Method Article

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

DOI:

10.3791/65411

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1W.M. Keck Science Department, Scripps College, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna College, 3Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 4W.M. Keck Science Department, Pitzer College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrekonstruowane kompozyty cytoszkieletowe okazały się cennym systemem modelowym do badania nierównowagowej miękkiej materii. Wierne uchwycenie dynamiki tych gęstych sieci 3D wymaga optycznego przekroju, który jest często kojarzony z fluorescencyjnymi mikroskopami konfokalnymi. Jednak ostatnie osiągnięcia w mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM) sprawiły, że jest to opłacalna, a czasami lepsza alternatywa. Aby ułatwić dostęp do LSFM badaczom cytoszkieletów, którzy są mniej zaznajomieni z optyką, przedstawiamy przewodnik krok po kroku dla początkujących, jak zbudować wszechstronny mikroskop fluorescencyjny z arkuszami świetlnymi z gotowych komponentów. Aby umożliwić montaż próbki z tradycyjnymi próbkami szkiełkowymi, LSFM jest zgodny z konstrukcją jednoobiektywowego arkusza świetlnego (SOLS), który wykorzystuje pojedynczy obiektyw zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji. Opisujemy funkcję każdego komponentu SOLS na tyle szczegółowo, aby umożliwić czytelnikom modyfikację oprzyrządowania i zaprojektowanie go tak, aby odpowiadało ich konkretnym potrzebom. Na koniec demonstrujemy zastosowanie tego niestandardowego instrumentu SOLS, wizualizując astry w sieciach mikrotubul sterowanych kinezyną.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym (LSFM) reprezentuje rodzinę technik obrazowania fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, w których światło wzbudzenia jest kształtowane w arkusz1,2, w tym mikroskopia selektywnego oświetlenia płaszczyzny (SPIM), konfokalnie wyrównane wzbudzenie płaskie (SCAPE) i mikroskopia skośna (OPM)3,4,5,6,7. W przeciwieństwie do innych metod mikroskopii, takich jak epi-fluorescencja, mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) lub mikroskopia konfokalna, fototoksyczność jest minimalna w LSFM, a próbki mogą być obrazowane w dłuższych skalach czasowych, ponieważ oświetlona jest tylko płaszczyzna aktywnie obrazowanej próbki8,9,10. Dlatego techniki LSFM są niezwykle przydatne do obrazowania próbek 3D w dłuższych okresach czasu, zwłaszcza tych zbyt grubych dla technik mikroskopii konfokalnej. Z tych powodów, od czasu swojego pierwotnego opracowania w 2004 roku, LSFM stał się techniką obrazowania wybieraną przez wielu fizjologów, biologów rozwojowych i neurobiologów do wizualizacji całych organizmów, takich jak żywe zarodki danio pręgowanego i Drosophila3,4,6,11. W ciągu ostatnich dwóch dekad zalety LSFM zostały wykorzystane do wizualizacji struktury i dynamiki w coraz mniejszych skalach, w tym tissue11,12, skale komórkowe i subkomórkowe, zarówno in vivo, jak i in vitro13,14,15,17.

Pomimo doniesień o udanych przypadkach użycia w literaturze, wysoki koszt komercyjnych systemów LSFM (~0,25 miliona USD w momencie pisania tego tekstu)18,19 uniemożliwia powszechne stosowanie tej techniki. Aby samodzielne kompilacje stały się realną alternatywą dla badaczy, opublikowano wiele przewodników po budowaniu8,13,20,21, w tym OpenSPIM22. Jednak do tej pory badacze z minimalnym doświadczeniem w optyce mogą używać tylko wcześniejszych projektów LSFM, które są niekompatybilne z tradycyjnymi próbkami montowanymi na szkiełkach (Rysunek 1A). Niedawna implementacja jednoobiektywowego arkusza świetlnego (SOLS) wykorzystuje pojedynczy cel zarówno do wzbudzenia, jak i wykrywania (Rysunek 1C), pokonując w ten sposób ograniczenia związane z kompatybilnością5,6,8,13,20. Jednak kosztem wszechstronności konstrukcji SOLS jest znaczny wzrost złożoności konstrukcji ze względu na wymóg dwóch dodatkowych celów do przekazywania, odchylania i ponownego obrazowania płaszczyzny obiektu na kamerę w celu obrazowania (Rysunek 1D). Aby ułatwić dostęp do złożonych konfiguracji w stylu SOLS, w niniejszym artykule przedstawiono przewodnik krok po kroku dotyczący procesu projektowania, budowy, wyrównywania i użytkowania systemu SOLS kompatybilnego ze szkiełkami, który byłby przydatny dla badaczy posiadających wiedzę tylko na temat kursu optyki na poziomie podstawowym.

Chociaż sam protokół jest zwięzły, czytelnicy muszą zapoznać się z innymi zasobami podczas przygotowań, aby dowiedzieć się więcej o poszczególnych częściach projektu lub rozważaniach sprzętowych. Jeśli jednak czytelnik zamierza postępować zgodnie ze specyfikacją tego projektu, może nie być konieczne zrozumienie, jak wybrać poszczególne elementy optyczne.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Charakterystyka różnych konfiguracji LSFM. (A) Konfiguracja z dwoma ortogonalnymi obiektywami powszechnymi we wczesnych projektach LSFM. W tej konfiguracji do przechowywania próbki używa się rurki kapilarnej lub cylindra z żelem, co nie jest kompatybilne z tradycyjnymi technikami montażu suwakowego. B) schemat konstrukcji arkusza świetlnego SOLS przedstawiający następujące elementy: C) pojedynczy obiektyw używany zarówno do wzbudzenia, jak i zbierania emisji na płaszczyźnie próbki (O1); pozwala to na zamontowanie tradycyjnego suwaka na górze i (D) układu obiektywu przekaźnikowego w ścieżce emisji SOLS. O2 zbiera światło emisyjne i powiększa obraz. O3 obrazuje płaszczyznę pod odpowiednim kątem nachylenia na matrycy kamery. Skróty: LSFM = mikroskopia fluorescencyjna w arkuszach świetlnych; SOLS = jednoobiektywny arkusz świetlny; O1-O3 = cele. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do wyrównania

  1. Przed rozpoczęciem budowy należy przeprowadzić wszelkie niezbędne przeglądy literatury, aby mieć jasne wyobrażenie o zamierzonym przypadku użycia (np. fluorofory do zobrazowania, niezbędna objętość obrazowania, wymagania dotyczące rozdzielczości). W szczególności należy zapoznać się z poniższą sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby zdecydować, czy właściwe jest podążanie za dokładnie opisanym tutaj projektem. Jeśli tak, przejdź do kroku 1.2. Jeśli nie, znajdź sugestie i wskazówki dotyczące wyboru sprzętu w Sheunglab SOLS Build Guide23.
    UWAGA: Użytkownik może znaleźć więcej informacji na temat specyfikacji tego konkretnego systemu w sekcji dyskusji.
  2. Zbierz wszystkie niezbędne komponenty optyczne, optomechaniczne i elektryczne, jak wyszczególniono w Tabeli materiałów. W przypadku użytkowników modyfikujących system zbierz wszystkie równoważne części.
  3. Zbuduj laser wyrównujący zgodnie z ilustracją Rysunek 2A. Sprawdź, czy belka jest skolimowana za pomocą blachy ścinanej.
  4. Zbuduj klatkę wyrównującą dysk z podwójnego matowego szkła, jak pokazano na Rysunek 2B.
  5. Przygotować próbkę badawczą pokrytą barwnikiem fluorescencyjnym.
    1. Stwórz nasycony roztwór barwnika rodaminy, stopniowo dodając 1 ml wody destylowanej do 0,2 g liofilizowanego proszku, aż do całkowitego rozpuszczenia. Wir do homogenizacji.
      UWAGA: To rozwiązanie jest światłoczułe. Chociaż nie ma niezbędnych środków ostrożności podczas przygotowania, upewnij się, że roztwór jest przechowywany w ciemnym miejscu po jego przygotowaniu.
      UWAGA: Zawsze noś rękawiczki i maskę podczas obchodzenia się z proszkiem rodaminy.
    2. Odpipetować 10 μl na środek szkiełka testowego.
    3. Umieść szkło nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na wierzchu płynu, upewniając się, że warstwa fluorescencji jest tak cienka, jak to możliwe.
    4. Uszczelnij bezbarwnym lakierem do paznokci.
      UWAGA: Ta próbka jest wrażliwa na światło. Aby zmaksymalizować żywotność próbki, upewnij się, że szkiełko jest przechowywane w ciemnym miejscu, gdy nie jest używane.
  6. Przygotuj próbkę kulki 3D (kulki 1 μm zatopione w żelu).
    1. Użyj taśmy dwustronnej, aby utworzyć pionowy kanał o szerokości 4-5 mm na szkiełku próbki o wysokości trzech warstw taśmy.
    2. Umieść szklaną pokrywę o wymiarach 22 mm x 22 mm na wierzchu taśmy na środku szkiełka. Mocno dociśnij zaklejone obszary, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkłem nakrywkowym.
    3. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar taśmy.
    4. Przygotuj 125 ml nasyconego roztworu gumy gellan, stopniowo dodając wodę DI do 1 g proszku gumy gellan. Roztwór ten będzie stały w temperaturze pokojowej i ciekły w temperaturze 65 °C.
    5. Wprowadzić 1 ml roztworu gumy gellan do probówki do mikrowirówki. Podgrzać pojemnik z wodą na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C i ogrzać probówkę do mikrowirówki, aż guma gellan stanie się widocznie lepka.
    6. Przygotować 10 μl kulek rozcieńczonych w stosunku 1:1 000 w podgrzanym roztworze gumy gellan.
    7. Ostrożnie odpipetować roztwór do komory, aż będzie pełny. Użyj wykałaczki, aby nanieść niewielką ilość żywicy epoksydowej po obu stronach kanału, całkowicie zakrywając otwory do uszczelnienia. Aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie, sprawdź wzrokowo oba końce, aby upewnić się, że żywica epoksydowa nieznacznie wniknęła w każdy koniec kanału.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zdjęcia narzędzi do wyrównywania. (A) Laser do kolimacji. AL1: Soczewka wyrównująca 1, −50 mm; AL2: Soczewka wyrównująca 2, 100 mm (B) Podwójnie matowa szklana klatka wyrównująca. Skróty: RMS CP = RMS gwintowana płyta koszykowa; SM1 CP = SM1 gwintowana płyta koszykowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wyrównywanie ścieżki wzbudzenia

