitowe szczura

  1. Rozmrozić 250 μl podwielokrotności EME na lodzie i podgrzać rIOM do temperatury 37 °C.
  2. Odessać pożywkę z płytki o średnicy 35 mm zawierającej organoidy i dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego w celu natychmiastowego uwolnienia organoidów z kopuł EME.
  3. Natychmiast przenieść odczynnik dysocjacyjny z rozdrobnionymi organoidami do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyć płytkę hodowlaną 2 ml AdDMEM+ i dodać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej rozdrobnione organoidy.
  4. Za pomocą szklanej pipety Pasteura delikatnie pipetuj w górę i w dół 15-20 razy, aby rozdrobnić organoidy. Wirować przy 350 x g przez 2 min.
  5. Dodać ~50 μL roztworu z dna rurki stożkowej do EME. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Unikaj robienia bąbelków.
  6. Umieścić 50 μl kopułek EME w naczyniu o średnicy 35 mm i inkubować przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Dodać 2 ml rIOM z 10 μM Y27632 i 10 μM CHIR99021. Zmieniaj podłoże wzrostowe co 2-3 dni. Podczas zmiany nośnika Y27632 i CHIR99021 można pominąć.

4. Kriokonserwacja i rozmrażanie organoidów jelitowych szczurów

  1. Kriokonserwujące organoidy jelitowe szczura
    UWAGA: Protokół kriokonserwacji został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniego protokołu dla organoidów ludzkich i mysich25. Przed zamrożeniem organoidy muszą mieć co najmniej dwa pasaże w kulturze podstawowej. Zaleca się hodowanie organoidów do punktu dużych sferoidów lub lekko pączkujących organoidów przed krioprezerwacją, ponieważ spowoduje to wyższy plon żywotnych organoidów po rozmrożeniu. Można to osiągnąć poprzez zwiększenie pożywki kondycjonowanej przez R-spondynę do 15% i/lub dodanie 10 mM nikotynamidu (Tabela 3) do hodowli organoidów.
    1. Za pomocą mikroskopu policz liczbę organoidów na szalce o średnicy 35 mm. Oznacz kriowiale w taki sposób, aby 200 organoidów zostało poddanych do każdego kriowialu.
    2. Wyjmij rIOM z naczynia 35 mm. Zastąp 2 ml PBS z zimnej hodowli tkankowej.
    3. Za pomocą końcówki P1000 zwolnij kopułki EME z dna naczynia hodowlanego do PBS, pipetując w górę iw dół. Kontynuuj pipetowanie w górę i w dół ~20 razy, aby rozbić EME i uwolnić organoidy. Zebrać organoidy i PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Dodać 2 ml zimnego PBS do naczynia hodowlanego i pipetować w górę iw dół, aby uwolnić pozostałe organoidy do PBS. Przenieść PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Osadzać organoidy przez odwirowywanie przy 290 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu organoidowego.
    6. Umyj granulkę, delikatnie ponownie zawieszając w 5 ml zimnego AdDMEM+. Wirować przy 200 x g przez 4 min. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
    7. Zawiesić osad organoidowy w 1 ml zimnej pożywki do zamrażania na 200 organoidów. Podwielokrotność 1 ml organoidów w pożywce zamrażającej na znakowany kriowial. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania.
    8. Przechowywać organoidy w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C przez 24 godziny, a następnie przenieść kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Rozmrażanie organoidów jelitowych szczura
    UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniego protokołu rozmrażania organoidów jelitowych ludzkich i myszy26.
    1. Rozmrozić 250 μl podwielokrotności EME na lodzie. Przygotuj rIOM uzupełniony 15% pożywką kondycjonowaną R-spondyną, 10 μM Y27632 i 10 μM CHIR99021. Ciepło w 37 °C.
    2. Dodać 2 ml pożywki do rozmrażania (Tabela 3) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
    3. Pobrać i rozmrozić fiolkę z organoidami z ciekłego azotu, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż fiolka zostanie prawie całkowicie rozmrożona.
    4. Dodać 1 ml pożywki do rozmrażania do fiolki i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki zawierającej pożywkę do rozmrażania. Umyć fiolkę dwukrotnie 1 ml środka do rozmrażania i przenieść do stożkowej probówki.
    5. Wirować przy 200 x g przez 5 min. Zassać pożywkę, pozostawiając ~50 μl pożywki z organoidami. Przenieść pożywkę zawierającą organoidy do 250 μl EME.
    6. Równomiernie rozprowadź organoidy w EME, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków. Odpipetować sześć kopułek o pojemności 50 μl do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm.
    7. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 15-20 minut, aby umożliwić polimeryzację EME. Dodaj 2 ml przygotowanego rIOM do naczynia.
    8. Po 2 dniach wymień nośnik na rIOM. Korzystanie z Y27632 i CHIR99021 można zawiesić. Wzrost organoidów może być powolny w pierwszym pasażu po rozmrożeniu. Zaleca się dwukrotne przejście organoidów po rozmrożeniu przed rozpoczęciem eksperymentów.

5. Generowanie monowarstw 2D jelit szczurów z organoidów 3D

UWAGA: Poniższy protokół opisuje objętości wymagane do wytworzenia 24 dołków 48-dołkowej płytki pokrytej EME, zaczynając od sześciu kopuł po 50 μL (szalka 35 mm) zawierających ~300 organoidów jelitowych/kopułę (skala: jedna kopuła generuje cztery dołki), ale może być skalowana w górę lub w dół w zależności od potrzeb. Jak napisano, protokół ten osiąga ~80% konfluencji w ciągu 4-5 dni. Przy wyższym zbieganiu komórki zaczynają ponownie nabywać struktury organoidowe 3D. Przy niskiej konfluencji (≤40%) komórki pozostają jako monowarstwy i są żywotne przez ~ 14 dni. Jeśli celem badania jest użycie monowarstw 2D, należy zmniejszyć skalę tak, aby jedna kopuła generowała osiem dołków z 24-dołkowej płytki. Studzienki mogą być również pokryte kolagenem I w celu utworzenia monowarstw.

