Artykuł metodologiczny

Reakcja łańcuchowa polimerazy i hybrydyzacja kropkowa do wykrywania Leptospira w próbkach wody

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65435

⸱

14 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu, aplikacja dot-blot została zaprojektowana do wykrywania Leptospira z trzech głównych kladów w próbkach wody. Metoda ta pozwala na identyfikację minimalnych ilości DNA specyficznie ukierunkowanych na sondę znakowaną digoksygeniną, łatwo wykrywalnych przez przeciwciało anty-digoksygeninowe. Takie podejście jest cennym i zadowalającym narzędziem do celów badań przesiewowych.

Streszczenie

Dot-blot to prosta, szybka, czuła i wszechstronna technika, która umożliwia identyfikację minimalnych ilości DNA specjalnie ukierunkowanego na hybrydyzację sondy w obecności DNA nośnika. Opiera się na przeniesieniu znanej ilości DNA na obojętny stały nośnik, taki jak membrana nylonowa, z wykorzystaniem aparatu dot-blot i bez separacji elektroforetycznej. Membrany nylonowe mają tę zaletę, że mają wysoką zdolność wiązania kwasów nukleinowych (400 μg/cm2), wysoką wytrzymałość i są naładowane dodatnio lub obojętnie. Zastosowana sonda to wysoce specyficzny fragment ssDNA o długości od 18 do 20 zasad, znakowany digoksygeniną (DIG). Sonda będzie sprzężona z DNA Leptospira. Gdy sonda zhybrydyzuje się z docelowym DNA, jest wykrywana przez przeciwciało anty-digoksygeninowe, co pozwala na jej łatwe wykrycie poprzez emisje ujawnione na kliszy rentgenowskiej. Kropki z emisją będą odpowiadać interesującym fragmentom DNA. Metoda ta wykorzystuje nieizotopowe znakowanie sondy, która może mieć bardzo długi okres półtrwania. Wadą tego standardowego znakowania immunologicznego jest niższa czułość niż sond izotopowych. Niemniej jednak jest on łagodzony przez sprzęgającą reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i testy dot-blot. Takie podejście umożliwia wzbogacenie sekwencji docelowej i jej wykrycie. Dodatkowo może być stosowany jako aplikacja ilościowa w porównaniu z seryjnym rozcieńczaniem dobrze znanego wzorca. Przedstawiono tutaj aplikację dot-blot do wykrywania Leptospira z trzech głównych kladów w próbkach wody. Metodologia ta może być stosowana do dużych ilości wody po jej zagęszczeniu przez odwirowanie w celu dostarczenia dowodów na obecność DNA leptospirali. Jest to cenne i zadowalające narzędzie do ogólnych celów przesiewowych i może być stosowane w przypadku innych bakterii nienadających się do hodowli, które mogą być obecne w wodzie, zwiększając zrozumienie ekosystemu.

Wprowadzenie

Leptospiroza u ludzi pochodzi głównie ze źródeł środowiskowych1,2. Obecność Leptospira w jeziorach, rzekach i strumieniach jest wskaźnikiem transmisji leptospirozy wśród dzikich zwierząt oraz zwierząt domowych i hodowlanych, które mogą ostatecznie wejść w kontakt z tymi zbiornikami wodnymi1,3,4. Ponadto Leptospira zostały zidentyfikowane w źródłach nienaturalnych, w tym w ściekach, wodzie stojącej i wodzie z kranu5,6.

Leptospira to bakterie rozpowszechnione na całym świecie7,8, a rola środowiska w ich przetrwaniu i transmisji jest dobrze znana. Leptospira może przetrwać w wodzie pitnej przy zmiennym pH i zawartości minerałów9 oraz w naturalnych zbiornikach wodnych1. Może również przetrwać przez długi czas w wodzie destylowanej10, a przy stałym pH (7.8) może przeżyć do 152 dni11. Co więcej, Leptospira może wchodzić w interakcje w konsorcjach bakteryjnych, aby przetrwać trudne warunki12,13. Może być częścią biofilmów w wodach słodkich wraz z Azospirillum i Sphingomonas, a nawet jest zdolna do wzrostu i przetrwania w temperaturach przekraczających 49 °C14,15. Może również namnażać się w glebie podmokłej i pozostawać żywotna do 379 dni16, zachowując zdolność do wywoływania choroby przez rok17,18. Jednak niewiele wiadomo o ekologii wewnątrz zbiorników wodnych i o tym, jak bakterie te są w nich rozprzestrzenione.

Od czasu odkrycia badania rodzaju Leptospira opierały się na testach serologicznych. Dopiero w bieżącym stuleciu techniki molekularne stały się bardziej powszechne w badaniach nad tą krętką. Metoda dot-blot była rzadko wykorzystywana do jej identyfikacji, stosując (1) sondę izotopową opartą na 16S rRNA oraz na powtarzalnych sekwencjach międzyprostymi (ISSR)19,20, (2) jako nanozłoty test immunoenzymatyczny w kierunku leptospirozy u ludzi stosowany w badaniu moczu21, lub (3) jako test oparty na przeciwciałach dla próbek moczu bydlęcego22. Technika ta wyszła z użycia, ponieważ pierwotnie opierała się na sondach izotopowych. Jest to jednak dobrze znana metoda, która w połączeniu z PCR daje lepsze wyniki i jest uważana za bezpieczną dzięki zastosowaniu sond nieizotopowych. PCR odgrywa kluczową rolę w wzbogacaniu DNA Leptospira poprzez amplifikację specyficznego fragmentu DNA, który w próbce może występować w ilościach śladowych. W każdym cyklu PCR ilość docelowego fragmentu DNA w reakcji ulega podwojeniu. Na koniec reakcji amplikon zostaje powielony ponad milionkrotnie23. Produkt amplifikowany metodą PCR, często niewidoczny w elektroforezie w żelu agarozowym, staje się widoczny dzięki specyficznej hybrydyzacji z sondą znakowaną DIG w metodzie dot-blot24,25,26.

Technika dot-blot jest prosta, niezawodna i odpowiednia dla licznych próbek, co czyni ją dostępną dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. Była ona wykorzystywana w różnych badaniach nad bakteriami, w tym (1) bakteriami jamy ustnej27, (2) innymi typami próbek, takimi jak żywność i kał28, oraz (3) w identyfikacji bakterii niehodowlanych29, często w zgodzie z innymi technikami molekularnymi. Do zalet oferowanych przez technikę dot-blot należą: (1) membrana posiada wysoką pojemność wiążącą, zdolną do związania ponad 200 μg/cm2 kwasów nukleinowych i do 400 μg/cm2; (2) wyniki dot-blot można interpretować wizualnie bez konieczności użycia specjalistycznego sprzętu oraz (3) mogą być one wygodnie przechowywane przez lata w temperaturze pokojowej (RT).