  1. Naszkicuj układ mikroskopu na powierzchni stołu optycznego. Zmierz wszystkie odległości tak dokładnie, jak to możliwe.
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się z lokalizacją komponentów w systemie.
  2. Zamontuj laser wzbudzający na stole. Ustaw dwie tęczówki na zamierzoną wysokość lasera i zamontuj je w odległości 2-3 stóp od siebie na żądanej linii otworów za lokalizacją lustra 1 (M1). Użyj tych przysłon, aby upewnić się, że belka jest wypoziomowana z powierzchnią stołu i wyśrodkowana na linii otworów na stole optycznym.
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa należy nosić okulary ochronne do ochrony oczu i blokować wszelkie zabłąkane wiązki laserowe za pomocą laserowych ekranów ochronnych. Dopóki wszystkie elementy nie zostaną trwale zaciśnięte, możliwy jest dryf rzędu godzin. Ustaw przysłonę w najdalszym punkcie wyrównania pod koniec każdego dnia, aby szybko sprawdzić wzrokowo dryf po powrocie do kompilacji. Wibracje, nieprawidłowo pływający stół optyczny i prądy powietrza to najczęstsze przyczyny dryfu optycznego.
  3. Zamontuj migawkę lasera jak najbliżej lasera wzbudzającego. Wykorzystaj tę migawkę, aby szybko zablokować światło lasera podczas wyrównywania, zamiast wielokrotnie włączać i wyłączać laser.
  4. Zamontuj filtry ND w kole filtrów ND (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 i puste gniazdo) i zamontuj za migawką lasera.
  5. Przełącz siłownik z napędem na jeden stolik translacyjny (TS1), a następnie włóż stolik pod lokalizację M1. Upewnij się, że stolik przesuwa się osiowo wzdłuż tej samej linii otworów, za którą podąża światło lasera. Ustaw scenę w środku jego zakresu dla początkowego umieszczenia.
    1. W kolejnych krokach 2.6-2.10 włóż odblaskowe elementy optyczne do ścieżki wiązki pojedynczo, aby skierować laser wzdłuż ścieżki narysowanej na stole. Użyj pary tęczówek ustawionych na dokładną wysokość, aby zdefiniować żądaną ścieżkę wiązki wyjściowej i pokierować rozmieszczeniem i wyrównaniem każdego elementu odblaskowego. Dla każdego elementu dostosuj wysokość i położenie mocowania, aby upewnić się, że przychodząca belka uderza w środek. Następnie obróć podstawę uchwytu, aby skierować belkę wzdłuż narysowanej ścieżki belki na stole, tak aby przechodziła przez obie tęczówki, i precyzyjnie wyreguluj nachylenie belki wychodzącej za pomocą pokręteł z tyłu każdego uchwytu.
      UWAGA: Po wyrównaniu każdego elementu na odpowiednią wysokość, dodaj wsuwany kołnierz do słupka, aby zabezpieczyć wysokość.
  6. Zamontuj i wyrównaj M1 na TS1.
  7. Zamontuj i wyrównaj dichroik na stole.
  8. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, podłącz galvo do zasilacza i generatora funkcyjnego.
  9. Zamontuj galvo tak, aby laser padał dokładnie na środek lustra. Włącz galvo, a następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk AM na generatorze przebiegów, aby ustawić nachylenie lustra na prąd 0 V DC (środek zakresu). Teraz dopasuj galvo do tęczówek.
  10. Zamontuj i wyrównaj lustro 2 (M2).
  11. Włóż duże cylindryczne lustro do cylindrycznego mocowania lustra. Użyj prętów klatki 1 cal, aby przymocować adapter klatki 30-60 mm nad lustrem 3 (M3). Użyj pokręteł na uchwycie lusterka, aby spłaszczyć nachylenie lustra M3 w celu początkowego umieszczenia.
  12. Zamontuj klatkę wyrównującą z podwójnie matowego szkła w adapterze klatki powyżej M3; Pamiętaj, aby dokręcić ustalające na adapterze klatki, które utrzymują klatkę wyrównującą na miejscu za każdym razem, gdy jest ona używana do wyrównywania. Zamontuj M3 na stole i dostosuj wysokość i położenie, aż belka zostanie z grubsza wyśrodkowana na obu tarczach wyrównujących z matowego szkła. Clamp M3 do stołu i użyj mocowania na słupku, 3 cale słupka, 90° clamp i 2 cale słupek po obu stronach M3, aby dodać podparcie za pomocą zaklejonych otworów po obu stronach mocowania lusterka. Użyj pokręteł z tyłu lustra, aby precyzyjnie wyregulować wiązkę.
    UWAGA: Wszystkie elementy odblaskowe na ścieżce wzbudzenia są teraz ustawione i nie należy ich dotykać.
  13. Zamontuj soczewkę 1 (L1) na stole. W przypadku wszystkich początkowych umieszczeń obiektywu użyj przykręcanej tarczy obiektywu, aby wyśrodkować przychodzącą wiązkę z przodu obiektywu. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną soczewki 1 (L1), aż wiązka zostanie wyśrodkowana na obu płytkach z matowego szkła na klatce wyrównującej powyżej M3.
  14. Zamontuj obiektyw 2 (L2) w odpowiedniej pozycji, aby utworzyć system 4f z L1. Przesuń L2 osiowo, aby uzyskać skolimowaną wiązkę, i użyj lasera wzbudzającego i płyty ścinającej, aby sprawdzić kolimację. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną L2, aby wyśrodkować wiązkę na obu dyskach z matowego szkła powyżej M3.
  15. Zamontuj otworek w uchwycie translacyjnym xy. Zamontuj go na stoliku do translacji 1D, aby zapewnić precyzyjne tłumaczenie osiowe. Zamontuj otwór i stolik na słupku i uchwycie na słupku, a następnie umieść go we wspólnym punkcie ogniskowym między L1 i L2. Wyreguluj otwór ręcznie, aż światło lasera będzie widoczne przez otwór.
  16. Zamontuj czujnik miernika mocy natychmiast za otworkiem i użyj przycisku długości fali na konsoli cyfrowej miernika mocy, aby wybrać długość fali lasera wzbudzenia. Dostosuj położenie xy otworka, aby zmaksymalizować transmisję i uzyskać profil wiązki zbliżony do TEM00. Następnie wyreguluj otworek osiowo za pomocą stolika 1D, aby jeszcze bardziej zmaksymalizować transmisję.
  17. Zamontuj soczewkę 4 (L4) na stole w jej pozycji i ustaw uchwyt na odpowiednią wysokość. Wyreguluj L4 osiowo tak, aby wiązka wzbudzenia była skupiona na powierzchni galvo. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną L4, aby wyśrodkować wiązkę na obu dyskach z matowego szkła powyżej M3.
  18. Zamontuj soczewkę 3 (L3) na stole w jej pozycji i ustaw uchwyt na odpowiednią wysokość. Użyj lasera wzbudzającego i płyty ścinającej, aby sprawdzić kolimację L3 i L4. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną L3, aby wyśrodkować wiązkę na obu dyskach z matowego szkła powyżej M3.
  19. Tymczasowo usuń L3. Zamontuj soczewkę skanującą 1 (SL1) na stole i wyreguluj odległość osiową, aby utworzyć skolimowany teleskop z L4, zgodnie z pomiarem za pomocą płyty ścinanej. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną SL1, aby wyśrodkować wiązkę na obu dyskach z matowego szkła powyżej M3.
  20. Włóż ponownie L3. Zamontuj soczewkę rurki 1 (TL1) i użyj belki wzbudzenia oraz płyty ścinającej do kolimacji SL1 i TL1. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną TL1, aby wyśrodkować wiązkę na obu dyskach z matowego szkła powyżej M3.
  21. Za pomocą pierścienia adaptera przykręć obiektyw 1 (O1) do płyty klatki powyżej M3. Usuń tymczasowo SL1 i pozwól, aby belka uderzyła w sufit. Dostosuj wysokość (odległość osiową) O1 w systemie klatek, aż belka utworzy dysk Airy na suficie, a następnie kontynuuj regulację, aż rozmiar dysku zostanie zminimalizowany.
  22. Po umieszczeniu O1 zamontuj stolik na próbkę w odpowiedniej pozycji.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Lokalizacja komponentów w systemie SOLS. (A) Schematyczny układ systemu SOLS z opisanymi wszystkimi komponentami. (B) Zdjęcie z góry fizycznego układu SOLS na stole optycznym, z wyłączeniem obszaru stolika na próbki. (C) Zdjęcie z góry obszaru etapu próbkowania (rozszerzenie do Rysunek 3B). Ścieżka wzbudzenia jest pokazana na zielono. Ścieżka emisji jest pokazana na czerwono. Ogniskowe obiektywów: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; dł. 3:150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać bardziej szczegółowe specyfikacje części. Skróty: SOLS = jednoobiektywny arkusz świetlny; Koło ND = koło filtrów o zmiennej gęstości neutralnej; L1-L4 = wklęsłe soczewki achromatyczne płaskie; CL1-CL3 = soczewki cylindryczne; M1-M3 = lusterka; TS1-TS2 = etapy tłumaczenia; DM = zwierciadło dichroiczne; Galvo = galwanometr skanujący; SL1-SL2 = soczewki skanujące; TL1-TL2 = soczewki tubusu; O1-O3 = cele; EF = filtr emisji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Wyrównanie ścieżki emisji

