Artykuł metodologiczny

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65411

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1W.M. Keck Science Department, Scripps College, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna College, 3Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 4W.M. Keck Science Department, Pitzer College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Streszczenie

Zrekonstruowane kompozyty cytoszkieletowe okazały się cennym systemem modelowym do badania nierównowagowej miękkiej materii. Wierne uchwycenie dynamiki tych gęstych sieci 3D wymaga optycznego przekroju, który jest często kojarzony z fluorescencyjnymi mikroskopami konfokalnymi. Jednak ostatnie osiągnięcia w mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM) sprawiły, że jest to opłacalna, a czasami lepsza alternatywa. Aby ułatwić dostęp do LSFM badaczom cytoszkieletów, którzy są mniej zaznajomieni z optyką, przedstawiamy przewodnik krok po kroku dla początkujących, jak zbudować wszechstronny mikroskop fluorescencyjny z arkuszami świetlnymi z gotowych komponentów. Aby umożliwić montaż próbki z tradycyjnymi próbkami szkiełkowymi, LSFM jest zgodny z konstrukcją jednoobiektywowego arkusza świetlnego (SOLS), który wykorzystuje pojedynczy obiektyw zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji. Opisujemy funkcję każdego komponentu SOLS na tyle szczegółowo, aby umożliwić czytelnikom modyfikację oprzyrządowania i zaprojektowanie go tak, aby odpowiadało ich konkretnym potrzebom. Na koniec demonstrujemy zastosowanie tego niestandardowego instrumentu SOLS, wizualizując astry w sieciach mikrotubul sterowanych kinezyną.

Wprowadzenie

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem światła (LSFM) reprezentuje rodzinę wysokorozdzielczych technik obrazowania fluorescencyjnego, w których światło wzbudzenia jest kształtowane w arkusz1,2, w tym mikroskopię z selektywnym oświetleniem płaszczyzny (SPIM), skanowane wzbudzenie płaskie wyrównane konfokalnie (SCAPE) oraz mikroskopię z płaszczyzną skośną (OPM)3,4,5,6,7. W przeciwieństwie do innych metod mikroskopowych, takich jak epifluorescencja, mikroskopia fluorescencyjna z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) czy mikroskopia konfokalna, fototoksyczność w LSFM jest minimalna, a próbki mogą być obrazowane w dłuższych odstępach czasu, ponieważ oświetlana jest tylko ta płaszczyzna próbki, która jest w danej chwili obrazowana8,9,10. W związku z tym techniki LSFM są niezwykle użyteczne do obrazowania próbek 3D w wydłużonych okresach czasu, w szczególności nawet tych, które są zbyt grube dla technik mikroskopii konfokalnej. Z tych powodów, od momentu jej pierwotnego opracowania w 2004 roku, LSFM stała się preferowaną techniką obrazowania dla wielu fizjologów, biologów rozwojowych i neurobiologów do wizualizacji całych organizmów, takich jak żywe rybki danio oraz embriony Drosophila3,4,6,11. W ciągu ostatnich dwóch dekad zalety LSFM zostały wykorzystane do wizualizacji struktury i dynamiki w coraz mniejszych skalach, w tym w skali tkankowej11,12, komórkowej i subkomórkowej, zarówno in vivo, jak i in vitro13,14,15,17.

Pomimo doniesień o udanych zastosowaniach w literaturze, wysoki koszt komercyjnych systemów LSFM (~0,25 miliona USD w momencie pisania)18,19 uniemożliwia powszechne stosowanie tej techniki. Aby uczynić konstrukcje typu DIY wykonalną alternatywą dla badaczy, opublikowano wiele przewodników budowy8,13,20,21, w tym projekt open-access OpenSPIM22. Jednak do tej pory badacze z minimalnym doświadczeniem w zakresie optyki mogli korzystać jedynie z wcześniejszych projektów LSFM, które są niekompatybilne z tradycyjnymi próbkami montowanymi na szkiełkach (Ryc. 1A). Niedawne implementacje jednoobiektywowych arkuszy światła (SOLS) wykorzystują jeden obiektyw zarówno do wzbudzenia, jak i detekcji (Ryc. 1C), co pozwala przełamać ograniczenia związane z kompatybilnością5,6,8,13,20. Jednak ceną za wszechstronność konstrukcji SOLS jest znaczny wzrost złożoności budowy ze względu na konieczność zastosowania dwóch dodatkowych obiektywów w celu przekaźnikowania, korygowania kąta nachylenia i ponownego odwzorowania płaszczyzny obiektu na kamerze do obrazowania (Ryc. 1D). Aby ułatwić dostęp do złożonych układów typu SOLS, niniejsza praca przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania, budowy, procesu wyrównywania oraz użytkowania systemu SOLS kompatybilnego ze szkiełkami, który byłby użyteczny dla badaczy posiadających wiedzę jedynie z podstawowego kursu optyki.

Choć sam protokół jest zwięzły, czytelnicy powinni w trakcie etapów przygotowawczych skorzystać z innych źródeł, aby dowiedzieć się więcej o poszczególnych elementach konstrukcji lub kwestiach sprzętowych. Jeśli jednak czytelnik zamierza postępować zgodnie ze specyfikacjami niniejszego projektu, zrozumienie sposobu wyboru konkretnych komponentów optycznych może nie być konieczne.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Charakterystyka różnych konfiguracji LSFM. (A) Układ z dwoma ortogonalnymi obiektywami, powszechny we wczesnych konstrukcjach LSFM. W tej konfiguracji do utrzymania próbki używa się rurki kapilarnej lub cylindra żelu, co nie jest kompatybilne z tradycyjnymi technikami montowania na szkiełkach. (B) Schemat konstrukcji light-sheet SOLS przedstawiający następujące elementy: (C) pojedynczy obiektyw służący zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji w płaszczyźnie próbki (O1); umożliwia to zamontowanie tradycyjnego szkiełka na górze oraz (D) system obiektywów przekaźnikowych w ścieżce emisji SOLS. O2 zbiera światło emisji i pomniejsza obraz. O3 obrazuje płaszczyznę pod odpowiednim kątem nachylenia na sensor kamery. Skróty: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy (mikroskopia fluorescencyjna z płaszczyzną światła); SOLS = single-objective light-sheet (light-sheet z pojedynczym obiektywem); O1-O3 = obiektywy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie do wyrównania

  1. Przed rozpoczęciem budowy należy przeprowadzić niezbędny przegląd literatury, aby mieć jasne wyobrażenie o zamierzonym przypadku użycia (np. fluorofory do obrazowania, wymagana objętość obrazowania, wymagania dotyczące rozdzielczości). W szczególności należy zapoznać się z poniższą sekcją wyników reprezentatywnych, aby zdecydować, czy zastosowanie dokładnie opisanego tutaj projektu jest odpowiednie. Jeśli tak, należy przejść do kroku 1.2. W przeciwnym razie wskazówki i wytyczne dotyczące wyboru sprzętu znajdują się w Sheunglab SOLS Build Guide23.
    UWAGA: Użytkownik może znaleźć więcej informacji na temat specyfikacji tego konkretnego systemu w sekcji dyskusji.
  2. Zgromadzić wszystkie niezbędne komponenty optyczne, optomechaniczne i elektryczne, zgodnie ze szczegółami zawartymi w Tabeli materiałów. Użytkownicy modyfikujący system powinni zgromadzić wszystkie równoważne części.
  3. Zbudować laser do wyrównania, jak przedstawiono na Rysunku 2A. Sprawdzić za pomocą płytki ścinającej, czy wiązka jest skolimowana.
  4. Zbudować klatkę do wyrównania z podwójnym matowym dyskiem szklanym, jak przedstawiono na Rysunku 2B.
  5. Przygotować próbkę testową powleczoną barwnikiem fluorescencyjnym.
    1. Przygotować nasycony roztwór barwnika rodamina, stopniowo dodając 1 mL wody destylowanej do 0,2 g liofilizowanego proszku, aż do całkowitego rozpuszczenia. Homogenizować za pomocą vortexa.
      UWAGA: Roztwór ten jest światłoczuły. Choć podczas przygotowania nie są wymagane szczególne środki ostrożności, należy upewnić się, że po przygotowaniu roztwór jest przechowywany w ciemnym miejscu.
      OSTRZEŻENIE: Podczas pracy z proszkiem rodaminy zawsze należy nosić rękawiczki i maseczkę.
    2. Nanieść pipetą 10 µL na środek szkiełka testowego.
    3. Położyć szkiełko zakrywe 22 mm x 22 mm na cieczy, dbając o to, aby warstwa fluorescencyjna była jak najcieńsza.
    4. Uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci.
      UWAGA: Próbka ta jest światłoczuła. Aby zmaksymalizować czas życia próbki, należy upewnić się, że szkiełko jest przechowywane w ciemnym miejscu, gdy nie jest używane.
  6. Przygotować próbkę z kuleczkami 3D (kuleczki 1 µm zatopione w żelu).
    1. Używając taśmy dwustronnej, utworzyć pionowy kanał o szerokości 4-5 mm na szkiełku przedmiotowym, składający się z trzech warstw taśmy.
    2. Położyć szkiełko zakrywe 22 mm x 22 mm na taśmie w centrum szkiełka. Mocno docisnąć obszary oklejone taśmą, aby zapewnić szczelne połączenie między taśmą a szkiełkiem zakrywym.
    3. Użyć żyletki, aby usunąć nadmiar taśmy.
    4. Przygotować 125 mL nasyconego roztworu gumy gellan, stopniowo dodając wodę dejonizowaną do 1 g proszku gumy gellan. Roztwór ten będzie stały w temperaturze pokojowej i ciekły w 65 °C.
    5. Wprowadzić 1 mL roztworu gumy gellan do probówki do mikrocentryfugi. Podgrzać naczynie z wodą na płycie grzejnej do 65 °C i ogrzewać probówkę do mikrocentryfugi, aż guma gellan stanie się widocznie lepka.
    6. Przygotować 10 µL rozcieńczenia kuleczek 1:1 000 w ogrzanym roztworze gumy gellan.
    7. Ostrożnie nanieść pipetą roztwór do komory, aż zostanie ona wypełniona. Za pomocą wykałaczki nałożyć niewielką ilość epoksydy po obu stronach kanału, całkowicie zakrywając otwory w celu uszczelnienia. Aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie, należy wizualnie sprawdzić oba końce, aby upewnić się, że epoksyda lekko wniknęła w każdy koniec kanału.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zdjęcia narzędzi do pozycjonowania. (A) Kolimowany laser do pozycjonowania. AL1: Soczewka pozycjonująca 1, −50 mm; AL2: Soczewka pozycjonująca 2, 100 mm (B) Obudowa pozycjonująca z podwójnym matowym dyskiem szklanym. Skróty: RMS CP = płytka gwintowana obudowy RMS; SM1 CP = płytka gwintowana obudowy SM1. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Ustawianie toru wzbudzenia

