Artykuł metodologiczny

Obrazowanie mtHyPer7, ratiometrycznego biosensora do pomiaru nadtlenku mitochondriów, w żywych komórkach drożdży

DOI:

10.3791/65428

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Irving Medical Center, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadtlenek wodoru (H2O2) jest zarówno źródłem uszkodzeń oksydacyjnych, jak i cząsteczką sygnałową. Protokół ten opisuje, jak mierzyć mitochondrialneH2O2za pomocą ukierunkowanego na mitochondria HyPer7 (mtHyPer7), genetycznie kodowanego biosensora ratiometrycznego, u żywych drożdży. Szczegółowo opisuje, jak zoptymalizować warunki obrazowania i przeprowadzić ilościową analizę komórkową i subkomórkową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja mitochondriów, czyli zmiana funkcjonalna, występuje w wielu chorobach i stanach, w tym w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i mięśniowo-szkieletowych, rakach i normalnym starzeniu się. W tym miejscu opisano podejście do oceny funkcji mitochondriów w żywych komórkach drożdży w rozdzielczościach komórkowych i subkomórkowych przy użyciu genetycznie kodowanego, minimalnie inwazyjnego, ratiometrycznego biosensora. Biosensor, HyPer7 (mtHyPer7) ukierunkowany na mitochondria, wykrywa nadtlenek wodoru (H2O2) w mitochondriach. Składa się z mitochondrialnej sekwencji sygnałowej połączonej z koliście permutowanym białkiem fluorescencyjnym i domeną reagującą naH2O2bakteryjnego białka OxyR. Bioczujnik jest generowany i integrowany z genomem drożdży za pomocą systemu wolnego od markerów CRISPR-Cas9, co zapewnia bardziej spójną ekspresję w porównaniu z konstruktami plazmidowymi.

mtHyPer7 jest ilościowo ukierunkowany na mitochondria, nie ma wykrywalnego wpływu na tempo wzrostu drożdży ani morfologię mitochondriów i dostarcza ilościowy odczyt dla mitochondriówH2O2 w normalnych warunkach wzrostu i po ekspozycji na stres oksydacyjny. Protokół ten wyjaśnia, w jaki sposób zoptymalizować warunki obrazowania za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i przeprowadzić analizę ilościową przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania. Narzędzia te umożliwiają gromadzenie bogatych informacji czasoprzestrzennych na temat mitochondriów zarówno w obrębie komórek, jak i między komórkami w populacji. Co więcej, opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do walidacji innych bioczujników.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi eukariotycznymi organellami komórkowymi, które są dobrze znane ze swojej funkcji wytwarzania ATP poprzez fosforylację oksydacyjną i transport elektronów1. Ponadto mitochondria są miejscami magazynowania wapnia, syntezy lipidów, aminokwasów, klastrów kwasów tłuszczowych i żelaza i siarki oraz transdukcji sygnału2,3. W komórkach mitochondria tworzą dynamiczną sieć o charakterystycznej morfologii i rozmieszczeniu, która różni się w zależności od typu komórki i stanu metabolicznego. Co więcej, chociaż mitochondria mogą się łączyć i dzielić, nie wszystkie mitochondria w komórce są równoważne. Liczne badania udokumentowały funkcjonalną heterogeniczność mitochondriów w poszczególnych komórkach pod względem atrybutów takich jak potencjał błonowy i stopień utlenienia4,5,6. Ta zmienność w funkcji mitochondriów jest częściowo spowodowana uszkodzeniem organelli przez mutacje mtDNA (które zachodzą szybciej niż w jądrowym DNA) oraz uszkodzeniem oksydacyjnym przez reaktywne formy tlenu (ROS) generowane zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz organelli7,8,9. Uszkodzenia organelli są łagodzone przez mitochondrialne mechanizmy kontroli jakości, które naprawiają uszkodzenia lub eliminują mitochondria, które są uszkodzone nie do naprawienia10.

Nadtlenek wodoru (H2O2) to reaktywna forma tlenu, która jest źródłem uszkodzeń oksydacyjnych białek komórkowych, kwasów nukleinowych i lipidów. JednakH2O2 służy również jako cząsteczka sygnałowa, która reguluje aktywność komórkową poprzez odwracalne utlenianie tioli w białkach docelowych11,12. H2O2 jest wytwarzany z elektronów, które wyciekają z mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów oraz przez specyficzne enzymy, takie jak oksydaza NADPH i oksydazy monoaminowe13,14,15,16,17,18,19,20. Jest również inaktywowany przez systemy antyoksydacyjne, w tym te oparte na tioredoksynie i glutationie21,22,23. W związku z tym analiza mitochondrialnych poziomówH2O2ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli tego metabolitu w prawidłowym funkcjonowaniu mitochondriów i komórek oraz w warunkach stresu oksydacyjnego.

Ogólnym celem tego protokołu jest wykrycie mitochondrialnego H2O2 za pomocą genetycznie kodowanego ratiometrycznego biosensora H2O2, HyPer7, który jest ukierunkowany na organellę (mtHyPer7). mtHyPer7 to chimera składająca się z mitochondrialnej sekwencji sygnałowej z ATP9 (presekwencja Su9), koliście permutowanej formy białka zielonej fluorescencji (GFP), oraz domena wiążącaH2O2 białka OxyR z Neisseria meningitidis24 (Rysunek 1). W GFP z permutacją kołową N- i C-końce natywnego GFP są łączone, a nowe końce powstają w pobliżu chromoforu, co nadaje białku większą ruchliwość i większą labilność jego charakterystyk widmowych w porównaniu z natywnym GFP25. Interakcja domeny OxyR mtHyPer7 zH2O2jest wysoce powinowactwo,H2O2-selektywnei prowadzi do odwracalnego utleniania konserwatywnych reszt cysteiny i tworzenia mostków dwusiarczkowych. Zmiany konformacyjne związane z utlenianiem OxyR są przenoszone do kołowo permutowanego GFP w mtHyPer7, co powoduje przesunięcie widmowe maksimum wzbudzenia chromoforu mtHyPer7 z 405 nm w stanie zredukowanym do 488 nm w stanie utlenionymH2O2-utlenionym26. Zatem stosunek fluorescencji z mtHyPer7 w odpowiedzi na wzbudzenie przy 488 nm w porównaniu z 405 nm odzwierciedla utlenianie sondy przezH2O2.

Idealnie, biosensor powinien dostarczać w czasie rzeczywistym, bezwzględny, ilościowy odczyt swojej docelowej cząsteczki. Niestety, nie zawsze jest to możliwe w pomiarach w warunkach rzeczywistych. W przypadku czujników utleniania, takich jak mtHyPer7, na odczyt w czasie rzeczywistym ma wpływ szybkość redukcji mostka dwusiarczkowego. Systemy redukcji stosowane przez biosensory ROS różnią się między sobą i mogą radykalnie zmienić dynamikę odpowiedzi sondy - jak pokazano w porównaniu HyPer7, zredukowanego przez układ tioredoksyny, i roGFP2-Tsa2ΔCR, zredukowanego przez glutation w drożdżach cytozol 27. Tak więc, aby wyciągnąć wniosek o względnym stężeniuH2O2 na podstawie współczynników mtHyPer7, należy założyć, że układ redukcyjny utrzymuje stałą pojemność podczas eksperymentu. Niezależnie od tych rozważań, HyPer7 i pokrewne sondy były używane w różnych kontekstach do uzyskiwania informacji oH2O2 w żywych komórkach25,28,29.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Projekt, mechanizm molekularny i widma wzbudzenia/emisji biosensora H2O2 mtHyPer7. (A) Sonda mtHyPer7 jest uzyskiwana przez wstawienie permutowanego kołowo GFP do domeny OxyR-RD z Neisseria meningitidis. Zawiera mitochondrialną sekwencję celującą z podjednostki 9 syntazy ATP z Neurospora crassa (Su9). (B) Ilustracja mechanizmu wykrywania H2O2 mtHyPer7. Utlenianie cystein w domenie RD zwiększa emisję fluorescencji przy wzbudzeniu przy 488 nm i zmniejsza emisję wytwarzaną przez wzbudzenie przy 405 nm. (C) Widma wzbudzenia i emisji HyPer7 w formie utlenionej i zredukowanej. Ten rysunek został przedrukowany za zgodą Pak et al.24. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; cpGFP = GFP z permutacją kołową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

To ratiometryczne obrazowanie mtHyPer7 oferuje ważne korzyści dla mitochondrialnej kwantyfikacji H2O2 24,27; zapewnia wewnętrzną kontrolę stężenia sondy. Ponadto przesunięcie piku wzbudzenia wywołanego ekspozycją na H2O2 nie jest całkowite, nawet w nasyconych stężeniach H2O2. W związku z tym obrazowanie wskaźnikowe może zwiększyć czułość poprzez włączenie do analizy dwóch punktów spektralnych.

