Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W eksperymentalnych badaniach nad udarem, okluzja tętnicy środkowej mózgu (MCAO) z włóknem wewnątrzświetlnym jest szeroko stosowana do modelowania udaru niedokrwiennego u myszy. Model MCAO z włóknami zazwyczaj wykazuje masywny zawał mózgu u myszy C57Bl / 6, który czasami obejmuje tkankę mózgową na terytorium zaopatrywanym przez tylną tętnicę mózgową, co jest w dużej mierze spowodowane dużą częstością występowania atrezji tętnicy łączącej się z tyłu. Zjawisko to jest uważane za główny czynnik przyczyniający się do wysokiej śmiertelności obserwowanej u myszy C57Bl / 6 podczas długotrwałej rekonwalescencji po udarze po włóknistym MCAO. W związku z tym wiele badań nad przewlekłym udarem mózgu wykorzystuje dystalne modele MCAO. Jednak modele te zwykle powodują zawał tylko w obszarze kory mózgowej, a co za tym idzie, ocena deficytów neurologicznych po udarze może być wyzwaniem. W badaniu tym ustalono zmodyfikowany przezczaszkowy model MCAO, w którym MCA na tułowiu jest częściowo zamknięty na stałe lub przejściowo przez małe okienko czaszkowe. Ponieważ lokalizacja okluzji jest stosunkowo proksymalna do początku MCA, model ten generuje uszkodzenie mózgu zarówno w korze, jak i prążkowiu. Obszerna charakterystyka tego modelu wykazała doskonały wskaźnik długoterminowego przeżycia, nawet u starszych myszy, a także łatwo wykrywalne deficyty neurologiczne. W związku z tym opisany tutaj mysi model MCAO stanowi cenne narzędzie do eksperymentalnych badań nad udarem.
Wprowadzenie
Prawie 800 000 osób rocznie doznaje udaru w USA, a większość z tych udarów ma charakter niedokrwienny1. Terminowe przywrócenie przepływu krwi w mózgu za pomocą tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) i/lub trombektomii jest obecnie najskuteczniejszym sposobem leczenia pacjentów po udarze; Jednak pełne przywrócenie funkcji neurologicznych w długim okresie jest rzadkie2,3. W związku z tym poszukiwanie nowatorskiej terapii udaru mózgu, która ma na celu poprawę funkcjonalną, jest intensywnym obszarem badań, który wymaga klinicznie istotnych zwierzęcych modeli udaru.
Najczęstszy model udaru niedokrwiennego u gryzoni wykorzystuje śródświetlne zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO) do wywołania udaru. W tym modelu, pierwotnie opracowanym przez Zea Longa w 1989 roku, nylonowe włókno jest wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) w celu zablokowania przepływu krwi do tętnicy środkowej mózgu (MCA)4. Model ten ma jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, gdy włókno zostanie wprowadzone do ICA, przepływ krwi do tylnej tętnicy mózgowej (PCA) może być również częściowo zablokowany, szczególnie u myszy. Co ważne, tętnica łącząca się tylna (PcomA), mała tętnica, która łączy przednie i tylne krążenie mózgowe, jest często słabo rozwinięta w niektórych szczepach myszy, takich jak C57Bl/6, szczep stosowany głównie w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Uważa się, że ta drożność PcomA przyczynia się do zmienności wielkości zmiany u myszy po udarze5. Rzeczywiście, gdy przepływ krwi do PCA gwałtownie spada podczas MCAO, a PcomA nie jest w stanie zapewnić wystarczającego przepływu krwi pobocznej, zawał udaru może rozszerzyć się na terytorium PCA. Co więcej, w tym modelu długi czas trwania niedokrwienia prowadzi do większego prawdopodobieństwa śmiertelności u myszy. W związku z tym u myszy zwykle stosuje się krótki czas trwania MCAO wynoszący 30-60 minut. Jednak większość pacjentów po udarze doświadcza kilkugodzinnego niedokrwienia przed leczeniem reperfuzyjnym. W związku z tym mysi model udaru mózgu z wydłużonym czasem trwania niedokrwienia ma duże znaczenie kliniczne.