Rodzaj Leptospira został podzielony na klady patogenne, pośrednie i saprofityczne30,31. Rozróżnienie pomiędzy tymi kladami można przeprowadzić na podstawie specyficznych genów, takich jak lipL41, lipL32 oraz 16S rRNA. LipL32 występuje w kladach patogennych i wykazuje wysoką czułość w różnych narzędziach serologicznych i molekularnych, natomiast nie występuje u gatunków saprofitycznych21. Gen gospodarczy lipL41 jest znany ze swojej stabilnej ekspresji i stosowany w technikach molekularnych32, natomiast gen 16S rRNA jest wykorzystywany do ich klasyfikacji.

Tę metodologię można zastosować do dużych objętości wody po ich skoncentrowaniu za pomocą wirowania. Pozwala ona na ocenę różnych punktów i głębokości w zbiorniku wodnym w celu wykrycia obecności DNA leptospir oraz określenia klady, do której ono należy. Narzędzie to jest wartościowe zarówno do celów ekologicznych, jak i ogólnego screeningu, a także może być wykorzystane do wykrywania innych niehodowlanych bakterii, które mogą występować w wodzie.

Ponadto testy PCR i dot-blot są technicznie i ekonomicznie dostępne dla szerokiego grona laboratoriów, nawet tych nieposiadających zaawansowanego lub kosztownego sprzętu. Celem niniejszego badania jest zastosowanie metody dot-blot opartej na digoksigeninie do identyfikacji trzech kladów Leptospira w próbkach wody pobranych z naturalnych zbiorników wodnych.

Szczepy bakteryjne
W badaniu ujęto dwanaście serowarów Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi oraz Wolffi). Serowary te należą do kolekcji Katedry Mikrobiologii i Immunologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej i Zootechniki Narodowego Autonomicznego Uniwersytetu Meksyku i są obecnie wykorzystywane w teście mikroaglutynacji (MAT).

Wszystkie serowary Leptospira hodowano w podłożu EMJH, a ich DNA wyekstrahowano przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA (patrz Tabela materiałów). Mieszaninę DNA genomicznego dwunastu serowarów wykorzystano jako kontrolę pozytywną dla klady patogennych Leptospira. Jako kontrolę pozytywną dla klady pośredniej Leptospira zastosowano DNA genomiczne Leptospira fainei serowaru Hurstbridge szczep BUT6, natomiast jako kontrolę pozytywną dla klady saprofitycznej Leptospira uwzględniono DNA genomiczne Leptospira biflexa serowaru Patoc szczep Patoc I.

Kontrole negatywne składały się z pustego plazmidu, DNA z niepowiązanych bakterii (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, oraz Escherichia coli) i wody do PCR, która służyła jako kontrola bez matrycy.

Próbki wody
Dwanaście próbnych próbek pobranych punktowo zostało zebranych przy użyciu metody próbkowania warstwowego losowego z Centrum Badań Biologicznych i Akwakultury Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Próbki te pobrano z trzech głębokości: powierzchniowej, 10 cm oraz 30 cm (Rycina 1A, B). Procedury pobierania wody nie wpłynęły na żadne gatunki zagrożone lub chronione. Każda próbka została pobrana do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 15 mL. Aby pobrać próbkę, każdą probówkę delikatnie zanurzano w wodzie, napełniano na wybranej głębokości, a następnie szczelnie zamykano. Próbki utrzymywano w temperaturze 22 °C i bezzwłocznie transportowano do laboratorium w celu ich przetworzenia.

Każdą próbkę skoncentrowano poprzez wirowanie w sterylnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL przy 8000 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej. Krok ten powtarzano do momentu skoncentrowania wszystkich próbek w jednej probówce, która została następnie wykorzystana do ekstrakcji DNA (Rycina 1C).

Analiza próbki wody; schemat metody ekstrakcji DNA; proces wirowania w celu zagęszczenia.
Rysunek 1: Zagęszczanie próbek wody poprzez wirowanie. (A) Stawy do pobierania próbek wody oraz (B) potoki naturalne. (C) Obróbka próbek wody oparta na wirowaniu w powtarzalnych krokach tak długo, jak jest to konieczne (n). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ekstrakcja DNA
Całkowite DNA wyizolowano przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Ekstrakty DNA eluowano w 20 µL buforu elucyjnego, a stężenie DNA określono za pomocą spektrofotometru UV przy 260-280 nm i przechowywano w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

Amplifikacja PCR
Docelami PCR były geny 16S rRNA, lipL41 oraz lipL32, które identyfikują DNA z rodzaju Leptospira i pozwalają na rozróżnienie trzech kladów: patogennego, saprofitycznego i pośredniego. Projekty zarówno starterów, jak i sond oparto na wcześniejszych pracach Ahmeda i wsp., Azaliego i wsp., Bourhy'ego i wsp., Weissa i wsp. oraz Brangera i wsp.33,34,35,36,37. Sekwencje każdej sondy, startera oraz amplifikowanego fragmentu opisano w Tabeli 1, a ich dopasowanie do sekwencji referencyjnych przedstawiono w Pliku uzupełniającym 1, Pliku uzupełniającym 2, Pliku uzupełniającym 3, Pliku uzupełniającym 4 oraz Pliku uzupełniającym 5. Odczynniki do PCR oraz warunki termocyklingu opisano w sekcji protokołu.

Produkty amplifikacji wizualizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego na 1% żelu agarozy w buforze TAE (40 mM Tris base, 20 mM kwas octowy i 1 mM EDTA; pH 8.3), przy napięciu 60 V przez 45 min z detekcją przy użyciu bromku etydyny, jak pokazano na Rysunku uzupełniającym 1. DNA genomiczne uzyskane z każdego serowaru zastosowano w stężeniach od 6 x 106 do 1 x 104 ekwiwalentnych kopii genomu (GEq) w każdej reakcji PCR, w oparciu o wielkość genomu L. interrogans (4 691 184 bp)38 dla patogennych Leptospira, wielkość genomu L. biflexa (3 956 088 bp)39 dla saprofitycznych Leptospira oraz wielkość genomu L. fainei serowaru Hurstbridge szczep BUT6 (4 267 324 bp) o numerze dostępu AKWZ00000000.2.

Czułość sond oceniono w każdym doświadczeniu przy użyciu DNA z każdego patogennego serowaru, L. biflexa serowaru Patoc szczep Patoc I oraz L. fainei serowaru Hurstbridge szczep BUT6. Aby ocenić swoistość PCR oraz analizy hybrydyzacji dot-blot, do badania włączono DNA z niespokrewnionych bakterii.