Używana tutaj sonda mtHyPer7 ma bardzo wysokie powinowactwo do H2O2 i stosunkowo niską czułość na pH24, i została skutecznie ukierunkowana na mitochondria Caenorhabditis elegans30. Białko to było również używane w drożdżach27,31. Jednak poprzednie badania opierały się na ekspresji mtHyPer7 przenoszonej przez plazmid, co skutkuje zmiennością między komórkami w ekspresji sondy27. Ponadto konstrukt opisany w tym protokole został zintegrowany z konserwatywnym, wolnym od genów regionem na chromosomie X32 przy użyciu podejścia opartego na CRISPR do integracji bez markerów. Ekspresja zintegrowanego genu biosensora jest również kontrolowana przez silny konstytutywny promotor TEF1 (Rysunek 2). W rezultacie istnieje bardziej stabilna, spójna ekspresja biosensora w populacjach komórek drożdży w porównaniu z tą obserwowaną przy użyciu ekspresji biosensora plazmidowego, a komórki z biosensorem mogą być rozmnażane bez potrzeby stosowania selektywnych pożywek.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Generowanie komórek wyrażających mtHyPer7 przez CRISPR. Plazmid (YN2_1_LT58_X2site) zawierający Cas9 i sgRNA oraz konstrukt biosensora mtHyPer7 z amplifikacją PCR są wprowadzane do pączkujących komórek drożdży przez transformację octanu litu. Wolne od genu miejsce insercji na chromosomie X (X2) jest rozpoznawane i cięte przez białko Cas9 z sgRNA, a bioczujnik jest integrowany z genomem przez rekombinację homologiczną. Po zidentyfikowaniu udanych transformantów za pomocą mikroskopowych badań przesiewowych, PCR kolonii i sekwencjonowania, plazmid Cas9 jest usuwany (utwardzany) przez wzrost w pożywkach nieselektywnych. Skróty: sgRNA = pojedynczy przewodnik RNA; TEF = czynnik wzmacniający transkrypcję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, mtHyPer7 oferuje przewagę nad innymi biosensorami ROS. Na przykład barwniki organiczne używane do wykrywania ROS (np. dihydroethidium [DHE]2 i MitoSOX3) mogą wytwarzać nierównomierne lub niespecyficzne barwienie i często są dostarczane w rozpuszczalnikach, takich jak etanol lub dimetylosulfotlenek, które wymagają dodatkowych kontroli działania rozpuszczalnika. Inną klasą biosensorów ROS są biosensory oparte na transferze energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) (np. Redoxfluor dla komórkowego stanu redoks4 oraz czujniki nadtlenkowe HSP-FRET5, OxyFRET6 i PerFRET6). Sondy te są kodowane genetycznie i zasadniczo bardzo czułe, a także mogą być ilościowo ukierunkowane na mitochondria przy użyciu dobrze scharakteryzowanych mitochondrialnych sekwencji sygnałowych. Istnieją jednak wyzwania związane z używaniem sond opartych na FRET, w tym tło spowodowane wzbudzeniem krzyżowym i przebijaniem oraz rygorystyczne wymagania dotyczące bliskości i orientacji fluoroforów dla wystąpienia FRET33,34. Ponadto sondy FRET składają się z dwóch białek fluorescencyjnych, które wymagają większych konstruktów do ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania w porównaniu z sondami zmieniającymi widmo. Opisany tutaj protokół został opracowany w celu wykorzystania zalet biosensora opartego na HyPer7 oraz wykorzystania tej kompaktowej, ratiometrycznej, o wysokim powinowactwie, kodowanej genetycznie sondy do ilościowego obrazowania nadtlenku w mitochondriach u żywych drożdży.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie plazmidu biosensora, integracja z genomem drożdży oraz ocena kierowania mtHyPer7 do mitochondriów i wpływu na morfologię mitochondriów, tempo wzrostu komórek lub wrażliwość na stres oksydacyjny

UWAGA: Zapoznaj się z Plikiem Uzupełniającym 1, Tabelą Uzupełniającą S1, Tabelą Uzupełniającą S2 i Tabelą Uzupełniającą S3, aby zapoznać się z budową plazmidów biosensorów, szczepami, plazmidami i starterami, odpowiednio, używanymi do budowy i charakterystyki biosensorów. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. Amplifikuj konstrukt biosensora z plazmidu biosensora za pomocą starterów Y290 i Y291 (Rysunek 2) za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
  2. Wymieszaj 500 ng plazmidu Cas9/guide RNA (YN2_1_LT58_X2site32) z 50 μl produktu PCR z kroku 1.1 (konstrukcja biosensora). Przekształć mieszaninę w pączkujące drożdże za pomocą metody octanu litu35 i wybierz transformanty na płytkach YPD zawierających 200 mg/ml G418.
  3. Przesiewowe transformanty kandydujące przez amplifikację PCR genomowego DNA przy użyciu starterów Y292 i Y293. W przypadku transformantów z wkładką o oczekiwanym rozmiarze (dodatnia: 3,5 kb; ujemna: 0,3 kb) należy uszeregować wstawiony obszar w celu dalszej walidacji.
  4. Oceń wpływ biosensora na wzrost i funkcję mitochondriów (Rysunek 3). Jeśli wydaje się, że bioczujnik wpływa na funkcję komórek lub mitochondriów, spróbuj zminimalizować ten efekt, zmieniając promotor, miejsce integracji lub szczep macierzysty.
    1. Określ wpływ konstrukcji biosensora na szybkość wzrostu w obecności i braku stresora oksydacyjnego (np. parakwatu), jak opisano wcześniej36.
      1. Rozcieńczyć komórki fazy środkowej logarytmu do gęstości optycznej 600 nm (OD600) 0,0035 w 200 μl odpowiednich pożywek z obróbką i bez niej do każdego dołka 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Mierzyć gęstość optyczną kultury co 20 minut przez 72 godziny za pomocą czytnika płytek. Obliczyć maksymalną szybkość wzrostu (nachylenie) jako maksymalną zmianę OD w odstępie 240 minut podczas 72-godzinnego przebiegu.
    2. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oceń jasność oraz morfologię mitochondriów, jak opisano wcześniej37.
      1. Wyhoduj komórki do fazy środkowej logarytmu, wybarwij mitochondria 250 nM MitoTracker Red przez 30 minut i umyj dwukrotnie przed obrazowaniem. Uchwyć stosy Z o głębokości 6 μm w odstępach 0,3 μm na szerokokątnym mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym i sprawdź wizualnie. Szukaj mitochondriów tworzących wydłużone struktury rurkowe.

figure-protocol-1
Rysunek 3: mtHyPer7 jest przeznaczony do mitochondriów i nie wpływa na morfologię mitochondriów, wzrost komórek ani wrażliwość na stres oksydacyjny. (A) Morfologia mitochondriów w żywych komórkach drożdży wykazujących ekspresję mtHyPer7. Lewy panel: mtHyPer7 uwidoczniony ze wzbudzeniem 488 nm. Panel środkowy: mitochondria oznaczone 250 nM MitoTracker Red. Prawy panel: scalone obrazy. Wyświetlane są projekcje o maksymalnej intensywności. Kontur komórki jest pokazany w kolorze białym. Pasek skali = 1 μm. (B,C) Krzywe wzrostu i maksymalna szybkość wzrostu komórek typu dzikiego i komórek eksprymujących mtHyPer7 hodowanych w obecności (+PQ) lub braku 2,5 mM parakwatu w pożywce YPD. (D,E) Krzywe wzrostu i maksymalna szybkość wzrostu komórek wykazujących ekspresję typu dzikiego i mtHyPer7 hodowanych w obecności (+PQ) lub braku parakwatu 2,5 mM w pożywce SC. Wszystkie krzywe wzrostu są średnimi trzech niezależnych kontrprób. Maksymalne stopy wzrostu są przedstawiane jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Analizę krzywej wzrostu przeprowadzono poprzez rozcieńczenie komórek w środkowej fazie logarytmu do OD600 0,0035 w 200 μl odpowiednich pożywek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Średnicę zewnętrzną kultury mierzono co 20 minut przez 72 godziny za pomocą czytnika płytek. Każdy szczep/warunek został posiany w trzech egzemplarzach i wykreślono uśrednioną szybkość wzrostu. Maksymalne tempo wzrostu (nachylenie) obliczono na podstawie zmian OD w odstępie 240 minut w ciągu 72 godzin. Skróty: WT = typ dziki; PQ = parakwat. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Hodowla komórkowa i przygotowanie do obrazowania (Rysunek 4)