  1. Przygotowanie powierzchni powlekanych
    1. Aby pokryć płytkę EME, należy rozcieńczyć EME w stosunku 1:20 w zimnym AdDMEM+ (Tabela 1). Do powlekania kolagenem przygotuj kolagen I zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć 5 mg/ml kolagenu I w AdDMEM+ do 100 μg/ml (w tym przypadku 1:50).
    2. Pokryj płytkę 200 μl rozcieńczonego EME lub kolagenu, aby całkowicie pokryć powierzchnię studzienki. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Przygotować organoidowe podłoże z organoidów jelitowych szczurów do hodowli jednowarstwowej 2D (rIOM2D) zgodnie z tabelą 4.
  2. Generowanie monowarstw
    1. Odessać pożywkę z płytki o średnicy 35 mm zawierającej organoidy. Dodaj 1 ml PBS.
    2. Zakłóć EME w studniach, drapiąc końcówką P1000. Pipetować w górę i w dół około 20 razy, aby poluzować cały EME. Przenieś wszystko do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Dodać 1 ml PBS do płytki o średnicy 35 mm w celu odzyskania wszelkich dodatkowych organoidów i przenieść do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Wirować przy 350 x g przez 2 minuty i odsysać supernatant wraz z pozostałością EME. Dodać 1 ml roztworu trypsyny do osadu organoidowego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    5. Pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą końcówki P1000 i dodaj 2 ml AdDMEM+, aby zneutralizować trypsynę.
    6. Wirować przy 350 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i dodać 4,8 ml rIOM2D (Tabela 4). Ponownie zawiesić osad komórkowy.
    7. Przed umieszczeniem organoidów należy usunąć nadmiar EME lub kolagenu z AdDMEM+ z dołków. Następnie dodaj 200 μl organoidów w rIOM2D i 10 μM Y27632 do każdej wstępnie powlekanej studzienki.
    8. Po 4-16 godzinach zebrać pożywkę i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wyrzucić osad.
    9. Przemyć każdą studzienkę 300 μl PBS i dodać 200 μl odwirowanego rIOM2D do każdej studzienki. Zmieniaj rIOM2D co 2-3 dni, zawieszając korzystanie z Y27632.
  3. Reformowanie organoidów 3D z monowarstw 2D
    UWAGA: Monowarstwy hodowane na EME mogą być indukowane do reformowania organoidów 3D, podczas gdy monowarstwy hodowane na kolagenie I nie wracają efektywnie do organoidów 3D. Zwykle 2-3 dołki organoidów wygenerowanych z monowarstw można użyć do wykonania jednej kopuły o objętości 50 μl EME w 5 dniu.
    1. Rozcieńczyć EME w stosunku 1:4 w rIOM2D. Gdy monowarstwy osiągną ~80% konflufluencji, ostrożnie odessać pożywkę i dodać 100 μl rozcieńczonego EME do studzienek zawierających monowarstwy.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 minut. Następnie dodać 100 μl rIOM2D i powrócić do kultury tkankowej, incubator. 3D organoidy zostaną wygenerowane w ciągu 5 dni od dodania rozcieńczonego EME.
    3. Po zreformowaniu się małych organoidów (~ dzień 5) przygotuj rIOM. Zebrać całą zawartość studzienki, pipetować w górę i w dół w celu zakłócenia EME, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Wirować przy 350 x g przez 2 min. Odessać supernatant i pozostałość EME.
    5. Dodać 1 ml zimnego AdDMEM+ i odwirować przy 350 x g przez 2 min. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając ~50 μl pożywki.
    6. Przenieść 50 μl pożywki i organoidów do podwielokrotności EME o pojemności 250 μl. Pipetować w górę i w dół, aby rozprowadzić organoidy w całym EME.
    7. Odpipetować 50 μl kopułek EME do naczynia o średnicy 35 mm i inkubować przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    8. Dodać 2 ml rIOM plus 10 μM Y27632. Zmieniaj podłoże wzrostowe co 2-3 dni. Podczas zmiany nośnika można pominąć Y27632.