Ogólnym celem tej procedury jest modelowanie udaru niedokrwiennego u myszy z zawałem średniej wielkości i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Ten przezczaszkowy model MCAO odnosi się do krytycznych atrybutów klinicznego udaru, ponieważ można przeprowadzić przedłużone niedokrwienie, a starsze myszy dobrze tolerują ten model, co pozwala na długoterminową ocenę powrotu do sprawności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane w tej pracy są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach, a protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Duke'a (IACUC). W niniejszym badaniu wykorzystano młode (8-10 tygodni) i w podeszłym wieku (22 miesiące) samce myszy C57Bl/6. Przegląd tego protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie chirurgiczne
- Zbadaj mysz pod kątem poważnych nieprawidłowości i deficytów behawioralnych.
UWAGA: Przed zabiegiem ważne jest, aby chirurdzy nosili odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym maskę chirurgiczną, czepek, rękawiczki i fartuch. - Zważ mysz; zaprogramuj wentylator (patrz Tabela materiałów) w oparciu o masę ciała.
- Umieść mysz w pudełku indukcyjnym anestezjologicznym o wymiarach 4 cale x 4 cale x 7 cali. Włącz przepływomierz tlenu (patrz Tabela materiałów) ustawiony na 30 i przepływomierz podtlenku azotu ustawiony na 70. Włącz waporyzator z 5% izofluranem.
- Wprowadzić przewód doprowadzający do cewnika dożylnego (IV) 20 G.
- Wyjmij mysz z pudełka indukcyjnego, gdy jej częstość oddechów zmniejszy się do 30-40 oddechów na minutę.
- Połóż mysz na stole operacyjnym w pozycji leżącej. Wyciągnij język myszy i przytrzymaj go palcami lewej ręki. Włóż laryngoskop (patrz Tabela materiałów) do pyska zwierzęcia, aby uwidocznić strunę głosową.
- Ustabilizuj podbródek myszy na laryngoskopie za pomocą prawego środkowego palca. Uwolnij lewą rękę, aby przytrzymać cewnik dożylny 20 G.
- Lekko włóż prowadnik do strun głosowych, a następnie powoli wepchnij cewnik dożylny 20 G do tchawicy, aż skrzydełkowa część cewnika zrówna się z końcówką nosa.
UWAGA: Jeśli mysz się porusza, nie wkładaj przewodu. Może to spowodować uraz tchawicy i krwawienie. - Włącz respirator (patrz Tabela materiałów) i podłącz go do cewnika dożylnego 20 G zaintubowanego w myszy. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5% i upewnić się, że oba płuca są wentylowane mechanicznie.
UWAGA: Nie należy zapominać o zmniejszeniu stężenia izofluranu. W przeciwnym razie mysz otrzyma przedawkowanie znieczulenia. - Nałożyć maść na oczy na oba oczy i wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu.
- Trzymaj mysz w pozycji bocznej z prawym obszarem skroniowym skierowanym do góry. Utrzymuj temperaturę w odbycie na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej (35 °C) i lampy grzewczej sterowanej regulatorem temperatury (patrz Tabela materiałów).
- Ogol powierzchnię między prawym okiem a uchem i zdezynfekuj obszar operacyjny co najmniej trzy razy wacikami jodowymi i nasączonymi alkoholem.
2. Operacja MCAO
- Otwórz sterylne opakowanie narzędzi do operacji MCAO. Nosić sterylne rękawiczki i wykonać 1 cm nacięcie skóry między prawym okiem a prawym uchem za pomocą nożyczek chirurgicznych.
UWAGA: Monitoruj kolor skóry, temperaturę ciała i reakcję na szczypanie palców u nóg co 15 minut. - Wypreparuj leżącą pod spodem powięź za pomocą kleszczy, aby odsłonić mięśnie skroniowe i żwacze.
UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić ślinianki przyusznej. - Użyj kleszczy, aby dotknąć dolnej części mięśnia skroniowego i wykryć położenie łuku jarzmowego. Ostrożnie odciągnij na bok gałęzie nerwu twarzowego.
- Użyj końcówki wysokotemperaturowej pętli kauterycznej (patrz tabela materiałów), aby wyciąć 5 mm poprzeczne nacięcie na mięśniu skroniowym.
- Użyj dwóch kleszczy, aby wypreparować leżący pod spodem łuk jarzmowy i odsłonić staw między szczęką a kośćmi jarzmowymi.
