Artykuł metodologiczny

Kontrolowana stymulacja procedura oceny funkcji rozkurczowych zależnych od częstości akcji serca w modelach mysiej niewydolności serca

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65384

⸱

21 lipca 2023

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Therapeutic Strategy for Heart Failure, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins Medical Institutions

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje uzyskanie zależności ciśnienie-objętość poprzez stymulację przezprzełykową, co służy jako cenne narzędzie do oceny funkcji rozkurczowej w mysich modelach niewydolności serca.

Streszczenie

Niewydolność serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) to stan charakteryzujący się dysfunkcją rozkurczową i nietolerancją wysiłku. Podczas gdy testy hemodynamiczne lub MRI mogą być stosowane do wykrywania dysfunkcji rozkurczowej i diagnozowania HFpEF u ludzi, takie modalności są ograniczone w podstawowych badaniach z wykorzystaniem modeli mysich. Test wysiłkowy na bieżni jest powszechnie stosowany w tym celu u myszy, ale na jego wyniki może mieć wpływ masa ciała, siła mięśni szkieletowych i stan psychiczny. W tym miejscu opisujemy protokół stymulacji przedsionków w celu wykrywania zależnych od częstości akcji serca (HR) zmian w wydajności rozkurczowej i walidacji jego przydatności w mysim modelu HFpEF. Metoda polega na znieczuleniu, intubacji i wykonaniu analizy pętli ciśnienie-objętość (PV) wraz z stymulacją przedsionków. W tej pracy wprowadzono cewnik kondukcyjny przez dostęp wierzchołkowy lewej komory, a w przełyku umieszczono cewnik stymulujący przedsionki. Podstawowe pętle fotowoltaiczne zebrano przed spowolnieniem tętna za pomocą iwabradyny. Pętle fotowoltaiczne zbierano i analizowano w przyrostach tętna w zakresie od 400 uderzeń na minutę do 700 uderzeń na minutę za pomocą stymulacji przedsionków. Korzystając z tego protokołu, wyraźnie wykazaliśmy zależne od HR upośledzenie rozkurczowe w metabolicznie indukowanym modelu HFpEF. Zarówno stała czasu relaksacji (Tau), jak i zależność ciśnienie-objętość końcoworozkurczowa (EDPVR) pogarszały się wraz ze wzrostem tętna w porównaniu z myszami kontrolnymi. Podsumowując, ten protokół kontrolowany stymulacją przedsionków jest przydatny do wykrywania dysfunkcji serca zależnych od HR. Zapewnia to nowy sposób badania mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji rozkurczowej w mysich modelach HFpEF i może pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia tego schorzenia.

Wprowadzenie

Niewydolność serca stanowi główną przyczynę hospitalizacji i zgonów na całym świecie, a niewydolność serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) stanowi około 50% wszystkich diagnoz niewydolności serca. HFpEF charakteryzuje się dysfunkcją rozkurczową i upośledzoną tolerancją wysiłku, a związane z tym nieprawidłowości hemodynamiczne, takie jak dysfunkcja rozkurczowa, można wyraźnie wykryć za pomocą testów hemodynamicznych pod obciążeniem fizycznym lub skanów MRI1,2.

W modelach eksperymentalnych dostępne metody oceny nieprawidłowości fizjologicznych związanych z HFpEF są ograniczone3,4. Testy wysiłkowe na bieżni (TMT) służą do określenia czasu biegu i dystansu, co może odzwierciedlać hemodynamikę serca w stresie wysiłkowym; Jednak ta metoda jest podatna na zakłócenia spowodowane zmiennymi zewnętrznymi, takimi jak masa ciała, siła mięśni szkieletowych i stan psychiczny.

Aby obejść te ograniczenia, opracowaliśmy protokół stymulacji przedsionkowej, który wykrywa subtelne, ale kluczowe zmiany w wydajności rozkurczowej na podstawie tętna (HR) i potwierdziliśmy jego przydatność w mysim modelu HFpEF5. Kilka czynników fizjologicznych przyczynia się do funkcji serca związanej z wysiłkiem, w tym odpowiedź nerwu współczulnego i katecholamin, rozszerzenie naczyń obwodowych, odpowiedź śródbłonka i częstość akcji serca6. Wśród nich jednak zależność tętno-ciśnienie (zwana również efektem Bowditcha) jest znana jako krytyczny wyznacznik cech fizjologicznych serca7,8,9.