  1. Rozmnażaj komórki w pożywce syntetycznej do środkowej fazy logarytmicznej w celu obrazowania. Hodowla w środkowej fazie logarytmicznej o pojemności 5 ml zapewnia wystarczającą ilość komórek na cztery lub pięć szkiełek i łącznie >100 pączkujących komórek do analizy.
    1. Rano w dniu poprzedzającym eksperyment przygotuj płynne prekultury, zaszczepiając 5 ml syntetycznej kompletnej pożywki (SC) w probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml z pojedynczą kolonią komórek drożdży.
    2. Inkubować prekulturę w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min i 30 °C przez 6-8 godzin. Zmierzyć OD600 kultury wstępnej, która powinna znajdować się w środkowej fazie logarytmicznej: ~0,5-1 × 107 komórek/ml, OD600 ~0,1-0,3.
    3. Przygotuj kulturę w środkowej fazie logarytmicznej, używając kultury wstępnej do obrazowania następnego dnia. Oblicz ilość kultury wstępnej potrzebnej do hodowli w środkowej fazie logarytmicznej po nocnym wzroście (8-16 godzin). Gdy komórki są hodowane w pożywce SC, czas podwajania wynosi ~2 godziny. W związku z tym objętość (V) kultury wstępnej do inokulacji 5 ml kultury przez noc oblicza się za pomocą równania (1):
      figure-protocol-2 (1)
    4. Zaszczepić 5 ml pożywki SC w probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml z ilością prekultury obliczoną w kroku 2.1.3. Rośnie w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min i 30 °C przez 8-16 godzin.
  2. W dniu obrazowania upewnij się, że kultura wygenerowana w kroku 2.1.4 znajduje się w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 ~0,1-0,3). Zagęścić komórki z 1 ml kultury w środkowej fazie logarytmicznej przez odwirowanie w ilości 6 000 × g przez 30 s. Usunąć supernatant, pozostawiając 10-20 μl supernatantu w probówce. Zawiesić osad komórkowy, delikatnie mieszając go z pozostałymi mediami za pomocą mikropipety.
  3. Użyj dmuchawy powietrza lub niestrzępiącej się chusteczki, aby usunąć kurz ze szklanego szkiełka mikroskopowego i dodaj 1,8 μl zawiesiny komórek do szkiełka. Przykryj komórki szklanym szkiełkiem nakrywkowym #1,5 (o grubości 170 μm), powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.
  4. Obraz natychmiast i wyrzuć szkiełko po 10 minutach obrazowania.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Wzrost i obrazowanie komórek. Pączkujące komórki drożdży wykazujące ekspresję mtHyPer7 są hodowane do środkowej fazy logarytmicznej. Obrazy z serii Z są zbierane za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, a następnie poddawane rekonstrukcji i analizie 3D. Patrz sekcje 2-3 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Optymalizacja warunków obrazowania i zbierania obrazów (Rysunek 5)

  1. Wybierz tryb obrazowania. Do przekroju optycznego bez obróbki końcowej preferowany jest instrument konfokalny z wirującym dyskiem. Jeśli jednak sygnał jest słaby lub ten instrument jest niedostępny, użyj obrazowania szerokokątnego, upewniając się, że obrazy o szerokim polu są zdekonwolucjonowane w celu usunięcia nieostrego rozmycia, jak opisano wcześniej38.
  2. Wybierz optykę. Użyj obiektywu olejowego o dużej aperturze numerycznej, takiego jak 100x/1,45 Plan-Apochromat.
  3. Wybierz długości fal wzbudzenia i emisji. Do obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem należy użyć wzbudzenia laserowego przy 405 nm i 488 nm oraz standardowego filtra emisyjnego GFP. Do obrazowania o szerokim polu widzenia należy użyć diody elektroluminescencyjnej (LED) lub wzbudzenia lampą, ale należy upewnić się, że konfiguracja filtra umożliwia zmianę wzbudzenia podczas przepuszczania emisji przez standardowy filtr GFP.
    UWAGA: Można to osiągnąć, na przykładample, wyjmując filtr wzbudzenia z kostki GFP i używając diody LED lub koła filtra do wybrania wzbudzenia.
  4. Wybierz czas ekspozycji i intensywność oświetlenia.
    1. Ustal warunki akwizycji, które dają łatwo wykrywalny sygnał i akceptowalną rozdzielczość w każdym kanale fluorescencyjnym. Na przykład w mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem z kamerą sCMOS użyj binningu 2 x 2, mocy lasera 20-40% i ekspozycji 200-600 ms.
    2. Sprawdź histogram obrazu. W obrazie 12-bitowym (4 096 możliwych poziomów szarości) upewnij się, że całkowity zakres dynamiczny wartości pikseli wynosi co najmniej kilkaset poziomów szarości, bez nasycenia (Rysunek 5A). Ponadto upewnij się, że zakres jest o jeden rząd wielkości wyższy niż poziom hałasu. Oblicz poziom szumu jako odchylenie standardowe wartości pikseli w obszarze obrazu wolnym od komórek, mierzone zgodnie z opisem w kroku 4.1.3.1.
    3. Test na fotowybielanie lub stres mitochondrialny wywołany obrazowaniem w wybranych warunkach obrazowania. W przypadku zaobserwowania nadmiernego fotowybielania lub wzrostu mitochondrialnegoH2O2należy zmniejszyć moc lasera i zwiększyć ekspozycję lub binning.
      1. Zbierz serię zdjęć poklatkowych, bez opóźnień między akwizycjami, aby ocenić wpływ warunków obrazowania na stabilność sygnału i stres oksydacyjny w mitochondriach. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopu lub ImageJ, zmierz średnią wartość piksela w każdym kanale fluorescencji, aby potwierdzić stabilność sygnału (zmiana <5%; Rysunek 5B). Jeśli eksperyment nie obejmuje obrazowania poklatkowego, upewnij się, że fluorescencja jest stabilna przez dwa lub trzy powtarzające się stosy Z (25-35 ekspozycji).
        UWAGA: Spadek fluorescencji obu kanałów może wskazywać na fotowybielanie; jednak spadek fluorescencji wzbudzonej 405 nm, któremu towarzyszy wzrost kanału wzbudzonego 488 nm, może wskazywać na zwiększony mitochondrialny H2O2 i stres oksydacyjny wywołany obrazowaniem w organellach.
  5. Pobieranie obrazów. W przypadku zbierania stosów Z upewnij się, że interwał Z jest taki sam dla wszystkich obrazów w zestawie danych i uwzględnij całą komórkę. W przypadku drożdży pączkujących obraz z odstępem Z 0,5 μm i całkowitą głębokością stosu 6 μm. Pozyskiwanie obrazów w świetle przechodzącym w celu udokumentowania granic komórek.
  6. Analizuj obrazy ręcznie lub półautomatycznie za pomocą skryptów dostępnych w pliku uzupełniającym 2 i w https://github.com/theresaswayne/biosensor, korzystając z dystrybucji Fidżi ImageJ39 i oprogramowania statystycznego R (Rysunek 6). W instrukcjach oprogramowania hierarchiczne polecenia menu są wyświetlane pogrubioną czcionką z "|", wskazując sekwencję wyborów menu. Opcje i przyciski są wyświetlane pogrubioną czcionką.

figure-protocol-4
Rysunek 5: Optymalizacja obrazowania. (A) Ocena obrazów i histogramów dla prawidłowego zakresu intensywności. Pokazane są projekcje maksymalnej intensywności obrazów konfokalnych z wirującym dyskiem. Histogramy są wyświetlane zarówno z liniową osią Y (), jak i osią Y w skali logarytmicznej (szara), aby zilustrować zakres dynamiczny obrazu. Lewe panele: zaszumiony obraz o niskiej intensywności i zakresie dynamicznym. Panele środkowe: obraz o akceptowalnym zakresie dynamiki (~1,000 poziomów szarości) i intensywności. Prawe panele: obraz nieprawidłowo wzmocniony kontrastem w celu uzyskania nadmiernego nasycenia. Podziałka = 1 μm. (B,C) Analiza fotowybielania mtHyPer7. Kolejne stosy Z zbierano bez opóźnień, stosy Z sumowano, a średnią intensywność mitochondriów mierzono i normalizowano do pierwszego punktu czasowego. Pokazane są wyniki z pierwszych trzech punktów czasowych (27 ekspozycji). (B) Długość fali wzbudzenia: 405 nm. (C) Długość fali wzbudzenia: 488 nm. Pokazane wartości są średnimi z trzech komórek z każdego z trzech niezależnych badań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Półautomatyczna analiza za pomocą skryptów

