Utrzymanie i ocena różnych typów tkanek i komórek oka przy użyciu nowatorskiego systemu płynów bez pompy

Summary

Analiza żywej tkanki w czasie rzeczywistym dostarcza ważnych danych funkcjonalnych i mechanistycznych. W tym artykule opisano protokoły i zmienne krytyczne w celu zapewnienia dokładnego i powtarzalnego generowania danych przez nowatorski i niewymagający pompowania wielokanałowy system fluidyki, który utrzymuje i ocenia szeroką gamę modeli tkanek i komórek.

Abstract

Wiele modeli in vitro używanych do badania funkcji tkanek i biologii komórki wymaga przepływu pożywki, aby zapewnić odpowiednie natlenienie i optymalne warunki dla komórek niezbędne do utrzymania funkcji i żywotności. W tym celu opracowaliśmy wielokanałowy system hodowli przepływowej, który utrzymuje tkanki i komórki w hodowli oraz stale ocenia funkcję i żywotność za pomocą czujników in-line i/lub zbierania frakcji odpływowych. System łączy w sobie 8-kanałowy, ciągły optyczny czujnik zużycia tlenu z wbudowanym kolektorem frakcji w celu jednoczesnego pomiaru tempa produkcji metabolitów i wydzielania hormonów. Chociaż jest w stanie utrzymać i ocenić szeroki zakres modeli tkanek i komórek, w tym wysp trzustkowych, mięśni i podwzgórza, tutaj opisujemy jego zasady działania i eksperymentalne preparaty/protokoły, które zastosowaliśmy do zbadania bioenergetycznej regulacji izolowanej siatkówki myszy, nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (RPE)-naczyniówki-twardówki oraz hodowanych ludzkich komórek RPE. Innowacje w konstrukcji systemu, takie jak bezpompowy przepływ płynu, znacznie uprościły obsługę wielokanałowego systemu przepływowego. Pokazane są filmy i obrazy, które ilustrują, jak złożyć, przygotować instrument do eksperymentu i załadować różne modele tkanek/komórek do komór perfuzyjnych. Ponadto nakreślono i omówiono wytyczne dotyczące wyboru warunków do eksperymentów specyficznych dla protokołu i tkanki, w tym ustawienie prawidłowego stosunku przepływu do tkanki w celu uzyskania spójnych i stabilnych warunków hodowli oraz dokładne określenie wskaźników zużycia i produkcji. Połączenie optymalnego utrzymania tkanek i oceny wielu parametrów w czasie rzeczywistym daje wysoce pouczające zestawy danych, które będą miały wielką użyteczność w badaniach nad fizjologią oka i odkrywaniu leków do leczenia zaburzeń widzenia.

Introduction

Systemy peryfuzji mają długą historię w naukach przyrodniczych. W szczególności, do badania funkcji wydzielniczych przez wyspy trzustkowe, zostały one wykorzystane do scharakteryzowania kinetyki wydzielania insuliny w odpowiedzi na secretagogues¹. Oprócz zbierania frakcji odpływowych do późniejszego oznaczania hormonów i metabolitów, zastosowano czujniki czasu rzeczywistego, głównie do wykrywania zużycia tlenu^2,3,4. Szeroko zakrojone wysiłki mające na celu lepsze zrozumienie mechanizmów pośredniczących w chorobach oczu były ograniczone przez brak fizjologicznie istotnych metod oceny regulacji metabolicznej i rozregulowania różnych izolowanych elementów oka, w tym siatkówki, nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), twardówki naczyniówki, twardówki i hodowanych komórek RPE. Systemy statyczne zaprojektowane dla hodowanych komórek zostały przystosowane do tissue⁵, ale tkanka wymaga przepływu dla odpowiedniego natlenienia. Systemy przepływu z powodzeniem mierzą w czasie rzeczywistym reakcje na wskaźnik zużycia tlenu (OCR) przez siatkówkę i twardówkę naczyniówkową RPE, a tkanki pozostają stabilne metabolicznie przez ponad 8 godzin, co pozwala na wysoce informacyjne protokoły obejmujące wiele związków testowych^4,6,7,8,9. Niemniej jednak działanie systemów fluidycznych historycznie wymagało aparatury wykonanej na zamówienie i przeszkolonego personelu technicznego w zakresie niestandardowych metodologii. Takie systemy nie zostały przyjęte jako standardowa metodologia w większości laboratoriów. BaroFuse to nowo opracowany system fluidyczny, który nie opiera się na pompach, ale raczej na ciśnieniu gazu, aby napędzać przepływ przez wiele kanałów i komór tkankowych (Rysunek 1). Każdy kanał jest stale monitorowany pod kątem OCR, a odpływ jest zbierany za pomocą płytkowego kolektora frakcji w celu późniejszego oznaczenia zawartości. Co ważne, komory peryfuzyjne tkanek w instrumencie są zaprojektowane tak, aby pomieścić tkanki o różnych geometriach i rozmiarach.

Sercem instrumentu jest system fluidics, w którym przepływ jest kierowany z zamkniętego, ciśnieniowego zbiornika przez rurkę o małej średnicy wewnętrznej (ID) (co przyczynia się do największego oporu przepływu w obiegu płynu) do szklanych komór na tkanki, które przechowują tkankę. Ciśnienie do modułu zbiornika mediów (MRM) jest dostarczane przez reduktory niskiego i wysokiego ciśnienia podłączone do butli gazowej zawierającej mieszaninę gazów (zwykle 21%_O2, 5% CO₂, bilans N₂), a zbiornik jest uszczelniony od góry przez moduł komory peryfuzyjnej (PCM), w którym znajdują się zespoły komory tkankowej (TCA). Natężenie przepływu jest kontrolowane przez długość i ID rurek oporowych oraz ustawienie ciśnienia regulatora niskiego ciśnienia. Rurki odpływowe połączone z górną częścią komór na chusteczki dostarczają płyn do pojemnika na odpady (który jest stale ważony w celu automatycznego określenia natężenia przepływu) lub do studzienek z 96-dołkową płytką kontrolowaną przez kolektor frakcji. System detekcji_O2 mierzy żywotność barwnika wrażliwego na_O2 namalowanego po wewnętrznej stronie każdej ze szklanych komór na chusteczki za tkanką. Informacje te są następnie wykorzystywane do ciągłego obliczania OCR. Cały układ fluidyczny znajduje się w obudowie o kontrolowanej temperaturze, a zbiornik gazu, kolektor frakcji i komputer są głównymi elementami przyrządu (Rysunek 2A). Wreszcie, oprogramowanie, które uruchamia przyrząd, służy do kontrolowania jego działania (w tym przygotowania i czasu wstrzykiwania związków testowych, systemu pomiaru przepływu i czasu kolektora frakcji), a także przetwarzania i tworzenia wykresów danych OCR i innych pomiarów dodatkowych.

W tym artykule opisujemy protokoły korzystania z systemu fluidics do peryfuzji i oceny OCR oraz szybkości produkcji mleczanu (LPR) dla różnych izolowanych elementów oka. LPR to parametr odzwierciedlający szybkość glikolityczną, który jest wysoce komplementarny do OCR, gdzie para odpowiada za dwie główne gałęzie wytwarzania energii z węglowodanów w komórce¹⁰. Ponieważ przygotowania tkanki i ładowania jej do komór tkankowych najlepiej nauczyć się, oglądając procedurę, film pomoże zilustrować kilka krytycznych kroków, które są wykonywane podczas konfiguracji i operacji, a które nie są łatwe do przekazania za pomocą samego tekstu.