Protokół obejmuje przeprowadzenie konwencjonalnej analizy ciśnienia i objętości na linii bazowej w celu oceny funkcji skurczowej i rozkurczowej, w tym parametrów takich jak szybkość wzrostu ciśnienia (dp/dt), końcowoskurczowa zależność ciśnienie-objętość (ESPVR) i końcoworozkurczowa zależność ciśnienie-objętość (EDPVR). Należy jednak zauważyć, że na parametry te ma wpływ tętno, które może się różnić między zwierzętami ze względu na różnice w ich wewnętrznym tętnie. Dodatkowo należy również wziąć pod uwagę wpływ znieczulenia na HR. Aby temu zaradzić, ustandaryzowano tętno poprzez jednoczesne podawanie stymulacji przedsionków z iwabradyną, a pomiary parametrów serca wykonywano przy przyrostowym tętnie. Warto zauważyć, że zależna od HR odpowiedź serca odróżniała myszy z HFpEF od myszy z grupy kontrolnej, podczas gdy nie zaobserwowano istotnych różnic w wyjściowych pomiarach pętli PV (przy użyciu wewnętrznego tętna)5.

Chociaż ten protokół stymulacji może wydawać się stosunkowo skomplikowany, jego skuteczność przekracza 90%, gdy jest dobrze zrozumiana. Protokół ten stanowiłby użyteczny sposób badania mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji rozkurczowej w mysich modelach HFpEF i pomógłby w opracowaniu nowych metod leczenia tego schorzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół dla zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i przestrzegał przepisów dotyczących eksperymentów na zwierzętach i powiązanych działań na Uniwersytecie Tokijskim. W niniejszym badaniu wykorzystano 8-12 tygodniowe samce myszy C57 / Bl6J. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Model HFpEF został stworzony poprzez stosowanie diety wysokotłuszczowej przez 15 tygodni w połączeniu z estrem metylowym NG-nitro-L-argininy, jak opisano wcześniej10.

1. Przygotowanie cewnika i kalibracja ciśnienia/objętości

  1. Umieść cewnik konduktancyjny w zwykłej soli fizjologicznej i podłącz go do modułu składającego się z PowerLab 8/35 i jednostki ciśnienie-objętość (moduł MPVS, patrz Tabela materiałów).
  2. Elektronicznie kalibruj ciśnienie i objętość poprzez rejestrację wstępnie określonych parametrów ciśnienia (0 mmHg i 100 mmHg) i objętości (różnią się one w zależności od modułów MPVS) w module MPVS3,11 (patrz również instrukcje producenta).