  1. Rozplanuj układ mikroskopu na powierzchni stołu optycznego. Zmierz wszystkie odległości jak najdokładniej.
    UWAGA: Należy odnieść się do Rycina 3 dotyczące rozmieszczenia komponentów w obrębie układu.
  2. Zamontuj laser wzbudzający na stole. Ustaw dwie przysłony na docelowej wysokości lasera i zamocuj je w odległości 2–3 stóp od siebie na wybranej linii otworów za położeniem lustra 1 (M1). Użyj tych przysłon, aby upewnić się, że wiązka jest równoległa do powierzchni stołu i wycentrowana względem linii otworów na stole optycznym.
    UWAGA: W celu ochrony oczu należy nosić okulary ochronne do pracy z laserem, a w ramach środków ostrożności osłonić wszelkie rozproszone wiązki lasera ekranami ochronnymi. Do momentu trwałego zamocowania wszystkich komponentów możliwy jest dryft w skali godzinowej. Na koniec każdego dnia należy ustawić przysłonę w najdalszym punkcie osiowania, aby po powrocie do pracy móc szybko wizualnie sprawdzić wystąpienie dryftu. Najczęstszymi przyczynami dryftu optycznego są wibracje, niewłaściwe wypoziomowanie stołu optycznego oraz prądy powietrza.
  3. Zamontuj migawkę laserową jak najbliżej lasera wzbudzającego. Używaj migawki do szybkiego blokowania wiązki lasera podczas ustawiania układu, zamiast wielokrotnego włączania i wyłączania lasera.
  4. Zamontuj filtry ND w kole filtrów ND (ND 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 oraz wolny slot), a następnie zainstaluj je za migawką lasera.
  5. Zamontuj zmotoryzowany siłownik na jednym stole translacyjnym (TS1), a następnie umieść stół pod lustrem M1. Upewnij się, że stół przesuwa się osiowo wzdłuż tej samej linii otworów, w której biegnie wiązka światła laserowego. W celu wstępnego ustawienia ustaw stół w połowie jego zakresu ruchu.
    1. W następnych krokach 2.6–2.10 należy pojedynczo wprowadzać refleksyjne komponenty optyczne do drogi wiązki, aby skierować laser zgodnie z wyznaczoną na stole ścieżką. Należy wykorzystać parę przysłon ustawionych na dokładnej wysokości, aby zdefiniować pożądany przebieg wiązki wyjściowej oraz prowadzić rozmieszczenie i wyrównanie każdego elementu refleksyjnego. W przypadku każdego elementu należy dostosować wysokość i pozycję uchwytu tak, aby wiązka wpadająca trafiała w jego centrum. Następnie należy obrócić podstawę uchwytu, aby skierować wiązkę wzdłuż wyznaczonej na stole ścieżki tak, aby przechodziła ona przez obie przysłony, a następnie precyzyjnie wyregulować nachylenie wiązki wyjściowej za pomocą pokręteł znajdujących się z tyłu każdego uchwytu.
      UWAGA: Po ustawieniu każdego elementu na właściwej wysokości, nałóż na słupek kołnierz zaciskowy, aby zablokować wysokość.
  6. Zamocuj i wyrównaj M1 na górze TS1.
  7. Zamocuj i wyrównaj lustro dichroiczne na stole.
  8. Zgodnie z instrukcjami producenta, podłącz galwanometr do zasilacza i generatora funkcji.
  9. Zamontuj skaner galwanometryczny w taki sposób, aby wiązka lasera padała dokładnie na środek lustra. Włącz zasilanie skanera, a następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk AM w generatorze przebiegów, aby ustawić nachylenie lustra na prąd stały 0 V DC (środek zakresu). Następnie wyrównaj skaner względem przysłon.
  10. Zamontuj i ustaw lustro 2 (M2).
  11. Wsuń duże lustro cylindryczne do uchwytu lustra cylindrycznego. Użyj prętów klatki 1 cal, aby przymocować adapter klatki 30-60 mm powyżej lustra 3 (M3). Za pomocą pokręteł w uchwycie lustra wyreguluj nachylenie lustra M3 do poziomu w celu wstępnego ustawienia.
  12. Zamocuj klatkę pozycjonującą z podwójnie matowionego szkła w adapterze klatki nad M3; Należy pamiętać o każdym razie dokręcaniu śrub blokujących w adapterze klatki, które utrzymują klatkę wyrównawczą na miejscu podczas przeprowadzania wyrównania.Zamocuj M3 do stołu i dostosuj wysokość oraz położenie tak, aby wiązka znajdowała się mniej więcej w centrum obu matowych szklanych dysków wyrównawczych. Przykręć M3 do stołu i użyj uchwytu słupkowego ze słupkiem o długości 3 cali, 90° zacisk oraz dwa słupki montażowe po obu stronach M3 w celu dodania wsparcia, wykorzystując otwory gwintowane po obu stronach uchwytu lustra. Do precyzyjnej regulacji wiązki należy użyć pokręteł znajdujących się z tyłu lustra.
    UWAGA: Wszystkie elementy odbijające w torze wzbudzenia zostały już ustawione i nie należy ich zmieniać.
  13. Zamocuj soczewkę 1 (L1) na stole. Przy wszystkich wstępnych ustawieniach soczewek użyj wkręcanego celu soczewkowego, aby wycentrować wiązkę wejściową na przedniej powierzchni soczewki. Reguluj nachylenie i pozycję boczną soczewki 1 (L1), aż wiązka zostanie wycentrowana na obu matowych płytkach szklanych w koszyku pozycjonującym nad M3.
  14. Zamontuj soczewkę 2 (L2) w odpowiedniej pozycji, aby stworzyć układ 4f wraz z soczewką L1. Przesuń L2 wzdłuż osi optycznej, aby uzyskać wiązkę skolimowaną, a następnie sprawdź kolimację, używając lasera wzbudzającego i płytki ścinającej. Dostosuj nachylenie oraz pozycję boczną L2, aby wycentrować wiązkę na obu matowych dyskach szklanych powyżej zwierciadła M3.
  15. Zamocuj otwór w formie pinhole w uchwycie translacyjnym xy. Zamocuj go na jednowymiarowej platformie translacyjnej (1D), aby zapewnić precyzyjną translację osiową. Zamocuj pinhole wraz z platformą na pręcie i uchwycie do pręta, a następnie umieść go w wspólnym punkcie ogniskowania pomiędzy L1 a L2. Ręcznie reguluj położenie pinhole, aż do momentu, gdy wiązka lasera stanie się widoczna przez otwór.
  16. Zamontuj czujnik miernika mocy bezpośrednio za otworem przypinowym (pinhole), a następnie za pomocą przycisku wyboru długości fali na konsoli cyfrowej miernika mocy wybierz długość fali lasera wzbudzającego. Dostrój pozycję xy otworu przypinowego, aby zmaksymalizować transmisję i uzyskać profil wiązki zbliżony do TEM00. Następnie za pomocą przesuwu 1D dostrój otwór przypinowy w osi, aby dodatkowo zmaksymalizować transmisję.
  17. Zamocuj soczewkę 4 (L4) na stole w wyznaczonym miejscu i ustaw uchwyt na odpowiedniej wysokości. Przesuń L4 wzdłuż osi tak, aby wiązka wzbudzenia była ogniskowana na powierzchni galwanometru. Dostosuj nachylenie i położenie boczne L4, aby wycentrować wiązkę na obu matowych dyskach szklanych nad M3.
  18. Zamocuj soczewkę 3 (L3) na stole w wyznaczonym miejscu i dostosuj uchwyt do odpowiedniej wysokości. Wykorzystaj laser wzbudzający oraz płytkę ścinającą, aby sprawdzić kolimację soczewek L3 i L4. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną soczewki L3 tak, aby wiązka znajdowała się w centrum obu matowych dysków szklanych nad lustrem M3.
  19. Tymczasowo usuń L3. Zamontuj soczewkę skanującą 1 (SL1) na stole i wyreguluj odległość osiową w celu utworzenia skolimowanego teleskopu z L4, mierząc ją za pomocą płytki ścinającej. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną SL1, aby wycentrować wiązkę na obu matowych dyskach szklanych nad M3.
  20. Ponownie włóż L3. Zamontuj soczewkę tubusową 1 (TL1), a następnie za pomocą wiązki wzbudzenia i płytki ścinającej skolimuj SL1 i TL1. Dostosuj nachylenie oraz pozycję boczną TL1 tak, aby wycentrować wiązkę na obu matowych dyskach szklanych powyżej M3.
  21. Za pomocą pierścienia adaptacyjnego wkręć obiektyw 1 (O1) do płyty klatki powyżej M3. Tymczasowo usuń SL1, aby wiązka padała na sufit. Reguluj wysokość (odległość osiową) O1 w systemie klatkowym, aż wiązka utworzy na suficie plamkę Airy'ego, a następnie kontynuuj regulację do momentu zminimalizowania rozmiaru plamki.
  22. Po ustawieniu O1 zamontuj stół z próbką w odpowiedniej pozycji.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Rozmieszczenie komponentów w systemie SOLS. (A) Schematyczny układ systemu SOLS z opisanymi wszystkimi komponentami. (B) Zdjęcie systemu SOLS z góry na stole optycznym, z wyłączeniem obszaru stolika z próbką. (C) Zdjęcie obszaru stolika z próbką z góry (rozszerzenie Rysunku 3B). Ścieżka wzbudzenia zaznaczona jest kolorem zielonym. Ścieżka emisji zaznaczona jest kolorem czerwonym. Ogniska soczewek: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3: 150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Szczegółowe specyfikacje części znajdują się w Tabeli materiałów. Skróty: SOLS = single-objective light-sheet; ND Wheel = obrotowe koło filtrów neutralnych; L1-L4 = achromatyczne soczewki plano-wklęsłe; CL1-CL3 = soczewki cylindryczne; M1-M3 = lustra; TS1-TS2 = stoliki translacyjne; DM = lustro dichroiczne; Galvo = galwanometr skanujący; SL1-SL2 = soczewki skanujące; TL1-TL2 = soczewki tubusowe; O1-O3 = obiektywy; EF = filtr emisyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Ustawianie toru emisji