6. Manipulacja genetyczna

  1. Transfekcja przejściowa monowarstw 2D
    UWAGA: Przygotować monowarstwy nabłonka jelit szczura zgodnie z sekcją 5.1 w 48-dołkowej płytce. Transfekcja musi być wykonywana przy zbieganiu 70%-80%. Zawsze zastępuj pożywkę w studzienkach 200 μl świeżego rIOM2D przed transfekcją. Obliczyć współczynniki absorbancji plazmidu DNA 260/280 nm i 260/230 nm; Muszą one wynosić powyżej 1,8, aby zapewnić dobre wyniki transfekcji.
    UWAGA: Użyj kontroli plazmidowej, aby obliczyć skuteczność transfekcji. Dla ułatwienia zaleca się plazmid, który koduje białko fluorescencyjne. W tym protokole użyto pLJM1-EGFP27.
    1. Przygotować 1 mg/ml 20 kDa polietyleniminy (PEI; Tabela 3). Dla każdej studzienki przygotować probówkę A (0,6 μg plazmidu + 50 μl zredukowanej pożywki surowicy) i probówkę B (1,8 μl PEI + 50 μl zredukowanej pożywki surowicy). Utrzymuj stosunek DNA:PEI wynoszący 1:3.
    2. Wiruj obie rurki przez 30 s. Połącz rurkę A i rurkę B i ponownie wiruj przez 30 s. W razie potrzeby użyj wirówki, aby odwirować. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Delikatnie dodawaj kroplami kompleks DNA/PEI do monowarstwy 2D. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wyrażenie można zwykle wykryć po 24 godz.
      UWAGA: Jeśli konieczny jest powrót do struktur organoidowych 3D, należy odczekać 48 godzin po transfekcji w celu dodania rozcieńczonego EME.
  2. Transdukcja lentiwirusowa organoidów jelitowych szczurów
    UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy z lentiwirusami należy uzyskać odpowiednie uprawnienia i specjalistyczne szkolenie w instytucji. Podczas pracy z lentiwirusami należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Chociaż nie zostało to tutaj opisane, wysokiej jakości, skoncentrowany lentiwirus jest niezbędny do udanej infekcji organoidów. Protokół ten wykorzystywał pusty wektor pLJM1-EGFP27 do wyrażenia rozpuszczalnego GFP. Ten protokół jest modyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanego protocol28. Skuteczność transdukcji zależy od jakości i stężenia cząsteczek wirusa, skutecznej dysocjacji organoidów w małe klastry komórkowe oraz ekspresji genu. W obliczeniach 5 dni po zakażeniu średnia skuteczność transdukcji przed selekcją wynosiła 19,4% (± 6,5% odchylenia standardowego).
    1. Na 2 dni przed zakażeniem lentiwirusem należy zaplanować przejście (sekcja 3) przez dwie gęste studzienki z 24-dołkową płytką dla każdego lentiwirusa, który będzie transdukowany. Każda studzienka na płytce 24-dołkowej może pomieścić jedną kopułę EME o pojemności 50 μl.
    2. Po zestaleniu się EME dodaj 0,5 ml rIOM uzupełnionego 10 mM nikotynamidu, 10 μM Y27632 i 2,5 μM CHIR99021. Powoduje to duże morfologie sferoidalne, co korzystnie wpływa na skuteczność transdukcji lentiwirusowej. W ciągu 2 dni od posiewu organoidy szczurów powinny być dużymi sferoidami. Jeśli zaobserwuje się znaczne różnicowanie (tj. pączkowanie), należy ponownie pasżować organoidy.
    3. Rozmrozić skoncentrowanego wirusa na lodzie. Przygotować świeże pożywki transdukcyjne, zgodnie z tabelą 3.
    4. Za pomocą końcówki P1000 zwolnij kopułki EME z dna naczynia do hodowli komórkowych do pożywki, pipetując w górę iw dół. Kontynuuj pipetowanie w górę i w dół 20 razy, aby rozbić EME i uwolnić organoidy.
    5. Odpipetować organoidy i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wszystkie studzienki mogą być połączone razem, pod warunkiem że organoidy mają ten sam genotyp i pochodzą z tej samej linii.
    6. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml zimnego AdDMEM+. Zebrać AdDMEM+ i przenieść go do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    7. Za pomocą szklanej pipety Pasteura mechanicznie rozerwać organoidy szczurów. Jest to kluczowy krok, ponieważ celem są małe wielokomórkowe skupiska komórek. Pipeta w górę i w dół ~30 razy. Sprawdź skuteczność zakłócenia pod mikroskopem za pomocą obiektywu 4x. Kontynuuj ten proces, aż zawiesina komórkowa będzie składać się głównie z klastrów komórek, w których pozostanie niewiele organoidów.
      UWAGA: Alternatywnie, organoidy można odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml rekombinowanego enzymu zastępującego konwencjonalną trypsynę/EDTA, wstępnie podgrzanego do 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Inkubować organoidy w substytucie trypsyny przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, z regularnym wirowaniem w celu pobudzenia dysocjacji. Unikaj długotrwałej inkubacji z substytucją trypsyny, ponieważ może to sprzyjać śmierci komórki. Regularnie sprawdzaj skuteczność zakłóceń pod mikroskopem za pomocą obiektywu 4x. Gdy zawiesina składa się głównie z pojedynczych komórek z kilkoma kulturami komórkowymi, rozcieńczyć trypsynę, dodając 4 ml AdDMEM+ i przejść do następnego kroku.
    8. Obracać stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą klastry komórek w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
    9. Zawiesić skupiska komórek w 230 μl pożywki transdukcyjnej na dołek, który ma być zakażony. W przypadku infekcji należy użyć jednego dołka z 48-dołkowej płytki na każdego lentiwirusa.
    10. Umieścić 230 μl zawiesiny komórkowej w każdym dołku na oznakowanej płytce 48-dołkowej. Dodać 20 μl skoncentrowanego wirusa do każdej studzienki. Użyj końcówki P1000, aby wymieszać roztwór wirusa/komórki w każdym dołku i uszczelnić płytkę przezroczystą folią.
    11. Przeprowadzić spinokkulację: odwirować płytkę przy 600 x g przez 1 godzinę w temperaturze 32 °C. Rozszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 6 godzin.
    12. Rozgrzej 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    13. Po inkubacji odpipetować każdy dołek w górę i w dół i przenieść zawartość do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj każdą studzienkę 750 μl AdDMEM+ i przenieś do probówki. Wirować probówki o masie 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    14. Wyjmij probówki z wirówki i przechowuj na lodzie. Użyj końcówki P1000, aby ostrożnie usunąć i prawidłowo zutylizować supernatant.
    15. Zawiesić osad komórkowy w kopułkach EME i płytkach o pojemności 50 μl w podgrzanej płytce 24-dołkowej. Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C, aż do polimeryzacji EME.
    16. Do każdej studzienki dodaj 500 μl rIOM uzupełnionego 10 mM nikotynamidu, 10 μM Y27632 i 2,5 μM CHIR99021.
    17. Wymień pożywkę na rIOM plus 10 μM Y27632 1 dzień po zakażeniu. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni. Jeśli selekcja będzie wykonywana, dodaj selekcję 48-72 h po zakażeniu. Do wyboru puromycyny użyj 2 μg/ml puromycyny.