Opis protokołu podzielony jest na 8 sekcji, które odpowiadają różnym fazom eksperymentu (Rysunek 2B): 1. przygotowanie przedeksperymentalne; 2. przygotowanie/równoważenie peryfuzatu; 3. Ustawienie instrumentu; 4. równowaga tkankowa; 5. Protokół eksperymentalny; 6. awaria instrumentu; 7. Przetwarzanie danych; oraz 8. oznaczanie frakcji odpływowych.

Protocol

Wszystkie procedury pobierania tkanek od szczurów i myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.

1. Przygotowanie przedeksperymentalne

UWAGA: Następujące zadania są wykonywane co najmniej dzień przed eksperymentem.

1. Projektowanie protokołu eksperymentalnego
   1. Przypisanie umieszczenia tkanki w kanałach: Wybierz model tkanki lub komórki, który ma zostać umieszczony w 3 z 4 kanałów po każdej stronie MRM. Jedna komora tkankowa z każdej strony jest prowadzona bez tkanki, która ma być użyta do korekcji linii podstawowej.
   2. Ułóż próbki przy użyciu jednego z dwóch typowych schematów - różnych protokołów związków testowych po każdej stronie (np. kanały po jednej stronie MRM odbierają badane związki, podczas gdy kanały po drugiej stronie działają jako kontrola); ten sam protokół wstrzykiwania badanego związku po obu stronach MRM, ale różne tkanki lub model tkankowy w porównaniu z kontrolą po obu stronach MRM.
   3. Wybór natężenia przepływu i ilości tkanki w celu optymalnego pomiaru OCR: Dostosuj natężenie przepływu, aż zmiana współczynnika żywotności razy 100 wyniesie około 3,
      UWAGA: Typowe ilości tkanki i odpowiadające im natężenia przepływu przedstawiono w Tabeli 1 dla elementów oka, gdzie przyrząd działa najlepiej przy natężeniach przepływu w zakresie 6-80 μl/min/kanał.
   4. Obliczanie wymaganej objętości nośnika/bufora: Oblicz objętość pożywki, która ma zostać dodana do każdej wkładki MRM na początku eksperymentu jako
      Objętość_MRM = 30 ml + czas trwania protokołu (w min) x natężenie przepływu (w ml/min) x 4 kanały (równanie 1)
      Na przykład przy 0,01 ml / min początkowa objętość_MRM o pojemności 60 ml pozwoli na protokół 12,5 godziny (gdzie 30 ml zostanie wyczerpane, podczas gdy pozostanie 30 ml), podczas gdy przy 0,04 ml / min 90 ml początkowej objętości_MRM pozwoli na protokół 6 godzin (z pozostałymi 30 ml).
   5. Protokół wstrzykiwania badanych związków: Należy wybrać badane związki do oceny, stężenie do zbadania (zazwyczaj wybierane w celu uzyskania odpowiedzi bliskiej maksymalnej lub jako zależności stężenia) oraz czas trwania narażenia. Weź pod uwagę rozpuszczalność i uzupełnij zapasy w pożądanym rozpuszczalniku, takim jak woda, DMSO lub etanol.
   6. Należy wybrać czas wstrzyknięć i kolejnych wstrzyknięć, tak aby odpowiedź osiągnęła stan ustalony przed dodaniem kolejnego środka. Powtarzając protokoły, dopasuj czas wstrzyknięć, aby można było uśrednić wiele kursów czasowych.
      UWAGA: Użyte tutaj związki pochodzą z poprzedniego mitochondrialnego (Mito) testu warunków skrajnych ¹¹ i zarówno oligomycyna, jak i cyjanek karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon (FCCP) wymagają DMSO zarówno w roztworach podstawowych, jak i w końcowym peryfuzacie.
   7. Czasy pobierania próbek na wypływ: Wybierz żądane interwały pobierania frakcji (od 1 do 60 min/próbkę), gdzie dla szybkich zmian wybierane są szybsze częstotliwości próbkowania, a w miarę zbliżania się do stanu ustalonego wybierane są dłuższe odstępy czasu. Używaj odpowiednich objętości studzienek (0,3 do 1,5 ml), aby uniknąć przepełnienia w okresie pobierania próbek (wybierz objętości, które są większe niż natężenie przepływu x przedział czasu).
      UWAGA: Czasy pobierania próbek będą się różnić w zależności od wyboru protokołu, ale w przypadku testu warunków skrajnych Mito zwykle stosujemy 5-minutowe interwały podczas linii bazowej i 15-minutowe odstępy podczas wstrzyknięć (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, gdzie każdy czas jest początkiem interwału próbkowania).
   8. Wprowadź wybrane wartości dla badanych związków i zbierania frakcji opisane powyżej do interfejsu użytkownika (UI), który generuje graficzne reprezentacje tych informacji. Eksport i rozpowszechnianie plików do oceny i dyskusji grupowych (Rysunek uzupełniający 1).
2. Określ akcesoria i części eksploatacyjne
   1. Należy określić materiały eksploatacyjne dostarczone i wstępnie zapakowane aseptycznie przez producenta, które obejmują: TCA (opakowanie 8 sztuk), zespoły przewodów odpływowych (opakowanie 8 probówek), rurki do wstrzykiwań substancji testowych (2), kleszcze, zaciski do przewodów (3), wkładki MRM, MRM (2), mieszadła (2) i zespół przewodów przepychających (umieszczony w szafie bezpieczeństwa biologicznego).
   2. Nie używaj ponownie części jednorazowych, które mają kontakt z cieczą, ponieważ doprowadzi to do wzrostu liczby niepowodzeń eksperymentalnych. Ponownie użyj kleszczyków i mieszadeł, czyszcząc je i sterylizując w autoklawie między eksperymentami.

2. Przygotowanie i równoważenie peryfuzatu (Czas: 30 minut nie wliczając czasu inkubacji)

1. Przygotować pożywkę lub bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera (KRB) dzień wcześniej na podstawie obliczeń z równania 1, zwykle 200 ml, a następnie inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 39 °C/5% CO₂ w kolbach do hodowli tkankowych T225, przy czym w każdej kolbie znajduje się nie więcej niż 90 ml.
2. W przypadku stosowania komercyjnie przygotowanego KRB lub pożywki (podgrzanej do temperatury pokojowej), należy przygotować peryfuzat rano w dniu eksperymentu i umieścić w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 na} co najmniej 1 godzinę. Wszystkie roztwory należy przygotować w sposób aseptyczny.
   UWAGA: Wszystkie ciecze i części układu fluidycznego, które mają kontakt z cieczą, są sterylne na początku eksperymentu. Jednak montaż systemu i ładowanie tkanki odbywa się z otwartym powietrzem.