  1. Skonfiguruj laser do osiowania.
    1. Zamontuj dwie puste płyty klatkowe obok lasera wzbudzającego na tej samej wysokości co laser. Użyj tych płyt klatkowych, aby zamontować laser wyrównujący, wsuwając pręty klatki lasera wyrównującego w puste otwory w dwóch płytach koszyka. Upewnij się, że laser można ustawić w pozycji włączonej, przyklejając taśmą przycisk zasilania lub podłączając włącznik/wyłącznik.
    2. Usuń O1 i ponownie włóż klatkę wyrównującą z matowego szkła. Użyj jednego mocowania lusterka kinematycznego i jednego lusterka opuszczanego, aby wyrównać belkę wyrównującą do ścieżki wiązki wzbudzenia.
    3. Użyj miernika mocy, aby zmaksymalizować sygnał belki wyrównującej za otworkiem poprzez precyzyjną regulację dwóch luster. Upewnij się, że wiązka pozostaje wyśrodkowana na klatce wyrównującej z matowego szkła.
  2. Wyjmij klatkę wyrównującą i ponownie włóż O1. Umieść kwadratowe lustro na stoliku próbki O1 i wyreguluj lustro osiowo, aż rozmiar profilu wiązki zostanie zminimalizowany po dichroiku.
  3. Zamontuj jedną przysłonę w ścieżce emisji i wystarczająco daleko z tyłu, aby można było bez zakłóceń włożyć soczewkę skanującą 2 (SL2), soczewkę tubusu 2 (TL2) i obiektyw 2 (O2). Dopasuj tę tęczówkę do lasera wyrównującego. Zamontuj dysk z matowego szkła co najmniej 1 cal za przysłoną i upewnij się, że jest on również wyrównany ze światłem lasera.
  4. Włóż SL2 w odpowiedniej odległości, mierzonej od galvo za pomocą linijki. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną SL2 tak, aby przychodząca belka wyrównująca była wyśrodkowana na SL2, a wiązka wychodząca przechodziła przez przysłonę i dysk z matowego szkła.
  5. Wstaw TL2 w odpowiedniej odległości, mierzonej od SL2 za pomocą linijki. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną TL2 tak, aby przychodząca belka wyrównująca była wyśrodkowana na TL2, a wiązka wychodząca przechodziła przez tęczówkę i dysk z matowego szkła.
  6. Zamontuj TS2 na stole. Upewnij się, że stolik przesuwa się wzdłuż osi optycznej O2.
  7. Przykręć O2 do uchwytu translacyjnego xy. Podłącz słupek pod mocowaniem xy, aby zamontować O2 na scenie tłumaczenia. Użyj przykręcanej tarczy, aby wyśrodkować tył O2 na czerwonym laserze.
  8. Wyreguluj pokrętła xy i nachylenie O2 tak, aby czerwona wiązka wyrównująca przechodziła przez tęczówkę i dysk z matowego szkła.
  9. Przesuń laser wyrównujący powyżej O1 i skieruj w dół na ścieżkę emisji. Włącz laser i upewnij się, że ta wiązka jest wyśrodkowana na wszystkich soczewkach na ścieżce emisji.
  10. Sprzęż płaszczyzny źrenic O1 i O2, otwierając tęczówkę i usuwając krążek z matowego szkła, tak aby wiązka wyrównująca wychodząca z O2 była kontynuowana bez przeszkód na odległej powierzchni lub ścianie (>0,5 m) (Rysunek 4). Dostosuj TS2, aż wiązka utworzy mały dysk Airy na powierzchni, a następnie kontynuuj regulację TS2, aby zminimalizować rozmiar dysku Airy.
    UWAGA: Silnie rozchodząca się wiązka wskazuje na nieprawidłowe rozmieszczenie O2. Ponieważ jednak wiązka ta przechodzi przez dwa obiektywy, niewielka rozbieżność jest nieodłączna. W związku z tym dysk Airy jest najlepszym przewodnikiem.
  11. Zoptymalizuj galvo pod kątem skanowania niezmiennego pod kątem pochylenia: Naciśnij przycisk FSK na generatorze przebiegów, aby wybrać sygnał fali trójkątnej dla galvo i ustaw na niską częstotliwość (~1 Hz). Obserwuj belkę wyrównującą na tej samej odległej powierzchni lub ścianie.
    UWAGA: Jeśli galvo zostanie umieszczone nieprawidłowo, wiązka będzie przesuwać się poziomo po powierzchni wraz z ruchem galvo. Można to rozwiązać poprzez precyzyjną regulację (ręczną) nachylenia i pozycji xy podstawy galvo, aż przemieszczenie wiązki będzie niewykrywalne gołym okiem.
  12. Sprawdź jakość systemu, obrazując pod kątem 0°.
    1. Wkręć O3 w uchwyt translacyjny xy. Wkręć tubus soczewki o średnicy 1 cala do stolika translacyjnego klatki i wkręć stopień translacyjny xy do tubusu. Użyj dwóch prętów klatki, aby połączyć przód stolika translacji klatki z płytą klatki i zamontuj płytę klatki do słupka. Zamontuj cel 3 (O3) blisko przodu O2 (~4-5 mm) pod kątem 0° i dostosuj wysokość, aby dopasować.
    2. Zamontuj tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2, zgodnie z pomiarem za pomocą linijki. Zamontuj akrylowy fluorescencyjny szkiełko testowe na stoliku i oświetl slajd laserem wzbudzającym. Spójrz przez tylną część O3, dostosuj zarówno wysokość, jak i pozycję osiową O3, aby znaleźć światło emisyjne, a następnie dostosuj O3 osiowo, aż światło emisyjne wypełni tylny otwór (Rysunek 5).
    3. Wkręć dwa pręty klatkowe o średnicy 8 cali z tyłu stolika translacyjnego O3. Wsuń płytę klatki z zamontowanym dyskiem z matowego szkła na pręty, a następnie precyzyjnie wyreguluj O3 za pomocą mocowania xy, aby upewnić się, że światło emisyjne wychodzi z O3 wyśrodkowane. Następnie usuń pręty klatki.
    4. Zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonym położeniu czujnika kamery i dopasuj wysokość i położenie dysku do światła emisyjnego.
    5. Wkręć soczewkę rurki 3 (TL3) w płytę klatki i zamontuj ją bezpośrednio za O3. Wyśrodkuj TL3 na przychodzącym świetle emisyjnym, a następnie wyreguluj nachylenie TL3, aby wyrównać światło wychodzące do dysku z matowego szkła.
    6. Zamontuj kamerę w odpowiedniej odległości od soczewki tubusu, mierzonej linijką.
    7. Przykręć zarówno 2 tubusy obiektywu, jak i filtr emisyjny do aparatu.
    8. Ponownie zamontuj tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2. Zamontuj próbkę testową barwnika fluorescencyjnego i oświetl próbkę wiązką wzbudzenia.
    9. Włącz kamerę, a następnie otwórz program Micromanager na podłączonym komputerze. Kliknij na Na żywo, aby przejść do podglądu na żywo. Kliknij Auto Once, aby ustawić początkowe ustawienia ekspozycji, a następnie zresetuj ekspozycję w razie potrzeby podczas obrazowania.
      UWAGA: Micromanager nie będzie działał poprawnie, jeśli nie zostanie otwarty po włączeniu kamery.
    10. Wyreguluj pokrętła translacji xy na uchwycie O3, aż mały otwór w szklanym dysku wyrównującym zostanie wyśrodkowany w polu view (FoV). Wyregulować O3 osiowo za pomocą etapu translacji klatki, aż otwór będzie ostry; krawędzie powinny być ostre (Rysunek 6).
    11. Obraz koralików fluorescencyjnych, aby sprawdzić jakość systemu.
      1. Usuń tarczę wyrównującą z matowego szkła, zamontuj próbkę koralików 3D i oświetl próbkę wiązką wzbudzenia.
      2. Dostosuj wysokość próbki względem O1, aż kulki fluorescencyjne wypełnią okrągły obszar w środku pola widzenia.
      3. Precyzyjnie dostosuj położenie O3 za pomocą stolika xy i etapu translacji osiowej, aż funkcje rozproszenia punktowego (PSF) będą okrągłe (wskazujące na minimalne aberracje) i jasne (wskazujące na dobry stosunek sygnału do szumu) (Rysunek 7). Jeśli nie można tego osiągnąć poprzez regulację O3, jest wysoce prawdopodobne, że układ optyczny pomiędzy składnikami O1 i O2 jest nieoptymalnie ustawiony; Postępuj zgodnie z kontrolami diagnostycznymi w kroku 3.13 poniżej.
      4. Jeśli można uzyskać okrągłe PSF, pomiń etap diagnostyki i przejdź do przechylania systemu obrazowania.
  13. W razie potrzeby wykonaj kontrole diagnostyczne.
    UWAGA: Po uzyskaniu dobrych PSF pozostałe etapy diagnostyczne można pominąć.
    1. Zamontuj światło jasnego pola (BF) nad O1. Zamontuj dodatni cel testu siatki na stoliku na próbkę na tej samej wysokości osiowej co lustro wyrównujące. Wyśrodkuj siatkę 10 μm i oświetl siatkę światłem BF.
    2. Zobrazuj siatkę w aparacie i przesuwaj próbkę, aż siatka będzie ostra. Użyj obrazu siatki, aby potwierdzić, że pole w poprzek pola widzenia jest płaskie: jeśli nie, siatka będzie wyglądać na zniekształconą i wygiętą. Aby skorygować zły obraz siatki, dostosuj pozycję xyz i nachylenie O3, a następnie odpowiednio dostosuj TL3 i kamerę.
      UWAGA: Jeśli możliwe jest uzyskanie płaskiej siatki, powtórz krok 3.12.10, a następnie przejdź do przechylania systemu obrazowania.
    3. Ustaw kamerę do wyrównywania lub kamerę do obrazowania w odpowiedniej odległości, aby SL2 ustawiła ostrość obrazu na matrycy. Wyobraź sobie cel siatki na płaszczyźnie pośredniej (Rysunek 8). Jeśli ta siatka jest również przekrzywiona, jest wysoce prawdopodobne, że układ optyczny pomiędzy komponentami O1 i SL2 jest nieoptymalnie wyrównany i powinien zostać ponownie przeanalizowany. W razie potrzeby zoptymalizuj wyrównanie przed przejściem dalej.
      UWAGA: Jeśli kamera nie mieści się pomiędzy SL2 i TL2, użyj dodatkowego lustra, aby odbić obraz o 90° po SL2 i na kamerę.
    4. Sprawdź PSF na płaszczyźnie pośredniej: Po sprawdzeniu siatki, kolejnym dobrym sprawdzeniem diagnostycznym jest sprawdzenie PSF na tej samej płaszczyźnie pośredniej. Dobry obraz w tej płaszczyźnie, który jest podobny do Rysunek 7, ale w innym powiększeniu (Rysunek 9), wskazuje na dobre wyrównanie przez SL2.
      UWAGA: Jeśli w płaszczyźnie pośredniej można uzyskać płaską siatkę i okrągłe PSF, powtórz krok 3.13.2, następnie krok 3.12.10, a następnie przejdź do przechylania systemu obrazowania.
  14. Przechyl podsystem obrazowania O3 do 30°.
    1. Usuń O3, TL3 i aparat.
    2. Ponownie włóż O3 pod kątem 30° do osi optycznej O2, używając linii na stole jako prowadnicy.
    3. Zamontuj tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2. Zamontuj akrylowy fluorescencyjny szkiełko testowe na stoliku i oświetl slajd laserem wzbudzającym. Jeszcze raz spójrz przez tył O3, wyreguluj zarówno wysokość, jak i położenie osiowe O3, aby znaleźć światło emisyjne pod kątem 30°, a następnie wyreguluj O3 osiowo, aż światło emisyjne wypełni tylny otwór.
    4. Wyjmij tarczę wyrównującą z matowego szkła pomiędzy SL2 i TL2, aby uzyskać silniejszy sygnał emisyjny.
    5. Wkręć dwa pręty klatkowe o średnicy 8 cali z tyłu stolika translacyjnego O3. Wsuń płytę klatki z zamontowanym dyskiem z matowego szkła na pręty, a następnie precyzyjnie wyreguluj O3 za pomocą mocowania xy, aby upewnić się, że światło emisyjne wychodzi z O3 wyśrodkowane. Następnie usuń pręty klatki.
    6. Zamontuj dysk z matowego szkła w przybliżonym położeniu czujnika kamery i dopasuj wysokość i położenie dysku do światła emisyjnego.
    7. Zamontuj TL3 bezpośrednio za O3. Wyśrodkuj TL3 na przychodzącym świetle emisyjnym, a następnie wyreguluj nachylenie TL3, aby wyrównać światło wychodzące do dysku z matowego szkła.
    8. Aby dokładniej ustawić odległość od kamery TL3, ostrożnie odkręć O3 i zamontuj laser wyrównujący tak, aby był ustawiony przez TL3 na kamerze. W razie potrzeby należy użyć filtrów ND, aby natężenie lasera wynosiło <1 mW. Uruchom podgląd na żywo z kamery i wyreguluj TL3 osiowo, aby zminimalizować plamkę lasera na kamerze.
    9. Ponownie zamontuj tarczę wyrównującą z matowego szkła we wspólnej płaszczyźnie ogniskowej między SL2 i TL2. Zamontuj próbkę testową barwnika fluorescencyjnego i oświetl próbkę wiązką wzbudzenia. Wyreguluj pokrętła translacji xy na uchwycie O3, aż mały otwór w szklanym dysku wyrównującym znajdzie się w polu widzenia w aparacie. Dostosuj etap translacji koszyka, aby przesuwać O3 osiowo, aż otwór będzie ostry; Upewnij się, że otwór wygląda podobnie do tego, jaki wyglądał pod kątem 0°.
    10. Ponownie zamontuj dodatni cel testu siatki na tej samej wysokości osiowej i oświetl siatkę światłem BF. Upewnij się, że tylko jedna sekcja pionowa jest ostra (ze względu na nachylenie 30°). Po raz kolejny użyj obrazu siatki, aby potwierdzić, że pole w poprzek pola widzenia jest płaskie, nawet gdy jest nieostre. Gdy slajd jest przesuwany osiowo, upewnij się, że ostra część pola widzenia (celu siatki) przesuwa się po ekranie w poziomie, podczas gdy kwadraty siatki zachowują stały rozmiar (Rysunek 10).
      UWAGA: Ze względu na nachylenie płaszczyzny obrazowania na próbce, siatka może wydawać się lekko rozciągnięta w płaszczyźnie x.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Technika lasera w środku. Wysyłanie skolimowanej wiązki testowej przez przód O1 i obserwowanie wiązki, która wychodzi z O2 na odległej powierzchni. Jeśli wszystkie komponenty zostaną ustawione w odpowiedniej odległości, wiązka utworzy mały dysk Airy na odległej powierzchni. Wszystkie skróty są takie same jak w Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Wykorzystanie światła emisyjnego do wyrównania. (A) Emisja światła z akrylowego suwaka fluorescencyjnego na przykręcanym celu za BFP O2. (B) Znajdowanie światła emisyjnego za pomocą wzroku przez tylną część O3. Skróty: O2-O3 = cele; BFP = tylna płaszczyzna ogniskowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 6: Obraz z kamery prawidłowo zogniskowanej tarczy wyrównującej z matowego szkła. Dysk został umieszczony w płaszczyźnie pośredniej między SL2 i TL2. Podziałka = 50 μm. Skróty: SL2 = obiektyw skanujący; TL2 = soczewka tubusu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-6
Rysunek 7: Obraz z kamery próbki koralików 3D. Obraz przedstawia koraliki 1 nm z modułem obrazowania ustawionym na 0° i oświetlone okrągłą wiązką przed włożeniem soczewek cylindrycznych. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-7
Rysunek 8: Dodatni cel testu siatki prawidłowo skupiony na płaszczyźnie pośredniej między SL2 a TL2. Płaskie siatki na całej powierzchni pola wskazują na dobre wyrównanie komponentów SL2 i wcześniejszych. Podziałka = 30 μm. Skróty: SL2 = obiektyw skanujący; TL2 = soczewka tubusu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-8
Rysunek 9: Obraz z kamery próbki koralików 3D. Obraz przedstawia koraliki 1 nm prawidłowo skupione na płaszczyźnie pośredniej między SL2 i TL2. Podziałka = 30 μm. Skróty: SL2 = obiektyw skanujący; TL2 = soczewka tubusu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-9
Rysunek 10: Dodatni cel testu siatki z nałożonym żółtym kwadratem o stałym rozmiarze, aby pasował do kwadratów siatki. (A) Siatka w centrum uwagi po lewej stronie. (B) Siatka z ostrością po prawej stronie. Żółty kwadrat odpowiada rozmiarowi pól siatki po obu stronach pola widzenia. Podziałka = 30 μm. Skrót = FoV = pole widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Wyrównywanie ukośnego arkusza światła