- Za pomocą nożyczek odetnij 3 mm część łuku jarzmowego i usuń go. Oddziel mięsień żwaczy od podstawy czaszki.
UWAGA: Uważaj, aby nie złamać zatoki zaoczodołowej i powierzchownej żyły skroniowej. - Zastosuj cztery małe zwijacze ustawione w różnych kierunkach, aby odsłonić podstawę czaszki czaszki, z gałęziami nerwu trójdzielnego ciągniętymi na boki przez jeden zwijacz.
UWAGA: Bruzda na zewnętrznej powierzchni podstawy czaszki oznacza położenie bocznej szczeliny między płatem czołowym a skroniowym. MCA leży tutaj (Rysunek 2A), a jego pień i gałęzie są widoczne przez cienką, przezroczystą czaszkę (Rysunek 2B). Związek tej tętnicy z innymi głównymi tętnicami mózgowymi jest pokazany w Rysunek 2A. - Nałóż kroplę 0,9% soli fizjologicznej na czaszkę powyżej tułowia MCA i proksymalnie do gałęzi kory nosa. Użyj szlifierki elektrycznej, aby rozrzedzić czaszkę, aż widoczne będzie małe pęknięcie.
UWAGA: Nie dociskaj młynka do czaszki, ponieważ może on przebić czaszkę i uszkodzić leżącą poniżej tętnicę. - Użyj czubka kleszczy, aby podnieść przerzedzoną czaszkę i usunąć ją. W przypadku myszy pozorowanych zatrzymaj się tutaj i nie podwiązuj tętnicy.
UWAGA: Powstaje małe prostokątne okno w poprzek pnia MCA. - Umieść jednożyłową pętlę z czarnego plecionego jedwabiu na wierzchu MCA (Rysunek 2C). Wstaw 8-0 igła mikrochirurgiczna do podniesienia tułowia MCA i zawiązać szew (patrz Tabela materiałów) pod igłą, pozostawiając oba końce igły na górze węzła pętli z nici jedwabnej (Rysunek 2D).
- W przypadku przejściowego MCAO, lekko zaciśnij węzeł jedwabnej nici pod igłą, aby zablokować przepływ krwi tętniczej (Rysunek 2E), reprezentując początek MCAO.
- Użyj kleszczy, aby przytrzymać szew i powoli wyjmij igłę pod koniec niedokrwienia (np. 60 minut lub dłużej).
UWAGA: Po usunięciu igły węzeł jedwabnej nici jest zsuwany z MCA, a mózg jest reperfundowany (Rysunek 2F). - W przypadku trwałego MCAO mocno zaciśnij pętlę z jedwabnej nici wokół tętnicy i wyjmij igłę. Wytnij i usuń nadmiar materiałów do szycia.
- Nanieść kroplę 0,25% bupiwakainy na nacięcie skóry i zszyć mięsień i skórę oddzielnie za pomocą nylonowych szwów 6-0 z przerwami (patrz tabela materiałów). Nałóż maść z antybiotykiem na powierzchnię nacięcia skóry.
UWAGA: Nacięcie skóry można również zamknąć sterylnymi zszywkami lub klejem.
3. Opieka pooperacyjna
- Wyłącz izofluran, aby obudzić mysz. Odłącz respirator, gdy spontaniczny oddech zostanie przywrócony.
- Przenieś mysz do komory odzyskiwania (patrz tabela materiałów) o kontrolowanej temperaturze.
- Ekstubuj mysz, gdy przywróci się jej odruch prostowania lub zacznie się poruszać.
- Uważnie monitoruj mysz w komorze o kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Wróć do klatki domowej po odzyskaniu pełnej przytomności (okres rekonwalescencji ~2 godziny). Karprofen należy podawać w dawce 5 mg/kg mc. podskórnie przez 3 dni.
4. Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI)
- Sześć i 24 godziny po MCAO, zamontuj znieczuloną mysz na ramie stereotaktycznej. Ogol czubek głowy i wyczyść go trzema naprzemiennymi wacikami z jodem i alkoholem.
UWAGA: Znieczulenie przeprowadzono zgodnie z opisem w kroku 1.3. LSCI jest również wykonywany przed MCAO. - Wykonaj 3-centymetrowe nacięcie skóry w linii środkowej i wypreparuj skórę z czaszki. Zastosuj cztery małe zwijacze igłowe, aby odsłonić wierzch czaszki.