3. Równoważenie temperatury i rozpuszczonego gazu w celu ustawienia instrumentu (Czas: 75 min)

1. Mocowanie przewodów rurowych do MRM
   1. Umieść MRM i pakiet płynów na stole obok instrumentu. Upewnij się, że rurka clamps (3), pręty mieszające (2) i kleszcze są już na tacy narzędziowej.
   2. Umieść nieużywaną wkładkę MRM z mieszadłem po obu stronach MRM (patrz Rysunek 3).
   3. Podłączyć TCA do portów iniekcyjnych na obu końcach MRM tak, aby koniec rurki znajdował się bezpośrednio nad mieszadłem. Upewnij się, że dłuższy z dwóch zespołów iniekcyjnych badanego związku znajduje się z tyłu MRM.
   4. Następnie podłącz przewód doprowadzający dopływ gazu i zespół rurki odpowietrzającej odpowiednio do tylnego i przedniego wolnego portu (patrz Rysunek 4A).
2. Umieszczanie zespołów MRM/przewodów w obudowie
   1. Umieść MRM (z dołączonymi zespołami przewodów) w grzałce MRM (Rysunek 4B).
   2. Umieść cztery zespoły przewodów w rowkach ścianek w podstawie obudowy (po dwa z każdej strony) tak, aby wystawały na zewnątrz obudowy po umieszczeniu środkowej obudowy.
   3. Zabezpiecz MRM między zaciskami, dokręcając dwa kółka na stojaku detektora.
   4. Przełóż dłuższy zespół wtryskowy badanego związku wystającego z tyłu obudowy przez dwie prowadnice rurek z boku obudowy, tak aby otwór probówek był skierowany do przodu (Rysunek 4C).
   5. Zacisknąć każdy z zamkniętych zespołów wtryskowych mieszanki testowej.
3. Montaż obudowy i aktywacja regulatorów temperatury
   1. Przełącz listwę zasilającą, która dostarcza zasilanie do wszystkich urządzeń elektrycznych w obudowie, do pozycji ON. Wentylator na stojaku detektora włączy się, a regulator temperatury MRM powinien się zaświecić, wyświetlając ustawioną wartość 38 °C ( Rysunek 5).
   2. Włącz mieszadła do 70 obr./min za pomocą interfejsu użytkownika, aby upewnić się, że mieszadła obracają się płynnie. Po zaobserwowaniu prawidłowego mieszania wyłącz mieszadła.
   3. Umieść środkową część obudowy na górze podstawy.
   4. Podłącz w środkowej części obudowy do ze skrzynki elektrycznej, aby podłączyć zasilanie do przełącznika dźwigniowego regulatora temperatury otoczenia i dostarczyć zasilanie do grzejnika temperatury otoczenia.
   5. Umieść pokrywę na obudowie, a wyświetlacz górnego regulatora temperatury (regulatora temperatury otoczenia) zaświeci się i wskaże 36 °C. Uruchom timer na 30 minut, czyli czas, w którym grzałka MRM osiąga temperaturę zadaną.
4. Wkładanie TCA do PCM
   1. Użyj narzędzia do wkładania TCA, aby włożyć każdy z 8 TCA do otworów PCM, mocno naciskając adapter powierzchnią czołową narzędzia do wkładania, aż górna część tulei rurki owiniętej wokół komory na chusteczki dotknie powierzchni opisującej otwory w PCM.
   2. Całkowicie włóż jeden TCA przed włożeniem następnego. Odłóż częściowo zmontowany PCM na bok obok klamry PCM i 6.
      UWAGA: Niepełne włożenie TCA uniemożliwi osiągnięcie nastawy ciśnienia w przestrzeni nad głową, a peryfuzat nie będzie płynąć.
5. Wypełnienie dwóch wkładek w MRM wstępnie zrównoważonym peryfuzatem
   1. W tym celu po 30 minutach od zmontowania obudowy i osiągnięciu temperatury przez MRM, należy przenieść wstępnie zrównoważony peryfuzator do wstępnie podgrzanej wkładki MRM, delikatnie dozując płyn po bokach za pomocą pipety o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Czynności te, jak również te opisane w sekcji 3.6, należy wykonać natychmiast, aby uniknąć przenoszenia gazu między peryfuzatem w MRM a atmosferą.
6. Montaż MRM/PCM w celu stworzenia gazoszczelnego uszczelnienia i pozycjonowanie detektora O₂
   1. Umieść PCM na MRM, wkładając rurki oporowe TCA wychodzące z dolnej części PCM do wkładek MRM, po 4 z każdej strony rozdzielacza MRM. Ustaw PCM tak, aby komory tkankowe mogły opierać się o detektor_O2 po jego ustawieniu.
   2. Zabezpiecz PCM i wspornik PCM za pomocą 6 za pomocą śrubokręta elektrycznego.
   3. Zabezpiecz TCA w żebrach nośnych PCM za pomocą dostarczonej elastycznej taśmy, rozciągając ją wokół żeber PCM na poziomie gumowych uszczelek (Rysunek 6).
   4. Umieść detektor O₂ na stojaku detektora tak, aby jego czoło opierało się o żebra PCM. Sprawdź, czy para diody LED/fotodetektora jest wyrównana z barwnikiem wrażliwym na_O2 w komorach tkankowych. W razie potrzeby wyreguluj prowadnice boczne detektora O₂ po poluzowaniu dociskowych z boku uchwytu detektora O₂.
   5. Umieść pokrywę na górze obudowy.
7. Równoważenie stężenia gazu w przestrzeni nad głową w MRM z peryfuzatem
   1. Gdy zawór wysokiego ciśnienia jest całkowicie zabezpieczony i zamknięty, otwórz zawór zbiornika gazu, obracając zawór butli na górze zbiornika w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
   2. Ustaw regulator wysokiego ciśnienia na ciśnienie 10 psi za pomocą pokrętła na regulatorze.
   3. Zwiększ ciśnienie w MRM, ustawiając regulator niskiego ciśnienia na 1.0 psi (Rysunek 7A).
   4. Zwolnij rurkę odpowietrzającą (Rysunek 7B), aby umożliwić gazowi ze zbiornika zastąpienie powietrza w przestrzeni nadprożowej MRM (wtryskiwacze badanego związku pozostają zaciśnięte) przez 15 minut. Potwierdź przepływ gazu, zanurzając koniec rurki odpowietrzającej w zlewce z wodą, aby zaobserwować bulgotanie.
   5. Po potwierdzeniu przepływu uruchomić detektor_O2 zgodnie z opisem poniżej w sekcji 3.8.
   6. Po 15 minutach włącz mieszadło przy 70 obr./min i pozostaw włączone do końca eksperymentu. Po dodatkowych 15 minutach zaciśnij zespół rurki odpowietrzającej (Rysunek 7C).
   7. Obniż ciśnienie na regulatorze niskiego ciśnienia do ciśnienia roboczego, które osiąga pożądane natężenie przepływu cieczy (zgodnie z opisem w opakowaniu eksperymentalnym - zwykle między około 0,5-0,7 psi). Jeśli natężenie przepływu przekracza 20 μl/min, tymczasowo ustaw ciśnienie na 0,3 psi, aby dać czas na obciążenie tkanki bez przepełniania komór. Nie jest to konieczne, jeśli tkanka zostanie załadowana w ciągu 15 minut od umieszczenia zacisku.
      UWAGA: Nie pozwól, aby bufor spływał po zewnętrznej stronie komory tkankowej, ponieważ płyn może zakłócać wykrywanie_O2
   .
8. Uruchamianie detektora_O2
   1. Aktywuj oprogramowanie detektora O₂ na laptopie, klikając ikonę oznaczoną Detektor tlenu.
   2. Po otwarciu programu (Rysunek uzupełniający 2) upewnij się, że wybrano właściwy port COM. W razie potrzeby port COM można zidentyfikować, odłączając i podłączając detektor O₂ do komputera, tak aby wyświetlany był numer portu. Jeśli port COM zostanie odłączony, gdy aplikacja jest uruchomiona, aplikacja musi zostać zamknięta i ponownie otwarta przed użyciem.
   3. Kliknij Start, a następnie Nagraj (i zapisz dane w folderze kopii zapasowej). Następnie kliknij Wykres.
   4. Zmień średnią wartość w lewym dolnym rogu wykresu czasu życia na 5 (co instruuje program, aby obliczył średnią ruchomą z 5 kolejnymi punktami). Po upływie minuty i wyświetleniu pierwszego punktu danych na ekranie wykresu kliknij przycisk Skalowanie automatyczne.