  1. Przygotuj laser do wyrównania.
    1. Zamontuj dwie puste płytki klatkowe obok lasera wzbudzającego na tej samej wysokości co laser. Użyj tych płytek klatkowych do zamontowania lasera do wyrównania, wsuwając pręty klatkowe lasera do wyrównania w puste otwory w obu płytkach klatkowych. Upewnij się, że laser może zostać ustawiony w pozycji włączonej, albo poprzez zaklejenie przycisku zasilania, albo poprzez podłączenie przełącznika włącz/wyłącz.
    2. Zdejmij O1 i ponownie włóż klatkę wyrównawczą z matowego szkła. Użyj jednej kinematycznej oprawy lustra i jednego lustra opadającego, aby wyrównać wiązkę wyrównawczą do ścieżki wiązki wzbudzającej.
    3. Użyj miernika mocy, aby zmaksymalizować sygnał wiązki wyrównawczej za otworkiem (pinhole), precyzyjnie regulując oba lustra. Upewnij się, że wiązka pozostaje wyśrodkowana na klatce wyrównawczej z matowego szkła.
  2. Zdejmij klatkę wyrównawczą i ponownie włóż O1. Umieść lustro kwadratowe na stoliku z próbką O1 i reguluj lustro osiowo, aż rozmiar profilu wiązki za lustrem dichroicznym zostanie zminimalizowany.
  3. Zamontuj jedną przysłonę irysową na ścieżce emisji, wystarczająco daleko z tyłu, aby soczewkę skanującą 2 (SL2), soczewkę tubusową 2 (TL2) i obiektyw 2 (O2) można było włożyć bez kolizji. Wyrównaj tę przysłonę do lasera wyrównawczego. Zamontuj dysk z matowego szkła co najmniej 1 in za przysłoną i upewnij się, że jest on również wyrównany do światła lasera.
  4. Włóż SL2 w odpowiedniej odległości, zmierzonej linijką od galwanometru. Dostosuj pochylenie i pozycję boczną SL2 tak, aby wpadająca wiązka wyrównawcza była wyśrodkowana na SL2, a wiązka wychodząca przechodziła przez przysłonę i dysk z matowego szkła.
  5. Włóż TL2 w odpowiedniej odległości, zmierzonej linijką od SL2. Dostosuj pochylenie i pozycję boczną TL2 tak, aby wpadająca wiązka wyrównawcza była wyśrodkowana na TL2, a wiązka wychodząca przechodziła przez przysłonę i dysk z matowego szkła.
  6. Zamontuj TS2 na stole. Upewnij się, że stolik przesuwa się wzdłuż osi optycznej O2.
  7. Przykręć O2 do oprawy translacyjnej xy. Połącz trzpień pod oprawą xy, aby zamontować O2 na stoliku translacyjnym. Użyj przykręcanego celu, aby wyśrodkować tył O2 na czerwonym laserze.
  8. Dostosuj pokrętła xy i pochylenie O2 tak, aby czerwona wiązka wyrównawcza przechodziła przez przysłonę i dysk z matowego szkła.
  9. Przesuń laser wyrównawczy nad O1 i skieruj go w dół do ścieżki emisji. Włącz laser i upewnij się, że wiązka ta jest wyśrodkowana na wszystkich soczewkach w ścieżce emisji.
  10. Sprzęż płaszczyzny źrenic O1 i O2, otwierając przysłonę i usuwając dysk z matowego szkła, tak aby wiązka wyrównawcza wychodząca z O2 kontynuowała bieg bez przeszkód do odległej powierzchni lub ściany (>0,5 m) (Rysunek 4). Reguluj TS2, aż wiązka utworzy mały krążek Airy’ego na powierzchni, a następnie kontynuuj regulację TS2, aby zminimalizować rozmiar krążka Airy’ego.
    UWAGA: Silnie rozbieżna wiązka wskazuje na nieprawidłowe umieszczenie O2. Jednakże, ponieważ wiązka ta przechodzi przez dwa obiektywy, niewielka rozbieżność jest nieunikniona. W związku z tym krążek Airy’ego jest najlepszym wskaźnikiem.
  11. Zoptymalizuj galwanometr pod kątem skanowania niezmiennego względem pochylenia: Naciśnij przycisk FSK na generatorze przebiegów, aby wybrać sygnał fali trójkątnej dla galwanometru i ustaw niską częstotliwość (~1 Hz). Obserwuj wiązkę wyrównawczą na tej samej odległej powierzchni lub ścianie.
    UWAGA: Jeśli galwanometr jest umieszczony nieprawidłowo, wiązka będzie przesuwać się poziomo po powierzchni wraz z ruchem galwanometru. Można to rozwiązać poprzez precyzyjne korekty (ręczne) pochylenia i pozycji xy podstawy galwanometru, aż przesunięcie wiązki stanie się niedostrzegalne dla oka.
  12. Sprawdź jakość systemu, wykonując obrazowanie pod kątem 0°.
    1. Przykręć O3 do oprawy translacyjnej xy. Przykręć tubus soczewkowy 1 in do klatkowego stolika translacyjnego, a następnie przykręć stolik translacyjny xy do tubusu. Użyj dwóch prętów klatkowych, aby połączyć przód klatkowego stolika translacyjnego z płytką klatkową, a płytkę klatkową zamontuj na trzpieniu. Zamontuj obiektyw 3 (O3) blisko przodu O2 (~4-5 mm) pod kątem 0° i dostosuj wysokość.
    2. Zamontuj wyrównawczy dysk z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 a TL2, zmierzonej linijką. Zamontuj akrylowy fluorescencyjny preparat testowy na stoliku i oświetl go laserem wzbudzającym. Patrząc przez tył O3, dostosuj zarówno wysokość, jak i pozycję osiową O3, aby znaleźć światło emisji, a następnie reguluj O3 osiowo, aż światło emisji wypełni tylną aperturę (Rysunek 5).
    3. Przykręć dwa 8-calowe pręty klatkowe do tyłu stolika translacyjnego O3. Nasuń na pręty płytkę klatkową z zamontowanym dyskiem z matowego szkła, a następnie precyzyjnie wyreguluj O3 za pomocą oprawy xy, aby upewnić się, że światło emisji wychodzi z O3 w sposób wyśrodkowany. Następnie usuń pręty klatkowe.
    4. Zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonej pozycji sensora kamery i wyrównaj wysokość oraz pozycję dysku do światła emisji.
    5. Przykręć soczewkę tubusową 3 (TL3) do płytki klatkowej i zamontuj ją bezpośrednio za O3. Wyśrodkuj TL3 na wpadającym świetle emisji, a następnie dostosuj pochylenie TL3, aby wyrównać wychodzące światło do dysku z matowego szkła.
    6. Zamontuj kamerę w odpowiedniej odległości od soczewki tubusowej, zmierzonej linijką.
    7. Przykręć oba tubusy soczewkowe 2 in oraz filtr emisji do kamery.
    8. Ponownie zamontuj wyrównawczy dysk z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 a TL2. Zamontuj testową próbkę z barwnikiem fluorescencyjnym i oświetl próbkę wiązką wzbudzającą.
    9. Włącz kamerę, a następnie otwórz program Micromanager na podłączonym komputerze. Kliknij Live, aby przejść do podglądu na żywo. Kliknij Auto Once, aby ustawić wstępne parametry ekspozycji, a następnie zresetuj ekspozycję w razie potrzeby podczas obrazowania.
      UWAGA: Micromanager nie będzie działać prawidłowo, jeśli zostanie uruchomiony po włączeniu kamery.
    10. Reguluj pokrętła translacji xy w oprawie O3, aż mały otwór w szklanym dysku wyrównawczym zostanie wyśrodkowany w polu widzenia (FoV). Reguluj O3 osiowo za pomocą klatkowego stolika translacyjnego, aż otwór zostanie ostry; krawędzie powinny być wyraźne (Rysunek 6).
    11. Wykonaj obrazowanie kulek fluorescencyjnych, aby sprawdzić jakość systemu.
      1. Usuń wyrównawczy dysk z matowego szkła, zamontuj próbkę z kulkami 3D i oświetl próbkę wiązką wzbudzającą.
      2. Reguluj wysokość próbki względem O1, aż kulki fluorescencyjne wypełnią okrągły obszar w centrum FoV.
      3. Precyzyjnie reguluj pozycję O3 za pomocą stolika xy i stolika translacji osiowej, aż funkcje rozproszenia punktu (PSF) będą okrągłe (co wskazuje na minimalne aberracje) i jasne (co wskazuje na dobry stosunek sygnału do szumu) (Rysunek 7). Jeśli nie można tego osiągnąć poprzez regulację O3, jest bardzo prawdopodobne, że układ optyczny pomiędzy komponentami O1 i O2 jest wyrównany suboptymalnie; wykonaj kroki diagnostyczne opisane w punkcie 3.13 poniżej.