  1. Usuń O1 i ponownie włóż na swoje miejsce klatkę wyrównującą z podwójnego matowego szkła. Upewnij się, że wiązka jest skolimowana i wyśrodkowana na obu dyskach z matowego szkła.
  2. Przykręć soczewkę cylindryczną 1 (CL1) do obrotowego mocowania obiektywu. Zamontuj CL1 w torze optycznym i obróć uchwyt tak, aby wiązka była rozszerzana w kierunku prostopadłym do stołu optycznego. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL1 tak, aby belka była wyśrodkowana z przodu i utrzymywała wyśrodkowaną pozycję na obu dyskach z matowego szkła.
  3. Przykręć soczewkę cylindryczną 2 (CL2) do obrotowego mocowania obiektywu i zamontuj CL2 w ścieżce optycznej w odpowiedniej odległości, aby utworzyć system 4f z CL1. Obróć CL2 do tej samej orientacji co CL1, tak aby wiązka została rozciągnięta w kierunku prostopadłym do stołu optycznego i skolimowana. Użyj karty testowej, aby zmierzyć wysokość cylindrycznego profilu belki w wielu miejscach, aby upewnić się, że belka jest skolimowana. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL2, jak wykonano w kroku 4.2.
  4. Przykręć soczewkę cylindryczną 3 (CL3) do obrotowego mocowania obiektywu i zamontuj CL3 w ścieżce optycznej w odpowiedniej odległości, aby utworzyć system 4f z L3. Obróć CL3 do tej samej orientacji, co CL1 i CL2, tak aby wiązka była skupiona w dół do poziomego profilu arkusza w płaszczyźnie ogniskowej. Dostosuj nachylenie i pozycję boczną CL3, jak wykonano w kroku 4.2.
  5. Włóż szczelinę: Używając czterech prętów klatkowych 4 cale i mocowania klatki CL3, zamontuj szczelinę w orientacji pionowej w płaszczyźnie ogniskowej między CL3 i L3, zgodnie z pomiarem linijką. Użyj rozciągniętego profilu belki wzbudzenia, aby wyregulować wysokość i boczne położenie szczeliny, aż zostanie wyśrodkowana na belce.
  6. Ponownie włóż O1, zamontuj próbkę do badania barwnika fluorescencyjnego i oświetl próbkę arkuszem światła wzbudzenia. Upewnij się, że na czujniku kamery arkusz światła 0° jest wyświetlany jako cienki pionowy arkusz (Rysunek 11A).
  7. Usuń próbkę testu barwnika fluorescencyjnego i wytrzyj O1 do czysta. Niech arkusz światła rozszerza się powyżej O1 bez przeszkód. Korzystając ze zmotoryzowanego sterowania stopniem translacji, przesuń M1 w kierunku soczewek cylindrycznych, aby ustawić kąt arkusza świetlnego na około 60 ° w stosunku do osi optycznej O1.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby arkusz świetlny był przechylony we właściwym kierunku, aby wyrównać się z podobnie nachyloną płaszczyzną obrazowania (Rysunek 12); Jeśli system jest ułożony inaczej niż ten konkretny projekt, prawidłowy kierunek nachylenia można określić za pomocą geometrycznego śledzenia promieni.
    UWAGA: Dla porównania, przesunięcie M1 2.647 mm w kierunku szczeliny ustawia arkusz światła na prawidłowe nachylenie w tej konfiguracji.
  8. Ponownie włóż próbkę do badania barwnika fluorescencyjnego, aby zobrazować przechylony arkusz. Upewnij się, że arkusz świetlny zachował pionowy kształt wiązki na kamerze, ale jest szerszy i słabszy (Rysunek 11B) .
  9. Przesuń próbkę osiowo ze stolikiem tak, aby barwnik fluorescencyjny był oświetlony przez arkusz świetlny na pięciu różnych głębokościach między środkiem pola widzenia a prawą stroną ekranu. Zapisz każdy obraz.
  10. Otwórz obrazy w Fidżi. Dla każdego obrazu wybierz narzędzie Linia i narysuj poziomą linię od środka pola widzenia do środka arkusza światła. Aby zmierzyć przemieszczenie, przejdź do punktu menu Analiza | Zmierz, aby zobaczyć długość linii. Następnie należy wykreślić przemieszczenie arkusza świetlnego w funkcji głębokości próbki, aby obliczyć kąt arkusza świetlnego powyżej O1.
  11. Lekko przetłumacz M1. Powtarzaj kroki 4.9 i 4.10, aż kąt arkusza świetlnego wyniesie 60° od osi optycznej O1, dopasowując się do kąta płaszczyzny obrazowania.