Tabela 1: Startery i sondy PCR do amplifikacji produktów służących do identyfikacji kladów patogennych, saprofitycznych i pośrednich Leptospira. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Test hybrydyzacji dot-blot
Technika ta nazywana jest dot-blot, ponieważ otwory, w których umieszcza się próbkę DNA, mają kształt kropki i nabierają one tej formy podczas ich odsysania w celu unieruchomienia za pomocą próżni. Technika ta została opracowana przez Kafatos i współpracowników40. Pozwala ona na półilościowe oznaczenie Leptospira w każdej próbce dodatniej pod kątem PCR. Protokół składa się z denaturacji za pomocą NaOH 0,4 M w temperaturze pokojowej; próbki zawierające DNA Leptospira w ilościach od 30 ng do 0,05 ng, co odpowiada 6 x 106 do 1 x 104 leptospir, są naniesione na membranę nylonową przy użyciu aparatu do dot-blotu z 96 dołkami. Po immobilizacji DNA jest wiązane z membraną poprzez naświetlanie światłem UV o dawce 120 mJ. Każda sonda DNA jest znakowana digoksygeniną-11 dUTP na końcu 3' w etapie katalizy transferazy terminalnej (Digoksygenina to steroid roślinny pozyskiwany z Digitalis purpurea, używany jako reporter41). Po rygorystycznej hybrydyzacji znakowanej sondy DNA (50 pmol) w specyficznej temperaturze z docelowym DNA, hybrydy DNA są wizualizowane za pomocą reakcji chemiluminescencyjnej z przeciwciałem anty-digoksygeninowym z fosfatazą alkaliczną kowalencyjnie sprzężonym z substratem CSPD. Luminescencja jest rejestrowana poprzez naświetlanie filmu rentgenowskiego (Rycina 2).

Schemat ekstrakcji DNA i PCR; proces: koncentracja, hybrydyzacja, detekcja chemiluminescencyjna.
Rysunek 2: Etapy procedury testu PCR-dot-blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Skoncentruj każdą próbkę wody w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL poprzez wirowanie przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powtarzaj ten krok tyle razy, ile będzie to konieczne, aby skoncentrować próbkę do objętości 250 µL.
  2. Użyj zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  3. Przeprowadź specyficzną reakcję PCR zgodnie z zastosowaną sondą do dot-blotu (Tabela 1).
    1. Wykonaj amplifikacje w probówkach do PCR przy końcowej objętości 25 µL zawierającej 1 X bufor, 2,5 jednostek polimerazy Taq, 1 µM każdego startera, 0,2 mM każdego dNTP, 1,5 mM MgCl2 oraz 100 ng docelowego DNA z każdej próbki wody lub referencyjnego DNA genomicznego.
    2. Zaprogramuj reakcję PCR w termocyklerze zgodnie z warunkami cyklicznymi (Tabela 2).
    3. Przechowuj reakcje w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  4. Nanieś 10 µL każdego produktu PCR przeznaczonego do analizy na osobne dołki płytki 96-dołkowej.
  5. Dodaj 40 µL buforu TE do każdego dołka i wymieszaj poprzez pipetowanie.
    UWAGA: Płytkę 96-dołkową można szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w Pliku uzupełniającym 6, aby przygotować bufory i roztwory do protokołu. Rysunek 3 przedstawia etapy przygotowania próbek.

Tabela 2: Warunki cykli termicznych PCR dla genów 16S, lipL41 i lipL32. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Schemat przygotowania próbek do PCR; przenoszenie reakcji PCR na płytkę; pipetowanie, dodawanie buforu TE.
Rycina 3: PCR i przygotowanie próbek. Zastosowano specyficzny protokół PCR, produkt PCR przeniesiono na płytkę mikrotitracyjną, a do każdego dołka dodano 40 µL buforu TE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Montaż aparatury do dot-blotu

UWAGA: Montaż aparatury do dot-blotu przedstawiono na Rysunku 4. Podczas procedury należy używać rękawiczek w celu bezpiecznego obchodzenia się z roztworami alkalicznymi oraz ochrony membrany nylonowej przed zanieczyszczeniem.

Schemat przygotowania do metody dot-blot z membranami nylonowymi, namaczaniem w 10X SSPE, przygotowaniem PCR i płukaniem w buforze TE.
Rycina 4: Montaż aparatury do metody dot-blot. Papier filtracyjny oraz membrana nylonowa (wcześniej namoczona w 10 X SSPE) muszą zostać ułożone w odpowiedniej kolejności. Przed zastosowaniem próżni zespół musi zostać mocno zabezpieczony śrubami. Każdy otwór należy wypłukać buforem TE, a następnie nanieść produkty PCR do odpowiednich otworów. Po przeniesieniu produktu PCR na membranę, każdy otwór należy ponownie wypłukać buforem TE i pozostawić do wyschnięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wytnij membranę nylonową (patrz Tabela materiałów) oraz papier filtrujący w arkusze o rozmiarze 12 x 8,5 cm.
  2. Oznacz membranę markerem permanentnym.
  3. Zrób nożyczkami wcięcie na jednej krawędzi, aby wskazać właściwą orientację. Użyj oznaczenia, aby zapamiętać kolejność próbek.
  4. Zwilż membranę i papier filtrujący 10 X buforem solno-fosforanowym z EDTA (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 oraz 0,02 M EDTA, pH 7,4) (Plik uzupełniający 6). Membranę przenoś za pomocą czystej pęsety z tępymi końcami.
  5. Złóż komorę do dot-blotu; najpierw ułóż papier filtrujący, a następnie membranę na uszczelce plastikowej. Przymocuj pokrywę śrubami, dokręcając je na krzyż.
  6. Podłącz komorę do pompy próżniowej, nalej 100 µL TE do każdego otworu, utrzymuj próżnię przez 1 min, a następnie ją wyłącz.
  7. Włącz próżnię na niskich obrotach i nanieś 50 µL każdej próbki do odpowiedniego otworu na membranie w aparacie do dot-blotu (zgodnie z wcześniej ustalonym rozkładem na membranie).
    UWAGA: Przed umieszczeniem w komorze do dot-blotu każdą próbkę należy zhomogenizować na 96-dołkowej płytce do hemaglutynacji.
  8. Pozostaw membranę do wyschnięcia pod wpływem próżni. W razie potrzeby delikatnie uderz w komorę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z próbki.
  9. Przemyj każdy otwór, wlewając do niego 100 µL TE przy stale włączonej próżni, a następnie pozostaw do wyschnięcia.
    UWAGA: Po zakończeniu transferu kluczowe jest najpierw wyłączenie pompy i jej odłączenie. Niedopełnienie tego wymogu może spowodować cofnięcie się cieczy do aparatu. DNA nie wymaga etapu denaturacji przy użyciu dodatnio naładowanej membrany nylonowej, jednak w przypadku stosowania innych nośników obojętnych może być konieczny etap przeddenaturacji oraz denaturacja w środowisku zasadowym41.

3. Denaturacja i utrwalanie DNA

UWAGA: Rysunek 5 przedstawia procedurę unieruchamiania DNA na membranie.