4. Obciążenie tkanek i okres równoważenia (Czas: 90 min)

1. Umieszczanie fryt w komorach na tkanki
   1. Zdejmij pokrywę i środkowe części obudowy.
   2. Po tym, jak peryfuzat w komorach tkankowych wzniesie się ponad wierzch wstępnie ustawionej fryty, popchnij frytę w dół za pomocą wskazówki fryty, lekko stukając w górną część fryty, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które utworzyły się poniżej lub wewnątrz fryty.
   3. Umieść fryty około 0,25 cala nad dnem komory tkankowej.
2. Ładowanie tkanki do komór tkankowych
   1. Gdy poziom podłoża znajdzie się 0,5 cala od góry, załaduj chusteczkę do komory.
   2. Ładowanie siatkówki lub twardówki naczyniówki: Zbierz siatkówkę lub twardówkę naczyniówki RPE, jak opisano w ⁶. Aby załadować tkankę, użyj cienkich kleszczyków punktowych, aby delikatnie umieścić tkankę w każdej komorze, uważając, aby nie złożyć tkanki, jednocześnie używając chusteczki do chusteczek, aby zapobiec kapaniu płynu z komory tkankowej na czujnik_O2. Obserwuj, jak tkanka opada w kierunku fryty i na nią.
      UWAGA: Pomiędzy pobraniem tkanki a załadowaniem tkanki do komór należy upewnić się, że nie doszło do uszkodzenia tkanki, nie pozostawiając tkanki w buforze/pożywce na bazie wodorowęglanów poza inkubatorem na dłużej niż 10 minut i upewniając się, że tkanka jest kąpana w wystarczającej ilości buforu/pożywki (co najmniej 1 ml/10 mg tkanki), aby zapobiec niedotlenieniu tkanki i zapobiec ekspozycji na powietrze.
   3. Ładowanie komórek RPE na membrany transwell: Przygotuj komórki RPE zgodnie z wcześniejszym opisem ¹² oraz w pliku uzupełniającym 1. Pasaż komórek przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i nasion na politereftalanie etylenu, filtry trawione śladowo (wkładki do hodowli komórkowych, wielkość porów 0,4 mm) przy minimum 2,0 x 10⁵ komórek/cm². W dniu eksperymentu przetnij błony na trzy paski o równej szerokości i załaduj kleszczami do komór tkankowych (patrz Rysunek 8A).
3. Mocowanie przewodów odpływowych do komór na chusteczki
   1. Wyjmij zespoły przewodów odpływowych z opakowania i umieść separator przewodów odpływowych na krawędzi środkowej części obudowy, tak aby adaptery przewodów odpływowych znajdowały się po wewnętrznej stronie obudowy (Rysunek 8B, C).
   2. Uważając, aby nie naciskać zbyt mocno na TCA (w przeciwnym razie poluzują się z MRM), przymocuj adaptery rurki odpływowej do górnej części komór tkankowych TCA (Rysunek 8D). Załóż środek obudowy i ponownie podłącz sterowania temperaturą otoczenia.
   3. Przed założeniem pokrywy obudowy upewnij się, że elementy systemu fluidics wewnątrz obudowy, w tym detektor_O2, PCM, komory na tkanki, rurki odpływowe, MRM i grzałka, są prawidłowo umieszczone, jak pokazano na Rysunek 8E.
   4. Załóż pokrywę obudowy. Przeprowadź osiem rur odpływowych przez ramię prowadzące kolektora frakcji.
4. Aktywacja kolektora frakcji
   1. Upewnij się, że kolektor frakcji jest wyśrodkowany względem prawej ściany obudowy i uchwytu rurki odpływowej: lewy wspornik podstawy kolektora frakcji powinien opierać się o krawędź ściany obudowy.
   2. Na laptopie kliknij skrót interfejsu użytkownika, a otworzy się strona z informacjami eksperymentalnymi (Rysunek uzupełniający 3 u góry).
   3. Wypełnij informacje w odpowiednich polach na stronie informacyjnej eksperymentu (można to zrobić przed rozpoczęciem eksperymentu), a następnie kliknij stronę Kolektor przepływu i frakcji na górze (Rysunek uzupełniający 3 na dole).
5. Ustawianie parametrów do automatycznego pomiaru natężenia przepływu
   1. Wybierz żądany czas integracji z menu rozwijanego czasu akwizycji próbki w górnej środkowej części, które równoważy żądaną dokładność (która jest proporcjonalna do czasu całkowania) i rozdzielczość czasową.
   2. Jeśli w eksperymencie nie zostaną zebrane żadne frakcje odpływowe, kliknij przycisk Start i przejdź do sekcji 4.7. Jeżeli będą zbierane frakcje odpływowe, należy wykonać czynności opisane w sekcji 4.6.
6. Zbieranie frakcji odpływowych
   1. W oprogramowaniu interfejsu użytkownika sprawdź opcję Zbierać ułamki? na stronie informacji o eksperymencie lub na stronie modułu zbierającego przepływ i frakcje. Następnie kliknij przycisk Compute FC Settings (Ustawienia obliczeń FC).
   2. Gdy otworzy się nowe okno, należy wpisać w protokole czas pierwszego wstrzyknięcia (zdefiniowany jako czas = 0) oraz natężenie przepływu na kanał, a także przedziały czasowe dla każdej próbki. Następnie kliknij przycisk Obliczenia.
   3. Po zweryfikowaniu interwałów kolekcji kliknij Generuj i Uruchom.
7. Pomiar natężenia przepływu dla poszczególnych kanałów (opcjonalnie)
   1. Jeśli mają być mierzone natężenia przepływu poszczególnych kanałów (które w normalnych warunkach różnią się tylko o kilka procent), należy zważyć osiem (lub mniej) probówek do mikrowirówek i zapisać ich wagę.
   2. Umieść uchwyt probówki zawierający wstępnie zważone probówki do mikrowirówek na wózku płytkowym. Kliknij opcję Zmierz natężenie przepływu ręcznie w sekcji innych narzędzi.
   3. Wybierz czas trwania pomiaru, a następnie kliknij przycisk Generuj szablon. Zamknij okno i kliknij przycisk Start. Kolektor frakcji będzie zbierał płyn z rurek odpływowych przez czas trwania pomiaru, a następnie ramię powróci do pozycji wyjściowej.
   4. Po pobraniu zważ probówki do mikrofuge i użyj różnicy masy podzielonej przez czas trwania pomiaru, aby obliczyć natężenie przepływu (gdzie 1 mg = 1 μl).
8. Stabilizacja linii podstawowej
   1. Po załadowaniu tkanki i/lub komórek do komór tkankowych, należy pozwolić systemowi na osiągnięcie równowagi przez 90 minut w celu ustalenia płaskiej linii podstawowej zużycia_O2, w którym to czasie można wstrzyknąć pierwszy badany związek (przyjmuje się, że czas = 0).
   2. Na 30 minut przed pierwszym wstrzyknięciem wprowadź średnią wartość ostatnich 3 FR na kanał na stronie wstrzyknięcia w celu przygotowania wstrzyknięć badanego związku.

5. Protokół eksperymentalny (Czas: 2-6 godzin)

UWAGA: Gdy stabilizacja linii bazowej jest w toku, następnym zadaniem jest wstrzykiwanie związków testowych i zmiana płytek na kolektorze frakcji, jeśli zostanie użyta więcej niż jedna.