figure-protocol-10
Rysunek 11: Obrazy z kamery próbki testowej barwnika fluorescencyjnego oświetlone odpowiednio ukształtowaną blachą świetlną. (A) Arkusz pod kątem 90°, prosto w górę wzdłuż osi optycznej O1, oraz (B) nachylony do 30° (60° do osi optycznej O1). Podziałka = 50 μm. Skrót: O1 = obiektyw. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-11
Rysunek 12: Prawidłowy kierunek nachylenia arkusza światła, aby wyrównać się z płaszczyzną obrazowania O1. Skrót: O1-O3 = cele. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Dostrajanie systemu do obrazowania i zbierania danych

  1. Zamontuj szkiełko koralikowe 3D i przesuń próbkę osiowo ze stolikiem, aż koraliki wypełnią pole widzenia w aparacie.
  2. Dostosuj O3 za pomocą stopnia xy i etapu translacji klatki, mając na celu zminimalizowanie aberracji i optymalizację stosunku sygnału do szumu w obrazie (Rysunek 13).
  3. Dostosuj kołnierz korekcyjny O1, mając na celu zminimalizowanie aberracji i optymalizację stosunku sygnału do szumu w obrazie.

figure-protocol-12
Rysunek 13: Obrazy z kamery próbki koralików 3D (koraliki 1 μm) oświetlone przez odpowiednio ukształtowaną blachę świetlną. (A) Arkusz pod kątem 90°, prosto w górę wzdłuż osi optycznej O1, oraz (B) nachylony do 30° do osi optycznej O1. Żółte pole wskazuje część pola widzenia, która jest płaska, spójna i użyteczna (80 μm x 80 μm) i w której można uchwycić wiarygodne dane. Podziałka liniowa = 50 μm. Skróty: O1 = obiektyw; FoV = pole widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Kalibracja powiększenia systemu

  1. Zamontuj dodatni cel testu siatki na stoliku próbki i oświetl światłem jasnego pola.
  2. Przesuń suwak siatki osiowo ze stołem montażowym, aby ustawić ostrość na suwaku siatki. Ustaw ostrość na środku siatki.
  3. Przechwyć i zapisz obraz, a następnie otwórz go na Fidżi.
  4. Użyj narzędzia Linia i funkcji Zmierz na Fidżi, aby dokładnie zmierzyć odległość między dwiema liniami siatki w pikselach. Podziel tę wartość przez znaną odległość (10 μm), aby określić kalibrację pikseli na mikrony.
  5. Oblicz powiększenie (M) układu, używając zmierzonego rozmiaru piksela i znanego rozmiaru piksela za pomocą równania (1).
    figure-protocol-13 (1)

7. Pobieranie skanów wolumetrycznych

  1. Ustawić próbkę.
    1. Włącz podgląd kamery, galvo, generator funkcji, zasilacz, stage i laser wzbudzenia.
    2. Zamontuj próbkę, a następnie kliknij przycisk FSK w generatorze funkcji, aby ustawić falę trójkątną. Aby znaleźć próbkę, użyj generatora funkcyjnego, aby ustawić następujące parametry: amplituda międzyszczytowa 400 mV (za pomocą przycisku Ampl.), przesunięcie 0 (za pomocą przycisku Przesunięcie) i częstotliwość 200 mHz. Użyj okna Micromanager, aby ustawić czas naświetlania 100 ms.
    3. Przewiń w polu z ręcznie, aż dojdziesz do płaszczyzny próbki. Zoptymalizuj ustawienie z tak, aby żądany obszar skanowania wolumetrycznego przechodził przez ekran podczas jednego cyklu.
  2. Wybierz parametry skanowania.
    1. Upewnij się, że amplituda między szczytami jest ustawiona prawidłowo, sprawdzając wzrokowo, czy podgląd wygląda na ostry przez cały czas skanowania. Jeśli jakość obrazu pogorszy się szybciej, zbliżając się do jednego końca skanowania niż do drugiego, edytuj przesunięcie w generatorze funkcji, aby przesunąć środek skanowania w kierunku lepszego obszaru.
    2. W programie Micromanager wybierz czas ekspozycji i kliknij Multi-D Acq., aby otworzyć okno Multi-Dimensional Acquisition. Użyj pola Liczba, aby wybrać liczbę klatek, która ustawi całkowity czas pozyskiwania. Interwał między klatkami (liczba klatek na sekundę) zostanie ustawiony na podstawie czasu ekspozycji, chyba że w polu Interwał określono dłuższy interwał. W generatorze funkcji ustaw częstotliwość, aby utworzyć pełne skanowanie objętości o połowę okresu funkcji fali trójkątnej (skanowanie liniowe w jednym kierunku).
      UWAGA: Jeśli liczba klatek na sekundę i częstotliwość są zbyt niskie, zostanie pobrana zbyt mała liczba klatek do skanowania woluminu, a niska liczba klatek spowoduje powstanie widocznych artefaktów w przetwarzaniu końcowym. Dla porównania, Rysunek 13 składał się z ~100 ramek w skanie, a Rysunek 14 składał się z ~800. Bardzo ważne jest również, aby przy doborze parametrów wziąć pod uwagę samą próbkę. Upewnij się, że czas ekspozycji jest ustawiony w taki sposób, aby próbka była wystarczająco wzbudzona, ale nie nasycona. W tym celu można również dostosować intensywność lasera wzbudzającego. Jeśli użytkownik nabywa serię skanów wolumetrycznych w celu scharakteryzowania procesu zmieniającego się w czasie w 3D, upewnij się, że skala czasu skanowania przekracza dynamikę skali czasowej systemu.
  3. Zbieranie filmów: Uzyskaj film poklatkowy, który uchwyci co najmniej czas trwania pełnego narastania lub zmniejszania fali trójkąta, co odpowiada jednemu pełnemu skanowaniu woluminu.