Proces utrwalania DNA na błonie; schemat z etapami: NaOH, moczenie w SSPE, suszenie, prehybrydyzacja, UV.
Rycina 5: Procedura utrwalania DNA na błonie. DNA jest denaturowane w roztworze alkalicznym. Następnie jest neutralizowane za pomocą 10 X SSPE, a błona zostaje wysuszona. W kolejnym kroku błona jest poddawana transiluminacji. Błonę rehydratuje się w 2 X SSPE i poddaje prehybrydyzacji przez noc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Inkubować membranę w 0,4 M NaOH przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  2. Równoważyć membranę w 10 X SSPE przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  3. Suszyć membranę w temperaturze 80 °C przez 2 h.
  4. Naświetlać światłem UV o dawce 120 mJ przez 3 min. Należy upewnić się, że próbki są skierowane stroną roboczą w dół, w stronę źródła światła UV. W przypadku użycia urządzenia do sieciowania UV (UV-crosslinker), należy upewnić się, że próbki są skierowane stroną roboczą do góry i powtórzyć ten krok dwukrotnie.
    UWAGA: Membrana musi być całkowicie sucha przed sieciowaniem UV. DNA zostanie unieruchomione poprzez wiązanie kowalencyjne z membraną nylonową. Każde sieciowanie trwa od około 18'' do 1' przy optymalnej dawce napromieniowania UV, która dla większości eksperymentów hybrydyzacyjnych wynosi w przybliżeniu 0,6-0,8 kJ/m2.
    Ekspozycja na promieniowanie UV jest szkodliwa dla oczu i skóry. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i unikać kontaktu z gołą skórą.
  5. Przemyć membranę w 2 X SSPE przez 10 min.
  6. Ostrożnie złożyć membranę i umieścić ją w probówce do hybrydyzacji (należy użyć probówki do mikrowirówki o pojemności 15 mL).
  7. Dodać do probówki 10 mL roztworu do prehybrydyzacji (Supplementary File 6) i inkubować w temperaturze 42 °C przez noc. Należy upewnić się, że probówka została szczelnie zamknięta, aby zapobiec wyciekowi.

4. Hybrydyzacja

  1. Odssać 5 mL roztworu do prehybrydyzacji z probówki do hybrydyzacji. Aby wykorzystać te 5 mL po raz drugi, należy przelać je do innej probówki i przechowywać w temperaturze -4 °C.
  2. Do probówki do hybrydyzacji dodać 15 µL znakowanej sondy (Tabela 1). Przepłukać końcówkę w roztworze, aby upewnić się, że znakowana sonda została całkowicie wprowadzona do rozcieńczenia.
    UWAGA: Wiązanie sondy DNA nie jest tak silne jak wiązanie antygen-przeciwciało. W związku z tym zmiany w stężeniu sondy lub DNA w próbce mogą wpływać na intensywność emitowanej fluorescencji. Sondy DNA są stechiometryczne, co oznacza, że liczba cząsteczek sondy związanych z DNA jest równoważna liczbie cząsteczek DNA obecnych w roztworze. Na Rysunku 6 przedstawiono hybrydyzację sondy.
  3. Inkubować w temperaturze 42 °C przez noc.
  4. Przeprowadzić znakowanie sondy DNA DIG. Postępować zgodnie z instrukcjami określonymi w Tabeli 3 w celu wymieszania odczynników, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 h. Następnie dodać 80 µL wody destylowanej i przechowywać znakowaną sondę w temperaturze 4 °C.

Schemat hybrydyzacji sondy przedstawiający proces usuwania roztworu do prehybrydyzacji i dodawania sondy DIG.
Rysunek 6: Hybrydyzacja sondy. Objętość buforu do hybrydyzacji zostaje dostosowana, a następnie dodawana jest sonda znakowana digoksigeniną, aby umożliwić hybrydyzację sondy przez noc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela 3: Odczynniki do znakowania sond digoksigeniną (DIG). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

5. Chemiluminescencja (znakowanie anty-DIG)

  1. Przemyj membranę dwukrotnie roztworem 2 X SSPE/0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  2. Inkubuj membranę w roztworze 5 X SSPE/0,1% SDS w temperaturze hybrydyzacji sondy przez 15 min.
    UWAGA: Na tym etapie należy użyć pojemnika z pokrywką, aby jak najdłużej utrzymać temperaturę. Należy zapewnić jednorodną i stałą temperaturę na całej powierzchni membrany. Przybliżona objętość każdego płukania to 100 mL wskazanego roztworu.
  3. Przemyj membranę raz Buforem 1 (Supplementary File 6) w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Przemyj membranę raz Buforem 2 (Supplementary File 6) w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  5. Przemyj membranę Buforem 2 i dodaj przeciwciało anty-digoksigeninowe (15 µL) (patrz Table of Materials), następnie inkubuj przez 45 min (czas inkubacji może wynosić od 30 do 60 min). To przeciwciało wtórne znakuje sondę w celu detekcji.
    UWAGA: Membranę można przechowywać w Buforze 2 z przeciwciałem anty-digoksigeninowym przez noc w temperaturze 4-8 °C. Proces znakowania anty-DIG w metodzie chemiluminescencji przedstawiono na Figure 7.

Schemat procesu znakowania przeciwciałem anty-DIG z etapami płukania i blokowania membrany w celu wiązania przeciwciał.
Rysunek 7: Znakowanie anty-DIG w procesie chemiluminescencji. Niewiązane kwasy nukleinowe są usuwane za pomocą roztworów buforowych. Sonda wiąże się z docelowym DNA, a nadmiar jest usuwany. Membranę blokuje się buforem blokującym 1 X, a następnie dodaje przeciwciało anty-DIG (1:10000). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

6. Chemiluminescencja (aplikacja substratu)

  1. Przemyć membranę dwukrotnie w Buforze 1 w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  2. Przemyć raz w Buforze 3 (patrz Plik uzupełniający 6) w temperaturze pokojowej przez 5 min, pozwalając odciec większości buforu, tak aby membrana pozostała prawie sucha.
  3. Dodać gotowy do użycia CSPD (fosforan dwusodowy 3-(4-metoksyspiro {1,2-dioksetan-3,2′-(5′-chloro) tricyklo [3.3.1.13,7] dekan}-4-yl) fenylowy, patrz Tabela materiałów) i pozostawić na 5 min (używając zwilżonych palców, rozprowadzić CSPD z jednej strony na drugą).
  4. Umieścić membranę w przezroczystej plastikowej torebce (12,5 x 9 cm) dopasowanej do wymiarów membrany. Ostrożnie usunąć pęcherzyki powietrza, równomiernie rozprowadzić CSPD i zgrzać torebkę termicznie.
  5. Inkubować membranę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 min (można wydłużyć do 30 min), upewniając się, że membrana z próbkami jest skierowana w dół, aby była całkowicie zanurzona. Należy zadbać o stałą temperaturę i jej równomierny rozkład na powierzchni membrany.
  6. Osuszyć plastikową torebkę i przymocować ją taśmą klejącą do zużytej wcześniej kliszy rentgenowskiej. Ułatwi to manipulację podczas procedury ekspozycji.
    UWAGA: Rysunek 8 przedstawia aplikację substratu w procesie chemiluminescencji.