1. Przygotowanie do wstrzykiwania badanego związku
   1. Wprowadź nazwy związków, pożądane stężenia (roztwory końcowe i podstawowe) oraz czasy wtrysku badanych związków do tabeli w interfejsie użytkownika na stronie Wtrysk. Potwierdzić informacje wyświetlane w programie, w tym objętości MRM pozostałe w momencie wstrzyknięć oraz ilość roztworu podstawowego, który należy wstrzyknąć, aby osiągnąć pożądane stężenia (Rysunek uzupełniający 4).
   2. Aby obliczyć, ile peryfuzatu i zapasu jest potrzebne do wstrzyknięcia, należy wypełnić białe pola w tabeli wstrzyknięć i kliknąć przycisk Oblicz. Korzystając z obliczonych wartości, przed wstrzyknięciem rozcieńczyć roztwór podstawowy badanego związku peryfugatem, tak aby wstrzyknięta objętość wynosiła 5% objętości w MRM po wstrzyknięciu.
   3. Przygotować każdy badany związek, mieszając roztwór podstawowy i peryfuzat. Ładować strzykawki na co najmniej 10 minut przed wstrzyknięciem i przechowywać w inkubatorze CO₂ (utrzymywanym w temperaturze 37-40 °C) do momentu przygotowania do wstrzyknięcia.
2. Wstrzykiwanie badanych związków
   1. Podłączyć strzykawkę zawierającą badany związek do przewodów iniekcyjnych (Rysunek 9A). Odblokuj miękkościenną rurkę prowadzącą do linii iniekcyjnej i powoli wstrzykuj badane związki (Rysunek 9B) z szybkością około 3 ml / min. Ponownie zacisnąć rurkę na przewodzie iniekcyjnym, a następnie wyjąć strzykawkę (Rysunek 9C); powtórz dla drugiej strony MRM.
   2. Po wstrzyknięciu każdego badanego związku należy przygotować każdy kolejny badany związek do wstrzyknięcia zgodnie ze stroną wstrzykiwania interfejsu użytkownika.
3. Wyznaczanie sygnału dopływu O₂ dla każdego kanału
   1. Pod koniec każdego eksperymentu wstrzyknij inhibitor oddechowy KCN (3 mM), aby określić sygnał czasu życia dopływu dla każdego kanału, który jest używany do korygowania zmian w podstawowej żywotności czujnika i niemitochondrialnym zużyciu tlenu.

6. Zakończenie eksperymentu i awaria systemu (Czas: 30 min)

1. Zapisywanie danych dotyczących tlenu
   1. Kliknij przycisk Zapisz w lewym górnym rogu okna wykresu w oprogramowaniu detektora tlenu; nazwij plik i zapisz go w folderze, w którym plik będzie przechowywany. Kliknij przycisk Zatrzymaj nagrywanie w oknie głównym, aby zapisać plik kopii zapasowej.
2. Zapisywanie eksperymentalnego pliku informacyjnego interfejsu użytkownika
   1. Kliknij przycisk Zapisz profil w lewym górnym rogu strony ogólnej interfejsu użytkownika; nazwij plik i zapisz go w folderze, w którym plik będzie przechowywany. Na stronie fraction & flow interfejsu użytkownika kliknij menu rozwijane Narzędzia, a następnie Zapisz. Zachowaj wygenerowaną nazwę lub wybierz inną i zapisz plik w żądanym miejscu. W razie potrzeby istnieją pliki kopii zapasowych, do których można uzyskać dostęp i je zapisać.
3. Rozkładanie instrumentu na czynniki pierwsze
   1. Ponieważ KCN jest lotny, zespoły płynów należy wyrzucić do dygestoriów; wlać media z tacy na odpady MRM i FC do pojemnika na odpady i dokładnie przepłukać wkładki MRM i mieszadła wodą. Zawartość pojemnika na odpady (zawierającego KCN) wlać do oznakowanego pojemnika na odpady chemiczne w celu późniejszego usunięcia z punktu widzenia bezpieczeństwa chemicznego. Przed kolejnym eksperymentem dokładnie wyczyść i autoklawuj mieszadła i kleszcze.

7. Przetwarzanie danych (Czas: 15-45 min)

1. Otwórz aplikację procesora danych na komputerze Mac lub PC. Wybierz plik danych .csv wygenerowany przez eksperyment. Jeśli protokół tego eksperymentu jest podobny do wcześniej analizowanego eksperymentu, wybierz ten plik ustawień i kliknij Następny krok. W przeciwnym razie po prostu kliknij Następny krok, aby rozpocząć wprowadzanie ustawień eksperymentu.
2. Wypełnij różne ustawienia eksperymentu. Podczas określania punktu czasowego odniesienia należy wybrać punkt czasowy bezpośrednio przed wejściem w życie KCN i zmniejszeniem wartości okresu istnienia. Zaznacz ten punkt za pomocą suwaka lub wpisując wartość czasu w polu.
3. Kliknij przycisk Oblicz, aby wygenerować wykresy OCR zgodnie z równaniem 2:
   OCR = ([O₂]_in- [O₂]_out) x FR = (217 nmol/ml - [O₂]_out) x FR/baza tkankowa (Równanie 2)
   gdzie stężenie_O2 w KRB w równowadze z 21%_O2 w temperaturze 37 °C wynosi 217 nmol/ml, FR jest natężeniem przepływu (w ml/min), podstawa tkankowa to ilość tkanki załadowanej do komory (tj. liczba siatkówki, twardówka naczyniówki-naczyniówka lub komórki RPE).
4. Zapisz wykresy jako pliki .pdf, naciskając przycisk Eksportuj wykres. Wykres OCR jako wartości bezwzględne lub ułamek wartości w stanie ustalonym, zaznaczając pola odpowiadające związkowi testowemu, który ma być ustawiony na 1 na stronie edycji ustawień.

8. Oznaczanie frakcji odpływowych

1. Jeżeli próbki nie mogą być oznaczone bezpośrednio po zakończeniu doświadczenia, należy umieścić płytki w temperaturze 4 °C, jeśli są oznaczane następnego dnia, lub zamrożone, jeśli są przechowywane dłużej. Jeżeli płytki są zamrożone, próbki należy rozmrozić w temperaturze 4 °C (tak, aby próbki pozostały zimne).
2. Po wykonaniu testów na wybranych frakcjach odpływowych, kolumny danych (po jednej na kanał) są wprowadzane do pliku .csv z czasem (w min) w skrajnej lewej kolumnie i stężeniem po prawej stronie (w nmol/ml lub ng/ml); link w programie do przetwarzania danych po naciśnięciu przesyła szablon.
3. Prześlij ten plik do procesora danych, aby obliczyć i wykreślić dane.

Results

Aby zilustrować rozdzielczość danych generowanych z izolowanych elementów oka, OCR i LPR zostały zmierzone za pomocą trzech typów tkanek (siatkówka, RPE-naczyniówka-twardówka i komórki RPE) zgodnie z powszechnie stosowanym protokołem (test stresu mitochondrialnego¹⁰; Rysunek 10, Rysunek 11, oraz Rysunek 12). Ilość tkanki użytej dla każdej tkanki jest przedstawiona w tabeli 1. Dane zostały przetworzone i zobrazowane za pomocą pakietu oprogramowania, który został opracowany dla systemu fluidics. Przygotowanie siatkówki i twardówki naczyniówki-twardówki jest stosunkowo proste i zajmuje mniej niż 20 minut dla każdego typu tkanki. OCR był stały w czasie, gdy badane związki zostały wstrzyknięte, wskazując na stabilny stan i funkcję tkanki oraz wspierając trafność metody (Rysunek 10). Po walidacji dla każdego typu tkanki nie stwierdziliśmy, że konieczne jest przeprowadzanie kontroli, w których nie wstrzykuje się żadnych badanych związków w każdym eksperymencie. Zgodne z danymi uzyskanymi przy użyciu bardziej konwencjonalnych metod peryfuzji^6,8,13, OCR spadek odpowiedzi na oligomycynę i zwiększony OCR w odpowiedzi na FCCP. Zmiany w LPR były w przeciwnym kierunku niż te obserwowane dla OCR: oligomycyna zwiększała LPR, który następnie zmniejszał się (ale tylko nieznacznie) w odpowiedzi na FCCP (Ryc. 11). Aby porównać istotność statystyczną wpływu każdego sekwencyjnego związku testowego, przeprowadzono testy t (które są obliczane automatycznie przez oprogramowanie dostarczone z urządzeniem). Ponieważ celem pracy było opisanie sposobu stosowania tej metody, liczba przeprowadzonych powtórzeń nie zawsze była wystarczająco wysoka, aby uzyskać istotność statystyczną. Ogólnie rzecz biorąc, gdy liczba powtórzeń wynosiła 3 lub więcej, wpływ FCCP i oligomycyny zarówno na OCR, jak i LPR był znaczący.