8. Procedury przetwarzania końcowego

  1. Prostowanie wolumetrycznych stosów obrazów
    1. Przekrzywienie skanów woluminu w celu przekształcenia stosu obrazów w pochylonych płaszczyznach na serię obrazów w rzeczywistych współrzędnych xyz.
      UWAGA: Istnieje wiele doskonałych przewodników na temat przetwarzania końcowego obrazów na jasnych arkuszach i oprogramowania typu open source do wykonywania prostowania istniejących skanów woluminów, a także do wykonywania prostowania i zapisywania obrazów prostowanych podczas akwizycji24.
    2. Aby przekrzywić skany woluminu, należy uzyskać następujące dwa parametry: rzeczywistą odległość między dwiema klatkami w pikselach (d) oraz kąt między płaszczyzną klatki a płaszczyzną x-y (θ jest ustawiane przez kąt ukośnego arkusza światła (w tym systemie 30°). Odległość między ramkami będzie zależeć od optyki obrazowania i ustawień akwizycji.
  2. Znajdowanie parametru d
    1. Kalibruj odległość między ramkami za każdym razem, gdy system jest znacznie wyrównany. Wykonaj tę kalibrację ze stosem obrazów koralików fluorescencyjnych, ponieważ są one najłatwiejsze w użyciu do diagnozowania problemów.
    2. Uzyskaj stos obrazów i uruchom kod prostowania, używając dowolnego początkowego odgadnięcia parametru d. Otwórz ustawiony stos obrazów w ImageJ i przewiń stos. Jeśli d zostało ustawione znacznie daleko od jego rzeczywistej wartości, zauważ, że koraliki będą wyglądały na sztucznie wydłużone w x lub y, a poszczególne koraliki będą wydawały się poruszać w płaszczyźnie xy, gdy użytkownik przewija klatki w z (zamiast ustawiać ostrość i rozmycie od tego samego punktu centralnego). Iteruj po parametrze d wiele razy, aż te problemy przestaną być widoczne.
    3. Gdy parametr d wydaje się być dość bliski wartości rzeczywistej, oblicz projekcje maksymalnej intensywności stosu obrazów wzdłuż kierunków x i y. Należy pamiętać, że koraliki o średnicy bliskiej granicy dyfrakcji mogą wydawać się wydłużone w z, ale idealnie nie powinny wydawać się stożkowe lub być wydłużone po przekątnej. Dostosuj parametry prostowania, aż te kryteria nie ulegną znacznej poprawie w nowych iteracjach. Dla porównania, dane pokazane w Rysunek 13 zostały przerysowane na d = 2,50 piksela, a dane w Rysunek 14 zostały przerysowane na d = 1,0 pikseli.
      UWAGA: Odległość między klatkami będzie zależeć liniowo od amplitudy skanowania, częstotliwości i liczby klatek na sekundę.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy wolumetryczne skany koralików 1 μm zanurzonych w gumie gellan. Rysunek 14 pokazuje maksymalne projekcje intensywności skanów wolumetrycznych wzdłuż kierunków x, y i z.

figure-results-1
Rysunek 14: Obrazowanie wolumetryczne koralików fluorescencyjnych 1 μm w gumie gellan. Pokazano projekcje maksymalnej intensywności skanów wolumetrycznych z odklejoną powierzchnią. Podziałka = 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pokazaliśmy użycie jednoobiektywowego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez wykonywanie wolumetrycznych skanów próbek astry mikrotubul. Krótko mówiąc, znakowane rodaminą, stabilizowane taksolem mikrotubule polimeryzowano z odtworzonych dimerów za pomocą GTP; następnie, po polimeryzacji, klastry motoryczne kinezyny na bazie streptawidyny zmieszano z próbkami wraz z ATP w celu uzyskania końcowych stężeń 6 μM mikrotubul, 0,5 μM dimerów kinezyny i 10 mM ATP. Obszerne protokoły i przewodniki dotyczące przygotowania stabilizowanych taksolem mikrotubul i klastrów motorycznych kinezyny można znaleźć na stronach internetowych Mitchson Lab i Dogic Lab25,26. Próbki delikatnie pipetowano do szkiełek mikroskopowych, szczelnie zamykano i pozostawiono na 8 godzin przed obrazowaniem, aby umożliwić zatrzymanie aktywności motorycznej, tak aby próbki osiągnęły stały stan strukturalny przypominający astry.

Badania nad zrekonstruowanymi systemami cytoszkieletowymi najczęściej wykorzystują mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną do obrazowania włókien znakowanych. Jednak obie te techniki mają ograniczone możliwości obrazowania gęstych próbek 3D27. Chociaż poczyniono znaczne postępy w badaniach nad materią aktywną opartą na cytoszkieletach in vitro, ograniczając próbki do bycia quasi 2D28,29, sieci cytoszkieletów są z natury 3D, a wiele obecnych wysiłków polega na zrozumieniu efektów, które mogą wystąpić tylko w próbkach 3D29,30, tworząc w ten sposób potrzebę obrazowania 3D w wysokiej rozdzielczości.

figure-results-2
Rysunek 15: Ułatwienie wizualizacji 3D próbek cytoszkieletu za pomocą jednoobiektywowej mikroskopii świetlnej. (A) Obrazy fluorescencyjnych astry mikrotubul uzyskane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica DMi8. Obrazy pokazują różne płaszczyzny z z-scanu. Podziałka liniowa = 30 μm. (B) Zdekonwolucjonizowane obrazy z pochylonymi obrazami ze skanu wolumetrycznego wykonanego na jednoobiektywowym zestawie arkuszy świetlnych tej samej próbki. Podziałka = 30 μm. Pochylony obszar obrazu odpowiada użytecznemu polu widzenia (żółte pole) pokazanemu w Rysunek 13B. Podczas gdy konfokalny doskonale radzi sobie z obrazowaniem pojedynczych płaszczyzn w pobliżu szkiełka nakrywkowego, gęstość próbki fluorescencyjnej wprowadza komplikacje podczas obrazowania w wyższych płaszczyznach ze względu na dodatkowy sygnał z dołu płaszczyzny obrazowania. Arkusz świetlny omija ten problem, oświetlając tylko płaszczyznę obrazowania, umożliwiając w ten sposób jednolicie ostre obrazowanie w różnych płaszczyznach w z. Skróty: SOLS = jednoobiektywny arkusz świetlny; FoV = pole widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W Rysunek 15, demonstrujemy obrazowanie objętościowe zrekonstruowanej sieci mikrotubul skurczonej do struktur podobnych do asterów przez klastry motoryczne kinezyny. Jak wykazano w poprzednich badaniach28,31, te struktury 3D mają tendencję do gęstego zagęszczenia w kierunku środka, co skutkuje jasnymi obszarami fluorescencji, które dominują w sygnale. W płaszczyznach obrazowania w pobliżu szkiełka nakrywkowego (niski poziom z), mikroskopia konfokalna (Rysunek 15A) może rozdzielić pojedyncze włókna na obwodzie asteru, z dodatkowym tłem w kierunku środka z powodu nieostrych sygnałów fluorescencyjnych z góry. Jednak przesunięcie o kilka mikronów w z szybko obniża jakość obrazów ze względu na to, że w sygnale na płaszczyźnie obrazowania dominują nieostre gęste sekcje asteru. Jednopłaszczyznowe oświetlenie arkusza świetlnego (Rysunek 15B) eliminuje nieostre sygnały z gęstych części asteru powyżej i poniżej płaszczyzny obrazowania, umożliwiając w ten sposób porównywalną jakość obrazu między płaszczyznami. Zdolność arkusza świetlnego do generowania wysokiej jakości, wiarygodnych wolumetrycznych danych skanowania otwiera możliwość wizualizacji i charakteryzowania zjawisk 3D w odtworzonych systemach cytoszkieletu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa ważne szczegóły dotyczące tego protokołu to całkowity koszt systemu oraz oczekiwany czas budowy i wyrównania. Chociaż dokładny koszt jest zmienny, możemy spokojnie oszacować, że koszt in toto tego SOLS lub podobnego systemu DIY mieściłby się w przedziale 85 000 USD. Zwracamy uwagę, że szacunki te uwzględniają cenę detaliczną wszystkich komponentów, więc ta ogólna cena może zostać znacznie obniżona poprzez pozyskiwanie używanych komponentów. Jeśli chodzi o czas budowy, rozsądne byłoby oczekiwanie, że użytkownik z niewielkim doświadczeniem w optyce zbuduje i wyrówna cały system SOLS w ciągu 1-2 miesięcy, pod warunkiem, że wszystkie komponenty są dostępne i gotowe. Pomimo długości i złożoności protokołu, uważamy, że ilość szczegółów w rękopisie pisemnym, w połączeniu z protokołem wideo, powinna sprawić, że protokół ten będzie prosty i szybki do naśladowania.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Po pierwsze, umiejscowienie galvo determinuje rozmieszczenie wielu soczewek, ponieważ jest on częścią trzech oddzielnych par soczewek 4f. Bardzo ważne jest, aby galvo było zarówno sprzężone z tylnymi płaszczyznami ogniskowymi O1 i O2, jak i prawidłowo wyśrodkowane, aby zapewnić skanowanie niezmiennicze pod kątem. Po drugie, jakość obrazu jest niezwykle wrażliwa na wyrównanie O2 i O3 względem siebie. W tym przypadku należy zwrócić uwagę, aby upewnić się, że po pierwsze, kąt wyrównania O3 do O2 odpowiada nachyleniu arkusza światła wzbudzenia, zapewniając w ten sposób maksymalnie płaskie oświetlenie w podobnie nachylonym polu widzenia. Po drugie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości osiowej, aby utrzymać płaskie pole widzenia o jak największej powierzchni. Po trzecie, O3 musi być umieszczony w odpowiedniej odległości bocznej od O2, aby zmaksymalizować sygnał przechodzący przez interfejs O2-O3.