2. Przygotowanie zwierzęcia do cewnikowania

  1. Znieczulenie i wentylacja
    1. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 mg/kg etomidatemu i 500 mg/kg uretanu (patrz Tabela Materiałów) 5-10 minut przed intubacją.
      UWAGA: Uretan, choć skuteczny jako środek znieczulający w badaniach na zwierzętach, podejrzewa się, że jest rakotwórczy dla ludzi. Dlatego, gdy uretan jest niezbędny do osiągnięcia celów eksperymentalnych i nie wystarczają żadne środki alternatywne, należy obchodzić się z nim ostrożnie. Wymagane są odpowiednie środki ochronne, takie jak noszenie rękawiczek i masek oraz używanie dygestorium podczas przygotowania. Jako możliwą alternatywę można zastosować ketaminę (80 mg/kg, ip).
    2. Umieścić mysz w komorze anestezjologicznej uprzednio nasyconej 2% izofluranem i przenieść zwierzę do wstępnie ogrzanej poduszki grzewczej utrzymywanej w temperaturze od 38 °C do 40 °C po indukcji znieczulenia.
    3. Ogolić obszar operacyjny. Następnie zdezynfekuj miejsce operowane trzema naprzemiennymi seriami betadyny i alkoholu.
    4. Wykonaj poziome nacięcie (1-2 cm) na szyi, wytnij mięsień tchawicy i odsłoń tchawicę. Przełóż chirurgiczny jedwabny szew 2-0 pod tchawicą, podnieś go i wykonaj małe nacięcie (1-2 mm), aby go otworzyć.
    5. Wprowadzić rurkę dotchawiczą do tchawicy i podłączyć ją do respiratora, który dostarcza mieszaninę 100% tlenu i 2% izofluranu (zredukowaną do 0,5% do 1% później).
  2. Wprowadzenie cewnika do żyły centralnej (CV) i wstrzyknięcie płynu
    1. Zlokalizuj żyłę szyjną wewnętrzną pod mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym3.
    2. Wprowadzić do żyły szyjnej centralny cewnik żylny, składający się z rurki silastycznej PE-10 (patrz Tabela materiałów) przymocowanej do igły 30 G.
    3. Podać wlew bolusa w ilości 5-6 μl/g masy ciała 10% albuminy/NaCl przez 3 minuty, a następnie stałą szybkość infuzji 5-10 μl/min.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niedociśnieniu wynikającemu z rozszerzenia naczyń obwodowych spowodowanego znieczuleniem. Żyła szyjna wewnętrzna znajduje się między mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym a tętnicą szyjną i wydaje się ciemniejsza niż tętnica.

3. Zabieg chirurgiczny cewnikowania lewej komory (otwarta klatka piersiowa)

  1. Ogolić obszar chirurgiczny znieczulonej myszy. Następnie zdezynfekuj miejsce operowane trzema naprzemiennymi seriami betadyny i alkoholu.
  2. Potwierdź głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Następnie wykonaj poziome nacięcie (2-3 cm) poniżej wyrostka mieczykowatego i oddziel skórę od ściany klatki piersiowej za pomocą nożyczek.
  3. Przeciąć ścianę klatki piersiowej bocznie po obu stronach za pomocą kauteryzacji elektrycznej (patrz Tabela materiałów).
  4. Odsłoń serce, przecinając przeponę, a następnie delikatnie usuń osierdzie z serca za pomocą kleszczy.
  5. Włóż igłę 27 G do wierzchołka lewej komory (LV) i wstecznie wprowadź cewnik konduktancyjny do lewej komory przez otwór do nakłucia.
  6. Wyreguluj położenie cewnika tak, aby uzyskać kwadratową pętlę ciśnienie-objętość.
  7. Sprawdź, czy cewnik nie styka się z mięśniem brodawkowatym, gdy zachodzą zmiany warunków obciążenia, sprawdzając kształt pętli PV podczas niedrożności żyły głównej dolnej (IVC).
    UWAGA: Odpowiednia ekspozycja serca ułatwia zabieg i pomaga uzyskać wyraźny obraz.

4. Rejestrowanie danych pętli fotowoltaicznej i określanie końcowej zależności ciśnienie-skurczowa objętość (ESPVR) oraz końcowej rozkurczowej zależności ciśnienie-objętość (EDPVR)

UWAGA: Zmniejszenie obciążenia wstępnego przez okluzję IVC umożliwia określenie ESPVR i EDPVR.

  1. Rejestruj i analizuj bazową pętlę ciśnienie-objętość (PV) za pomocą oprogramowania LabChart (patrz Tabela materiałów), PowerLab i modułu MPVS po stabilizacji sygnału (5-10 min po kaulacji).
  2. Wykonaj okluzję IVC, ściskając IVC kleszczami i rejestruj pętlę PV przez co najmniej 20 cykli serca podczas okluzji IVC. Określ ESPVR, dopasowując linię regresji liniowej przez końcowe punkty skurczowe pętli fotowoltaicznej, a EDPVR dopasowując linię krzywoliniową przez końcowe punkty rozkurczowe pętli fotowoltaicznej za pomocą oprogramowania LabChart.
    UWAGA: Zatrzymaj respirator podczas niedrożności IVC, aby zapobiec artefaktom ruchu płuc. Środek paraliżujący, taki jak pankuronium (0,5-1 mg/kg) może być pomocny, gdy ruch płuc jest nadmierny i powinien być stosowany dopiero po potwierdzeniu stabilnej płaszczyzny znieczulenia.