      4. Jeśli uda się uzyskać okrągłe PSF, pomiń krok diagnostyczny i przejdź do pochylania systemu obrazowania.
  13. Wykonaj kontrole diagnostyczne, jeśli są potrzebne.
    UWAGA: Po uzyskaniu dobrych PSF pozostałe kroki diagnostyczne można pominąć.
    1. Zamontuj światło pola jasnego (BF) nad O1. Zamontuj pozytywny cel testowy w formie siatki na stoliku z próbką na tej samej wysokości osiowej co lustro wyrównawcze. Wyśrodkuj siatkę 10 µm i oświetl ją światłem BF.
    2. Wykonaj obraz siatki kamerą i przesuwaj próbkę, aż siatka będzie ostra. Użyj obrazu siatki, aby potwierdzić, że pole w całym FoV jest płaskie: jeśli nie, siatka będzie wydawać się zniekształcona i wygięta. Aby skorygować wadliwy obraz siatki, dostosuj pozycję xyz i pochylenie O3, a następnie odpowiednio dostosuj TL3 i kamerę.
      UWAGA: Jeśli uda się uzyskać płaską siatkę, powtórz krok 3.12.10, a następnie przejdź do pochylania systemu obrazowania.
    3. Ustaw kamerę wyrównawczą lub kamerę obrazującą w odpowiedniej odległości, tak aby SL2 skupiała obraz na sensorze. Wykonaj obraz celu siatki w płaszczyźnie pośredniej (Rysunek 8). Jeśli ta siatka również jest skrzywiona, jest bardzo prawdopodobne, że układ optyczny pomiędzy komponentami O1 a SL2 jest wyrównany suboptymalnie i należy do niego wrócić. Zoptymalizuj wyrównanie w razie potrzeby przed kontynuacją.
      UWAGA: Jeśli kamera nie mieści się pomiędzy SL2 a TL2, użyj dodatkowego lustra, aby odbić obraz o 90° za SL2 na kamerę.
    4. Sprawdź PSF w płaszczyźnie pośredniej: Po sprawdzeniu siatki inną dobrą metodą diagnostyczną jest sprawdzenie PSF w tej samej płaszczyźnie pośredniej. Dobry obraz w tej płaszczyźnie, podobny do Rysunek 7, ale przy innym powiększeniu (Rysunek 9), wskazuje na prawidłowe wyrównanie przez SL2.
      UWAGA: Jeśli w płaszczyźnie pośredniej uda się uzyskać płaską siatkę i okrągłe PSF, powtórz krok 3.13.2, następnie krok 3.12.10, a potem przejdź do pochylania systemu obrazowania.
  14. Pochyl podsystem obrazowania O3 do 30°.
    1. Zdejmij O3, TL3 i kamerę.
    2. Ponownie włóż O3 pod kątem 30° do osi optycznej O2, używając linii na stole jako prowadnicy.
    3. Zamontuj wyrównawczy dysk z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 a TL2. Zamontuj akrylowy fluorescencyjny preparat testowy na stoliku i oświetl go laserem wzbudzającym. Ponownie spójrz przez tył O3, dostosuj wysokość i pozycję osiową O3, aby znaleźć światło emisji pod kątem 30°, a następnie reguluj O3 osiowo, aż światło emisji wypełni tylną aperturę.
    4. Usuń wyrównawczy dysk z matowego szkła z przestrzeni między SL2 a TL2, aby uzyskać silniejszy sygnał emisji.
    5. Przykręć dwa 8-calowe pręty klatkowe do tyłu stolika translacyjnego O3. Nasuń na pręty płytkę klatkową z zamontowanym dyskiem z matowego szkła, a następnie precyzyjnie wyreguluj O3 za pomocą oprawy xy, aby upewnić się, że światło emisji wychodzi z O3 w sposób wyśrodkowany. Następnie usuń pręty klatkowe.
    6. Zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonej pozycji sensora kamery i wyrównaj wysokość oraz pozycję dysku do światła emisji.
    7. Zamontuj TL3 bezpośrednio za O3. Wyśrodkuj TL3 na wpadającym świetle emisji, a następnie dostosuj pochylenie TL3, aby wyrównać wychodzące światło do dysku z matowego szkła.
    8. Aby dokładniej ustawić odległość TL3-kamera, ostrożnie wykręć O3 i zamontuj laser wyrównawczy tak, aby był skupiany przez TL3 na kamerze. W razie potrzeby użyj filtrów ND, aby intensywność lasera była <1 mW. Uruchom podgląd na żywo kamery i reguluj TL3 osiowo, aby zminimalizować plamkę lasera na kamerze.
    9. Ponownie zamontuj wyrównawczy dysk z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 a TL2. Zamontuj testową próbkę z barwnikiem fluorescencyjnym i oświetl próbkę wiązką wzbudzającą. Reguluj pokrętła translacji xy w oprawie O3, aż mały otwór w szklanym dysku wyrównawczym znajdzie się w FoV kamery. Reguluj klatkowy stolik translacyjny, aby przesuwać O3 osiowo, aż otwór zostanie ostry; upewnij się, że otwór wygląda podobnie jak przy 0°.
    10. Ponownie zamontuj pozytywny cel testowy w formie siatki na tej samej wysokości osiowej i oświetl siatkę światłem BF. Potwierdź, że tylko jedna sekcja pionowa jest ostra (ze względu na pochylenie 30°). Ponownie użyj obrazu siatki, aby potwierdzić, że pole w całym FoV jest płaskie, nawet gdy jest nieostre. Gdy preparat jest przesuwany osiowo, potwierdź, że ostra część FoV (cel siatki) przesuwa się poziomo po ekranie, podczas gdy kwadraty siatki zachowują stały rozmiar (Rysunek 10).
      UWAGA: Ze względu na pochylenie płaszczyzny obrazowania przy próbce, siatka może wydawać się lekko rozciągnięta w płaszczyźnie x.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Technika laser-in-laser-out. Przesyłanie skolimowanego wiązki testowej przez przednią stronę O1 i obserwacja wiązki wychodzącej z O2 na odległej powierzchni. Jeśli wszystkie komponenty są wyrównane w odpowiedniej odległości, wiązka utworzy mały dysk Airy'ego na odległej powierzchni. Wszystkie skróty są identyczne jak na Rysunku 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rycina 5: Wykorzystanie światła emisji do wyrównania. (A) Światło emisji z akrylowego preparasu fluorescencyjnego na wkręcanym celu za BFP obiektywu O2. (B) Lokalizacja światła emisji wzrokowo przez tył obiektywu O3. Skróty: O2-O3 = obiektywy; BFP = tylna płaszczyzna ogniskowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-5
Rycina 6: Obraz z kamery przedstawiający prawidłowo ustawioną ostrość matowego szklanego dysku wyrównawczego. Dysk został umieszczony w płaszczyźnie pośredniej między SL2 a TL2. Pasek skali = 50 µm. Skróty: SL2 = soczewka skanująca; TL2 = soczewka tubusowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-6
Rycina 7: Obraz z kamery próbki 3D z kuleczkami. Na obrazie przedstawiono kuleczki o rozmiarze 1 nm przy module obrazowania ustawionym na 0°, oświetlone wiązką kołową przed włożeniem soczewek cylindrycznych. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-7
Rysunek 8: Pozytywny obiekt testowy w postaci siatki prawidłowo ustawiony w płaszczyźnie pośredniej między SL2 a TL2. Płaskie siatki w całym polu widzenia wskazują na prawidłowe wyrównanie komponentów SL2 i wcześniejszych. Pasek skali = 30 µm. Skróty: SL2 = soczewka skanująca; TL2 = soczewka tubusowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-8
Rysunek 9: Obraz z kamery próbki kulek 3D. Na obrazie widoczne są kulki 1 nm prawidłowo skupione w płaszczyźnie pośredniej między SL2 a TL2. Pasek skali = 30 µm. Skróty: SL2 = soczewka skanująca; TL2 = soczewka tubusowa. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-protocol-9
Rycina 10: Pozytywny wynik testu siatki z nałożonym żółtym kwadratem o stałym rozmiarze, dopasowanym do kwadratów siatki. (A) Siatka w punkcie ostrości po lewej stronie. (B) Siatka w punkcie ostrości po prawej stronie. Żółty kwadrat odpowiada rozmiarowi pól siatki po obu stronach FoV. Paski skali = 30 µm. Skrót = FoV = pole widzenia. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