  1. Generuj i mierz obrazy proporcji za pomocą skryptu analizy biosensora (np. biosensor.ijm lub biosensor-image-subtraction.ijm).
    1. Wybierz skrypt, którego chcesz użyć. Protokół korzystania z każdego skryptu jest podobny; Wszelkie różnice zostaną określone w tekście.
      1. biosensor.ijm: W tym skrypcie tło i szum są korygowane za pomocą wybranych przez użytkownika obszarów obrazu, stałych wartości lub bez odejmowania. Metody korekcji tła i szumu wybieraj niezależnie.
      2. biosensor-image-subtraction.ijm: W tym skrypcie zarówno tło, jak i szum są obsługiwane przez tę samą metodę wybraną przez użytkownika, która może być jedną z następujących: pusty obraz, wybrany przez użytkownika obszar na obrazie, stała wartość lub brak korekcji.
    2. Na Fidżi otwórz wielokanałowy obraz stosu Z uzyskany w kroku 3.5. Otwórz żądany plik skryptu analizy biosensora. Uruchom skrypt, klikając przycisk Uruchom w oknie Edytora skryptów. W wyświetlonym oknie dialogowym wprowadź wymagane informacje.
      1. Wybierz numery kanałów licznika i mianownika do obliczenia stosunku. Dla mtHyPer7 licznikiem jest kanał wzbudzony przy 488 nm, a mianownikiem jest kanał wzbudzony przy 405 nm. Wybierz numer kanału obrazu w świetle przechodzącym, jeśli jest obecny, lub 0, jeśli go nie ma.
      2. Wybierz żądaną metodę odejmowania tła spośród następujących czterech opcji. Jeśli tło jest względnie jednolite, wybierz opcję Wybierz obszar obrazu, który bezpośrednio mierzy poziom tła na obrazie. Jeśli tło różni się znacznie w całym polu, użyj skryptu biosensor-image-subtraction.ijm i wybierz Pusty obraz (aby zebrać pusty obraz do korekcji, przechwyć wielokanałowy stos Z o identycznych warunkach akwizycji w polu widzenia bez komórek lub ze slajdu wykonanego przy użyciu pożywki wzrostowej bez komórek). Stała wartość umożliwia wprowadzenie wcześniej zmierzonej wartości tła. Żaden z nich nie pozostawia tła bez korekty, ale może zmniejszyć precyzję pomiaru.
      3. Wybierz żądaną metodę odejmowania szumu. Wartość szumu jest używana jako dolny próg na odejmowanych, zamaskowanych obrazach kanałów z tłem, aby zmniejszyć efekt losowych zmian w odczycie detektora. Wybierz opcję Wybierz obszar obrazu lub Wartość stała, aby umożliwić wprowadzenie wcześniej zmierzonego poziomu szumu, co zwykle działa dobrze, ponieważ poziomy szumów są stałe, jeśli warunki obrazowania są stałe. Alternatywnie wybierz opcję Brak i użyj wartości 1 jako dolnego progu, co może zwiększyć zmienność pomiarów.
      4. Wybierz algorytm progowania, aby dokładnie i konsekwentnie wykrywać mitochondria; Zalecane są Otsu lub MaxEntropia. Najlepiej użyć tego samego algorytmu dla wszystkich obrazów w eksperymencie, ale zapewnić dokładne rozpoznanie mitochondriów. Użyj innej metody progowania, jeśli podczas eksperymentu wystąpią zmiany w morfologii.
      5. Wybierz liczbę obszarów zainteresowania (ROI) na komórkę. Na przykład, jeśli mierzysz różnice między pączkami macierzystymi, wybierz 2.
      6. Wybierz folder wyjściowy, w którym zostaną zapisane obrazy pomiarów i proporcji.
    3. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby uzyskać korekcję tła i szumów.
      1. Zaznaczanie obszaru (jeśli dotyczy): Jeśli do pomiaru tła lub szumu wybrano opcję Wybierz obszar obrazu, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby narysować obszar tła (poza komórkami lub artefaktami fluorescencyjnymi) za pomocą narzędzia ROI prostokąta. Po narysowaniu obszaru kliknij przycisk OK.
      2. Wprowadzenie wartości stałej (jeśli dotyczy): Jeśli do pomiaru tła lub szumu wybrano wartość stałą, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wprowadzić wartości tła i/lub szumu dla każdego kanału fluorescencji.
      3. Pusty obraz referencyjny (jeśli dotyczy): W skrypcie biosensor-image-subtraction.ijm, jeśli do korekcji tła lub szumu wybrano pusty obraz, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby wybrać pusty plik obrazu.
    4. Oznaczanie ROI do pomiaru. W hodowlach w środkowej fazie logarytmicznej należy ograniczyć analizę do komórek pączkujących.
      1. Narysuj ROI odpowiadające poszczególnym komórkom lub regionom subkomórkowym na podstawie obrazu w jasnym polu. Zwrot z inwestycji nie musi dokładnie odpowiadać konturowi komórki, ponieważ mierzone będą tylko progowe mitochondria w obrębie ROI. Możesz też otworzyć wcześniej zapisany zestaw ROI: w Menedżerze ROI kliknij w Więcej, a następnie wybierz plik ROI.
      2. Naciśnij T po utworzeniu każdego ROI, aby dodać wybrany ROI do Menedżera ROI. W Menedżerze zwrotu z inwestycji zaznacz opcję Pokaż wszystko, aby udokumentować komórki, które zostały oznaczone. Każdy dodany region pojawi się jako numerowany element na liście Menedżera zwrotu z inwestycji. Jeśli analizujesz więcej niż jeden zwrot z inwestycji na komórkę (np. matkę i pączek), zaznacz zwrot z inwestycji w tej samej kolejności dla każdej analizowanej komórki.
      3. Po dodaniu wszystkich żądanych ROI do Menedżera ROI kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Oznaczanie komórek.
    5. Wybierz format tabeli pomiarów. W wyświetlonym oknie dialogowym MultiMeasure zaznacz opcję Zmierz wszystkie plasterki. Zaznacz opcję Jeden wiersz na wycinek, aby utworzyć tabelę o żądanym formacie. Użyj process_multiROI_tables. Skrypt języka R do przetwarzania tabel utworzonych za pomocą opcji Jeden wiersz na wycinek; nie zaznaczaj opcji Dołącz wyniki. Powtórz ten krok 3 razy (dla pomiaru obrazów licznika [488], mianownika [405] i proporcji [488/405]).
    6. Skrypt zapisze pliki wyjściowe w folderze wybranym w kroku 4.1.2.6.
  2. Obliczanie średnich ważonych współczynników dla każdego regionu lub komórki
    1. Korzystając z wyników uzyskanych w poprzednim kroku, oblicz średnie ważone współczynniki dla każdego regionu lub komórki, używając równania (2). Oblicz współczynniki "pikselowe" lub "regionalne" (szczegółowe informacje można znaleźć w dyskusji).
      figure-protocol-5 (2)
      UWAGA: Wartości pola powierzchni i gęstości zintegrowanej (IntDen) obejmują tylko piksele w mitochondriach z progiem. Obliczenia te można zautomatyzować za pomocą process_multiROI_tables. Skrypt R i oprogramowanie statystyczne R.
  3. Wygeneruj obraz o proporcjach kolorów. Ponieważ zmiany odcienia (koloru) są bardziej oczywiste dla ludzkiego oka niż zmiany intensywności, przekonwertuj wartość współczynnika na skalę kolorów, aby ułatwić interpretację wizualną. Skrypt colorize_ratio_image.ijm pokoloruje obraz o zamaskowanych proporcjach.
    1. Na Fidżi otwórz obraz stosu Z o proporcjach Wygenerowany w kroku 4.1.6. Otwórz plik skryptu colorize_ratio_image.ijm. Uruchom skrypt, klikając przycisk Uruchom w oknie Edytora skryptów. W wyświetlonym oknie dialogowym wprowadź wymagane informacje.
      1. Metoda kolorowania: W opcji Niemodulowana wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się z tą samą jasnością. Jednak niektóre obrazy mogą wydawać się zaszumione, ponieważ zarówno ciemne, jak i jasne piksele mają wpływ na proporcje obrazu. Aby zmniejszyć ten efekt, użyj opcji Intensywność modulowana.
      2. Minimalna i maksymalna wyświetlana wartość: Te wartości sterują zakresem wartości współczynników, które będą kolorowane. Wybierz wartości zbliżone do średnich wartości minimalnych i maksymalnych zaobserwowanych w eksperymencie (na podstawie średnich ważonych współczynników obliczonych w kroku 4.2.1). W ramach eksperymentu należy uzyskać wszystkie obrazy w identycznych warunkach obrazowania i wyświetlić wszystkie obrazy z identycznymi wartościami minimalnymi i maksymalnymi.
      3. Tryb projekcji: Stosy Z są wyświetlane jako projekcje, aby pokazać całą populację mitochondriów. Projekcja jest tworzona przed koloracją. Wybierz opcję Maksimum, aby uzyskać projekcję o maksymalnej intensywności (z zachowaniem maksymalnego współczynnika i wartości intensywności) lub Średnia, aby uzyskać projekcję o średniej intensywności.
      4. Folder wyjściowy: Wybierz folder, w którym chcesz zapisać pokolorowane obrazy.
    2. Jeśli wybrano opcję Bez modulacji, wybierz schemat kolorów (tabela przeglądowa; LUT) w wyświetlonym oknie dialogowym. Użyj tablic LUT Fire lub Rainbow RGB wbudowanych w Fidżi lub dowolnej żądanej tablicy LUT w formacie .lut ImageJ (importuj z pliku LUT). Zalecana jest tablica LUT Rainbow Smooth40 (zawarta w pliku uzupełniającym 2 i na GitHub).
    3. Skrypt zapisuje pliki wyjściowe w folderze wybranym w kroku 4.3.1.4. Należą do nich obraz o współczynniku koloru (Color_RGB.tif) i obraz o proporcjach kolorów z paskiem kalibracji pokazującym zgodność między wartościami proporcji a kolorem obrazu (Color_with_bar.tif).

5. Ręczna analiza

UWAGA: To podejście zajmuje więcej czasu, ale pozwala na elastyczność w wstępnym przetwarzaniu i ustawianiu progu.