7. Immunofluorescencyjne barwienie całego wierzchowca organoidów

  1. Odessać pożywkę i dodać 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS-Tween 20 (PBS-T) (Tabela 3) do organoidów w naczyniu do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Uwolnić organoidy z EME, pipetując w górę i w dół. Zebrać organoidy do probówki o pojemności 0,75 ml. Organoidy osiądą na dnie probówki grawitacyjnie w ciągu kilku minut. W razie potrzeby odwirować przy 100 x g przez 1 min.
  3. Za pomocą pipety transferowej usunąć PFA i ponownie zawiesić organoidy w PBS-T. Niech organoidy osiądą na dnie probówki. Usunąć PBS-T i ponownie zawiesić w 200 μl roztworu blokowego (Tabela 3).
  4. Inkubować w temperaturze pokojowej na kołysce lub nutatorze przez 45 minut. Organoidy mogą zbrylać się i osiadać na dnie probówki. Od czasu do czasu przesuwaj probówkę palcem, aby ponownie zawiesić i rozproszyć w roztworze.
  5. Niech organoidy osiądą na dnie probówki. W razie potrzeby odwirować przy 100 x g przez 1 min. Usuń roztwór blokowy.
  6. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w 100 μl roztworu blokowego. Inkubować w temperaturze pokojowej na mieszalniku nutującym przez 45 minut przy 24 obr./min. Stężenia przeciwciał różnią się w zależności od zastosowanego przeciwciała.
    UWAGA: Ten etap można przedłużyć w zależności od przeciwciała pierwszorzędowego, do nocy w temperaturze 4 °C.
  7. Niech organoidy osiądą na dnie probówki. W razie potrzeby odwirować przy 100 x g przez 1 min.
  8. Przemyć PBS-T pięć razy za pomocą pipety transferowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na mieszadle nutującym z prędkością 24 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  9. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:200 i 50 μg/ml 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczone w 100 μl roztworu blokowego. Inkubować w temperaturze pokojowej na mieszalniku nutującym przez 30 minut przy 24 obr./min.
  10. Niech organoidy osiądą na dnie probówki. W razie potrzeby odwirować przy 100 x g przez 1 min. Usuń przeciwciało wtórne. Przemyć pięć razy w PBS-T za pomocą pipety transferowej.
  11. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na mieszadle nutującym z prędkością 24 obr./min. Powtórz krok prania dwukrotnie.
  12. Podczas mycia organoidów podgrzać porcję szczeliwa VALAP (tabela 3) w temperaturze 40–50 °C w celu upłynnienia. Za pomocą pędzla pomaluj cienki kwadrat VALAP na szkiełku mikroskopowym o wielkości mniej więcej szkiełka nakrywkowego. Użyj szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 22 mm nr 1.5 .
  13. Za pomocą nożyczek odetnij koniec końcówki pipety P200. Przenieść organoidy do dołka VALAP na szkiełku. Za pomocą chusteczki higienicznej ostrożnie usuń PBS-T. Nie dopuścić do wyschnięcia organoidów.
  14. Zalej studnię VALAP środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu (Tabela 3). W przypadku kwadratu o wymiarach ~22 mm x 22 mm będzie to wymagało 100-150 μl płynu zapobiegającego blaknięciu.
  15. Organoidy mogą się grupować; w razie potrzeby zamieszaj środek zapobiegający blaknięciu za pomocą końcówki pipety, aby ponownie rozprowadzić organoidy. Montaż za pomocą szkiełka nakrywkowego nr 1,5 o wymiarach 22 mm x 22 mm, bez powstawania pęcherzyków powietrza. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, malując cienką warstwę VALAP na krawędziach.
    UWAGA: W przypadku mikroskopów odwróconych organoidy można również zamontować w czaszy ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.

8. Wywołany przez forskolinę obrzęk organoidów jelitowych szczurów

  1. Hoduj organoidy przez 3-5 dni po pasażowaniu w rIOM. Zaleca się hodowanie organoidów na 24-dołkowej płytce, aby zapewnić łatwe odtworzenie tego samego obszaru. Uchwyć obrazy przed dodaniem forskoliny (T0).
  2. Dodać forskolinę (Tabela 3) bezpośrednio do pożywki organoidowej do końcowego stężenia 10 μM. Dodać taką samą objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) do studzienek kontrolnych.
  3. Obrazuj studzienki kontrolne i leczone forskoliną w regularnych odstępach czasu, co 15-30 minut. Podczas wykonywania badań obrazowych należy przechowywać organoidy w inkubatorze lub stosować system kontrolowanego obrazowania z inkubacją. Maksymalne obrzęki należy zaobserwować po 120 minutach.
  4. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami, aby obliczyć względne pęcznienie na podstawie uzyskanych obrazów29.

Wyniki

Organoidy dwunastnicy i jelita czczego szczura zostały wygenerowane zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 2. Podczas etapów izolacji krypt bardzo ważne jest skuteczne usunięcie kosmków z PBS. Jeśli zbyt wiele kosmków zostanie wysianych do EME wraz z kryptami, może to doprowadzić do obumarcia całej hodowli i uniemożliwić ustanowienie linii organoidów. Z tego powodu pomocne jest izolowanie krypt pod mikroskopem stereoskopowym, co pozwala na wizualne potwierdzenie usunięcia kosmków. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne fragmenty kosmków oraz krypty (Rycina 1A). Należy zwrócić uwagę na znacznie mniejszy rozmiar krypt w porównaniu do kosmków (Rycina 1B). Po wysianiu krypty w ciągu następnych kilku dni przekształcą się w sferoidy, a w dniach 4–7 zaczną pączkować i różnicować się (Rycina 2). Gdy organoidy osiągną etap intensywnego pączkowania, należy je pasażować. Podczas pasażowania ważne jest dostateczne rozbicie organoidów w celu rozdzielenia pączków krypt, co pozwala na zwiększenie liczby organoidów (Rycina 3B).

Skuteczna regeneracja organoidów po zamrożeniu w dużym stopniu zależy od stanu, w którym zostały one zamrożone. Organoidy w silnie proliferacyjnym stanie niedróżnicowanym regenerują się z najwyższą wydajnością. Dlatego zalecamy indukowanie stanu sferycznego i cystycznego zamiast stanu pączkującego i zróżnicowanego. Aby to osiągnąć, można hiperaktywować szlak Wnt poprzez zwiększenie ilości liganda Wnt R-spondin w pożywce oraz poprzez dodanie do pożywki nikotynamidu, który w kilku systemach hodowlanych wykazał działanie wspierające tworzenie organoidów i przeżywalność komórek30,31. Rysunek 3A przedstawia zdrową hodowlę organoidów zaledwie 2 dni po rozmrożeniu. Dodanie BSA do pożywki podczas rozmrażania pomogło również w przeżywalności hodowli organoidów jelitowych szczura, które okazały się bardziej delikatne niż organoidy jelitowe myszy.

Choć hodowla organoidów 3D jest często preferowana, ponieważ odzwierciedla ona pewne elementy naturalnej architektury jelita, sprawia ona, że inne podejścia, w tym obrazowanie na żywo, transfekcje i transdukcje lentiwirusowe, stają się bardziej wymagające technicznie. Zastosowanie monowarstw 2D generowanych z organoidów 3D32 (Rysunek 4) pozwala na bardziej efektywne wprowadzanie plazmidów. Mimo że trójwymiarowe organoidy jelitowe są tradycyjnie oporne na transfekcje przejściowe, plazmidy kodujące EGFP mogą być pomyślnie wprowadzane przy użyciu metod transfekcji opartych na lipidach. Najbardziej efektywne kosztowo podejście z wykorzystaniem PEI opisano w kroku 6.1 (Rysunek 5), jednak elektroporacja i dostępne komercyjnie odczynniki do transfekcji przyniosły również porównywalne wyniki (dane niepokazane). Przyszłe badania skupią się na tym, czy podejścia te mogą być wykorzystane do wprowadzania konstruktów CRISPR do monowarstw.