4. Ustawianie ukośnej płaszczyzny światła

  1. Wyjmij O1 i w miejsce niego ponownie włóż klatkę wyrównawczą z podwójnym matowym szkłem. Potwierdź, że wiązka jest skolimowana i wycentrowana na obu matowych dyskach szklanych.
  2. Wkręć soczewkę cylindryczną 1 (CL1) do obrotowej oprawy soczewki. Zamontuj CL1 w drodze optycznej i obróć oprawę tak, aby wiązka była rozszerzona w kierunku prostopadłym do stołu optycznego. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL1, aby wiązka była wycentrowana z przodu i zachowała wycentrowaną pozycję na obu matowych dyskach szklanych.
  3. Wkręć soczewkę cylindryczną 2 (CL2) do obrotnej oprawy soczewki i zamontuj CL2 w drodze optycznej w odpowiedniej odległości, aby utworzyć układ 4f z CL1. Obróć CL2 do tej samej orientacji co CL1, aby wiązka była rozciągnięta w kierunku prostopadłym do stołu optycznego i skolimowana. Użyj karty testowej do pomiaru wysokości profilu wiązki cylindrycznej w wielu miejscach, aby upewnić się, że wiązka jest skolimowana. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL2, analogicznie do kroku 4.2.
  4. Wkręć soczewkę cylindryczną 3 (CL3) do obrotnej oprawy soczewki i zamontuj CL3 w drodze optycznej w odpowiedniej odległości, aby utworzyć układ 4f z L3. Obróć CL3 do tej samej orientacji co CL1 i CL2, aby wiązka została skupiona do postaci poziomej płaszczyzny w płaszczyźnie ogniskowej. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL3, analogicznie do kroku 4.2.
  5. Włóż szczelinę: używając czterech 4-calowych prętów klatki oraz uchwytu klatkowego CL3, zamontuj szczelinę w orientacji pionowej w płaszczyźnie ogniskowej między CL3 a L3, mierząc odległość linijką. Wykorzystaj rozciągnięty profil wiązki wzbudzenia, aby dostosować wysokość i pozycję boczną szczeliny, aż zostanie ona wycentrowana na wiązce.
  6. Ponownie włóż O1, zamontuj próbkę testową z barwnikiem fluorescencyjnym i oświetl próbkę arkuszem światła wzbudzenia. Na matrycy kamery potwierdź, że arkusz światła pod kątem 0° wygląda jak cienka pionowa płaszczyzna (Rysunek 11A).
  7. Wyjmij próbkę testową z barwnikiem fluorescencyjnym i przemyj O1. Pozwól arkuszowi światła rozszerzyć się nad O1 bez przeszkód. Używając sterowania zmotoryzowanym stołem translacyjnym, przesuń M1 w stronę soczewek cylindrycznych, aby ustawić kąt arkusza światła na około 60° względem osi optycznej O1.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby arkusz światła był nachylony w odpowiednim kierunku, aby pokrywał się z analogicznie nachyloną płaszczyzną obrazowania (Rysunek 12); jeśli system jest zbudowany inaczej niż w tym konkretnym projekcie, właściwy kierunek nachylenia można wyznaczyć za pomocą geometrycznego śledzenia promieni.
    UWAGA: Dla odniesienia, przesunięcie M1 o 2,647 mm w stronę szczeliny pozwoliło ustawić prawidłowe nachylenie arkusza światła w tej konfiguracji.
  8. Ponownie włóż próbkę testową z barwnikiem fluorescencyjnym, aby obrazować nachylony arkusz. Upewnij się, że arkusz światła zachowuje pionowy kształt wiązki na kamerze, ale jest szerszy i słabiej widoczny (Rysunek 11B).
  9. Przesuwaj próbkę osiowo za pomocą stołu, tak aby barwnik fluorescencyjny był oświetlany przez arkusz światła na pięciu różnych głębokościach pomiędzy centrum pola widzenia (FoV) a prawą stroną ekranu. Zapisz każdy obraz.
  10. Otwórz obrazy w programie Fiji. Dla każdego obrazu wybierz narzędzie linii (Line tool) i narysuj poziomą linię od centrum FoV do centrum arkusza światła. Aby zmierzyć przesunięcie, przejdź do Analyze | Measure, aby sprawdzić długość linii. Następnie wykreśl przesunięcie arkusza światła jako funkcję głębokości próbki, aby obliczyć kąt arkusza światła nad O1.
  11. Przesuń M1 niewielko. Powtarzaj krok 4.9 i krok 4.10, aż kąt arkusza światła wyniesie 60° od osi optycznej O1, odpowiadając kątowi płaszczyzny obrazowania.

figure-protocol-10
Rysunek 11: Obrazy z kamery próbki barwnika fluorescencyjnego oświetlonej prawidłowo ukształtowaną płaszczyzną światła. (A) Płaszczyzna pod kątem 90°, skierowana prosto wzdłuż osi optycznej O1, oraz (B) nachylona pod kątem 30° (60° względem osi optycznej O1). Paski skali = 50 µm. Skrót: O1 = obiektyw. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-11
Rysunek 12: Prawidłowy kierunek nachylenia arkusza światła w celu wyrównania z płaszczyzną obrazowania O1. Skróty: O1-O3 = obiektywy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Optymalizacja systemu do obrazowania i gromadzenia danych

  1. Zamocuj preparat z koralikami 3D i przesuń próbkę wzdłuż osi za pomocą stolika, aż koraliki wypełnią pole widzenia (FoV) kamery.
  2. Dostrój O3, korzystając ze stolika xy oraz przesuwnego uchwytu klatkowego, dążąc do zminimalizowania aberracji i optymalizacji stosunku sygnału do szumu na obrazie (Rysunek 13).
  3. Dostrój pierścień korekcyjny O1, dążąc do zminimalizowania aberracji i optymalizacji stosunku sygnału do szumu na obrazie.

figure-protocol-12
Rycina 13: Obrazy z kamery próbki 3D z kuleczkami (kuleczki 1 µm) oświetlonej prawidłowo uformowaną płaszczyzną światła. (A) Płaszczyzna pod kątem 90°, skierowana pionowo wzdłuż osi optycznej O1, oraz (B) nachylona pod kątem 30° do osi optycznej O1. Żółta ramka wskazuje część FoV, która jest płaska, jednorodna i użyteczna (80 µm x 80 µm), a w której można zarejestrować wiarygodne dane. Paski skali = 50 µm. Skróty: O1 = obiektyw; FoV = pole widzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Kalibracja powiększenia systemu

  1. Zamocuj pozytywny wzorzec siatki na stole obiektowym i oświetl go światłem w polu jasnym.
  2. Przesuń preparat z siatką wzdłuż osi za pomocą stołu, aby ustawić ostrość. Ustaw ostrość na środku siatki.
  3. Przechwyć i zapisz obraz, a następnie otwórz go w programie Fiji.
  4. Użyj narzędzia linii (Line tool) oraz funkcji pomiaru (Measure function) w programie Fiji, aby dokładnie zmierzyć odległość między dwiema liniami siatki w pikselach. Podziel tę wartość przez znaną odległość (10 µm), aby wyznaczyć kalibrację piksel-mikrometr.
  5. Oblicz powiększenie (M) systemu, korzystając z zmierzonego rozmiaru piksela i znanego rozmiaru piksela zgodnie z równaniem (1).
    figure-protocol-13     (1)

7. Pozyskiwanie skanów wolumetrycznych

  1. Ustawienie próbki.
    1. Włącz podgląd kamery, galwanometr, generator funkcji, zasilacz, stół i laser wzbudzający.
    2. Zamocuj próbkę, a następnie kliknij przycisk FSK w generatorze funkcji, aby ustawić falę trójkątną. Aby zlokalizować próbkę, użyj generatora funkcji do ustawienia następujących parametrów: amplituda szczyt-szczyt 400 mV (za pomocą przycisku Ampl.), offset 0 (za pomocą przycisku Offset) oraz częstotliwość 200 mHz. W oknie Micromanager ustaw czas ekspozycji 100 ms.
    3. Przesuwaj oś z ręcznie, aż do osiągnięcia płaszczyzny próbki. Zoptymalizuj ustawienie z tak, aby pożądany obszar dla skanowania wolumetrycznego przesuwał się przez ekran podczas jednego cyklu.
  2. Wybór parametrów skanowania.
    1. Upewnij się, że amplituda szczyt-szczyt jest ustawiona prawidłowo, sprawdzając wizualnie, czy podgląd wydaje się być w ostrości przez cały czas trwania skanowania. Jeśli jakość obrazu pogarsza się szybciej przy zbliżaniu się do jednego z końców skanu niż do drugiego, zmień wartość offsetu w generatorze funkcji, aby przesunąć centrum skanowania w stronę obszaru o lepszej jakości.
    2. W programie Micromanager wybierz czas ekspozycji i kliknij Multi-D Acq., aby otworzyć okno akwizycji wielowymiarowej (Multi-Dimensional Acquisition window). W polu Count wybierz liczbę klatek, co ustali całkowity czas akwizycji. Odstęp między klatkami (częstotliwość klatek) będzie określony przez czas ekspozycji, chyba że w polu Interval zostanie określony dłuższy odstęp. W generatorze funkcji ustaw częstotliwość tak, aby stworzyć pełny skan wolumetryczny w ciągu połowy okresu funkcji fali trójkątnej (skan liniowy w jednym kierunku).
      UWAGA: Jeśli częstotliwość klatek i częstotliwość generatora będą zbyt niskie, zostanie pozyskane zbyt mało klatek dla skanu wolumetrycznego, a niska liczba klatek spowoduje widoczne artefakty podczas post-processingu. Dla odniesienia, Rysunek 13 został złożony z ~100 klatek w skanie, a Rysunek 14 z ~800. Przy wyborze parametrów krytyczne jest również uwzględnienie samej próbki. Upewnij się, że czas ekspozycji jest ustawiony tak, aby próbka była wystarczająco wzbudzona, ale nie nasycona. W tym celu można również dostosować intensywność lasera wzbudzającego. Jeśli użytkownik pozyskuje serię skanów wolumetrycznych w celu charakterystyki procesu zmiennego w czasie w 3D, należy upewnić się, że skala czasowa skanowania przekracza dynamikę czasową systemu.
  3. Gromadzenie filmów: Wykonaj nagranie time-lapse, które obejmuje co najmniej czas trwania pełnego narastania lub opadania fali trójkątnej, odpowiadający jednemu pełnemu skanowi objętości.