Jeśli chodzi o użyteczne pole widzenia, system ten osiągnął płaskie, niezawodne pole ze stałym oświetleniem na obszarze 80 μm x 80 μm. Obszar ten jest mniejszy niż maksymalne pole widzenia zapewniane przez kamerę, więc użyteczne pole widzenia jest oznaczone żółtym polem na rysunku 13. Jeśli chodzi o zdolność rozdzielczą, system ten osiągnął minimalną rozdzielczość 432 nm wzdłuż osi x i 421 nm wzdłuż osi y, która została zmierzona poprzez znalezienie średniej sigma x i y funkcji rozproszenia Gaussa (PSF) w dobrym polu widzenia i pomnożenie przez dwa. Zwracamy uwagę, że ten system nie został zoptymalizowany pod względem całkowitego NA, co oznacza, że jest miejsce na znaczną poprawę, jeśli użytkownicy oczekują wyższej zdolności rozdzielczej niż ta, którą osiągnął ten system. Istnieje wiele kompatybilnych opcji obiektywów dla tego typu konstrukcji SOLS, z których wiele przyczyniłoby się do wyższej rozdzielczości systemu, ale z wadami w postaci wyższego kosztu, mniejszego pola widzenia lub bardziej skomplikowanych technik dopasowywania na interfejsie przekaźnika 8,11,13,20. Oddzielnie, jeśli użytkownicy pragną większego pola widzenia, włączenie drugiego galvo, aby umożliwić skanowanie 2D, osiągnęłoby ten cel, ale wymagałoby dodatkowej optyki i mechaniki sterowania, które zostałyby zintegrowane z projektem32. Więcej szczegółów na temat modyfikacji systemu podaliśmy na naszej stronie internetowej, wraz z linkami do innych pomocnych zasobów dotyczących procesu projektowania23.

Poza ulepszeniem konkretnych komponentów dla tego konkretnego projektu, bardzo możliwe byłoby dodanie innych technik lub modalności mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do tej konstrukcji. Jednym z takich ulepszeń byłoby włączenie oświetlenia o wielu długościach fali, co wiązałoby się z ustawieniem dodatkowych laserów wzbudzających do oryginalnej ścieżki wzbudzenia8. Ponadto, ponieważ ten typ konstrukcji SOLS pozostawia próbkę dostępną, dodanie dodatkowych funkcji do mikroskopu, w tym między innymi pęsety optycznej, mikrofluidyki i reometrii, jest stosunkowo proste 2,33.