Schemat aplikacji substratu dla inkubacji błony, płukania buforami 1 i 3, reakcji CSPD, filmu rentgenowskiego.
Rysunek 8: Aplikacja substratu w procesie chemiluminescencji. Po usunięciu wolnych przeciwciał do błony dodaje się substrat CSPD (1:250). Reakcję aktywuje się poprzez inkubację w 37 °C, a następnie błonę przygotowuje się do zapisu chemiluminescencji na filmie rentgenowskim. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Chemiluminescencja (detekcja)

  1. Przeprowadź procedurę naświetlania. W ciemni przygotuj roztwory wywoływacza i utrwalacza (patrz Tabela materiałów) w odpowiednich kuwetach.
  2. W ciemności ostrożnie przyłóż utrwaloną membranę stroną aktywną do nowej kliszy rentgenowskiej i włóż ją do kasety rentgenowskiej (patrz Tabela materiałów).
  3. Zapisz czas naświetlania. Czas naświetlania może wynosić od 1 min do 30 min lub więcej. Rozpocznij od 5 min i dostosuj czas w zależności od potrzeb.
  4. Zanurz kliszę rentgenowską w roztworze wywoływacza na 1-3 min, a następnie delikatnie opłucz wodą z kranu (15-45 s).
  5. Zanurz kliszę rentgenowską w roztworze utrwalacza na 1-3 min, a następnie delikatnie opłucz wodą z kranu (45 s).
  6. Pozostaw kliszę rentgenowską do wyschnięcia na powietrzu i udokumentuj wynik badania na białym podświetlaczu.
    UWAGA: Unikaj potrząsania membraną podczas czasu naświetlania rentgenowskiego. Proces detekcji przedstawiono na Rysunku 9.
  7. Przejdź do interpretacji wyników. Na naświetlonej kliszy rentgenowskiej można wizualnie zlokalizować kropki z emisją, które odpowiadają fragmentom DNA z hybrydyzacją sondy. Intensywność emitowanego sygnału zależy od luminescencji oraz czasu naświetlania.
    UWAGA: Membrany można przechowywać w stanie wysuszonym między arkuszami papieru filtracyjnego przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.

Proces detekcji na filmie rentgenowskim; schemat ciemni; sekwencja: wywoływanie, płukanie, utrwalanie, suszenie; przygotowanie membrany.
Rysunek 9: Detekcja procesu chemiluminescencji. W warunkach całkowitej ciemności membrana jest eksponowana na film rentgenowski wewnątrz kasety rentgenowskiej. Następnie pozostawiono ją na określony czas ekspozycji, po czym film rentgenowski wywołano i utrwalono. Na koniec film wysuszono na powietrzu i poddano interpretacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Procedura dehumanidyzacji membrany

  1. Przemyć membranę dwukrotnie przez 10 min wodą destylowaną.
  2. Przemyć membranę przez 20 min 0.4 M NaOH w temperaturze 53 °C (dwukrotnie).
  3. Przemyć membranę dwukrotnie przez 10 min w 2 X SSPE.
  4. Pozostawić membranę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  5. Przechowywać membranę i wrócić do kroku 3.5 protokołu.
    UWAGA: Membranę można przechowywać w buforze do prehybrydyzacji przez noc w temperaturze 4-8 °C. Następnego dnia rozpocząć od inkubacji w 42 °C przez 1 h, aby bufor do prehybrydyzacji osiągnął odpowiednią temperaturę. Następnie przejść do kroku 3.5 protokołu.

Wyniki

Aby ocenić skuteczność tej techniki, wykorzystano DNA genomiczne z czystych kultur każdego serowaru Leptospira wraz z sondą specyficzną dla danej klady. Membrany przygotowano z 100 ng DNA genomicznego na reakcję PCR dla każdego serowaru, a następnie z DNA genomicznego ośmiu niepowiązanych bakterii oraz z różnych stężeń DNA genomicznego serowarów ad hoc Leptospira. Każdy test obejmował kontrolę dodatnią, ujemną oraz kontrolę bez matrycy. DNA genomiczne niepowiązanych bakterii nie wykazało powinowactwa do sond w metodzie dot-blot. Rozkład na membranach oraz membrany dot-blot przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2, rysunku uzupełniającym 3, rysunku uzupełniającym 4, rysunku uzupełniającym 5, rysunku uzupełniającym 6, rysunku uzupełniającym 7. W odniesieniu do klady saprofitów, przy użyciu sondy DB_Saproprobe z produktem PCR o długości 1059 bp amplifikowanym za pomocą starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD oraz produktem PCR o długości 517 bp amplifikowanym starterami DB_16SSapREV i DB_16SSapFWD z DNA genomicznego Leptospira biflexa serowaru Patoc szczep Patoc I, możliwe było wykrycie od 0,05-0,1 ng DNA saprofitów (rysunek uzupełniający 2 oraz rysunek uzupełniający 3). Analogicznie, w celu wykrycia klady pośredniej, przy użyciu sondy DB_Interprobe z produktem PCR o długości 1059 bp amplifikowanym starterami DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD oraz produktem PCR o długości 299-301 bp amplifikowanym starterami DB_16SInterREV i DB_16SInterFWD z DNA genomicznego Leptospira fainei serowaru Hurstbridge szczep BUT6 (rysunek uzupełniający 4 oraz rysunek uzupełniający 5), możliwe było wykrycie około 0,1 ng DNA pośredniego. Podobnie, dla klady patogennej, przy użyciu sondy DB_16SPathoprobe z produktem PCR o długości 1059 bp amplifikowanym starterami DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD lub sondy DBlipL41probe z produktem PCR o długości 479 bp amplifikowanym starterami DB_lipL41REV i DB_lipL41FWD z mieszaniną DNA genomicznego patogennych serowarów Leptospira, możliwe było wykrycie stężeń DNA w zakresie 0,3-0,6 ng DNA patogennego (rysunek uzupełniający 6 oraz rysunek uzupełniający 7).

Testy zaprojektowane w celu identyfikacji trzech kladów mogą być stosowane indywidualnie dla każdego z nich. Jednakże, w przypadku cennych i rzadkich próbek, można przygotować jedną błonę z użyciem starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD, które amplifikują produkt o długości 1058-1069 bp. Produkt ten można następnie hybrydyzować oddzielnie z DB_Interprobe, DB_Saproprobe oraz DB_16SPathoprobe, wykonując etap dehybrydyzacji (krok 8) przed każdą z tych operacji. Takie podejście umożliwia identyfikację wszystkich kladów na tej samej błonie.

W przypadku próbek wody pobranych w terenie zastosowano protokół z użyciem sondy lipL32. DNA z każdej próbki wody wykorzystano w stężeniu 100 ng na reakcję PCR. Dodatkowo uwzględniono kontrolę protokołu ekstrakcji DNA, która polegała na dodaniu 100 ng genomowego DNA Leptospira do 15 mL próbki wody destylowanej. Uwzględniono również kontrole negatywne i pozytywne (Rysunek 10).