8. Procedury postprocessingu

  1. Korekta skosu (deskewing) wolumetrycznych stosów obrazów
    1. Przeprowadź korektę skosu skanów wolumetrycznych, aby przekształcić stos obrazów w płaszczyznach nachylonych w serię obrazów w rzeczywistych współrzędnych xyz.
      UWAGA: Istnieje wiele doskonałych przewodników dotyczących postprocessingu obrazów z mikroskopii arkusza światła oraz oprogramowania open-source służącego do korekty skosu istniejących skanów wolumetrycznych, a także do wykonywania korekty skosu i zapisywania obrazów skorygowanych podczas akwizycji24.
    2. Aby skorygować skos skanów wolumetrycznych, należy wyznaczyć dwa następujące parametry: rzeczywistą odległość między dwiema klatkami w pikselach (d) oraz kąt między płaszczyzną klatki a płaszczyzną x-y (θ ustalony przez kąt skośnego arkusza światła (w tym systemie 30°)). Odległość między klatkami będzie zależała od optyki obrazowania i ustawień akwizycji.
  2. Wyznaczanie parametru d
    1. Kalibruj odległość między klatkami za każdym razem, gdy system zostanie w znacznym stopniu ponownie wyrównany. Przeprowadź tę kalibrację, używając stosu obrazów kulek fluorescencyjnych, ponieważ są one najłatwiejsze do wykorzystania w diagnozowaniu problemów.
    2. Pozyskaj stos obrazów i uruchom kod do korekty skosu, używając dowolnego wartości początkowej dla parametru d. Otwórz skorygowany stos obrazów w programie ImageJ i przejrzyj go. Jeśli d zostało ustawione zbyt daleko od swojej rzeczywistej wartości, zauważysz, że kuleczki będą wydawać się sztucznie wydłużone w osi x lub y, a poszczególne kuleczki będą sprawiać wrażenie przesuwania się w płaszczyźnie xy podczas przewijania klatek w osi z (zamiast ostrości i rozmycia względem tego samego punktu centralnego). Powtarzaj proces zmiany parametru d wielokrotnie, aż problemy te przestaną być widoczne.
    3. Gdy parametr d będzie wydawał się wystarczająco bliski wartości rzeczywistej, oblicz maksymalne projekcje intensywności stosu obrazów w kierunkach x i y. Należy zauważyć, że kuleczki o średnicy zbliżonej do granicy dyfrakcyjnej mogą wydawać się wydłużone w osi z, ale idealnie nie powinny mieć kształtu stożka ani być wydłużone po przekątnej. Precyzyjnie dostrajaj parametry korekty skosu, aż kryteria te nie będą ulegać znaczącej poprawie w kolejnych iteracjach. Dla odniesienia, dane przedstawione na Rysunku 13 zostały poddane korekcie skosu przy d = 2.50 pixels, a dane na Rysunku 14 przy d = 1.0 pixels.
      ​UWAGA: Odległość między klatkami zależy liniowo od amplitudy skanowania, częstotliwości i szybkości klatek.

Wyniki

Wykonaliśmy skany wolumetryczne kulek o średnicy 1 µm zatopionych w gumie gellanowej. Rysunek 14 przedstawia maksymalne projekcje intensywności skorygowanych o skośność skanów wolumetrycznych wzdłuż kierunków x, y i z.

figure-results-1
Rycina 14: Obrazowanie wolumetryczne fluorescencyjnych kulek o rozmiarze 1 µm w gumie gellanowej. Przedstawiono projekcje maksymalnej intensywności skorygowanych wolumetrycznych skanów. Paski skali = 30 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykazaliśmy zastosowanie jednobiektywowego mikroskopu z arkuszem światła do charakterystyki zrekonstruowanych sieci cytoszkieletu poprzez skanowanie wolumetryczne próbek asterów mikrotubularnych. W skrócie, znakowane rhodaminą, stabilizowane taxolem mikrotubule spolimeryzowano z zrekonstruowanych dimerów przy użyciu GTP; następnie, po polimeryzacji, do próbek dodano klastry silników kinesynowych oparte na streptawidynie wraz z ATP, aby uzyskać stężenia końcowe 6 µM mikrotubul, 0,5 µM dimerów kinesyny i 10 mM ATP. Szczegółowe protokoły i instrukcje przygotowania stabilizowanych taxolem mikrotubul oraz klastrów silników kinesynowych można znaleźć na stronach internetowych Mitchson Lab oraz Dogic Lab25,26. Próbki ostrożnie naniesiono pipetą na szkiełka przedmiotowe, uszczelniono i pozostawiono na 8 h przed obrazowaniem, aby aktywność silników ustała, a próbki osiągnęły stabilny stan strukturalny przypominający astery.

W badaniach nad zrekonstytuowanymi systemami cytoszkieletu najczęściej wykorzystuje się mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną do obrazowania znakowanych filamentów. Jednak obie te techniki mają ograniczone możliwości obrazowania gęstych próbek 3D27. Mimo że w badaniach nad aktywną materią opartą na cytoszkielecie in vitro poczyniono duże postępy poprzez ograniczanie próbek do formy quasi-2D28,29, sieci cytoszkieletu są z natury trójwymiarowe, a wiele obecnych wysiłków koncentruje się na zrozumieniu efektów, które mogą wystąpić wyłącznie w próbkach 3D29,30, co stwarza potrzebę zastosowania wysokorozdzielczego obrazowania 3D.

figure-results-2
Rycina 15: Ułatwienie wizualizacji 3D próbek zrekonstytuowanego cytoszkieletu za pomocą mikroskopii arkusza światła z jednym obiektywem. (A) Obrazy fluorescencyjnych asterów mikrotubul uzyskane za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica DMi8. Obrazy przedstawiają różne płaszczyzny z serii skanów z wzdłuż osi z. Pasek skali = 30 µm. (B) Zdekonwolwowane i skorygowane pod kątem skośności (deskewed) obrazy z jednowolumetrycznego skanu wykonanego na tym samym próbce przy użyciu układu mikroskopii arkusza światła z jednym obiektywem. Pasek skali = 30 µm. Obszar obrazu po korekcie skośności odpowiada tutaj użytecznemu polu widzenia FoV (żółta ramka) przedstawionemu na Rycini 13B. Podczas gdy mikroskop konfokalny doskonale obrazuje pojedyncze płaszczyzny w pobliżu szkiełka nakrywkowe, gęstość fluorescencyjnej próbki powoduje komplikacje podczas obrazowania w wyższych płaszczyznach ze względu na dodatkowy sygnał z obszarów poniżej płaszczyzny obrazowania. Arkusz światła rozwiązuje ten problem, oświetlając jedynie płaszczyznę obrazowania, co pozwala na uzyskanie jednolicie ostrych obrazów w różnych płaszczyznach z. Skróty: SOLS = single-objective light-sheet (arkusz światła z jednym obiektywem); FoV = field of view (pole widzenia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Na Rysunku 15 przedstawiamy obrazowanie wolumetryczne zrekonstytuowanej sieci mikrotubul skurczonej w struktury przypominające astery przez klastry motorów kinezynowych. Jak pokazano w poprzednich badaniach28,31, struktury 3D te mają tendencję do zagęszczania się w kierunku centrum, co skutkuje występowaniem jasnych obszarów fluorescencji, które dominują w sygnale. W płaszczyznach obrazowania blisko szkiełka podstawowego (niski poziom z), mikroskopia konfokalna (Rysunek 15A) pozwala rozdzielić pojedyncze filamenty na obrzeżach astera, przy dodatkowym tle w kierunku centrum wynikającym z sygnałów fluorescencji poza ogniskową pochodzących z warstw powyżej. Jednak przesunięcie o kilka mikronów w osi z szybko obniża jakość obrazów, ponieważ w płaszczyźnie obrazowania w sygnale dominują gęste sekcje astera znajdujące się poza ogniskową. Jednopłaszczyznowe oświetlenie arkuszem światła (Rysunek 15B) eliminuje sygnały poza ogniskową z gęstych części astera powyżej i poniżej płaszczyzny obrazowania, co pozwala na uzyskanie porównywalnej jakości obrazu między płaszczyznami. Zdolność arkusza światła do generowania wysokiej jakości, wiarygodnych danych z przeskanowania wolumetrycznego otwiera możliwość wizualizacji i charakteryzacji zjawisk 3D w zrekonstytuowanych systemach cytoszkieletu.

Dyskusja

Dwa ważne szczegóły dotyczące tego protokołu to całkowity koszt systemu oraz oczekiwany czas budowy i wyrównania. Chociaż dokładny koszt jest zmienny, możemy spokojnie oszacować, że koszt in toto tego SOLS lub podobnego systemu DIY mieściłby się w przedziale 85 000 USD. Zwracamy uwagę, że szacunki te uwzględniają cenę detaliczną wszystkich komponentów, więc ta ogólna cena może zostać znacznie obniżona poprzez pozyskiwanie używanych komponentów. Jeśli chodzi o czas budowy, rozsądne byłoby oczekiwanie, że użytkownik z niewielkim doświadczeniem w optyce zbuduje i wyrówna cały system SOLS w ciągu 1-2 miesięcy, pod warunkiem, że wszystkie komponenty są dostępne i gotowe. Pomimo długości i złożoności protokołu, uważamy, że ilość szczegółów w rękopisie pisemnym, w połączeniu z protokołem wideo, powinna sprawić, że protokół ten będzie prosty i szybki do naśladowania.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Po pierwsze, umiejscowienie galvo determinuje rozmieszczenie wielu soczewek, ponieważ jest on częścią trzech oddzielnych par soczewek 4f. Bardzo ważne jest, aby galvo było zarówno sprzężone z tylnymi płaszczyznami ogniskowymi O1 i O2, jak i prawidłowo wyśrodkowane, aby zapewnić skanowanie niezmiennicze pod kątem. Po drugie, jakość obrazu jest niezwykle wrażliwa na wyrównanie O2 i O3 względem siebie. W tym przypadku należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że po pierwsze, kąt wyrównania O3 do O2 odpowiada nachyleniu arkusza światła wzbudzenia, zapewniając w ten sposób maksymalnie płaskie oświetlenie w podobnie nachylonym polu widzenia. Po drugie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości osiowej, aby utrzymać płaskie pole widzenia o jak największej powierzchni. Po trzecie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości bocznej od O2, aby zmaksymalizować sygnał przechodzący przez interfejs O2-O3.