Kluczowe było umożliwienie ponownego formowania organoidów 3D z monowarstw 2D po transfekcji, aby można było je utrzymywać jako pasażowalną linię z elementami architektury 3D krypt. Co ciekawe, monowarstwy 2D wysiane na EME łatwo przekształcały się z powrotem w małe sferoidy po ponownym dodaniu EME na wierzch komórek, podczas gdy podłoże z kolagenu I nie było wystarczające do odtworzenia struktur 3D (Rysunek 6).

Chociaż transfekcje przejściowe są przydatne w wielu badaniach, często bardziej użyteczne jest tworzenie linii stabilnych, co wymaga wprowadzenia lentiwirusa do komórek. Organoidy jelita szczura zainfekowano lentiwirusem, modyfikując wcześniej opublikowane protokoły (Rysunek 7). Kluczowym krokiem w protokole jest rozbicie organoidów na małe agregaty lub klastry komórkowe. Jeśli kultury nie zostaną skutecznie rozbite i organoidy pozostaną nienaruszone, cząsteczki lentiwirusowe nie dostaną się do wnętrza komórek. Po infekcji organoidy muszą się zregenerować i odrosnąć. Opisany tutaj protokół pozwala na pobranie cząsteczek wirusowych przez 10%-48% (średnia: 19,4% ± 6,5%) komórek przed selekcją.

Barwienie całych organoidów może być utrudnione ze względu na niepełne usunięcie pozostałości EME lub niepełną penetrację przeciwciał. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia skuteczne barwienie organoidów. Wizualizacja organoidów w mikroskopie konfokalnym może być również trudna, jeśli znajdują się one zbyt daleko od szkiełka nakrywki. Dzięki zastosowaniu VALAP tworzy się pewną wysokość w studzience, dzięki czemu organoidy nie są zgniatane przez szkiełko nakrywkowe, a jednocześnie mogą one osiąść blisko szkiełka, co ułatwia obrazowanie. Reprezentatywne barwienie na apikalny anionowy kanał regulator przewodnictwa błony komórkowej w mukowiscydozie (CFTR) oraz faloidyną w celu oznakowania aktyny F przedstawiono na Rysunku 8.

Wreszcie organoidy znajdują zastosowanie w testach funkcjonalnych. Organoidy pochodzące od pacjentów z mukowiscydozą były wykorzystywane do badania funkcji białka CFTR, ponieważ opracowanie z agonistą cAMP, forskoliną, indukuje silną zależną od CFTR sekrecję płynu, co prowadzi do obrzęku organoidu29,33-37. Jednym z celów niniejszej pracy było zidentyfikowanie i opracowanie modelu organoidów, który mógłby być stosowany równolegle z badaniami przedklinicznymi in vivo. W związku z tym dążyliśmy do ustalenia, czy jelitowe organoidy szczura ulegają obrzękowi indukowanemu forskoliną. Rzeczywiście, w ciągu 30 min od podania forskoliny organoidy szczura spęczniały, a maksymalny efekt zaobserwowano po 120 min (Rycina 9).