5. Stymulacja przezprzełykowa

  1. Wprowadzić cewnik z elektrodą tetrapolarną 2-Fr do przełyku, podłączyć cewnik do stymulatora impulsów (patrz tabela materiałów) i określić próg przechwytywania przedsionków (zwykle amplituda bodźca wynosi 3 mA, a szerokość impulsu wynosi 1 ms).
  2. Zmniejszyć tętno poniżej 400 uderzeń/min, stosując 20 mg/kg iwabradyny (patrz tabela materiałów) podawaną dootrzewnowo.
  3. Po ustabilizowaniu należy wykonać 20 ciągłych cykli pracy serca w pętlach PV o różnym tempie stymulacji od 400 uderzeń/min do 700 uderzeń/min, z przyrostem 100 uderzeń/min; uzyskać cykle w ciągu 5 minut przy każdym tempie stymulacji.

6. Kalibracja soli fizjologicznej i kalibracja przepływu w aorcie

  1. Dezaktywować respirator i podać dożylnie 5-10 μl hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej przez cewnik sercowo-naczyniowy.
  2. Udokumentuj wahania ciśnienia i objętości podczas wstrzykiwania soli fizjologicznej i oblicz wartość Vp za pomocą PowerLab3,11.
  3. Powtórz kalibrację soli fizjologicznej, aby zwiększyć dokładność i odtwarzalność.
  4. Obróć mysz na lewą stronę, aby nie zakłócać sygnału głośności.
  5. Wykonaj torakotomię boczną między Th3 a Th5 w kierunku kręgosłupa i delikatnie wypreparuj niewielką część aorty zstępującej za pomocą kleszczy.
  6. Umieść sondę przepływu naczyniowego (patrz Tabela materiałów) nad aortą, aby zmierzyć pojemność minutową serca.
    UWAGA: Dokładne obliczenie objętości bezwzględnej wymaga zastosowania dwóch rodzajów kalibracji: kalibracji soli fizjologicznej i kalibracji przepływu w aorcie. Ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z potencjalnych zagrożeń związanych z hipertonicznym naparem soli fizjologicznej u zwierząt, ponieważ nadmierne obciążenie solą może spowodować spadek kurczliwości.

7. Eutanazja

  1. Po badaniu należy poddać myszy eutanazji w przypadku przedawkowania środka znieczulającego poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Aby zapewnić całkowite ustanie funkcji życiowych, stosuje się wtórną metodę eutanazji, taką jak wykrwawienie w znieczuleniu, a następnie pobranie tkanki serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podstawowe dane pętli fotowoltaicznej są wyświetlane w Rysunek 1 i Tabela 1. Na początku badania (przy braku stymulacji) nie stwierdzono istotnych różnic w parametrach rozkurczowych, takich jak stała czasu relaksacji (Tau), minimalna szybkość zmiany ciśnienia (dP/dt min) i EDPVR między myszami kontrolnymi i HFpEF. Jednak myszy z HFpEF wykazywały wyższe ciśnienie krwi i elastancję tętniczą (Ea), jak pokazano na Rysunek 1, i wykazywały typową pętlę PV w ksz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono metodykę oceny zależności ciśnienie-objętość przy zastosowaniu stymulacji przezprzełykowej. Nietolerancja wysiłku fizycznego jest jedną z kluczowych cech HFpEF, jednak nie ma dostępnych technik oceny czynności serca u myszy podczas wysiłku fizycznego. Nasz protokół stymulacji stanowi cenne narzędzie do wykrywania dysfunkcji rozkurczowej, która może nie być widoczna w warunkach spoczynku.