Jeśli chodzi o użyteczne pole widzenia, system ten osiągnął płaskie, niezawodne pole ze stałym oświetleniem na obszarze 80 μm x 80 μm. Obszar ten jest mniejszy niż maksymalne pole widzenia zapewniane przez kamerę, więc użyteczne pole widzenia jest oznaczone żółtym polem na rysunku 13. Jeśli chodzi o zdolność rozdzielczą, system ten osiągnął minimalną rozdzielczość 432 nm wzdłuż osi x i 421 nm wzdłuż osi y, która została zmierzona poprzez znalezienie średniej sigma x i y funkcji rozproszenia Gaussa (PSF) w dobrym polu widzenia i pomnożenie przez dwa. Zwracamy uwagę, że ten system nie został zoptymalizowany pod względem całkowitego NA, co oznacza, że jest miejsce na znaczną poprawę, jeśli użytkownicy oczekują wyższej zdolności rozdzielczej niż ta, którą osiągnął ten system. Istnieje wiele kompatybilnych opcji obiektywów dla tego typu konstrukcji SOLS, z których wiele przyczyniłoby się do wyższej rozdzielczości systemu, ale z wadami w postaci wyższego kosztu, mniejszego pola widzenia lub bardziej skomplikowanych technik dopasowywania na interfejsie przekaźnika 8,11,13,20. Oddzielnie, jeśli użytkownicy pragną większego pola widzenia, włączenie drugiego galvo, aby umożliwić skanowanie 2D, osiągnęłoby ten cel, ale wymagałoby dodatkowej optyki i mechaniki sterowania, które zostałyby zintegrowane z projektem32. Więcej szczegółów na temat modyfikacji systemu podaliśmy na naszej stronie internetowej, wraz z linkami do innych pomocnych zasobów dotyczących procesu projektowania23.

Poza ulepszeniem konkretnych komponentów dla tego konkretnego projektu, bardzo możliwe byłoby dodanie innych technik lub modalności mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do tej konstrukcji. Jednym z takich ulepszeń byłoby włączenie oświetlenia o wielu długościach fali, co wiązałoby się z ustawieniem dodatkowych laserów wzbudzających do oryginalnej ścieżki wzbudzenia8. Ponadto, ponieważ ten typ konstrukcji SOLS pozostawia próbkę dostępną, dodanie dodatkowych funkcji do mikroskopu, w tym między innymi pęsety optycznej, mikrofluidyki i reometrii, jest stosunkowo proste 2,33.