Zdjęcia mikroskopowe komórek (A) wskazujące na oddziaływanie i (B) pokazujące izolowany organizm, z zaznaczonymi strzałkami.
Rycina 1: Fragmenty kosmków i krypt podczas izolacji nabłonka. (A) Reprezentatywne zdjęcie fragmentów kosmków w roztworze EDTA podczas protokołu izolacji krypt. Żółte groty strzałek zaznaczają fragmenty kosmków. Czerwone strzałki przedstawiają krypty przytwierdzone do fragmentu kosmka. Zwróć uwagę na różnicę w względnych rozmiarach. (B) Zdjęcie pojedynczej krypty (czerwona strzałka) przy większym powiększeniu, umożliwiające wizualizację morfologii. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost organoidów w ciągu 7 dni; obrazy mikroskopowe, różnicowanie komórek, hodowla 3D, badanie biologiczne.
Rycina 2: Progresja organoidów jelita szczura. Krypty jelita czczego szczura zostały wysiane w EME bezpośrednio po izolacji (A,B). W ciągu 2 dni krypty przekształciły się w sferoidy (C,D). Do 5. dnia zaczęły formować pączki krypt (E,F), które rozwijały się i rosły do 7. dnia (G). Paski skali: 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia kultur komórkowych wykazująca wzrost organoidów, porównanie 2 dni po rozmrożeniu i po pasażowaniu.
Rysunek 3: Organoidy po rozmrożeniu i pasażowaniu. (A) Organoidy jelita czczego szczura po rozmrożeniu zgodnie z opisanymi protokołami po kriotransporcie. Zwróć uwagę na obecność zarówno sferoidów, jak i organoidów z pączkowaniem zaledwie 2 dni po rozmrożeniu. (B) Ta sama linia organoidów przedstawiona w A bezpośrednio po pasażowaniu zgodnie z opisanym protokołem. Zwróć uwagę na względną różnicę w wielkości struktur w A i B oraz obecność pojedynczych domen przypominających krypty w B. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces wzrostu komórek w EME i Kolagenie I; obraz mikroskopowy kultur po 24 h, 48 h i 5 dniach.
Rysunek 4: Tworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy z trójwymiarowych (3D) organoidów. (A-C) Postęp tworzenia monowarstwy 2D na EME. (D-F) Postęp tworzenia monowarstwy 2D na kolagenie I. W 5. dniu w każdym wariancie osiągnięto konfluencję na poziomie ~80%. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące ekspresję pLJM1-EGFP w hodowlach komórkowych, analiza emisji.
Rycina 5: Przejściowa transfekcja monowarstwy 2D. Reprezentatywny obraz monowarstwy 2D hodowanej na EME, poddanej przejściowej transfekcji plazmidem pLJM1-EGFP przy użyciu PEI. (A) pole jasne, (B) fluorescencja (GFP), (C) nałożenie obrazów. Czerwona przerywana linia oznacza granicę monowarstwy. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy struktur komórkowych w EME i Kolagenie I, podkreślający morfologię tkanki.
Rysunek 6: Ponowne formowanie organoidów 3D z monowarstw 2D na EME. (A) Powstawanie organoidów 3D z monowarstw 2D hodowanych na EME. Organoidy uformowały się efektywnie w ciągu 5 dni po dodaniu EME na powierzchnię apikalną monowarstwy. Zwróć uwagę na obfitość martwych komórek otaczających małe sferoidy 3D. (B) Przetrwanie monowarstw 2D 5 dni po dodaniu kolagenu I na powierzchnię apikalną monowarstw 2D hodowanych na kolagenie I. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ekspresja jądrowego GFP, obrazy z mikroskopii konfokalnej, badanie lokalizacji komórkowej, zielona fluorescencja.
Rycina 7: Infekcja lentiwirusem organoidów 3D. Organoidy jelita czczo szczura zostały zainfekowane lentiwirusem z jądrowym GFP zgodnie z opisanym protokołem. Po regeneracji i wzroście przez 5 dni organoidy utrwalono i przebarwiono DAPI. (A) DAPI: szary; nuclearGFP: zielony. (B) nuclearGFP: zielony. Czerwona przerywana linia wyznacza granicę organoidu. Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające barwienie CFTR i faloidyną struktur komórkowych.
Rycina 8: Immunofluorescencja całych preparatów organoidów jelitowych szczura. (A) CFTR, (B) faloidyna oraz (C) nałożone obrazy immunofluorescencji całych preparatów organoidów jelita cienkiego (ciśniej) szczura. Zwróć uwagę na apikalne wzbogacenie barwienia CFTR w organoidach (szary kolor w A, magenta w C). Faloidyna znakuje aktynę F i wyraźnie barwi apikalne rąbka szczoteczkowe (szary kolor w B, cyjan w C). Paski skali: 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii poklatkowej wzrostu komórek w ciągu 120 minut; analiza dynamiki proliferacji.
Rycina 9: Organoidy jelitowe szczura pęcznieją po stymulacji forskoliną. Reprezentatywny przebieg czasowy pęcznienia organoidu jelitowego szczura po dodaniu agonisty cAMP, forskoliny. Czas 0 min reprezentuje punkt czasowy bezpośrednio przed dodaniem 10 µM forskoliny. Obrazy przedstawiają ten sam organoid w odstępach 30 min. Maksymalne pęcznienie zaobserwowano w 120 min po dodaniu forskoliny. Czerwona przerywana linia wyznacza granicę organoidu. Ciemny materiał w środku światła organoidu składa się z martwych komórek. Paski skali: 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1: Skład pożywki AdDMEM+. Składniki do przygotowania standardowej pożywki AdDMEM+, która stanowi pożywkę podstawową we wszystkich opisanych tutaj metodach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Skład pożywki do organoidów jelitowych szczura (rIOM). Szczegółowy skład standardowej pożywki do organoidów jelitowych szczura, obejmujący rozpuszczalnik oraz warunki przechowywania białek rekombinowanych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Roztwory. Przepisy i instrukcje przygotowania pozostałych roztworów stosowanych w protokole. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4. Pożywka do organoidów jelita szczura dla hodowli monowarstw 2D (rIOM2D). Zmodyfikowany skład pożywek do hodowli organoidów, zoptymalizowany pod kątem wzrostu monowarstw w 2D. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opracowanie modelu organoidów jelitowych szczura pozwala zachować ważne cechy funkcjonalne występujące w narządzie in vivo i jest obiecującym narzędziem do badań przedklinicznych, badań przesiewowych leków i testów funkcjonalnych. Ten model in vitro może być stosowany równolegle z przedklinicznymi badaniami gastroenterologicznymi in vivo , w których szczury są często preferowanym modelem ze względu na większy rozmiar jelita, wspólne aspekty fizjologiczne z ludźmi, a w niektórych przypadkach są lepszymi modelami choroby38. W tym miejscu przedstawiono solidny protokół krok po kroku dotyczący izolacji krypt jelitowych szczurów, generowania i długotrwałej hodowli organoidów jelitowych szczurów, a także dalszych zastosowań, w tym funkcjonalnych testów obrzęku forskoliny, immunofluorescencji całej góry, hodowli jednowarstwowej 2D i manipulacji genetycznych lentiwirusów. Organoidy jelitowe szczurów mogą być istotne w wielu kontekstach chorobowych, w których patofizjologia modeli mysich jest nieodpowiednia i mogą stanowić lepszy model fizjologii jelit człowieka w porównaniu z organoidami jelitowymi myszy.

Aby stworzyć długowieczne kultury organoidów, które mogą być pasażowane i namnażane, konieczne jest zidentyfikowanie kluczowych czynników wzrostu wymaganych do utrzymania proliferacji nabłonka jelitowego. Organoidy myszy są najczęściej hodowane w prostym koktajlu EGF, R-spondyny i Noggin, chociaż doniesiono, że Noggin nie jest niezbędny do hodowli organoidów jelitowych39. Kondycjonowane pożywki mogą zastąpić rekombinowane czynniki wzrostu, a najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi są L-WRN, który wydziela komórki Wnt3a, Rspondin-3 i Noggin39, L-Wnt3a i HA-Rspondin1-Fc 293T40. Pożywka kondycjonowana L-WRN jest wystarczająca do wspierania nie tylko wzrostu organoidów39 w jelicie myszy, ale także wzrostu organoidów jelitowych od kilku zwierząt gospodarskich i towarzyszących, w tym psów, kotów, kurczaków, koni, krów, owiec i świń12. Jednak ludzkie organoidy jelitowe bardzo różnią się pod względem wymagań dotyczących czynników wzrostu, ponieważ wymagają odrębnych preparatów pożywek dla ich fazy wzrostu ekspansji (tj. progresji od małych do dużych sferoidów) w porównaniu z fazą różnicowania (tj. wytwarzaniem i dojrzewaniem zróżnicowanych typów komórek)10. Wymagania dotyczące pożywek organoidów jelitowych szczurów ściśle odzwierciedlają wymagania pożywki ekspansywnej dla organoidów jelitowych ludzkich, ale w szczególności organoidy szczurów są zdolne zarówno do wzrostu, jak i różnicowania w tym środowisku pożywki, co znacznie upraszcza ich wymagania dotyczące hodowli. Podczas gdy nasze początkowe próby koncentrowały się na ustaleniu i hodowli organoidów jelitowych szczurów w pożywkach kondycjonowanych L-WRN, długoterminowa hodowla była wątła, a linie organoidów jelitowych szczurów cierpiały na brak odporności (dane nie pokazane). Może to być spowodowane tym, że linie komórkowe L-WRN są zmodyfikowane do wydzielania R-spondyny 3, podczas gdy zalecana tutaj linia komórkowa 293T-Rspo1 jest zmodyfikowana do wydzielania R-spondyny 1. Możliwe, że organoidy szczurów i ludzi preferują R-spondynę 1, co może odpowiadać za niewydolność linii organoidowych szczurów w pożywkach kondycjonowanych L-WRN.