  1. Poprawne dla tła.
    1. Ustawianie opcji na Fidżi.
      1. Kliknij Analizuj | Ustaw wymiary. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz pola wyboru Obszar, Średnia, Odchylenie standardowe, IntDen i Etykieta wyświetlania. Ustaw liczbę miejsc dziesiętnych na 3.
      2. Kliknij Edytuj | Opcje | Wejście/Wyjście. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz pola wyboru Zapisz numery wierszy i Zapisz nagłówki kolumn.
    2. Aby zwiększyć czułość obliczenia współczynnika, odejmij tło od każdego kanału fluorescencji. Jeśli tło jest względnie jednolite, zmierz średnią intensywność obszaru wolnego od komórek na obrazie i odejmij tę wartość od całego obrazu (krok 5.1.2.1). Alternatywnie, jeśli tło różni się znacznie w całym polu, użyj pustego obrazu do korekcji (krok 5.1.2.2.).
      1. Aby odjąć region wybrany przez użytkownika, kliknij Obraz | Kolor | Podziel kanały i pozostaw otwarte wszystkie obrazy kanałów, ponieważ będą potrzebne później. Dla każdego kanału fluorescencyjnego narysuj ROI na tle (poza dowolnymi komórkami) i kliknij Analizuj | Zmierz lub w przypadku stosów kliknij pozycję Obraz | Stosy | Zmierz stos. Zwróć uwagę na średnią wartość ROI, która pojawia się w tabeli wyników. Kliknij Edytuj | Wybierz Brak, a następnie Przetwarzaj | Matematyka | Odejmować. W wyświetlonym oknie dialogowym wprowadź zmierzoną średnią wartość tła, zaokrągloną do najbliższej liczby całkowitej.
        UWAGA: Zaokrąglanie zapobiega późniejszym błędom związanym z operacjami binarnymi.
      2. Aby odjąć pusty obraz od pliku danych, należy pobrać pusty obraz z całkowicie wolnego od komórek pola widzenia lub ze szkiełka przygotowanego z pożywką wzrostową bez komórek. Kliknij Proces | Kalkulator obrazów. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw operację na Odejmowanie i ustaw Obraz1 i Obraz2 odpowiednio na obraz komórki i pusty obraz. Zaznacz Utwórz nowe okno i wynik 32-bitowy.
  2. Aby ograniczyć analizę do mitochondriów, należy przeprowadzić segmentację. Ponieważ każdy kanał może zmieniać intensywność w zależności od stanu biosensora, użyj sumy dwóch kanałów, aby spójnie zdefiniować obszar mitochondriów.
    1. Aby utworzyć obraz sumy, kliknij na Proces | Kalkulator obrazów. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw operację na Dodaj, a następnie ustaw Image1 i Image2 na dwa odjęte tło kanały fluorescencyjne w dowolnej kolejności. Zaznacz Utwórz nowe okno i wynik 32-bitowy i poczekaj, aż pojawi się obraz sumy.
    2. Ustaw próg, aby zdefiniować mitochondria na obrazie sumy.
      1. Kliknij na Obrazek | Dostosuj | Próg. W wyświetlonym oknie Próg zaznacz opcję Ciemne tło i Histogram stosu. Ustaw Metodę na żądany algorytm (np. Otsu lub MaxEntropy). Zastosuj automatyczne progowanie w celu zapewnienia odtwarzalności, ale jeśli żadna metoda automatyczna nie jest odpowiednia, ręcznie dostosuj próg.
        UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby ten sam algorytm był używany dla wszystkich obrazów w eksperymencie, ale zmiany w morfologii podczas eksperymentu mogą wymagać innej metody progowania w niektórych warunkach.
      2. Gdy próg jest zadowalający, kliknij przycisk Zastosuj. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz opcję Konwertuj na maskę. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz Czarne tło i pozostaw inne pola niezaznaczone. Zapisz wynikowy obraz maski w celu oceny dokładności segmentacji.
    3. Zamień wartości maski z 0 i 255 odpowiednio na 0 i 1, klikając Process | Matematyka | Dzielić. Ustaw wartość na 255, a po wyświetleniu monitu wybierz opcję przetworzenia wszystkich obrazów.
    4. Zastosuj maskę do kanałów fluorescencyjnych odjętych od tła, klikając Procesowy | Kalkulator obrazów. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw operację na Mnożenie. Ustaw Image1 i Image2 odpowiednio na kanał licznika i maskę. Zaznacz opcję Utwórz nowe okno i wynik 32-bitowy; Powtórz mnożenie maski z kanałem mianownika.
    5. Przygotuj każdy zamaskowany kanał do obliczenia współczynnika, ustawiając piksele tła na NaN ("nie liczbę").
      1. Wybierz zamaskowany kanał licznika i kliknij Obraz | Dostosuj | Próg. W oknie Próg kliknij przycisk Ustaw, a następnie w wyświetlonym oknie dialogowym ustaw wartość minimalną na obliczony poziom hałasu lub na 1 i pozostaw maksimum bez zmian.
      2. W oknie Próg kliknij przycisk Zastosuj. W następnym oknie dialogowym wybierz opcję Ustaw na NaN. Powtórz te czynności dla kanału zamaskowanego mianownika.
  3. Wygeneruj obraz proporcji.
    1. Kliknij Proces | Kalkulator obrazów. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw operację na Dzielenie. Ustaw Image1 i Image2 odpowiednio na zamaskowane kanały licznika i mianownika odjęte od tła. Dla mtHyPer7 licznikiem jest forma utleniona wzbudzona przy 488 nm, a mianownikiem jest forma zredukowana wzbudzona przy 405 nm. Dlatego wyższe współczynniki wskazują na wyższeH2O2.
    2. Zaznacz Utwórz nowe okno i wynik 32-bitowy. Zapisz obraz proporcji do analizy.
  4. Oznacz i określ ilościowo obszary zainteresowania. Każda komórka lub region subkomórkowy jest wybierany i przechowywany jako ROI w Menedżerze ROI. Zwrot z inwestycji nie musi idealnie pasować do konturów komórek, ponieważ mierzone będą tylko zamaskowane regiony mitochondriów.
    1. Korzystając z obrazu w świetle przechodzącym, aby zapobiec stronniczości, utwórz ROI odpowiadające poszczególnym komórkom (lub regionom subkomórkowym). W hodowlach w środkowej fazie logarytmicznej ogranicz analizę do komórek drożdży zawierających pąki, które są aktywnie zaangażowane w podział komórek. Naciśnij T po utworzeniu każdego ROI, aby dodać go do Menedżera ROI. Zaznacz opcję Pokaż wszystko, aby udokumentować komórki, które zostały oznaczone.
    2. Kliknij utworzony powyżej obraz proporcji, a następnie w Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij Więcej ... | Funkcja MultiMeasure. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz opcję Zmierz wszystkie plasterki. Nie sprawdzaj opcji Dołącz wyniki. Zaznacz opcję Jeden wiersz na wycinek, aby utworzyć tabelę o żądanym formacie. W process_multiROI_tables. Skrypt języka R będzie przetwarzał tabele utworzone za pomocą opcji Jeden wiersz na wycinek w oprogramowaniu statystycznym języka R.
    3. Zapisz wyniki. Kliknij okno Wyniki, a następnie Plik | Zapisz i zapisz tabelę wyników w formacie .csv lub .xls. Ustaw nazwę pliku tak, aby była zgodna z nazwą obrazu.
    4. Zapisz zwrot z inwestycji. W Menedżerze ROI najpierw upewnij się, że nie wybrano żadnych ROI: kliknij Odznacz, a następnie Więcej | Zapisz. Otwórz zapisane ROI wraz z oryginalnym obrazem na Fidżi, aby porównać pomiary z obrazem.
  5. Oblicz średnie ważone współczynniki na komórkę lub region, korzystając z wyników uzyskanych w poprzednim kroku i równania (3). Oblicz współczynniki "pikselowe" lub "regionalne" (szczegółowe informacje można znaleźć w dyskusji).
    figure-protocol-6 (3)
    UWAGA: Wartości powierzchni i gęstości zintegrowanej obejmują tylko piksele w mitochondriach progowych. Obliczenia te można zautomatyzować za pomocą process_multiROI_tables. Skrypt R w oprogramowaniu statystycznym R.
  6. Wygeneruj obraz o proporcjach koloru.
    UWAGA: Obrazy kolorowane mogą być niemodulowane, gdzie wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się przy tej samej jasności, lub z modulacją intensywności, gdzie intensywność pikseli w oryginalnym obrazie jest używana do ustawiania intensywności w kolorowanym obrazie.
    1. Aby uzyskać niemodulowany kolorowany obraz:
      1. Otwórz obraz proporcji wygenerowany powyżej. Kliknij na Obrazek | Duplikuj, aby wygenerować kopię obrazu, a następnie zamknij oryginalny obraz.
      2. Jeśli obraz jest stosem Z, zaznacz pojedynczy wycinek lub wygeneruj projekcję Z, aby wyświetlić wszystkie mitochondria. Użyj projekcji maksymalnej intensywności (zachowując maksymalny współczynnik i wartości intensywności dla każdej współrzędnej piksela XY) lub projekcji o średniej intensywności.
      3. Kliknij na Obrazek | Lookup Tables i ustaw LUT na żądany schemat kolorów (np. Rainbow RGB lub Fire [dostępny domyślnie w ImageJ]). Alternatywnie kliknij Plik | Zaimportuj LUT i wybierz dowolną żądaną tablicę LUT w formacie .lut ImageJ, taką jak Rainbow Smooth40 (zawarta w pliku uzupełniającym 2 i na GitHub). Upewnij się, że tablica LUT ma ciemny kolor przypisany do wartości 0.
      4. Ustaw kontrast wyświetlania, klikając Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. W oknie Jasność/Kontrast kliknij przycisk Ustaw, a następnie w wyświetlonym oknie dialogowym wprowadź żądane wartości dla wyświetlanych wartości minimalnych i maksymalnych. Aby zmaksymalizować zaobserwowane różnice kolorów, ustaw je w przybliżeniu na minimum i maksimum uzyskane na wszystkich obrazach. Ustaw te same poziomy kontrastu dla wszystkich obrazów w eksperymencie.
        UWAGA: Nie klikaj przycisku Zastosuj, ponieważ spowoduje to zmianę wartości pikseli i uniemożliwi wygenerowanie dokładnego paska kalibracji w następnym kroku.
      5. Dodaj pasek kalibracji kolorów, klikając Analizuj | Narzędzia | Pasek kalibracji. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz opcję Nakładka, aby w razie potrzeby usunąć pasek, klikając Obraz | Nakładka | Usuń nakładkę.
      6. W razie potrzeby dodaj podziałkę liniową, klikając Analizuj | Narzędzia | Pasek skali. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw żądany rozmiar, położenie i kolor paska. Zaznacz opcję Nakładka, aby zachować kolor paska niezależnie od użytej tablicy LUT.
      7. Wygeneruj obraz RGB do publikacji, klikając Obraz | Nakładka | Spłaszczyć. Zapisz wynikowy obraz.
        UWAGA: Ten obraz służy wyłącznie do prezentacji lub publikacji. Wartości intensywności są zmieniane, więc nie można jej zmierzyć. Paski są również trwale wypalane na obrazie.
    2. Aby utworzyć obraz z modulacją intensywności:
      1. Kliknij na Obrazek | Duplikuj, aby wygenerować kopię obrazu, a następnie zamknij oryginał.
      2. Jeśli obraz jest stosem Z, wybierz pojedynczy wycinek lub wygeneruj projekcję Z, aby wyświetlić wszystkie mitochondria.
      3. Ustaw kontrast wyświetlania obrazu o proporcjach, klikając Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast, a następnie w oknie Jasność/Kontrast kliknij przycisk Ustaw. W wyświetlonym oknie dialogowym wprowadź żądane wartości dla wyświetlanych wartości Minimum i Maksimum. Aby zmaksymalizować zaobserwowane różnice kolorów, ustaw je na mniej więcej minimum i maksimum uzyskane na wszystkich obrazach, a następnie ustaw te same poziomy kontrastu dla wszystkich obrazów w eksperymencie. Kliknij przycisk Zastosuj, aby przeskalować wartości pikseli.
      4. Aby utworzyć pasek kalibracji, zduplikuj ten ulepszony obraz i wygeneruj pasek, przechodząc do punktu Analizuj | Narzędzia | Pasek kalibracji. Konwertuj obraz i nakładkę do formatu RGB, klikając Obraz | Nakładka | Spłaszczyć. W razie potrzeby wklej ten pasek na obraz RGB z modulacją intensywności uzyskany w kroku 5.6.2.12 w celu prezentacji lub publikacji.
      5. Utwórz nowy obraz o tej samej szerokości i wysokości co obraz, klikając Plik | Nowość | Obraz.... W oknie dialogowym, które zostanie otwarte, ustaw parametry w następujący sposób: Typ: RGB; Wypełnienie:; Szerokość i wysokość: 9szerokość i wysokość obrazu); Plastry: 1.
      6. Przekonwertuj nowy stos na stos obrazów HSB (odcień, nasycenie, jasność), klikając Obraz | Rodzaj | Stos HSB.
      7. Kliknij obraz z dostosowanym współczynnikiem kontrastu, przechodząc do Edycja | Zaznacz wszystko, a następnie Edytuj | Kopiuj. Następnie kliknij na stos HSB, zaznacz pierwszy plasterek (Barwa) i kliknij Edytuj | Wklej, aby przenieść wartości proporcji.
      8. Zaznacz wycinek 2 (Nasycenie) stosu HSB. Ustaw kolor pierwszego planu na biały, przechodząc do punktu menu Edycja | Opcje | Zabarwienie. Kliknij Edytuj | Zaznacz wszystko, a następnie Edytuj | Wypełnij, a następnie w oknie dialogowym, które zostanie otwarte, wybierz opcję Nie, aby wypełnić kolorem białym tylko bieżący plasterek.
      9. Otwórz obraz surowych danych i podziel kanały, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały.
      10. Wygeneruj średnią z dwóch kanałów współczynnika za pomocą kalkulatora obrazów i klikając Proces | Kalkulator obrazów. W wyświetlonym oknie dialogowym ustaw operację na wartość Średnia, a następnie ustaw Obraz1 i Obraz2 odpowiednio na obrazy licznika i mianownika. Zaznacz opcję Utwórz nowe okno.
      11. Kliknij średni obraz utworzony powyżej, przechodząc do Edycja | Zaznacz wszystko, a następnie Edytuj | Kopiuj. Następnie kliknij na stos HSB, wybierz trzeci wycinek (Wartość) i kliknij Edytuj | Wklej, aby przenieść wartości intensywności.
      12. Przekonwertuj stos HSB na przestrzeń kolorów RGB, klikając Obraz | Rodzaj | Kolor RGB. Zapisz wynikowy obraz.