W porównaniu z niezliczonymi przewodnikami po arkuszach świetlnych, które zostały opublikowane, protokół ten zawiera instrukcje na poziomie zrozumienia, który może uznać za pomocny dla użytkownika bez znaczącego doświadczenia w optyce. Tworząc przyjazną dla użytkownika konstrukcję SOLS z tradycyjnymi możliwościami montażu szkiełek z próbkami dostępnymi dla szerszego grona odbiorców, mamy nadzieję umożliwić jeszcze dalsze rozszerzenie zastosowań badań opartych na SOLS we wszystkich dziedzinach, w których instrument jest lub może być wykorzystywany. Nawet przy szybko rosnącym zastosowaniu instrumentów SOLS w liczbie 2,34,35, uważamy, że wiele korzyści i zastosowań instrumentów typu SOLS nadal pozostaje niezbadanych i wyrażamy podekscytowanie możliwościami tego typu instrumentów w przyszłości.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Wszystkie badania zostały przeprowadzone przy braku powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) dla J.S. Jesteśmy wdzięczni za wskazówki udzielone przez dr Bin Yanga i dr Manisha Kumara podczas procesu dostosowania. Dziękujemy dr Jenny Ross i K. Alice Lindsay za instrukcje przygotowania silników kinezynowych.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soczewka płasko-wklęsła 1" f = -50 mmThorlabs LC1715-A-MLDo lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $49.5
1" Achromatyczny dublet f = 100 mm (x3)ThorlabsAC254-100-A-MLL2, L4 i laser do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 342.42
1" Achromatyczny dublet f = 125 mmThorlabsAC254-125-A-MLSL2
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=150 mmThorlabsAC254-150-A-MLL3
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=150 mmThorlabsAC254-150-A-MLTL2
Szacowany koszt: $114.14
" Achromatyczny dublet f=45 mmThorlabsAC254-045-A-MLL1
Szacowany koszt: $114.14
1" Achromatyczny dublet f=75 mmThorlabsAC254-075-A-MLSL1
Szacowany koszt: $114.14
Soczewka cylindryczna 1" f = 100 mmThorlabsLJ1567RM CL3
Szacowany koszt: $117.62
" Soczewka cylindryczna f = 200 mmThorlabsLJ1653RMCL2
Szacowany koszt: $111.22
" Soczewka cylindryczna f = 50 mmThorlabsLJ1695RMCL1
Szacowany koszt: $117.62
1" Zamontowany otworek, 30 &mikro; m Średnica otworkaThorlabsP30KSzacowany koszt: $ 77.08
1" Srebrne lustro (x3)ThorlabsPF10-03-P01M1, M2, jeden do wyrównania
Szacowany koszt: $ 168.78
2-calowe lustro eliptyczneThorlabsPFE20-P01M3
Szacowany koszt: $179.98
2-calowy uchwyt na słupki (x11)ThorlabsPH2Do niestandardowego montażu laserowego, koła ND, ekranów bezpieczeństwa
Szacowany koszt: $ 98.45
Słupki 2" (x47)ThorlabsTR2Do niestandardowego montażu laserowego i komponentów optycznych
Szacowany koszt: $277.3
Słupki 3" (x4) Szpitale TR3Do podpór M3 i innych mocowań
Szacowany koszt: $24.6
3-calowy uchwyt na słupki (x4)Thorlabs PH3Szacowany koszt: 38,48 USD
Adapter klatki od 30 do 60 mm ThorlabsLCP33Do montażu O1
Szacowany koszt: $ 45.42
Koło filtra klatkowego 30 mmThorlabsCFW6Do montażu filtrów ND
Szacowany koszt: $ 172.36
Płyta klatki 30 mm (x6)ThorlabsCP33Aby zbudować klatkę wyrównującą i laser do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 114.54
30mm Kątowe mocowanie lustra kinematycznego 30 mm (x3)ThorlabsKCB1Do montażu M1 i M2 oraz do wyrównywania lasera
Szacowany koszt: 463,95 $
4-calowy uchwyt na słupek (x30)ThorlabsPH4Szacowany koszt: 320,1 $
Laser i zasilacz 561 nm Opto Engine LLCMGL-FN-561-100mWLaser wzbudzenia
Szacowany koszt: 6000 $
Płyta klatki 60 mm (x2)ThorlabsLCP01Do montażu TL1 i M3 mount
Szacowany koszt: $ 88.52
60mm Kątowy uchwyt do lusterka kinematycznegoThorlabsKCB2Aby zamontować M3
Szacowany koszt: $ 187.26
90° Odwróć góręThorlabs TRF90Do lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 95.5
Adapter z zewnętrznymi gwintami C-Mount i wewnętrznymi gwintami SM1Thorlabs SM1A9Aby podłączyć tubus obiektywu do aparatu
Szacowany koszt: $20.96
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami C-MountThorlabs SM1A10Aby podłączyć soczewkę tubusu do mocowania obiektywu
Szacowany koszt: $21.82
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M25 (x2)ThorlabsSM1A12Do montażu O1 i O2
Szacowany koszt: $ 47.06
Adapter z zewnętrznymi gwintami SM1 i wewnętrznymi gwintami M26ThorlabsSM1A27Do montażu O3
Szacowany koszt: $22.38
Dysk wyrównującyThorlabs SM1A7Szacowany koszt: 20.45 USD
Laser wyrównującyBISKEEhttps://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM
Szacowany koszt: 16.98 USD
Autoluorescent Plastic Slide, czerwony Chroma92001Szacowany koszt: 20 USD
Beam Shutter Szpitale SM1SH1Do blokowania światła laserowego
Szacowany koszt: 65.8 USD
Montaż obrotowy klatki (x3)ThorlabsCRM1TDo montażu CL1-3
Szacowany koszt: 282.15 USD
Pręty systemu klatkowego 1" (x8)Thorlabs ER1Do montażu M3 i O1
Szacowany koszt: 44,8 USD
Pręty systemu klatkowego 3" (x2)Thorlabs ER3Do montażu O3
Szacowany koszt: 14,28 USD
Pręty systemu klatkowego 4" (x4)Thorlabs ER4Do montażu szczeliny
Szacowany koszt: $ 30.76
Pręty systemu klatkowego 8 "(x2)Thorlabs ER8Do wyrównania soczewek tubusu
Szacowany koszt: 25,3 USD
Pręty systemu klatkowego 12 "(x8)ThorlabsER12Do klatki wyrównującej
Szacowany koszt: 145,36 USD
KameraAndorZyla 4.2 sCMOSSzacowany koszt: ~ $ 14,000
Widelec zaciskowy (x35)ThorlabsCF125Do mocowania mocowań słupków
Szacowany koszt: $ 338.8
Szkło osłonowe, 22 x 22 mm Corning2850-22Dla próbek preparatów
Szacowany koszt: 265 USD
Dichroic AVRDI01-R405/488/561/635-25x36Aby podzielić ścieżki wycinkowe/emisyjne
Szacowany koszt: $ 965
Etap translacji jaskółczego ogonaThorlabsDT12Aby przetłumaczyć otworek
Szacowany koszt: $ 90.55
Filtr emisyjnyThorlabsFELHO600Szacowany koszt: $ 140.99
Dysk wyrównujący z matowego szkła (x2)ThorlabsDG10-1500-H1Do klatki wyrównującej i płaszczyzny pośredniej
Szacowany koszt: 75.14 USD
Generator funkcyjnyHewlett-PackardHP 33120A 15 MHzDo sterowania galvo
Szacowany koszt: 900 USD
Galwanometr - system 1D o dużej średnicy wiązkiThorlabsGVS011Szacowany koszt: 1715.78
USD Zasilacz galwanometruSiglentSPD3303CSzacowany koszt: 300 USD
GelriteResearch Products InternationalG35020-100.0Guma Gellan do próbki koralików 3D
Szacowany koszt: $ 68.25
FIJI SoftwareOpen-sourcePobierz z https://imagej.net/software/fiji/downloads
Szacowany koszt: bezpłatna
płyta grzejna / mieszadłoCorning6795-220Do przygotowania roztworów próbnych
Szacowany koszt: $ 550
Sterownik silnika szczotkowanego K-CubeThorlabsKDC101Napędy Z825B
Szacowany koszt: $ 757.51
Montaż kinematycznyThorlabsKM100SDo montażu dichroic
Szacowany koszt: $ 92.01
Oprogramowanie KinesisThorlabs Pobierz z https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285
Szacowany koszt: Bezpłatny
laserowy bloker światła Szpitale LB1Do odbić filtra ND
Szacowany koszt: 57.65
USD Montaż laserowywykonanydrukowany w 3D
Szacowany koszt: Nie dotyczy
laserowego ekranu bezpieczeństwa (x2)Thorlabs TPS4Do blokowania rozproszonego światła laserowego
Szacowany koszt: 92.02 USD
Soczewki do skanowania laserowegoThorlabsTTL200MPTL1
Szacowany koszt: 1491 USD
Mocowanie obiektywu (x10) ThorlabsLMR1Aby zamontować wszystkie obiektywy i dodatkowe lustro wyrównawcze.
Szacowany koszt: 164,7 USD
Linijka magnetycznaThorlabsBHM4Aby sprawdzić wyrównanie
Szacowany koszt: 52,74 USD
Oprogramowanie Micro-Manager Open-sourcePobierz z https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
Szacowany koszt: Bezpłatne
szkiełka mikroskopoweThermo Fisher Scientific 12550400Dla próbek preparatów
Szacowany koszt: 123.9 USD
Stolik mikroskopowy ASIFTP-2000 z niestandardowymiczęściami Aby dokładnie przetłumaczyć próbki
Szacowany koszt: ~$16,000
Mini mikser wirowy VWR10153-688Do przygotowania próbki
Szacowany koszt: 152.64 USD
Siłownik z napędemThorlabsZ825BAby dokładnie przetłumaczyć M1
Szacowany koszt: 729,07 USD
Zamontowana standardowa tęczówka (x2)ThorlabsID20Co najmniej 2 do wyrównania
Szacowany koszt: 118,02 USD
Zestaw filtrów ND Klatki piersioweNDK01 Aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia
Szacowany koszt: $ 726.73
Obiektyw Lens 1Nikon Plan Apo 60X/ 1.20 WIO1
Szacowany koszt: ~$15,000
Obiektyw 2NikonTU Plan Fluor 100X/0.90 O2
Szacowany koszt: ~ $ 6,000
Obiektyw Lens 3MitutoyoPlan Apo HR 50X/0.75O3
Szacowany koszt: ~ 6,800
USD OPM Oprogramowanie do deskowaniaOpen-sourcedo przetwarzania obrazu. Pobierz z https://github.com/QI2lab/OPM
Szacowany koszt: Bezpłatny
czujnik mocy fotodiodyThorlabs S121CDo pomiaru intensywności lasera
Szacowany koszt: 379,68 USD
Dodatnie zniekształcenia siatki CelThorlabsR1L3S3Pwyrównanie jasnego pola
Szacowany koszt: 267.87 USD
Miernik mocy Konsola cyfrowaThorlabs PM100DDo pomiaru intensywności lasera
Szacowany koszt: $1245.48
Rhodamine 6GThermo Scientific J62315.14Do próbki szkiełka z powłoką fluorescencyjną
Szacowany koszt: $27.7
Zacisk kątowy do słupkówThorlabs RA90Do wspornika M3 i lusterka opuszczanego
Szacowany koszt: 32.46 USD
Płyta klatki z gwintem RMS (x2) Szpitale CP42Do lasera do wyrównywania
Szacowany koszt: $ 70.56
Płyta ścinająca 2.5-5.0 mmThorlabsSI050P Szacowany koszt: $ 182.85
Płyta ścinająca 5,0-10,0 mmThorlabsSI100PSzacowany koszt: $ 201.47
Płyta ścinana 10.0-25.4 mmThorlabsSI254PSzacowany koszt: $ 236.42
Ekran podglądu płyty ścinanejThorlabsSIVSSzacowany koszt: $ 337.74
Interferometr ścinający z płytką 1-3 mmThorlabsSI035Do sprawdzania kolimacji
Szacowany koszt: $ 465.85
Wsuwany kołnierz na słupku (x35)Thorlabs R2Aby utrzymać wysokość słupka
Szacowany koszt: 208.25
USD SzczelinaThorlabsVA100Szacowany koszt: 294.64 USD
Szczelinowy tubus obiektywu, 3"Thorlabs SM1L30CDo wyrównywania lasera
Szacowany koszt: 77,45 USD
Lustro kwadratowe, 1 x 1 "https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva
did=642191768069& hvpos=& hvne
tw=g& hvrand=1336734911900437
4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt=
& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=&
hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1
943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L
yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL
q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA
Lw_wcB& th = 1
Szacowany koszt: 14.76 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stosy 1/2 "(x3)ThorlabsSM1L05Do montażu CL1-3
Szacowany koszt: 40.86 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 1 "ThorlabsSM1L10Aby zamontować O3
Szacowany koszt: 15.41 USD
Tubus obiektywu z możliwością układania w stos 2 "(x2)ThorlabsSM1L20Do ścieżki kamery
Szacowany koszt: $35.7
Adapter podstawy cokołu z ćwiekami (x37)Thorlabs BE1Aby przymocować mocowania słupków do stołu
Szacowany koszt: $ 400.71
Tłumaczenie mocowania obiektywu (x3)ThorlabsLM1XYAby drobno przetłumaczyć otworki, O2 i O3
Szacowany koszt: $ 441
Etap translacji ze standardowym mikrometrem (x2)ThorlabsPT1/MTS1-2
Szacowany koszt: $647.54
Instrukcja podróży Etap tłumaczeniaThorlabsCT1AMocowanie translacji klatki O3
Szacowany koszt: 497,3 USD
Obiektyw tubusowyNikonMXA20696TL3
Szacowany koszt: 359 USD
LED zamontowane Źródło światła MNWHL4Brightfield
Szacowany koszt: 171.28 USD
         CAŁKOWITY SZACOWANY KOSZT: $ 84,858.98
         Autorzy zauważają, że wiele części zostało zakupionych jako używane. Tutaj staraliśmy się odzwierciedlić cenę detaliczną wszystkich przedmiotów, więc całkowity koszt można znacznie obniżyć, kupując poszczególne używane przedmioty, zwłaszcza te droższe.
KOMPONENTY
Grasshopper3 USB3FLIR&nbsp; GS3-U3-23S6C-CDo kontroli diagnostycznych podczas osiowania. Zamiast tego można użyć kamery Acquisiton, ale później wymaga ona ponownego wyrównania.
Szacowany koszt: $ 1089
1 1 1 1 1 na zamówienie Białe diodyOPCJONALNE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The light-sheet microscopy revolution. Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).">Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).
  2. Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter. Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).">You, R., McGorty, R. Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter. Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).
  3. Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography. Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).">Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography. Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).
  4. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).">Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).">Dunsby, C. Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).
  6. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).">Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  7. Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy. Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).">Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy. Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).
  8. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).">Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  9. Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy. Optica. 3 (8), 897-910 (2016).">Wu, Y., et al. Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy. Optica. 3 (8), 897-910 (2016).
  10. Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization. Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).">Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization. Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).
  11. Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging. Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).">Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging. Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).
  12. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).">Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  13. A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife. 9, e57681(2020).">Sapoznik, E., et al. A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife. 9, e57681(2020).
  14. Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).">Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).
  15. Focusing super resolution on the cytoskeleton. F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).">Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. Focusing super resolution on the cytoskeleton. F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).
  16. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), (2019).">Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), (2019).
  17. Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites. Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).">Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites. Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).
  18. https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html (2023).">Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html (2023).
  19. https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html (2023).">Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html (2023).
  20. Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform. bioRxiv. , (2021).">Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform. bioRxiv. , (2021).
  21. Light-sheet microscopy: A tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).">Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  22. OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).">Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  23. https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols (2023).">Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols (2023).
  24. Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data. Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).">Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data. Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).
  25. https://mitchison.hms.harvard.edu/home (2023).">Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: https://mitchison.hms.harvard.edu/home (2023).
  26. http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/ (2023).">Research at Dogic Lab. , Available from: http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/ (2023).
  27. Light sheet imaging comes of age. Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).">Watkins, S. C., St. Croix, C. M. Light sheet imaging comes of age. Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).
  28. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).">Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  29. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).">Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  30. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).">Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).
  31. Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors. Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).">Kim, K., et al. Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors. Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).
  32. High NA single-objective lightsheet. , (2019).">Millett-Sikking, A., et al. High NA single-objective lightsheet. , (2019).
  33. 3D adaptive optics in a light sheet microscope. Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).">Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. 3D adaptive optics in a light sheet microscope. Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).
  34. Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy. Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).">Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy. Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).
  35. Computational hyperspectral light-sheet microscopy. Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).">Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. Computational hyperspectral light-sheet microscopy. Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light Sheet MicroscopySingle Objective MicroscopeFluorescence MicroscopyCytoskeleton NetworksOptical SectioningMicrotubule NetworksVolumetric ImagingSample MountingConfocal MicroscopyMicroscope Alignment

Related Articles