Aby jak najdokładniej podsumować warunki in vivo , ważne jest opracowanie warunków hodowli organoidów, które pozwalają na przeżycie, utrzymanie i proliferację komórek macierzystych, a także mogą utrzymać obrót komórkowy i jednoczesne różnicowanie się w odrębne typy komórek. W związku z tym stężenia białek rekombinowanych i/lub białek w kondycjonowanych pożywkach muszą być ściśle miareczkowane i kontrolowane, aby osiągnąć tę idealną równowagę. W szczególności optymalne poziomy Wnt są niezbędne, aby uniknąć utraty kultur organoidów jelitowych. Zbyt mała ilość Wnt w kondycjonowanych pożywkach nie będzie w stanie wspierać wzrostu, co prowadzi do utraty komórek macierzystych, a następnie śmierci organoidów; nadmierna aktywacja Wnt spowoduje, że organoidy będą torbielowate i niezróżnicowane10. Chociaż nie jest to tutaj wyszczególnione, zdecydowanie zaleca się przetestowanie każdej partii pożywek kondycjonowanych L-Wnt3a i 293T-Rspo1 za pomocą testu lucyferazy reporterowej Wnt, takiego jak linia komórkowa Topflash41. Wcześniejsze badania opisywały, że optymalna partia pożywek L-Wnt3a powinna skutkować 15-krotnym wzrostem sygnału przy 12,5% i 300-krotnym wzrostem sygnału przy 50%, w porównaniu do 1% L-Wnt3a10. Ponieważ organoidy szczurów są bardziej wrażliwe niż organoidy myszy na wymagania hodowlane, w szczególności poziomy aktywacji Wnt, te dodatkowe etapy kontroli jakości znacznie pomagają w ułatwieniu solidności i niezawodności kultur organoidów szczurów. Ponieważ podobna linia reporterowa nie jest dostępna do testowania aktywności Bmp i względnych stężeń Noggin w pożywkach kondycjonowanych przez Noggin, zaleca się stosowanie rekombinowanego Noggin, gdy tylko jest to możliwe, w celu precyzyjnej kontroli poziomów Noggin. Podczas gdy organoidy jelitowe myszy mogą być hodowane i utrzymywane pod nieobecność Noggin39, nie próbowano tego robić w przypadku kultur organoidów jelitowych szczurów.

Poza wymaganiami dotyczącymi hodowli komórkowych, pomyślne początkowe ustanowienie linii organoidów szczurów zależy w decydującym stopniu od skutecznego zubożenia zróżnicowanych kosmków podczas izolacji krypty. Wysoki poziom zanieczyszczenia villarem powoduje śmierć krypt, przypuszczalnie z powodu sygnałów z umierających komórek lub sekwestracji istotnych czynników. Aby precyzyjnie i konsekwentnie zubożyć te zróżnicowane kosmki z preparatów nabłonkowych, zaleca się wykonanie izolacji nabłonka za pomocą stereoskopu. Oględziny uwalnianego nabłonka dostarczają wyraźnej wskazówki, kiedy należy wyrzucić PBS i wymienić go na inną stronę (ryc. 1). Krypt nie należy zbierać, dopóki nie nastąpi wystarczające wyczerpanie kosmków. Komórki Villar są nieuleczalnie zróżnicowane i nie mogą wytwarzać organoidów w hodowli. Dodatkowo, późniejsze pasażowanie organoidów jelitowych szczurów i ich wykorzystanie do wszelkich dalszych zastosowań wymaga delikatnej pielęgnacji. Inkubacja w odczynnikach dysocjacyjnych przez dłuższy czas (10 minut) powoduje znaczną śmierć komórki i utratę linii organoidowej.

Tutaj opisano prosty i szybki protokół generowania monowarstw jelitowych z organoidów szczurów. Substraty EME i kolagenu I mają różny wpływ na nabłonek, który można wykorzystać w zależności od celu badania. EME pozwala na szybką i wydajną adhezję pojedynczych komórek oraz tworzenie wypustek komórkowych. Natomiast pokrycie powierzchni kolagenem I opóźnia te procesy. Gdy monowarstwy osiągną około 80% konfluencji, komórki wyhodowane na EME zaczynają ponownie generować struktury organoidowe 3D. Brakuje im jednak wystarczającego fizycznego i chemicznego wsparcia dla dalszego wzrostu. Temu powrotowi do stanu organoidów można zapobiec, utrzymując monowarstwy w EME na poziomie 50%-80%. Dodanie rozcieńczonego EME do wierzchołkowej powierzchni monowarstw sprzyja szybkiemu odzyskiwaniu i tworzeniu organoidów de novo, generując obszary konwergencji szybciej i łatwiej. Na powierzchni kolagenu I komórki mogą tworzyć jednolitą monowarstwę i generować małe skupiska. Jednak dodanie kolagenu I do monowarstw nie jest wystarczające do wywołania tworzenia organoidów. EME należy rozcieńczyć podczas dodawania do powierzchni jednowarstwowej, ponieważ powstający organoid będzie musiał pokonać większy opór mechaniczny. Jednak ten rozcieńczony EME nie pozwala na solidne tworzenie dużych organoidów. Wszelkie organoidy szczurów wytworzone de novo, które w naturalny sposób odrywają się od powierzchni, muszą zostać natychmiast usunięte i przeniesione do nierozcieńczonego EME, aby można było przywrócić wsparcie strukturalne i wzrost. Ze względu na mały rozmiar organoidów na tym etapie, nie zaleca się przechodzenia organoidów, dopóki nie zostanie ustalony silny wzrost. Biologiczne znaczenie tego, dlaczego EME może wspierać reformację organoidów, ale nie jest jasne, czy kolagen I może, czy nie. Istnieją jednak doniesienia, że komórki wyhodowane w kolagenie 3D nie mogą tworzyć pączkujących organoidów42,43 ani wspierać długotrwałej konserwacji. Dostępne na rynku produkty EME to niejednorodne mieszaniny białek zewnątrzkomórkowych, głównie lamininy i kolagenu IV44. Dlatego wyraźny skład białek i zdolność komórki nabłonkowej do angażowania się w macierz zewnątrzkomórkową przy użyciu różnych kompleksów komórkowych może pozwolić na przebudowę w EME, ale nie w kolagenie I. Nie przetestowano, czy monowarstwy kolagenu pochodzące z I można umieścić w EME w celu wspierania tworzenia i wzrostu organoidów.