W porównaniu z niezliczonymi przewodnikami po arkuszach świetlnych, które zostały opublikowane, protokół ten zawiera instrukcje na poziomie zrozumienia, który może uznać za pomocny dla użytkownika bez znaczącego doświadczenia w optyce. Tworząc przyjazną dla użytkownika konstrukcję SOLS z tradycyjnymi możliwościami montażu szkiełek z próbkami dostępnymi dla szerszego grona odbiorców, mamy nadzieję umożliwić jeszcze dalsze rozszerzenie zastosowań badań opartych na SOLS we wszystkich dziedzinach, w których instrument jest lub może być wykorzystywany. Nawet przy szybko rosnącym zastosowaniu instrumentów SOLS w liczbie 2,34,35, uważamy, że wiele korzyści i zastosowań instrumentów typu SOLS nadal pozostaje niezbadanych i wyrażamy podekscytowanie możliwościami tego typu instrumentów w przyszłości.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Wszystkie badania zostały przeprowadzone przy braku powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) dla J.S. Jesteśmy wdzięczni za wskazówki udzielone przez dr Bin Yanga i dr Manisha Kumara podczas procesu dostosowania. Dziękujemy dr Jenny Ross i K. Alice Lindsay za instrukcje przygotowania silników kinezynowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka płasko-wklęsła 1" f = -50 mmThorlabs LC1715-A-MLDo lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $49.5
1" Achromatyczny dublet f = 100 mm (x3)ThorlabsAC254-100-A-MLL2, L4 i laser do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 342.42
1" Achromatyczny dublet f = 125 mmThorlabsAC254-125-A-MLSL2
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=150 mmThorlabsAC254-150-A-MLL3
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=150 mmThorlabsAC254-150-A-MLTL2
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=45 mmThorlabsAC254-045-A-MLL1
Szacowany koszt: $114.14
1" Achromatyczny dublet f=75 mmThorlabsAC254-075-A-MLSL1
Szacowany koszt: $114.14
Soczewka cylindryczna 1" f = 100 mmThorlabsLJ1567RM CL3
Szacowany koszt: $117.62
" Soczewka cylindryczna f = 200 mmThorlabsLJ1653RMCL2
Szacowany koszt: $111.22
" Soczewka cylindryczna f = 50 mmThorlabsLJ1695RMCL1
Szacowany koszt: $117.62
1" Zamontowany otworek, 30 &mikro; m Średnica otworkaThorlabsP30KSzacowany koszt: $ 77.08
1" Srebrne lustro (x3)ThorlabsPF10-03-P01M1, M2, jeden do wyrównania
Szacowany koszt: $ 168.78
2-calowe lustro eliptyczneThorlabsPFE20-P01M3
Szacowany koszt: $179.98
2-calowy uchwyt na słupki (x11)ThorlabsPH2Do niestandardowego montażu laserowego, koła ND, ekranów bezpieczeństwa
Szacowany koszt: $ 98.45
Słupki 2" (x47)ThorlabsTR2Do niestandardowego montażu laserowego i komponentów optycznych
Szacowany koszt: $277.3
Słupki 3" (x4) Szpitale TR3Do podpór M3 i innych mocowań
Szacowany koszt: $24.6
3-calowy uchwyt na słupki (x4)Thorlabs PH3Szacowany koszt: 38,48 USD
Adapter klatki od 30 do 60 mm ThorlabsLCP33Do montażu O1
Szacowany koszt: $ 45.42
Koło filtra klatkowego 30 mmThorlabsCFW6Do montażu filtrów ND
Szacowany koszt: $ 172.36
Płyta klatki 30 mm (x6)ThorlabsCP33Aby zbudować klatkę wyrównującą i laser do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 114.54
30mm Kątowe mocowanie lustra kinematycznego 30 mm (x3)ThorlabsKCB1Do montażu M1 i M2 oraz do wyrównywania lasera
Szacowany koszt: 463,95 $
4-calowy uchwyt na słupek (x30)ThorlabsPH4Szacowany koszt: 320,1 $
Laser i zasilacz 561 nm Opto Engine LLCMGL-FN-561-100mWLaser wzbudzenia
Szacowany koszt: 6000 $
Płyta klatki 60 mm (x2)ThorlabsLCP01Do montażu TL1 i M3 mount
Szacowany koszt: $ 88.52
60mm Kątowy uchwyt do lusterka kinematycznegoThorlabsKCB2Aby zamontować M3
Szacowany koszt: $ 187.26
90° Odwróć góręThorlabs TRF90Do lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 95.5
Adapter z zewnętrznymi gwintami C-Mount i wewnętrznymi gwintami SM1Thorlabs SM1A9Aby podłączyć tubus obiektywu do aparatu
Szacowany koszt: $20.96
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami C-MountThorlabs SM1A10Aby podłączyć soczewkę tubusu do mocowania obiektywu
Szacowany koszt: $21.82
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M25 (x2)ThorlabsSM1A12Do montażu O1 i O2
Szacowany koszt: $ 47.06
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M26ThorlabsSM1A27Do montażu O3
Szacowany koszt: $22.38
Dysk wyrównującyThorlabs SM1A7Szacowany koszt: 20.45 USD
Laser wyrównującyBISKEEhttps://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM
Szacowany koszt: 16.98 USD
Autoluorescent Plastic Slide, czerwony Chroma92001Szacowany koszt: 20 USD
Beam Shutter Szpitale SM1SH1Do blokowania światła laserowego
Szacowany koszt: 65.8 USD
Montaż obrotowy klatki (x3)ThorlabsCRM1TDo montażu CL1-3
Szacowany koszt: 282.15 USD
Pręty systemu klatkowego 1" (x8)Thorlabs ER1Do montażu M3 i O1
Szacowany koszt: 44,8 USD
Pręty systemu klatkowego 3" (x2)Thorlabs ER3Do montażu O3
Szacowany koszt: 14,28 USD
Pręty systemu klatkowego 4" (x4)Thorlabs ER4Do montażu szczeliny
Szacowany koszt: $ 30.76
Pręty systemu klatkowego 8 "(x2)Thorlabs ER8Do wyrównania soczewek tubusu
Szacowany koszt: 25,3 USD
Pręty systemu klatkowego 12 "(x8)ThorlabsER12Do klatki wyrównującej
Szacowany koszt: 145,36 USD
KameraAndorZyla 4.2 sCMOSSzacowany koszt: ~ $ 14,000
Widelec zaciskowy (x35)ThorlabsCF125Do mocowania mocowań słupków
Szacowany koszt: $ 338.8
Szkło osłonowe, 22 x 22 mm Corning2850-22Dla próbek preparatów
Szacowany koszt: 265 USD
Dichroic AVRDI01-R405/488/561/635-25x36Aby podzielić ścieżki wycinkowe/emisyjne
Szacowany koszt: $ 965
Etap translacji jaskółczego ogonaThorlabsDT12Aby przetłumaczyć otworek
Szacowany koszt: $ 90.55
Filtr emisyjnyThorlabsFELHO600Szacowany koszt: $ 140.99
Dysk wyrównujący z matowego szkła (x2)ThorlabsDG10-1500-H1Do klatki wyrównującej i płaszczyzny pośredniej
Szacowany koszt: 75.14 USD
Generator funkcyjnyHewlett-PackardHP 33120A 15 MHzDo sterowania galvo
Szacowany koszt: 900 USD
Galwanometr - system 1D o dużej średnicy wiązkiThorlabsGVS011Szacowany koszt: 1715.78
USD Zasilacz galwanometruSiglentSPD3303CSzacowany koszt: 300 USD
GelriteResearch Products InternationalG35020-100.0Guma Gellan do próbki koralików 3D
Szacowany koszt: $ 68.25
FIJI SoftwareOpen-sourcePobierz z https://imagej.net/software/fiji/downloads
Szacowany koszt: bezpłatna
płyta grzejna / mieszadłoCorning6795-220Do przygotowania roztworów próbnych
Szacowany koszt: $ 550
Sterownik silnika szczotkowanego K-CubeThorlabsKDC101Napędy Z825B
Szacowany koszt: $ 757.51
Montaż kinematycznyThorlabsKM100SDo montażu dichroic
Szacowany koszt: $ 92.01
Oprogramowanie KinesisThorlabs Pobierz z https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285
Szacowany koszt: Bezpłatny
laserowy bloker światła Szpitale LB1Do odbić filtra ND
Szacowany koszt: 57.65
USD Montaż laserowywykonanydrukowany w 3D
Szacowany koszt: Nie dotyczy
laserowego ekranu bezpieczeństwa (x2)Thorlabs TPS4Do blokowania rozproszonego światła laserowego
Szacowany koszt: 92.02 USD
Soczewki do skanowania laserowegoThorlabsTTL200MPTL1
Szacowany koszt: 1491 USD
Mocowanie obiektywu (x10) ThorlabsLMR1Aby zamontować wszystkie obiektywy i dodatkowe lustro wyrównawcze.
Szacowany koszt: 164,7 USD
Linijka magnetycznaThorlabsBHM4Aby sprawdzić wyrównanie
Szacowany koszt: 52,74 USD
Oprogramowanie Micro-Manager Open-sourcePobierz z https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
Szacowany koszt: Bezpłatne
szkiełka mikroskopoweThermo Fisher Scientific 12550400Dla próbek preparatów
Szacowany koszt: 123.9 USD
Stolik mikroskopowy ASIFTP-2000 z niestandardowymiczęściami Aby dokładnie przetłumaczyć próbki
Szacowany koszt: ~$16,000
Mini mikser wirowy VWR10153-688Do przygotowania próbki
Szacowany koszt: 152.64 USD
Siłownik z napędemThorlabsZ825BAby dokładnie przetłumaczyć M1
Szacowany koszt: 729,07 USD
Zamontowana standardowa tęczówka (x2)ThorlabsID20Co najmniej 2 do wyrównania
Szacowany koszt: 118,02 USD
Zestaw filtrów ND Klatki piersioweNDK01 Aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia
Szacowany koszt: $ 726.73
Obiektyw Lens 1Nikon Plan Apo 60X/ 1.20 WIO1
Szacowany koszt: ~$15,000
Obiektyw 2NikonTU Plan Fluor 100X/0.90 O2
Szacowany koszt: ~ $ 6,000
Obiektyw Lens 3MitutoyoPlan Apo HR 50X/0.75O3
Szacowany koszt: ~ 6,800
USD OPM Oprogramowanie do deskowaniaOpen-sourcedo przetwarzania obrazu. Pobierz z https://github.com/QI2lab/OPM
Szacowany koszt: Bezpłatny
czujnik mocy fotodiodyThorlabs S121CDo pomiaru intensywności lasera
Szacowany koszt: 379,68 USD
Dodatnie zniekształcenia siatki CelThorlabsR1L3S3Pwyrównanie jasnego pola
Szacowany koszt: 267.87 USD
Miernik mocy Konsola cyfrowaThorlabs PM100DDo pomiaru intensywności lasera
Szacowany koszt: $1245.48
Rhodamine 6GThermo Scientific J62315.14Do próbki szkiełka z powłoką fluorescencyjną
Szacowany koszt: $27.7
Zacisk kątowy do słupkówThorlabs RA90Do wspornika M3 i lusterka opuszczanego
Szacowany koszt: 32.46 USD
Płyta klatki z gwintem RMS (x2) Szpitale CP42Do lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 70.56
Płyta ścinająca 2.5-5.0 mmThorlabsSI050P Szacowany koszt: $ 182.85
Płyta ścinająca 5,0-10,0 mmThorlabsSI100PSzacowany koszt: $ 201.47
Płyta ścinana 10.0-25.4 mmThorlabsSI254PSzacowany koszt: $ 236.42
Ekran podglądu płyty ścinanejThorlabsSIVSSzacowany koszt: $ 337.74
Interferometr ścinający z płytką 1-3 mmThorlabsSI035Do sprawdzania kolimacji
Szacowany koszt: $ 465.85
Wsuwany kołnierz na słupku (x35)Thorlabs R2Aby utrzymać wysokość słupka
Szacowany koszt: 208.25
USD SzczelinaThorlabsVA100Szacowany koszt: 294.64 USD
Szczelinowy tubus obiektywu, 3"Thorlabs SM1L30CDo wyrównywania lasera
Szacowany koszt: 77,45 USD
Lustro kwadratowe, 1 x 1 "https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva
did=642191768069& hvpos=& hvne
tw=g& hvrand=1336734911900437
4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt=
& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=&
hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1
943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L
yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL
q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA
Lw_wcB& th = 1
Szacowany koszt: 14.76 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stosy 1/2 "(x3)ThorlabsSM1L05Do montażu CL1-3
Szacowany koszt: 40.86 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 1 "ThorlabsSM1L10Aby zamontować O3
Szacowany koszt: 15.41 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 2 "(x2)ThorlabsSM1L20Do ścieżki kamery
Szacowany koszt: $35.7
Adapter podstawy cokołu z ćwiekami (x37)Thorlabs BE1Aby przymocować mocowania słupków do stołu
Szacowany koszt: $ 400.71
Tłumaczenie mocowania obiektywu (x3)ThorlabsLM1XYAby drobno przetłumaczyć otworki, O2 i O3
Szacowany koszt: $ 441
Etap translacji ze standardowym mikrometrem (x2)ThorlabsPT1/MTS1-2
Szacowany koszt: $647.54
Instrukcja podróży Etap tłumaczeniaThorlabsCT1AMocowanie translacji klatki O3
Szacowany koszt: 497,3 USD
Obiektyw tubusowyNikonMXA20696TL3
Szacowany koszt: 359 USD
LED zamontowane Źródło światła MNWHL4Brightfield
Szacowany koszt: 171.28 USD
         CAŁKOWITY SZACOWANY KOSZT: $ 84,858.98
         Autorzy zauważają, że wiele części zostało zakupionych jako używane. Tutaj staraliśmy się odzwierciedlić cenę detaliczną wszystkich przedmiotów, więc całkowity koszt można znacznie obniżyć, kupując poszczególne używane przedmioty, zwłaszcza te droższe.
KOMPONENTY
Grasshopper3 USB3FLIR&nbsp; GS3-U3-23S6C-CDo kontroli diagnostycznych podczas osiowania. Zamiast tego można użyć kamery Acquisiton, ale później wymaga ona ponownego wyrównania.
Szacowany koszt: $ 1089
1 1 1 1 1 na zamówienie Białe diodyOPCJONALNE

Bibliografia

  1. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).
  2. You, R., McGorty, R. Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter. Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).
  3. Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography. Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Dunsby, C. Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).
  6. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  7. Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy. Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).
  8. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  9. Wu, Y., et al. Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy. Optica. 3 (8), 897-910 (2016).
  10. Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization. Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).
  11. Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging. Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).
  12. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  13. Sapoznik, E., et al. A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife. 9, e57681(2020).
  14. Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).
  15. Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. Focusing super resolution on the cytoskeleton. F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).
  16. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), (2019).
  17. Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites. Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).
  18. Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html (2023).
  19. Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html (2023).
  20. Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform. bioRxiv. , (2021).
  21. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  22. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  23. Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols (2023).
  24. Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data. Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).
  25. Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: https://mitchison.hms.harvard.edu/home (2023).
  26. Research at Dogic Lab. , Available from: http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/ (2023).
  27. Watkins, S. C., St. Croix, C. M. Light sheet imaging comes of age. Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).
  28. Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  29. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  30. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).
  31. Kim, K., et al. Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors. Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).
  32. Millett-Sikking, A., et al. High NA single-objective lightsheet. , (2019).
  33. Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. 3D adaptive optics in a light sheet microscope. Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).
  34. Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy. Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).
  35. Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. Computational hyperspectral light-sheet microscopy. Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia arkusza światłamikroskop jednoobiektywowymikroskopia fluorescencyjnasekcjonowanie optycznesieci mikrotubularneobrazowanie wolumetrycznemontowanie próbekmikroskopia konfokalnacentrowanie mikroskopu
Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.