Tabela 4: Opis i głębokość próbek wody. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wyniki ELISA; układ siatki; kontrole pozytywne i negatywne; analiza próbek wody z oczka wodnego.
Rysunek 10: Analiza dot-blot każdej próbki wody. (A) Rozmieszczenie na membranie oraz (B) dot-blot z użyciem sondy DB_lipL32 oraz produktu (262 bp) starterów DB_lipL32REV i DB_lipL32FWD w próbkach wody z terenu. Powierzchnia z oczka wodnego nr 3 wykazuje wynik pozytywny, a kontrola protokołu ekstrakcji oraz kontrole pozytywne wykazują intensywny sygnał. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Opis próbki wody przedstawiono w Tabela 4, a rozkład na membranie dot-blot oraz obraz przedstawiono w Rycina 9Kropka A7 wskazuje na obecność DNA *Leptospira* na powierzchni stawu 3. Aby określić stężenie DNA obecnego w stawie 3, przeprowadzono analizę dot-blot z użyciem znanych stężeń DNA mieszaniny Leptospira serowary, a sonda lipL32 została przeprowadzona (Rysunek 11). Membranę przygotowano z DNA genomicznym w zakresie od 100 ng do 1 x 10-13 ng w każdej kropce. Minimalne stężenie, które można było bez wątpienia wykryć, wynosiło około 0,3 ng, co odpowiadało 6 x 105 GEq w próbkach wody.

Analiza dot blot; tabela i wyniki blotu; detekcja DNA Leptospira; eksperyment biologii molekularnej.
Rycina 11: Analiza dot-blot z zastosowaniem znanych stężeń DNA mieszaniny serowarów Leptospira i sondy lipL32. (A) Rozmieszczenie na membranie i (B) dot-blot sondy DB_lipL32probe oraz produktu (262 bp) starterów DB_lipL32REV i DB_lipL32FWD z rozcieńczeniami (1:2) mieszaniny genomowego DNA patogennych serowarów Leptospira. Sygnał sondy może być łatwo wykryty przy stężeniu aż do 3.91 x 10-1 ng mieszaniny DNA Leptospira. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Produkty amplifikacji PCR wizualizowane za pomocą rozdziału elektroforetycznego. Ścieżka 1. Marker masy cząsteczkowej 100 bp DNA Ladder. Ścieżka 2. PCR oparta na genie lipL32 z mieszaniną DNA patogennych Leptospira jako matrycą; Ścieżka 3. PCR oparta na genie lipL41 z mieszaniną DNA patogennych Leptospira jako matrycą; Ścieżka 4. PCR oparta na genie 16S rRNA z mieszaniną DNA patogennych Leptospira jako matrycą; Ścieżka 5. PCR oparta na genie 16S rRNA z zastosowaniem starterów DB_16SSapREV i DB_16SSapFWD oraz DNA Leptospira biflexa serowaru Patoc szczepu Patoc I jako matrycą; Ścieżka 6. PCR oparta na genie 16S rRNA z zastosowaniem starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD oraz DNA Leptospira biflexa serowaru Patoc szczepu Patoc I jako matrycą; Ścieżka 7. PCR oparta na genie 16S rRNA z zastosowaniem starterów DB_16SInterREV i DB_16SInterFWD oraz DNA Leptospira fainei serowaru Hurstbridge szczepu BUT6 jako matrycą; Ścieżka 8. PCR oparta na genie 16S rRNA z zastosowaniem starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD oraz DNA Leptospira fainei serowaru Hurstbridge szczepu BUT6 jako matrycą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: (A) Rozkład membranowy oraz (B) dot-blot sondy DB_Saproprobe i produktu (1059 bp) starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD z DNA genomowego Leptospira biflexa serowaru Patoc, Patoc I.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 3: (A) Rozkład błonowy oraz (B) dot-blot sondy DB_Saproprobe z produktem (517 bp) starterów DB_16SSapREV i DB_16SSapFWD z DNA genomowego Leptospira biflexa serowaru Patoc, Patoc I. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: (A) Rozkład błonowy i (B) dot-blot sondy DB_Interprobe z produktem (1059 bp) starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD oraz DNA genomicznym Leptospira fainei serowaru Hurstbridge szczep BUT6. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: (A) Rozkład w błonie oraz B) dot-blot dla DB_Interprobe oraz produktu (299-301 bp) starterów DB_16SInterREV i DB_16SInterFWD z wykorzystaniem DNA genomicznego Leptospira fainei serotyp Hurstbridge szczep BUT6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: (A) Rozkład błonowy i (B) dot-blot sondy DB_16SPathoprobe oraz produktu (1059 bp) starterów DB_16SPathoREV i DB_16SPathoFWD z mieszanką DNA genomowego patogennych serowarów Leptospira.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: (A) Rozkład błonowy oraz (B) dot-blot sondy DB_lipL41 z produktem (479 bp) starterów DB_lipL41REV i DB_lipL41FWD z mieszaniną DNA genomicznego patogennych serowarów Leptospira.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Dopasowanie gatunków saprofitycznych Leptospira do starterów i sondy na podstawie sekwencji 16S rRNA. Startery zostały wyróżnione pogrubioną czcionką i kolorem czarnym w celu ich identyfikacji, a ich kierunek wskazują czarne strzałki. Sonda jest zaznaczona pogrubioną czcionką i wyróżniona kolorem szarym, a jej pozycja jest oznaczona szarą linią. Dopasowane sekwencje są wyróżnione jasnoszarym kolorem, natomiast sekwencje niedopasowane są w kolorze czarno-białym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Dopasowanie pośrednich gatunków Leptospira do starterów i sondy na podstawie sekwencji 16S rRNA. Startery zostały wyróżnione pogrubioną czcionką i kolorem czarnym w celu ich identyfikacji, a ich kierunek wskazują czarne strzałki. Sonda jest zaznaczona pogrubioną czcionką i wyróżniona kolorem szarym, a jej pozycja jest oznaczona szarą linią. Dopasowane sekwencje są w kolorze jasnoszarym, natomiast sekwencje niedopasowane są przedstawione w kolorze czarno-białym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Dopasowanie patogennych gatunków Leptospira do starterów i sondy na podstawie sekwencji genu lipL32. Startery zostały wyróżnione pogrubioną czcionką i kolorem czarnym w celu ich identyfikacji, a ich kierunek wskazano czarnymi strzałkami. Sonda jest zaznaczona pogrubioną czcionką i wyróżniona kolorem szarym, a jej położenie oznaczono szarą linią. Dopasowane sekwencje przedstawiono w kolorze jasnoszarym, natomiast sekwencje niedopasowane w kolorach czarnym i białym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Dopasowanie patogennych gatunków Leptospira do starterów i sondy na podstawie sekwencji genu lipL41. W celu ich identyfikacji startery zostały pogrubione i wyróżnione na czarno, a ich kierunek wskazują czarne strzałki. Sonda jest pogrubiona i wyróżniona na ciemnoszaro, a jej pozycja jest zaznaczona szarą linią. Dopasowane sekwencje są w kolorze jasnoszarym, natomiast sekwencje niedopasowane są czarno-białe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Dopasowanie gatunków Leptospira do starterów celujących w sekwencję 16S rybosomalnego RNA oraz sond dla gatunków saprofitycznych, pośrednich i patogennych. W celu ich identyfikacji startery zaznaczono pogrubieniem i wyróżniono kolorem czarnym, a ich kierunek oznaczono czarnymi strzałkami. Sondy zaznaczono pogrubieniem i wyróżniono kolorem szarym, a ich pozycje przedstawiono szarymi liniami. Dopasowane sekwencje są w kolorze jasnoszarym, a sekwencje niedopasowane w kolorze białym i czarnym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Bufor i roztwory do testu dot-blot. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Krytyczne etapy techniki dot-blot obejmują (1) unieruchomienie DNA, (2) zablokowanie wolnych miejsc wiązania na błonie z niehomologicznym DNA, (3) komplementarność między sondą a fragmentem docelowym w warunkach wyżarzania, (4) usunięcie niezhybrydyzowanej sondy oraz (5) wykrycie cząsteczki reporterowej41.