Komórki RPE nie były wcześniej analizowane za pomocą systemów przepływowych, ale reagowały podobnie do RPE-naczyniówka-twardówki (zgodne z poglądem, że duża część OCR jest spowodowana komórkami RPE; Rysunek 11). Te ilustracyjne przykłady podkreślają zdolność systemu do utrzymania żywotności tkanek, co znajduje odzwierciedlenie w stabilności OCR w kanałach kontrolnych oraz wysoki stosunek sygnału do szumu dla zmian OCR o wielkości indukowanej przez oligomycynę i FCCP, który wynosił ponad 100 do 1. Ponadto testy frakcji odpływowych mogą być wykorzystane do skorelowania szybkości wychwytu lub produkcji szerokiej gamy związków wymieniających się z płynem zewnątrzkomórkowym jako komplementarnych do OCR (w tym przypadku LPR). Te cechy instrumentu pozwoliły na dokładne ilościowe określenie charakterystycznych różnic w reakcjach tkanek między typami tkanek wykonywanych równolegle. OCR przez twardówkę naczyniówkową RPE i komórki RPE są konsekwentnie bardziej wrażliwe na oligomycynę niż siatkówka (Rysunek 11 i Figura 12), chociaż dla twardówki RPE naczyniówka i twardówki czas ekspozycji na FCCP nie był wystarczająco długi, aby osiągnąć stan stacjonarny. Należy wziąć pod uwagę fakt, który pojawił się podczas używania DMSO jako rozpuszczalnika. Przy wyższych stężeniach (0,2%) DMSO miało przejściowy wpływ na OCR przez siatkówkę (prawdopodobnie odzwierciedlając efekt zmiany ciśnienia osmotycznego spowodowany wpływem DMSO na przepuszczalność błony).

Na podstawie założenia, że KCN całkowicie hamuje oddychanie poprzez bezpośrednie działanie na oksydazę cytochromu c, OCR na końcu ekspozycji KCN jest ustawiony na 0, a wszystkie wartości OCR są obliczane na podstawie zmiany w stosunku do wartości KCN. OCR może zachodzić niezależnie od łańcucha oddechowego i oksydazy cytochromu c. Jednak wielkość tego wkładu w ogólny OCR na ogół nie przekracza kilku procent (dane nie pokazane), a wydłużony czas, w którym tkanka jest wystawiona na działanie KCN, zapewnia, że substraty oksydaz, które nie są częścią łańcucha transportu elektronów, zostały wyczerpane.

Analiza statystyczna
Pojedyncze eksperymenty pokazano tak, jak pokazano na rysunkach, ale z wieloma kanałami, które zostały uśrednione. Dane zostały następnie przedstawione na wykresie jako średnia ± błędu standardowego (SE; obliczona jako SD/√n).

Rysunek 1. Schemat systemu fluidyki/oceny. Główne komponenty obejmują obudowę, elementy kontroli temperatury, systemy fluidyki i komór tkankowych, regulację ciśnienia gazu w przestrzeni nad peryfuzatem, monitorowanie kolektora frakcji/natężenia przepływu oraz detektory_O2. Skróty: MRM = Moduł Zbiornika Mediów, PCM = Moduł Komory Peryfuzyjnej, TCA = Zespoły Komór Tkankowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. (A) Zdjęcie głównych elementów instrumentu. Główne elementy składają się ze zbiornika gazu (regulatorów ciśnienia), obudowy, kolektora frakcji i komputera. (B) Eksperymentalny schemat blokowy przedstawiający główne kategorie kroków i czas potrzebny do ich wykonania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Widok MRM. MRM jest pokazany z wkładką MRM (po lewej) i prętami mieszającymi (po prawej) umieszczonymi na dnie wkładek MRM (umieszczonymi po obu stronach rozdzielacza MRM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Zespół przewodów i zespół przewodów przepłukujących w MRM. (A) Zespół przewodów iniekcyjnych do badań i zespół przewodów odpowietrzających podłączony do portów w MRM. (B-C) Zespół wtrysku badanego związku i zespół rurki odpowietrzającej (B) umieszcza się w rowku z przodu obudowy (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Włączanie regulatora temperatury MRM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Komory na tkanki i zbiornik gazu. Umieszczenie detektora_O2 na stojaku detektora (który obsługuje również MRM i PCM) i umieszczenie opaski wokół żeber PCM, które pomagają zabezpieczyć komory tkankowe na miejscu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. (A) Reduktory wysokiego i niskiego ciśnienia na zbiorniku gazu. (B-C) Rurka odpowietrzająca. Rurka odpowietrzająca umożliwia oczyszczenie przestrzeni nad głową w MRM z powietrza i napełnienie gazem ze zbiornika zasilającego. Zdjęcia przedstawiające otwartą rurkę odpowietrzającą (B) i zamkniętą rurkę odpowietrzającą (C). Zespół wtrysku badanego związku pozostaje zamknięty w procesie oczyszczania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Komora tkankowa i układ odpływu. (A) Wymiary membrany Transwell po jej przecięciu na trzy paski o równej szerokości. (B) Wspornik wielorurowy odpływowy. (C) Wielorurowy wspornik odpływowy umieszczony na krawędzi obudowy z adapterami rurek w pobliżu komór na tkanki. (D) Zdjęcie zespołów przewodów odpływowych przymocowanych do komór na tkanki. (E) Widok z lotu ptaka na obudowę bez pokrywy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Wstrzykiwanie związku w MRM. Wstrzykiwanie badanego związku przez port iniekcji do MRM za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Krzywe OCR i LPR w odpowiedzi na badane związki. OCR i LPR za pomocą siatkówki wyizolowanej od myszy (1 siatkówka/kanał) w odpowiedzi na obecność lub brak (kontrolę) badanych związków, jak wskazano. Każda krzywa jest średnią z 6 powtórzeń z pojedynczego eksperymentu (słupki błędów to SE; wartości p oblicza się, wykonując sparowane testy t porównujące wartości w stanie ustalonym dla każdego badanego czynnika z wartościami poprzedniego czynnika testowego). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11. Krzywe OCR. OCR za pomocą twardówki naczyniówki i siatkówki wyizolowanej od myszy (1 siatkówka lub 2 RPE-twardówka-naczyniówka/kanał) mierzone równolegle w odpowiedzi na badane związki, jak wskazano. Dane są średnią powtórzeń z pojedynczego eksperymentu (n = 2 i 4 odpowiednio dla twardówki i siatkówki RPE-naczyniówki; wartości p oblicza się, wykonując sparowane testy t, porównując wartości w stanie ustalonym dla każdego badanego czynnika z wartościami poprzedniego badanego czynnika). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12. Krzywe OCR i LPR z komórek RPE. OCR i LPR z komórek RPE przymocowanych do membran transwell, które zostały pocięte na paski i załadowane do komór peryfuzyjnych. Dane są średnią powtórzeń z pojedynczego eksperymentu (n = 3, z 1,5 błonami/kanał (360 000 komórek/kanał); wartości p oblicza się, wykonując sparowane testy t porównujące wartości stanu ustalonego dla każdego badanego czynnika z wartościami poprzedniego badanego czynnika). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt.