figure-protocol-7
Rysunek 6: Schemat analizy i prezentacji obrazu. Obrazy konfokalne z wirującym dyskiem są najpierw odejmowane od tła. Mitochondria są segmentowane przez progowanie i przekształcane w maski dla każdego wycinka. Maski te są stosowane do obu kanałów, a zamaskowane obrazy są używane do obliczania proporcji obrazu. Zwroty akcji są rysowane w celu zmierzenia stosunku mtHyPer7 w komórkach lub regionach subkomórkowych. Obrazy o proporcjach kolorów mogą być również generowane w celu prezentacji danych. Podziałka liniowa = 1 μm. Skrót: ROI = region zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić, że mtHyPer7 jest odpowiednią sondą do oceny mitochondriówH2O2, oceniono lokalizację mtHyPer7 i jego wpływ na mitochondria drożdży i zdrowie komórek. Aby ocenić celowanie mtHyPer7, mitochondria wybarwiono ważnym barwnikiem specyficznym dla mitochondriów MitoTracker Red w kontrolnych komórkach drożdży i drożdżach, które eksprymują mtHyPer7. Korzystając z barwienia MitoTracker Red, mitochondria zostały rozwiązane jako długie struktury rurkowe, które ustawiły się wzdłuż osi pączek macierzysty i zgromadziły się na czubku pąka i czubku komórki macierzystej dystalnie do bud41. Morfologia mitochondriów była podobna w komórkach kontrolnych i eksprymujących mtHyPer7. Ponadto, mtHyPer7 współlokalizowany z mitochondriami barwionymi na czerwono MitoTracker (Rysunek 3A). W związku z tym mtHyPer7 został skutecznie i ilościowo ukierunkowany na mitochondria bez wpływu na normalną morfologię lub dystrybucję mitochondriów.

Następnie przeprowadzono dodatkowe eksperymenty walidacyjne, aby ocenić wpływ mtHyPer7 na sprawność komórkową i wrażliwość na stres oksydacyjny w mitochondriach. Tempo wzrostu komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 w bogatych lub syntetycznych pożywkach na bazie glukozy (odpowiednio YPD lub SC) jest podobne do tych w nieprzekształconych komórkach typu dzikiego (Rysunek 3B, D). Aby ocenić możliwy wpływ na stres oksydacyjny w mitochondriach, drożdże kontrolne i wykazujące ekspresję mtHyPer7 potraktowano niskimi poziomami parakwatu, małej cząsteczki aktywnej redoks, która gromadzi się w mitochondriach i powoduje podwyższony poziom ponadtlenkowy w organelli24,27. Jeśli ekspresja mtHyPer7 albo indukuje stres oksydacyjny w mitochondriach, albo chroni mitochondria przed stresem oksydacyjnym, to komórki wykazujące ekspresję mtHyPer7 powinny wykazywać odpowiednio zwiększoną lub zmniejszoną wrażliwość na leczenie parakwatem. Leczenie niskim poziomem parakwatu spowodowało zmniejszenie tempa wzrostu drożdży. Co więcej, tempo wzrostu komórek eksprymujących typ dziki i mtHyPer7 w obecności parakwatu było podobne (Rysunek 3C, E). W związku z tym ekspresja biosensora nie spowodowała znaczących stresów komórkowych w pączkujących komórkach drożdży ani nie zmieniła wrażliwości drożdży na mitochondrialny stres oksydacyjny.

Biorąc pod uwagę dowody na to, że mtHyPer7 nadaje się do badania mitochondrialnego H2O2 u pączkujących drożdży, sprawdzono, czy mtHyPer7 może wykryć mitochondrialne H2O2 w drożdżach typu dzikiego w środkowej fazie logarytmicznej oraz zmiany w mitochondrialnym H2O2 indukowane przez zewnętrznie dodane H2O2. Przeprowadzono eksperyment miareczkowaniaH2O2i zmierzono średni stosunek utleniony:zredukowany (O/R) mtHyPer7 w mitochondriach.