PCR-Dot-blot ma pewne ograniczenia, takie jak technika ta nie dostarcza informacji o wielkości zhybrydyzowanego fragmentu37, wymaga dehybrydyzacji pojedynczej błony przed ponowną hybrydyzacją za pomocą drugiej lub trzeciej sondy oraz wymaga znacznego czasu i wysiłku do uzyskania końcowego wyniku.

Technika ta wykazała spójność z innymi technikami molekularnymi42,43 i jej zastosowaniami. Odwrócona kropka-plama, nanozłota kropka21 i kropka ELISA42 zostały wykorzystane do wykrywania określonych genów w organizmach takich jak Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 i Mycobacterium tuberculosis48,49 na podstawie 16S rRNA29,43oraz do wykrywania DNA lub RNA wirusów roślinnych41. Granica wykrywalności (LOD) zdefiniowana jako najniższe stężenie mikroorganizmu, które można konsekwentnie i wiarygodnie zmierzyć za pomocą tej techniki50, wahała się od 100 pg (5 x 104 bakterii) w przypadku H. pylori47 do pojedynczej komórki B. burgdorferi w próbkach klinicznych45, i fg, który jest mniejszy niż komórka, M. tuberculosis48,49.

Jednym z cennych aspektów tej połączonej metodologii jest jej zdolność do rozszerzenia granicy wykrywalności o jeden rząd, przezwyciężając wyniki fałszywie ujemne wynikające z dwóch warunków próbki, które mogą prowadzić do niespójnych wyników: (1) próbek z niewystarczającym DNA lub (2) zanieczyszczenia próbki, co pozwala na 100 % wykrycie próbek dodatnich 25,45,47,48,49. PCR-Dot-blot ma zdolność wykrywania mniejszych ilości amplifikowanych produktów niż te, które można wykryć w elektroforezie w żelu agarozowym, i pozwala uniknąć zanieczyszczenia w wyniku drugich etapów amplifikacji, jak w przypadku zagnieżdżonego i częściowo zagnieżdżonego PCR. Zalety te są szczególnie istotne podczas pracy z próbkami środowiskowymi zawierającymi niski ładunek bakteryjny, które mogą zawierać szerszy zakres inhibitorów i DNA z niepowiązanych źródeł, które mogą zakłócać techniki molekularne.

Wcześniejsze prace sugerują, że leptospiry mogą być identyfikowane przez sondy DNA znakowane fotobiotyną, osiągające LOD 5 pg (5 x 103 leptospires)51. Sondy znakowane DIG wykrywają 0,1-1 pg (102 leptospiry), podczas gdy 32sondy znakowane P wykrywają 1-5 pg (750 do 1000 leptospirów)51, a sondy znakowane biotyną wykrywają 5 pg (2500 leptospirów)52. Co więcej, 32sondy znakowane P dla saprofitu Leptospira osiągnęły LOD 1,95 ng, a dla patogennej Leptospira 3,9 ng53. W tym badaniu ustalono podobne LOD dla trzech kladów. LOD dla gatunków chorobotwórczych wynosił około 0,3 ng genomowego DNA (6-8 x 104 GEq) (ryc. 11), a dla saprofitów i gatunków pośrednich wynosił 0,1 ng (2 x 104 GEq). Warto zauważyć, że poprzednie badania przeprowadzono przy użyciu czystych kultur Leptospira 51 i surowic od eksperymentalnie zakażonych chomików złotych, mając na celu wykrycie patogennej Leptospira54,55 i zastosowanie hybrydyzacji DNA z 32P znakowaną jako narzędzie do identyfikacji i klasyfikacji Leptospira56. Sondy te wykazują wysoką specyficzność i nie wykazują hybrydyzacji krzyżowej z niehomologicznym DNA z innych mikroorganizmów 19,51,54,55,56,57 i mogą rozróżniać nawet wśród blisko spokrewnionych gatunków, takich jak Leptonema 57. Podobnie w tej pracy nie zaobserwowano hybrydyzacji z niehomologicznym DNA. Chociaż sondy nieizotopowe nie są tak czułe jak sondy izotopowe58 lub inne techniki43, można oczekiwać, że kombinacja PCR-Dot-blot pozwala na nawet dziesięciokrotny wzrost czułości w porównaniu z innymi technikami opartymi na PCR, co zaobserwowano w wykrywaniu Leishmania i herpeswirusa bydła 4 (BHV4)24,26.

Z drugiej strony, test dot-blot do identyfikacji Leptospira jest częściej stosowany w przypadku przeciwciał, a ostatnio z przeciwciałami monoklonalnymi jako alternatywa dla diagnozowania ludzi i zwierząt w próbkach moczu 59,60,61,62. W tych badaniach próbka jest bezpośrednio przetwarzana na błonę bez wcześniejszych etapów, a przeciwciała są ukierunkowane na specyficzne białka powierzchniowe Leptospira związane z patogenezą. Na przykład test ELISA Mab-Dot-blot wykazuje wysoką czułość i swoistość, wykrywając zaledwie 1 μg homogenatu bakteryjnego62. Wyniki uzyskane z testu Mab-Dot-blot mogą być porównywalne z testami PCR, które zazwyczaj mają LOD około 103 leptospires/ml moczu lub 9,3 ng homogenatu Leptospira 63. Ilość genomowego DNA, która może być amplifikowana przez PCR, wynosi 100 komórek (500 fg DNA)61. W poprzednich badaniach wykorzystano czyste kultury lub próbki kliniczne bez procedur wzbogacania i były zorientowane na lepszą diagnozę. Biorąc pod uwagę, że zakażone szczury mogą wydalić do 107 leptospirów/ml moczu64, a psy mogą wydalać od 102 do 106 leptospirów/ml moczu65, służąc jako źródła zanieczyszczenia zbiorników wodnych, próbki środowiskowe wymagają wzbogacenia leptospiralą. Amplifikacja docelowego DNA metodą PCR in vitro przed blottem pozwala na dziesięciokrotną poprawę czułości zabiegu52,55. Zwykle produkt amplifikowany przez PCR w punkcie końcowym nie byłby wizualizowany w elektroforezie w żelu agarozowym; niemniej jednak staje się to oczywiste poprzez specyficzną hybrydyzację sondy znakowanej DIG w plamie punktowej.