TKANKA/KOMÓRKA	Kwota/kanał	NATĘŻENIE PRZEPŁYWU: mL/min
Siatkówka (mysz)	1	0,025
RPE-naczyniówka-twardówka (mysz)	cyfra arabska	0,02
Komórki RPE na membranach Transwell	360 000 ogniw (4 x 1/3 pasków filtracyjnych)	0,016

Tabela 1. Zalecane specyfikacje operacyjne dla różnych tkanek.

Rysunek uzupełniający 1. Graficzna reprezentacja projektu eksperymentalnego. Czas i skład ekspozycji na badane związki oraz czas zbierania frakcji. Przyrost stężenia (Conc Inc) to zmiana stężenia, która ma zostać wprowadzona. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2. Interfejs użytkownika podczas uruchamiania. Interfejs użytkownika okna startowego oprogramowania do wykrywania_O2, które monitoruje_O2 w komorach tkankowych wprowadzonych do PCM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3. Interfejs użytkownika dla ustawień eksperymentu. Interfejs użytkownika do wprowadzania informacji eksperymentalnych (po lewej) i wyboru czasu zbierania frakcji odpływowych (po prawej). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4. Interfejs użytkownika strony iniekcji. Strona iniekcji, która oblicza objętości wstrzyknięć na podstawie pożądanych stężeń badanego związku i objętości pozostałej w MRM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Metody przygotowania próbki tkanki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Ze względu na znaczenie bioenergetyki we wszystkich aspektach funkcjonowania komórek i utrzymania różnych elementów oka, istnieje pilna potrzeba opracowania metod badania jej regulacji. W szczególności siatkówka nerwowa i RPE zależą od metabolizmu zarówno w zakresie wytwarzania energii, jak i sygnalizacji wewnątrz- i międzykomórkowej 14,15,16,17. Ze względu na ich wysoką zdolność oksydacyjną, izolowane tkanki oka nie są dobrze utrzymane w warunkach statycznych^18,19 i dlatego badanie izolowanych elementów oka wymaga systemów przepływu, które mogą zarówno utrzymywać, jak i oceniać procesy metaboliczne. System fluidics został opracowany do generowania danych OCR i LPR z szerokiego zakresu typów tkanek, a w tym artykule przedstawiliśmy szczegółowe protokoły, które okazały się dające optymalne wyniki.

Głównym czynnikiem decydującym o generowaniu wiarygodnych danych przy użyciu systemu przepływu jest wstępna równowaga pożywki/bufora na bazie CO₂ w temperaturze 39 °C (w celu zapewnienia, że peryfuzat nie jest przesycony rozpuszczonym gazem, który uległby odgazowaniu podczas eksperymentu). W szczególności pożywka lub bufor KRB przechowywane w temperaturze 4 °C będą przesycone w stosunku do 37 °C i zostaną odgazowane podczas eksperymentu, jeżeli czasy równowagi wstępnej są niewystarczające. Ponadto tkanki załadowane do komór tkankowych nie mogą być uszkodzone przez niewłaściwą izolację tkanki z powodu rozerwania lub niepełnego oddzielenia tkanki lub przez zbyt długie wystawienie tkanki w małej ilości buforu na bazie wodorowęglanów na działanie powietrza atmosferycznego. Kontrola temperatury, stabilność przepływu i niezawodność detekcji_O2 mają niewielką zmienność, a czynniki te nie przyczyniają się znacząco do awaryjności.

Przyrząd posiada osiem kanałów przepływowych/komór tkankowych, które działają jednocześnie, które są zasilane peryfuzatem z dwóch zbiorników, po cztery komory tkankowe dla każdego zbiornika. Aby uzyskać najdokładniejsze przebiegi czasowe OCR, krzywe kinetyczne są korygowane według linii bazowej przez komory, które nie są obciążone tkanką. Tak więc typowy protokół eksperymentalny obejmowałby dwie grupy po trzy komory tkankowe. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dzielą się na dwie kategorie: jedna to różne protokoły dotyczące związków testowych po każdej stronie (na przykład lek/nośnik po jednej stronie MRM, a po drugiej tylko nośnik); drugi to ten sam protokół wstrzykiwania badanego związku po obu stronach MRM, ale inna tkanka lub model tkanki po każdej stronie MRM. W tym artykule wpływ oligomycyny i FCCP na siatkówkę porównano z OCR przez tkanki, które nie były narażone na żadne badane związki, a dwie tkanki oceniano jednocześnie w tym samym protokole i warunkach w celu zidentyfikowania zachowania specyficznego dla tkanki. To ostatnie zostało zilustrowane w tym badaniu, pokazując zwiększony zakres dynamiczny tempa przemiany materii przez twardówkę naczyniówkową RPE w stosunku do siatkówki równolegle w tym samym eksperymencie. Inne raporty opisywały szerszy zakres projektów badań, w tym pomiar wpływu różnych poziomów_O2 na OCR i LPR oraz zależności od stężeń paliw, leków i toksyn^20,21. Ponadto, chociaż ograniczyliśmy analizę frakcji odpływowych do pomiaru mleczanu i obliczenia LPR, zawartość informacji w eksperymencie znacznie wzrasta, jeśli testuje się wiele związków i klas związków we frakcjach odpływowych, takich jak hormony, neuroprzekaźniki, sygnały komórkowe i metabolity, które mogą opuścić komórki^{20,22, Lokal mieszkalny 23}.

Obciążenie izolowanej siatkówki lub twardówki naczyniówkowej jest proste, a po wyizolowaniu tkanki te są po prostu umieszczane w górnej części komór tkankowych za pomocą kleszczy i pozostawiane do opadnięcia na frytę. Komórki RPE hodowane na wkładach filtracyjnych rozwijają odpowiednią polaryzację i markery dojrzałości RPE po 4-8 tygodniach w hodowli. Nie jest możliwe usunięcie RPE do analizy żywych komórek po podłączeniu do membrany transwell, jeśli ma być zachowana dojrzałość i polaryzacja RPE²⁴. W komorze peryfuzyjnej mogą znajdować się paski membrany transwell, które są cięte skalpelem, gdy są zanurzone w buforze i szybko wprowadzane do komór tkankowych. Chociaż wycinanie pasków filtracyjnych zostało umieszczone w systemie statycznym²⁴, żadna inna metoda fluidyczna do oceny tych ważnych typów komórek nie jest dostępna. Odpowiedzi komórek RPE były szybkie i bardziej dynamiczne niż siatkówki lub twardówki naczyniówki-twardówki, prawdopodobnie częściowo ze względu na natychmiastowy dostęp zarówno wierzchołkowych, jak i podstawowych aspektów komórek RPE skonfigurowanych jako monowarstwa na wkładce błonowej.