Skrypty automatycznej analizy wygenerowały kilka plików wyjściowych.

Obraz o proporcjach (ratio.tif): Stos Z składający się ze stosunku stosów 488 nm i 405 nm z poprawionym tłem, progowym. Ten stos można przeglądać na Fidżi bez dodatkowego przetwarzania; Zaleca się jednak zwiększenie kontrastu i/lub pokolorowanie obrazu zgodnie z opisem w kroku 4.3 lub 5.6 protokołu przed wyświetleniem.

Obraz maski (mask.tif): Stos Z składający się z progowych obszarów mitochondrialnych używanych do analizy. Ten obraz musi być używany do oceny dokładności progowania.

Zwroty z inwestycji używane do analizy (ROIs.zip): Gdy ten plik jest otwierany na Fidżi, razem z obrazem źródłowym, ROI są nakładane na obraz, aby porównać tabelę wyników z obrazem źródłowym. Nazwa każdego ROI jest zmieniana na numer komórki i numer ROI.

Tabele pomiarów (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) zawierające obszar, średnią i zintegrowaną gęstość progowych mitochondriów dla każdego wycinka w obrazach licznika, mianownika i stosunku, odpowiednio. W wycinkach, w których mitochondria były nieobecne lub nieostre, rejestruje się NaN.

Plik dziennika (Log.txt) dokumentujący opcje używane do korekcji tła i szumu, progowania i obliczania współczynników.

Stosunek O/R mtHyPer7 wykazał reakcję zależną od dawki na stężenie H2O2, które osiągnęło plateau przy 1-2 mM zewnętrznie dodanym H2O2 (Rysunek 7). Co zaskakujące, stosunek HyPer7 był niższy w komórkach wystawionych na działanie 0,1 mM H2O2 niż w komórkach kontrolnych, chociaż różnica ta nie była statystycznie istotna. Jednym z wyjaśnień tego zjawiska może być reakcja hormezy, w której narażenie na niski poziom stresora może wywołać reakcje stresowe, takie jak mechanizmy przeciwutleniające, które z kolei obniżają ilość ROS wykrywalnych przez sondę. Z kolei wyższe poziomy stresorów mogą przytłoczyć wewnętrzne reakcje na stres i skutkować wyższym odczytem z HyPer7.

figure-results-1
Rysunek 7: Odpowiedź mtHyPer7 na zewnętrznie dodane H2O2. (A) Maksymalna projekcja wzbudzonych obrazów 405 nm i 488 nm oraz projekcja średniej intensywności obrazów ratiometrycznych mtHyPer7 w komórkach fazy środkowej log wystawionych na różne stężenia H2O2. Pseudokolor wskazuje na stosunek utleniony do zredukowanego mtHyPer7 (skala na dole). Podziałka liniowa = 1 μm. Kontur komórki jest pokazany w kolorze białym; n > 100 komórek na warunek. (B) Oznaczanie ilościowe utlenionego mtHyPer7 w stosunku utlenionym: zredukowanym w pączkujących komórkach drożdży poddanych działaniu różnych stężeńH2O2. Pokazane są średnie z pięciu niezależnych prób, z różnymi kształtami i kolorami symboli dla każdej próby. Średnia ± SEM stosunku utleniony:zredukowany mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (bez leczenia), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (jednoczynnikowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). Wartości p są oznaczone jako: ****p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, poprzednie badania wykazały, że mitochondria sprawniej, które są bardziej zredukowane i zawierają mniej nadtlenków, są preferencyjnie dziedziczone przez komórki potomne drożdży4, oraz że katalazy cytozolowe są transportowane i aktywowane w komórkach potomnych drożdży42,43,44,45. Badania te dokumentują asymetryczne dziedziczenie mitochondriów podczas podziału komórek drożdży oraz rolę tego procesu w sprawności i długości życia komórek potomnych, a także asymetrię wieku matka-córka. Aby sprawdzić, czy istnieją różnice wH2O2między matkami a pąkami, mtHyPer7 zmierzono w pąkach i komórkach macierzystych. Różnice w mitochondrialnymH2O2 zaobserwowano w komórkach drożdży, a subtelny, ale statystycznie istotny spadek odczytu biosensora H2O2 wykryto w mitochondriach w zarodku w porównaniu z tymi w komórce macierzystej (Ryc. 8). Odkrycia te są zgodne z wcześniejszymi odkryciami, że mitochondria w zarodku są lepiej chronione przed stresem oksydacyjnym. Dostarczają również dokumentację, że mtHyPer7 może zapewnić ilościowy odczyt mitochondriówH2O2z rozdzielczością komórkową i subkomórkową u pączkujących drożdży.

figure-results-2
Rysunek 8: Poziom mitochondrialnegoH2O2 jest niższy w komórce potomnej. (A) Maksymalna projekcja ratiometrycznego obrazu mtHyPer7 w reprezentatywnej komórce. Pseudokolor wskazuje na stosunek utleniony do zredukowanego mtHyPer7 (skala na dole). Widoczne są subkomórkowe różnice w stosunku (groty strzałek). Podziałka liniowa = 1 μm. Kontur komórki: biały. (B) Różnica między stosunkiem mtHyPer7 w pączku a komórce matecznej. Dla każdej pojedynczej komórki wartość współczynnika matki została odjęta od wartości współczynnika pąków i wykreślona jako punkt. n = 193 komórki zebrane z pięciu niezależnych eksperymentów, pokazane z różnokolorowymi symbolami dla każdego eksperymentu. Średnia ± SEM różnicy między stosunkiem mtHyPer7 w komórkach pączkowych i macierzystych: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (sparowany test t) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Szczepy użyte w tym badaniu. Wykaz użytych szczepów drożdży. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Plazmidy użyte w tym badaniu. Lista użytych plazmidów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S3: Startery użyte w tym badaniu. Lista użytych podkładów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Protokół budowy plazmidu biosensora. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Skrypty do automatycznej analizy. Dla każdego skryptu dostarczane są przykładowe pliki wejściowe i pliki wyjściowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisano metodę wykorzystania mtHyPer7 jako biosensora do oceny mitochondriówH2O2w żywych, pączkujących komórkach drożdży. Bioczujnik został skonstruowany przy użyciu metody opartej na CRISPR i wprowadzony do konserwatywnego, wolnego od genów regionu w genomie drożdży bez użycia selektywnych markerów. W porównaniu z biosensorami plazmidowymi, zintegrowane biosensory ulegają ekspresji we wszystkich komórkach i na stałych poziomach, co zapewnia bardziej wiarygodne wyniki kwantyfikacji. Do generowania komórek wykazujących ekspresję mtHyPer7 nie stosuje się żadnych selektywnych markerów, co pozwala na wykorzystanie szerszego zakresu tła szczepów i ułatwia modyfikację genetyczną komórek wykazujących ekspresję biosensorów. Białko mtHyPer7 jest prawidłowo ukierunkowane na mitochondria bez zauważalnego wpływu na morfologię, funkcję, dystrybucję lub tempo wzrostu mitochondriów. mtHyPer7 wykazuje odpowiedź zależną od dawki na zewnętrznie dodaneH2O2. Co więcej, mtHyPer7 jest w stanie raportować o niejednorodności jakości mitochondriów z rozdzielczością subkomórkową. Wreszcie, użycie mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, w przeciwieństwie do mikroskopii szerokokątnej do obrazowania bioczujników ukierunkowanych na mitochondria, powoduje mniejsze fotowybielanie fluoroforów i generuje obrazy o wysokiej rozdzielczości do analizy różnic subkomórkowych.

Ograniczenia i alternatywne podejścia
Ta metoda nie jest odpowiednia do obrazowania komórek przez okres dłuższy niż 10 minut, ponieważ komórki wyschną pod szkiełkiem nakrywkowym. W przypadku obrazowania długoterminowego lepiej jest użyć metody padów agarowych46 lub unieruchomić komórki w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem wypełnionym pożywką SC.

Przy wyborze biosensora należy kierować się stężeniem celu w warunkach doświadczalnych. Jeśli czułość HyPer7 jest zbyt wysoka, zalecana jest inna wersja HyPer, taka jak HyPer3 lub HyPerRed47,48. Należy jednak zauważyć, że inne sondy HyPer są bardziej wrażliwe na pH. W przypadku wyższej czułości bardziej odpowiedni może być roGFP na bazie peroksyredoksyny (roGFP2Tsa2ΔCR)27.

Stały stan utlenienia czujnikaH2O2jest powiązany zarówno ze współczynnikami utleniania, jak i redukcji. Szybkość utleniania bioczujników jest spowodowana głównie przezH2O2, ale szybkość redukcji zależy od systemów redukcji przeciwutleniaczy aktywnych w komórce i organellach. Wykazano, że HyPer7 jest głównie redukowany przez układ tioredoksyny w cytozolu drożdży, a jego redukcja jest szybsza niż w przypadku roGFP2Tsa2ΔCR27. W związku z tym przy interpretacji pomiarów biosensorówH2O2należy wziąć pod uwagę różne mechanizmy redukcji i dynamikę odpowiedzi sondy. W szczególności, aby wywnioskować poziomyH2O2z odczytu biosensora, należy założyć, że układ redukcyjny utrzymuje stałą pojemność podczas eksperymentu. Jako alternatywę dla opisanych tutaj skryptów, udostępniono bezpłatnie szereg innych programów do analizy czujników redoks49.