Aby uzyskać pętlę fotowoltaiczną o dokładnej i stałej jakości, należy skrupulatnie wykonać na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Fundacji Fukuda na rzecz Technologii Medycznej (dla E.T. i G. N.) oraz JSPS KAKENHI Scientific Research Grant-in-Aid 21K08047 (dla E.T.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szew jedwabny 2-0, sterlieAlfresa Pharma Corporation, Osaka, Japonia62-9965-57Materiały chirurgiczne
Cewnik do elektrod tetrapolarnych 2-FrFukuda Denshi, Japonia i UNIQUE MEDICAL, JaponiaMateriały chirurgicznena zamówienie
Albumina Surowica bydlęcaNacalai Tesque, Inc., Kioto, Japonia01859-47Różne C57
/BI6J myszJackson Laboratoryzwierzęta
Cewnik konduktancyjnyMillar Instruments, Houston, TXPVR 1035
Kauteryzacja elektryczna, zestaw noży do elektrokoagulacjiellman-Japonia, Osaka, Japonia1-1861-21Materiały chirurgiczne
EtomidateTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokio JaponiaE0897Anestezjologiczny
instrument do trawy S44G Kwadratowy stymulator impulsówAstro-Med, Zachód Warwick, RISprzęt stymulujący
IsofluraneViatris Inc., Tokio, Japonia8803998Anesthetic
IvabradineTokyo Chemical Industory Co., Ltd., Tokio JaponiaI0847Różne
oprogramowanie LabChartADInstruments, Sydney, AustraliaLabChart 7Sprzęt hemodynamiczny
MPVS UltraMillar Instruments, Houston, TXPL3516B49Sprzęt hemodynamiczny
Bromek pankronuSigma Aldrich Co., St. Louis, MO15500-66-0Rurka polietylenowa znieczulająca
PE10Centrum Badań Biologicznych  Co. Ltd., Tokio, Japonia62101010Materiały chirurgiczne
Instrumenty PowerLab 8/35AD, Sydney, AustraliaPL3508/PSprzęt hemodynamiczny
PVR 1035Millar Instruments, Houston, TX842-0002Sprzęt hemodynamiczny
Uretan (karbaminian etylu)Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japonia050-05821Znieczulająca
sonda przepływu naczyniowegoTransonic, Ithaca, NYMA1PRBMateriały chirurgiczne

Bibliografia

  1. Backhaus, S. J. Exercise stress real-time cardiac magnetic resonance imaging for noninvasive characterization of heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. 143 (15), 1484-1498 (2021).
  2. Borlaug, B. A., Nishimura, R. A., Sorajja, P., Lam, C. S. P., Redfield, M. M. Exercise hemodynamics enhance diagnosis of early heart failure with preserved ejection fraction. Circulation. Heart Failure. 3 (5), 588-595 (2010).
  3. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., David, A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
  4. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2198-2206 (2011).
  5. Numata, G., et al. A pacing-controlled protocol for frequency-diastolic relations distinguishes diastolic dysfunction specific to a mouse HFpEF model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 323 (3), H523-H527 (2022).
  6. Piña, I. L., et al. Exercise and heart failure. Circulation. 107 (8), 1210-1225 (2003).
  7. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Minimal force-frequency modulation of inotropy and relaxation of in situ murine heart. Journal of Physiology. 534 (2), 535-545 (2001).
  8. Takimoto, E., et al. Frequency- and afterload-dependent cardiac modulation in vivo by troponin I with constitutively active protein kinase A phosphorylation sites. Circulation Research. 94 (4), 496-504 (2004).
  9. Meyer, M., Lewinter, M. M. Heart rate and heart failure with preserved ejection fraction: Time to slow β-blocker use? Circulation. Heart Failure. 12 (8), 006213(2019).
  10. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  11. Abraham, D., Mao, L. Cardiac pressure-volume loop analysis using conductance catheters in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942(2015).
  12. Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac catheterization in mice to measure the pressure volume relationship: Investigating the Bowditch effect. Journal of Visualized Experiments. (100), e52618(2015).
  13. Townsend, D. W. Measuring pressure volume loops in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810(2016).
  14. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), H47(2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dysfunkcja rozkurczowastymulacja przedsionkowap tle ci nienie obj tomodele mysie HFpEFocena funkcji sercazale no od cz sto ci uderze sercacewnik konduktancjici nienie ko coworozkurczowesta a czasowa relaksacji

Powiązane artykuły