Opisano tutaj manipulację genetyczną modelu organoidów jelitowych szczura oraz przedstawiono protokoły transdukcji lentiwirusowej organoidów 3D i transfekcji przejściowej monowarstw 2D. Aby przezwyciężyć niską skuteczność transdukcji organoidów lentiwirusowych, opracowano protokół przejściowej transfekcji monowarstw 2D. Płaska morfologia i odsłonięte domeny wierzchołkowe monowarstw zapewniają łatwiejszy dostęp do wirusów i kompleksów zawierających DNA. Do walidacji tej techniki wykorzystano ekspresję reportera EGFP przy użyciu wektora pLJM1-EGFP. Ekspresję reporterową GFP obserwowano po 24 godzinach i utrzymywała się ona przez 5-6 dni w monowarstwach. Przyszłe badania koncentrujące się na transdukcji lentiwirusowej monowarstw prawdopodobnie będą miały wyższą skuteczność niż transdukcja organoidów 3D. Korzystając z powyższych protokołów, organoidy 3D mogą być reformowane z zainfekowanych monowarstw 2D, aby ułatwić tworzenie stabilnych linii. Przy zachowaniu ostrożności linie organoidów jelitowych szczurów mogą być z powodzeniem utrzymywane przez ponad rok, pozostając stabilne przez wiele pasaży, kriokonserwowane, pomyślnie rozmrażane i genetycznie modyfikowane za pomocą transdukcji lentiwirusowej, zaspokajając w ten sposób potrzebę dostępnego i wykonalnego modelu organoidów jelitowych in vitro , który zachowuje fizjologiczne znaczenie dla ludzi.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratoriów Sumigray i Ameen za ich wnikliwe dyskusje. Praca ta była wspierana przez grant na zdrowie dzieci Fundacji Charlesa H. Hooda oraz grant Fundacji Mukowiscydozy (004741P222) dla KS oraz przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health dla NA pod numerem nagrody 2R01DK077065-12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Macierz do hodowli 3D Kolagen szczurzy ICultrex/R& D Systems3447-020-01
70 &mikro; m Sitko komórkoweCorning/Falcon352350
Advanced DMEM/F12Gibco/Thermo Fisher12634010
Amfoterycyna BSigma AldrichA2942-20ML
B-27 Suplement (50X), bez surowicyThermo Fisher17504044
CHIR99021Cayman Chemical13122
CryoStor100-1061
Cultrex HA-Rspondin1-Fc Komórki 293TR & D Systems3710-001-01
FBSGibco/Thermo Fisher16-000-044
Gastrin I (człowiek)Sigma AldrichG9145
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekTechnologie komórek macierzystych100-0485
GlutamaxThermo Fisher35-050-061
Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu, bez czerwieni fenoluCorning
HEPESAmericanBioAB06021
LanolinaBeantown Chemical144255-250G
L-glutaminaGibco/Thermo FisherA2916801
komórki L-Wnt3aATCCCRL-2647
Suplement N-2 (100X)Thermo Fisher17502-048
N-acetylocysteinaSigma AldrichA9165-5G
Amid kwasu nikotynowego Sigma AldrichN0636
Opti-MEM I Zredukowana Surowica MediumGibco/Thermo Fisher31985070
ParaffinFisher ScientificP31-500
ParafilmSigma AldrichP7793przezroczysta folia
PBSThermo Fisher10010023
Penicylina/StreptomycynaGibco/Thermo Fisher
pLJM1-EGFPAddgene19319
PolybreneMilliporeTR-1003-G
Chlorowodorek polietyleniniminy (PEI)Sigma Aldrich764965
p-fenylenodiamina Acros Organics/Thermo Fisher417481000
PuromycinVWRJ593-25mg
Rekombinowane ludzkie białko FGF2Peprotech100-18B-250ug
Rekombinowane ludzkie białko IGF-1BiolegendB356441
Rekombinowane ludzkie białko NogginR & D Systems6057-NG-100
Rekombinowane mysie białko EGFThermo FisherPMG8041
Sprague Dawley ratCharles River LaboratoriesSzczep 001
Triton X-100American BioanalyticalAB02025-00500
TrypLE Express EnzymeGibco/Thermo Fisher12604013
dichlorowodorekY27632Sigma AldrichY0503
Technologie komórek macierzystych35623115140122

Bibliografia

  1. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Yin, Y. -B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143(2019).
  4. Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517(2018).
  5. Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282(2021).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
  8. Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).
  9. Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).
  11. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  12. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  13. Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
  14. Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
  15. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  16. Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
  17. Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
  18. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
  19. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  20. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  21. Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
  22. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  23. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  24. Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614(2020).
  25. How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023).
  26. How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL. , Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023).
  27. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  28. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).
  29. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).
  30. Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351(2022).
  31. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  32. Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
  33. Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
  34. deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
  35. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112(2013).
  36. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  37. van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379(2019).
  38. Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
  39. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  40. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  41. Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
  42. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814(2014).
  43. Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
  44. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla organoidówmanipulacje genetycznetransdukcja lentiwirusowaizolacja krypt jelitowychmonowarstwy organoidowebarwienie całych preparatówfunkcyjny test pęcznieniaorganoidy dwunastnicy i jelita czczegodecyzje o losach komórek
Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.