Kroki krytyczne
W przypadku każdego biosensora bardzo ważne jest wykazanie, że sam bioczujnik nie wpływa na mierzony proces. Dlatego ważne jest porównanie wzrostu i morfologii mitochondriów szczepów w każdych warunkach eksperymentalnych. W tym przypadku morfologia mitochondriów jest oceniana za pomocą MitoTracker Red, który barwi mitochondria w sposób zależny od potencjału błony. Jednak porównanie mitochondriów w komórkach nieprzekształconych i przekształconych przez biosensory można przeprowadzić poprzez barwienie estrem metylowym tetrametylorodaminy (TMRM), alternatywnym mitochondrialnym barwnikiem witalnym wykrywającym potencjał błonowy, lub MitoTracker Green, który barwi mitochondria niezależnie od potencjału błonowego. Jeśli podejrzewa się szkodliwe skutki, pomocne może być zmniejszenie poziomu wyrażenia lub zmiana witryny integracji.

Walidacja zachowania sondy w zakresie dawka-odpowiedź oraz stosunek sygnału do szumu w technice obrazowania są również niezbędne do uzyskania wiarygodnych wyników. Jeśli zmienność w obrębie grupy przewyższa zmienność między grupami, różnice stają się trudne do wykrycia. Zmienność wewnątrzgrupowa może wynikać z rzeczywistej zmienności populacji lub z szumu w procesie wykrywania. Kluczowymi krokami w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu są akwizycja obrazu (zakres wartości pikseli i szum), odejmowanie tła i progowanie.

Efekty hałasu można również zredukować na etapach obliczeń. Najprostszym podejściem jest obliczenie średniej ważonej intensywności na podstawie pomiarów obrazu współczynnika (Results.csv), gdzie każdy piksel reprezentuje lokalny stosunek między sprawnościami wzbudzenia. W ten sposób uzyskuje się proporcje "pikselowe". Jeśli jednak stosunek sygnału do szumu obrazu jest niski, bardziej wiarygodne wyniki można uzyskać, obliczając średnią ważoną intensywność dla ROI zarówno w kanałach licznika, jak i mianownika, a następnie obliczając stosunek między tymi dwiema średnimi ważonymi (stosunek "regionowy").

Aby wybrać metodę progowania, należy użyć polecenia Fidżi Image | Dostosuj | Funkcja Auto Threshold może być używana do automatycznego wypróbowywania wszystkich wbudowanych metod Fidżi. Aby ocenić segmentację (progowanie), zapisana maska jest przekształcana w zaznaczenie, klikając Edytuj | Selekcja | Utwórz zaznaczenie, dodany do Menedżera ROI (przez naciśnięcie T), a następnie aktywowany w pliku obrazu raw. Jeśli mitochondria nie zostaną odpowiednio wykryte, należy spróbować zastosować inną metodę segmentacji.

Podczas porównywania obrazów ważne jest, aby uzyskać wszystkie obrazy w identycznych warunkach obrazowania, a także wyświetlić wszystkie obrazy z identycznym wzmocnieniem kontrastu.

Podczas optymalizacji warunków obrazowania należy wziąć pod uwagę ruch mitochondriów. Jeśli mitochondria poruszają się znacznie między wzbudzeniem przy 405 a 488 nm, obraz proporcji nie będzie dokładny. Zaleca się utrzymanie czasu naświetlania <500 ms i zmianę wzbudzenia najszybszą dostępną metodą (np. impuls wyzwalający lub akustyczno-optyczny filtr przestrajalny). Podczas przechwytywania stosu Z należy wykonać oba wzbudzenia dla każdego kroku Z przed przejściem do następnego kroku Z.

W celu wyświetlenia wyników, zmiany odcienia (koloru) są bardziej widoczne dla ludzkiego oka niż zmiany intensywności. W związku z tym wartość współczynnika jest konwertowana na skalę kolorów w celu łatwiejszej interpretacji wizualnej. Obrazy kolorowane mogą być niemodulowane, gdzie wszystkie piksele mitochondrialne pojawiają się z tą samą jasnością, lub modulowane intensywnie, gdzie intensywność pikseli w oryginalnym obrazie jest używana do ustawiania intensywności w kolorowym obrazie.

Modyfikacja i rozwiązywanie problemów
Jako alternatywę dla potwierdzania funkcji mitochondriów przez prowokację parakwatem, komórki mogą być replikowane lub inokulowane do fermentujących i niefermentujących źródeł węgla.

W przypadku odejmowania tła, odejmowania toczącej się piłki (poprzez przejście do punktu menu Process | Odejmij tło...) może być również używany do usuwania niejednorodności oświetlenia. Należy upewnić się, że obecność komórek nie zmienia odejmowanego tła (zaznaczając opcję Utwórz tło i sprawdzając wynik).

Podsumowując, sonda mtHyPer7 zapewnia spójną, minimalnie inwazyjną metodę powiązania morfologicznego i funkcjonalnego stanu mitochondriów drożdży w żywych komórkach oraz umożliwia badanie ważnego stresora komórkowego i cząsteczki sygnałowej w genetycznie wykonalnym, łatwo dostępnym systemie modelowym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Katherine Filpo Lopez za fachową pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH) (GM122589 i AG051047) dla LP.

W tych badaniach wykorzystano wspólny zasób mikroskopii konfokalnej i specjalistycznej Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, częściowo finansowany przez NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Soczewka obiektywowa 100x/1.45 Plan Apo LambdaNikonMRD01905
Siarczan adeninySigma-AldrichA9126
Bacto AgarBD DifcoDF0145170
Bacto
TryptonBD DifcoDF211705
Ekstrakt z drożdży BactoBD Difco
BamHINew England BiolabsR0136S
BglIINew England BiolabsR0144S
CarbenicilinSigma-AldrichC1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil CarlZeiss444960
Dekstroza (D-(+)-glukoza)Sigma-AldrichG8270
E. cloni 10G substancja chemiczna kompetentna komórkaBioserch Technologies60108
FIDŻINIHSchindelin i wsp. 2012
G418 (Geneticin)Sigma-AldrichA1720
Filtr emisyjny GFPChroma525/50
New England BiolabsE2611
Graphpad Prism 7GraphPadhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H2O2 (stabilny)Sigma-AldrichH1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HOPon LabJYE057/EP41Liao i in. 20201
Wytrząsarka do inkubatoraNew Brunswick ScientificE24
KAPA HiFi PCR kitRoche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MAKK1006
Chlorowodorek L-argininySigma-AldrichA8094
laserAgilent405 i 488 nm
Chlorowodorek L-histydynySigma-AldrichH5659
L-leucynaSigma-AldrichL8912
Chlorowodorek L-lizynySigma-AldrichL8662
L-metioninaSigma-AldrichM9625
L-fenyloalaninaSigma-AldrichP5482
L-tryptofanSigma-AldrichT8941
L-tyrozynaSigma-AldrichT8566
plazmid mHyPer7To badanieJYE116
Szkiełka nakrywkowe mikroskopuThermoScientific3406#1.5 (170 &mikro; m grubość)
Szkiełka mikroskopoweThermoScientific3050
MitoTracker Red CM-H2XrosThermoFisherScientificM7513
NaClSigma-AldrichS9888
NEBuilder HiFi Assembly Master MixNew England BiolabsE2621
Nikon ElementsNikonMicroscope oprogramowanie do akwizycji
Mikroskop odwrócony Nikon Ti EclipseNikon
Paraquat (hydrat dichlorku metylu wioligogenu)Sigma-AldrichCat. 856177 
RStudioPosit.coDarmowa wersja na komputery stacjonarne
SpektrofotometrBeckmanBU530
Inkubator StagetopTokai HitINU
UracilSigma-AldrichU1128
Drożdżowa zasada azotowa (YNB) zawierająca siarczan amonu bez aminokwasówBD DifcoDF0919073
YN2_1_ LT58_X2siteAddgene177705Pianale i wsp. 2021
Kamera Zyla 4.2 sCMOSAndor
Bacto Peptone BD Difco DF0118170 DF0127179Zespół Gibsona

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  2. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  3. Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678(2021).
  4. McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  5. Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
  6. Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
  7. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
  8. Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
  9. Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
  10. Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
  11. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
  12. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  13. Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
  14. Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
  15. Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
  16. Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
  17. Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
  18. Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
  19. Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
  20. Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
  21. Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
  22. Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
  23. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  24. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  25. Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
  26. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
  27. Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866(2021).
  28. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
  29. Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
  30. Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403(2022).
  31. Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160(2022).
  32. Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169(2022).
  33. Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323(2021).
  34. Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
  35. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  36. Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902(2020).
  37. Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
  38. Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160(2020).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
  42. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
  43. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  44. Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
  45. Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
  46. Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
  47. Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
  48. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222(2014).
  49. Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
  50. Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial BiosensorHydrogen Peroxide DetectionLive Cell ImagingYeast MitochondriaRatiometric BiosensorSpinning Disk ConfocalMitochondrial FunctionOxidative Stress ImagingCRISPR Genome IntegrationFiji Image Analysis

Powiązane artykuły