- Przesuń laserową kamerę plamkową (patrz Tabela materiałów) nad głowę i wyreguluj ostrość kamery. Wyobraź sobie przepływ krwi w mózgu.
5. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)
- Głęboko znieczulij mysz 5% izofluranem pod koniec eksperymentu, zwykle w 1, 3 lub 28 dniu po udarze. Uszczypnij ogon, aby upewnić się, że nie ma reakcji bólowej.
- Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych i zbierz mózg. Inkubuj mózg w lodowatej soli fizjologicznej przez 20 minut.
- Umieść mózg w matrycy krajalnicy mózgu na lodzie i upuść zimną sól fizjologiczną na mózg. Pokrój mózg na plastry o grubości 1 mm za pomocą cienkich żyletek.
- Zanurz plastry mózgu w tej samej orientacji w naczyniu z 2% roztworem TTC (patrz Tabela Materiałów). Przechowywać naczynie w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 min.
UWAGA: Normalna tkanka mózgowa staje się czerwona, a tkanka niedokrwienna pozostaje biała. - Przenieś plastry mózgu do 10% formaliny na 24 godziny utrwalenia. Wyobraź sobie wycinki mózgu i zmierz obszar zawału.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki bezpośredniej obserwacji pod mikroskopem chirurgicznym można wizualnie potwierdzić zablokowanie przepływu krwi w MCA podczas niedokrwienia. Nasze poprzednie badanie wykazało >80% redukcji przepływu krwi w obszarze niedokrwiennym przy użyciu monitora laserowego Dopplera6. W celu określenia zmian przepływu krwi po MCAO można zastosować LSCI, aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenie niedokrwienne i reperfuzję (Rycina 1). Rzeczywiście, na Rycin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pierwszy przezczaszkowy model okluzji MCA został opracowany u szczurów w 1981 roku11,12 i zastąpiony przez model MCAO bez kraniektomii w 1989 roku4. Początkowa przezczaszkowa okluzja MCA miała szerokie pole operacyjne, tak że cały łuk jarzmowy został usunięty, a mięśnie ściągnięte na boki. Miejscowe tkanki były spuchnięte po operacji, co powodowało stres i zmniejszone pobieranie pokarmu przez zwierzęta. W naszym zmodyfikowanym przezczaszko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkich autorów nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Kathy Gage za jej redakcyjne wsparcie. Figury schematu zostały stworzone za pomocą BioRender.com. Badanie to było wspierane przez fundusze z Wydziału Anestezjologii (Duke University Medical Center) oraz granty NIH (NS099590, HL157354, NS117973 i NS127163).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% bupiwakaina | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0,9% chlorek sodu | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) | Sigma lub dowolny dostępny dostawca | ||
| Cewnik dożylny 20 G | BD | 381534 | 20 GA Igła 1,6 W |
| 30 G Szew | BD | 305106 | |
| 4-0 | Look | SP116 | pleciony jedwabny |
| szew 8-0 z igłą | Ethilon | 2822G | |
| Waciki nasączone alkoholem | BD | 326895 | |
| Skrzynka indukcyjna anestezjologiczna | Każdy odpowiedni sprzedawca | Marka Pexiglass | |
| Szlifierka elektryczna | JSDA | JD 700 | |
| Końcówka pętli kauterycznej wysokotemperaturowej | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laserowy monitor perfuzji dopplerowskiej | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Smar maść do oczu | Bausch + Lomb 339081 | ||
| Sonda doodbytnicza dla myszy | Physitemp | RET-3 | |
| Podtlenek azotu | Airgas | UN1070 | |
| Otoskop | Welchallyn | 728 | 2,5 mm Otoskop wziernikowy służył jako laryngoskop do wizualizacji strun głosowych u myszy |
| Tlen | Airgas | UN1072 | |
| Powidon-jod | CVS | 955338 | |
| Skrzynka regeneracyjna | Brinsea | TLC eco | |
| Rimadyl (karprofen) | Zoetis | 6100701 | Wstrzykiwany respirator dla gryzoni 50 mg/ml |
| Kent Scientific | Rodent Jr. | ||
| Regulator temperatury | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Potrójny antybioryk i przeciwbólowy | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Waporyzator | RWD | R583S |
Bibliografia
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