Podczas gdy wiele badań nad Leptospira i leptospirozą koncentrowało się na diagnozowaniu chorób, niewiele wiadomo na temat ich ekologii w zbiornikach wodnych i ich rozmieszczenia w nich. Technika PCR-Dot-blot stanowi uzupełnienie zestawu narzędzi do badania Leptospira i leptospirozy, oferując tę zaletę, że umożliwia badanie przesiewowe dużej liczby próbek oraz przyspiesza wyniki i interpretację. PCR-Dot-blot to stosunkowo tania, prosta i nieradioaktywna technika, która może pomieścić wiele sond na jednej membranie. Poza tym eliminuje potrzebę stosowania zaawansowanego sprzętu i złożonych przepływów pracy, które mogą być trudne w warunkach ograniczonych zasobów.

Wpływ tego badania polega na jego przyszłym zastosowaniu do badania dużych zbiorników wodnych na różnych głębokościach, a także innych nisz ekologicznych i typów próbek, w tym gleby, stojącej wody, kału, krwi i tkanek.

Podsumowując, praca ta demonstruje zastosowanie techniki PCR-Dot-blot, opartej na znakowaniu digoksygeniną sond DNA w celu identyfikacji trzech kladów w obrębie rodzaju Leptospira. Metoda ta usprawnia proces identyfikacji, redukując go do jednego etapu amplifikacji i pozwala na trzy jednoczesne hybrydyzacje lub trzy kolejne hybrydyzacje przy użyciu jednej membrany. Granice wykrywalności osiągnięte za pomocą tej techniki są podobne do tych osiągniętych za pomocą sond radioaktywnych53, co czyni ją cennym narzędziem do identyfikacji Leptospira w próbkach wody ze źródeł naturalnych. W związku z tym technika ta zapewnia zwiększoną czułość i zapewnia dokładne i spójne wyniki podczas oceny próbek z minimalną ilością bakteryjnego DNA. Służy jako alternatywne podejście do badania dynamiki Leptospira w zbiornikach wodnych i może pomóc w ocenie i nadzorze szerszych próbek środowiskowych, pomagając we wdrażaniu środków zapobiegawczych przeciwko przenoszeniu tego mikroorganizmu.

W przypadku problemów z techniką należy wziąć pod uwagę następujące najważniejsze informacje dotyczące rozwiązywania problemów: (1) Jeśli kropki mają nieregularne kształty, sprawdź, czy system próżniowy jest bezpiecznie zamknięty w poprzek, a następnie powtórz przenoszenie. (2) W przypadku, gdy rurka hybrydyzacyjna pęknie podczas procedury nocnej, powodując utratę buforu hybrydyzacyjnego przez membranę, zapoznaj się z sekcją "Procedura dehybrydyzacji" i uruchom ponownie proces. (3) Jeśli nie widać żadnych kropek, nie wyrzucaj membrany; przejdź do sekcji "Procedura dehybrydyzacji", aby powtórzyć kroki hybrydyzacji. (3) Jeśli na wywołanej kliszy rentgenowskiej zostaną zauważone nierówne białe obszary, upewnij się, że podczas procesu zamykania worka nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki powietrza. (5) Jeżeli na wywołanym filmie rentgenowskim zaobserwowane są nierówne czarne obszary, należy upewnić się, że CSPD został dokładnie rozprowadzony za pomocą zwilżonych palców. (6) Jeśli na kliszy rentgenowskiej widoczne są cienie kropek, należy upewnić się, że film nie jest przesuwany w czasie naświetlania.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni kolekcji Leptospira z Wydziału Mikrobiologii i Immunologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej i Zootechniki Narodowego Uniwersytetu Autonomicznego Meksyku. Jesteśmy wdzięczni za hojną darowiznę w postaci referencyjnych szczepów Leptospira; Leptospira fainei serowar Hurstbridge szczep BUT6 i Leptospira biflexa serowar Patoc szczep Patoc I do Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Dziękujemy dr José Antonio Ocampo Cervantesowi, koordynatorowi CIBAC oraz personelowi za wsparcie logistyczne. EDT był częścią programu Terminal Project dla studentów studiów licencjackich Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Przyjmujemy do wiadomości Biorender.com oprogramowanie do tworzenia figur 1 i 3 do 9.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
Zestaw do ekstrakcji DNA PurelinkInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (zestaw polimerazy End-Point PCR Taq)PromegaM3001
Bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1,nylonowe MerkWHA1001325
, dodatnio naładowana rolka 30cm x 3 mRoche
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab Owce Poliklonalne przeciwciało pierwszorzędoweRoche11093274910
Średnia zasada EMJHDifcoS1368JAA
Wzbogacanie Leptospira EMJHDifcoBD 279510
Odczynnik blokującyRoche11096176001
CSPD gotowy do użycia 3-(4-metoksyspiro {1,2-dioksetano-3,2′-(5′-chloro) tricyklo [3.3.1.13,7] decan}8-4-ylo) fosforan fenylowyMerk11755633001
Kwas dezoksyrybonukleinowy z plemników śledziaSigma AldrichD3159
Deweloper Carestream CarestreamHealth IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA, Sól disodowa (Dihydrat)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
Lauryl sulfate Sól sodowa (dodecylosiarczan sodu; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
Sól sodowa N-lauroilsarkozyny CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150Jest to anionowy środek powierzchniowo czynny
Poliwinylopirolidon (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Glikol polietylenowy Monolaurynian sorbitanu (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Chlorek sodu (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Fosforan sodu dwuzasadowy (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Transferaza końcowa, rekombinowanaRoche3289869103
Chlorowodorek Tris (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LMoże być domowej roboty następujące Plik uzupełniający 6
PodkładySigma-AldrichNa żądaniePostępuj zgodnie z tabelą 1
SondySigma-AldrichNa żądaniePostępuj zgodnie z tabelą 1
Sprzęt
Nanodrop™ Jeden spektrofotometrThermo-ScientificND-ONE-W
Mikrowirówka z chłodzeniem Sigma 1-14K, odpowiednia do wirowania probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy prędkości 14 000 obr./minSigma-Aldrich1-14K
Pipety regulowane dezynfekowane, zakres 2-20 i mikro; l, 20-200 i mikro; lGilsonSKU:F167360
Jednorazowe probówki do mikrowirówek 1,5 ml (autoklawowane)AxygenMCT-150-SP
Jednorazowe 600 &mikro; l probówki do mikrowirówek (autoklawowane)Axygen3208
Jednorazowe końcówki do pipet 1-10 i mikro; lAxygenT-300
1-200 i mikro; lAparat AxygenTR-222-Y
Dot-Blot Bio-DotBIORAD1706545
Przenośny ssący HergomHergom7E-A
(światło widzialne PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Ekspresowy termocyklerHybaid
Kaseta radiograficzna z płytą IP14 X 17Fuji
membrany 11417240001 Jednorazowe końcówki do pipet Naukowa kaseta oświetleniowa HBPX110

Bibliografia

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898(2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843(2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051(2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721(2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816(2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241(2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28(2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996(2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607(2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317(2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356(2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250(2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNAmembrana nylonowahybrydyzacja sondyprzeciwcia o anty digoksigeninowenadz r nad chorobamirodowiskowe DNA
Reakcja łańcuchowa polimerazy i hybrydyzacja kropkowa do wykrywania Leptospira w próbkach wody
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.