Innym czynnikiem zapewniającym, że dane mają najwyższy stosunek sygnału do szumu, jest wybór optymalnego stosunku tkanki załadowanej do komór peryfuzyjnych w stosunku do natężenia przepływu. Zbyt mała ilość tkanki w stosunku do natężenia przepływu powoduje, że różnica stężenia rozpuszczonego_O2 między dopływem a odpływem jest bardzo mała i trudna do wiarygodnego zmierzenia. W przeciwieństwie do tego, jeśli przepływ jest zbyt wolny, stężenie O₂ staje się tak niskie, że tkanka jest dotknięta niedotlenieniem. Niemniej jednak przepływ cieczy sterowany ciśnieniem gazu może być utrzymywany przy natężeniu przepływu do 5 ml / min, co wymaga tylko niewielkiej ilości tkanki do dokładnych pomiarów OCR i LPR. W pokazanych tutaj eksperymentach użyto około 20 ml / min / kanał, co było odpowiednie dla jednej siatkówki, dwóch twardówek naczyniówkowych RPE lub 360 000 komórek RPE. Aby zminimalizować efekty systemowe, które opóźniają i rozpraszają narażenie tkanki na wstrzyknięty badany związek, dostarczane są komory tkankowe o różnych rozmiarach, tak aby ilość tkanki (i szybkość przepływu) była dopasowana do odpowiedniej wielkości komory.

Dane z analiz przedstawionych w tym artykule zostały przedstawione na dwa sposoby: wielkość bezwzględna w odniesieniu do szybkości lub zmiany ułamkowe w stosunku do stanu ustalonego lub linii bazowej. Skoncentrowano się na zilustrowaniu pomiaru odpowiedzi na badane związki. Jednak system fluidics jest dobrze przystosowany do oceny i porównywania efektów leczenia tkanek przed analizą peryfuzyjną, takich jak modyfikacje genetyczne. Badanie, czy leczenie różni się od grupy kontrolnej, jest najbardziej wiarygodne, jeśli analizowany jest wpływ leczenia na znormalizowane odpowiedzi badanych związków. Jeśli analiza wymaga wielkości bezwzględnych, moc statystyczna analiz próbek, które są poddawane wstępnej obróbce, jest maksymalizowana, jeśli ich ocena i kontrole są przeprowadzane w tym samym eksperymencie.

Z wyjątkiem mieszadła, wszystkie części, które mają kontakt z cieczą, są dostarczane przez producenta jako materiały eksploatacyjne i zostały wysterylizowane. Części te nie powinny być ponownie używane, ponieważ eksperymenty mogą czasami zostać utracone z powodu niepełnego czyszczenia i zanieczyszczonych powierzchni. System na początku konfiguracji jest sterylny. Jednak pożywka jest dodawana do MRM, a tkanka jest ładowana do komór w warunkach niesterylnych. Zmierzyliśmy OCR w systemie, który jest zmontowany z części, które są sterylne, ale sam eksperyment jest przeprowadzany w warunkach niesterylnych. Potrzeba około 14 godzin, aby bakterie zgromadziły się do punktu, w którym można uzyskać mierzalny OCR (niepublikowane wyniki). Jeśli stosowane są protokoły krótsze niż 10 godzin, nagromadzenie bakterii i wszelkie skutki z tego powodu będą znikome.

Wielu badaczy używa przyrządów przeznaczonych do pomiaru OCR w statycznej inkubacji monowarstwy komórek o stosunkowo wysokiej przepustowości^25,26. W przeciwieństwie do tego, przyrząd do fluidyki, który przetestowaliśmy i opisaliśmy w tym artykule, utrzymuje tkankę, zapewniając odpowiednie dostarczanie_O2, co ma kluczowe znaczenie dla większych odległości dyfuzji, które są obecne w próbkach tkanek. Ponadto jest w stanie zbierać frakcje, co pozwala na ocenę wielu parametrów równolegle z OCR, co znacznie zwiększa możliwość badania relacji między nimi. Wreszcie, stężenia rozpuszczonych gazów (takich jak_O2 i CO₂ ) mogą być kontrolowane, co wydłuża czas trwania eksperymentów z pożywkami i buforem na bazie wodorowęglanów, umożliwiając użytkownikowi badanie skutków_O2. Należy podkreślić, że ograniczeniem dla obu metodologii jest brak możliwości badania wymywania badanych związków, co są funkcjonalnością, którą mają inne systemy peryfuzyjne ^4,27,28. Innym czynnikiem branym pod uwagę przy określaniu optymalnej metody analizy jest fakt, że systemy fluidyczne zużywają więcej mediów i związków testowych niż systemy statyczne. Dodatkowe koszty są zminimalizowane w przypadku obecnych systemów płynów, jednak ze względu na niskie natężenia przepływu, z których można korzystać.

Ogólnie rzecz biorąc, opisano szczegółowy opis protokołów przeprowadzania eksperymentów z nowym instrumentem do przepływu/oceny. Dane wygenerowane za pomocą siatkówki i twardówki naczyniówkowej RPE podsumowały poprzednie wyniki uzyskane za pomocą systemów, które są znacznie trudniejsze w użyciu (i nie są łatwo dostępne). Wykazano również, że system może utrzymywać i oceniać komórki RPE przyczepione do membran transwell, co jest bardzo ważnym modelem komórkowym, który nie był wcześniej analizowany za pomocą systemów przepływowych ze względu na kruchość komórek. Główne części protokołu składają się z 75-minutowego czasu konfiguracji, po którym następuje 90-minutowy okres równoważenia i protokół eksperymentalny, dzięki czemu nadaje się do rutynowego użytku przez laboratoria, które nie specjalizują się w obsłudze systemów fluidycznych. Chociaż skupiliśmy się na pomiarze ostrej odpowiedzi tkanki na badane związki, system jest bardzo odpowiedni do porównywania tkanek z różnych źródeł, takich jak modele zwierzęce lub modele komórek, które zostały genetycznie zmienione lub przeszły testowe zabiegi/warunki. Ponadto zakres testów, które można przeprowadzić na frakcjach odpływowych, jest szeroki i obejmuje metabolity, cząsteczki sygnalizacji komórkowej oraz wydzielane hormony/neuroprzekaźniki, a także analizę wieloskładnikową generowaną przez spektrometrię mas na frakcjach, a także na tkance.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOLOGICAL SAMPLES
C57BL/6J myszy	Envigo Harlan (Indianapolis, IN)	N/A
ODCZYNNIKI
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920L9795
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270G
KCN	Mleczan Sigma-Aldrich	60178
	MilliporeSigma	L6661
Oliigomycyna A	Sigma-Aldrich	75351L9795
HODOWLA KOMÓRKOWA I ZBIÓR TKANEK
Beuthanasia-D	Schering-Plough Animal Health Corp., Unia, NJ	N/A
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A3059
Euthasol, 390 mg/ml sodu pentobarbital	Virbac	RXEUTHASOL
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	12303C
Motek' s Buforowany roztwór soli	GIBCO	14065056
Krebs Ringer Wodorowęglan (KRB)	Thermo Fisher Scientific	J67795L9795
Matrigel	ThermoFisher	#CB-40230
Penicylina-streptomycyna	ThermoFisher Scientific
ROCKi	Selleck Chemicals	Y-27632
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	#25-200-072
SUPPLIES
Gas Butle: 21% O2/5% CO2/balance N2	Praxair Distribution, Inc	N/A
Filtry Transwell	MilliporeSigma	3470
TESTY KOMERCYJNE
Amplex Zestaw do oznaczania czerwonej glukozy/oksydazy glukozowej	ThermoFisher	A22189
Oksydaza glukozowa z Aerococcus viridans	Invitrogen (Carlsbad, CA)	A22189L9795
Oksydaza mleczanowa	Sigma-Aldrich	L9795
SPRZĘT
BaroFuse  Wielokanałowy system peryfuzji	EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA	Model 001-08
Synergy 4 Fluorometer	BioTek (Winooski, VT)	S4MLFPTA