Method Article

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

DOI:

10.3791/65442

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, University of Kent

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten innowacyjny system, wykorzystujący krótki znacznik peptydowy, który eksportuje wiele rekombinowanych białek w pęcherzykach błonowych z E. coli, zapewnia skuteczne rozwiązanie szeregu problemów związanych z ekspresją bakteryjnych białek rekombinowanych. Te rekombinowane pęcherzyki dzielą białka na przedziały w mikrośrodowisku, które ułatwia produkcję białek bakterii, które w przeciwnym razie stanowiłyby wyzwanie, toksyny, nierozpuszczalne lub zawierające wiązania dwusiarczkowe. Wydajność białka jest znacznie zwiększona w porównaniu z typową ekspresją bakteryjną przy braku znacznika peptydowego zarodkującego pęcherzyki. Uwalnianie białek upakowanych w pęcherzyki wspomaga izolację od pożywki hodowlanej i umożliwia długotrwałe przechowywanie aktywnych białek. Technologia ta pozwala na zwiększenie wydajności funkcjonalnych białek upakowanych w pęcherzyki, co upraszcza dalsze przetwarzanie w szerokim zakresie zastosowań, od biotechnologii stosowanej po odkrycia naukowe i medycynę. W niniejszym artykule i powiązanym z nim filmie przedstawiono szczegółowy protokół metody, który podkreśla kluczowe kroki w metodologii mającej na celu maksymalizację produkcji pęcherzyków wypełnionych rekombinowanym białkiem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gram-ujemne bakterie E. coli to atrakcyjny system do produkcji białek rekombinowanych zarówno na skalę przemysłową, jak i akademicką. Jest to nie tylko opłacalne i proste do hodowli w partiach do dużych gęstości, ale stworzono szerokie spektrum odczynników, szczepów, narzędzi i promotorów, aby promować wytwarzanie funkcjonalnych białek w E. coli1. Ponadto techniki biologii syntetycznej pokonują obecnie przeszkody zwykle związane z zastosowaniem modyfikacji potranslacyjnych i fałdowaniem złożonych białek2. Możliwość ukierunkowania wydzielania rekombinowanych białek na pożywki hodowlane jest atrakcyjna dla poprawy wydajności i obniżenia kosztów produkcji. Kontrolowane pakowanie zdefiniowanych przez użytkownika białek do pęcherzyków błonowych pomaga w rozwoju produktów i technologii w przemyśle biotechnologicznym i medycznym. Do tej pory brakowało powszechnie stosowanych metod wydzielania rekombinowanych białek z E. coli 3.

Eastwood i in. opracowali ostatnio metodę opartą na znakowaniu peptydów do produkcji i izolowania rekombinowanych pęcherzyków zawierających białka od E. coli1. Ten peptyd zarodkujący pęcherzyki (VNp) umożliwia wytwarzanie zewnątrzkomórkowych pęcherzyków błony bakteryjnej, do których można skierować wybrane białko rekombinowane, aby uprościć oczyszczanie i przechowywanie białka docelowego, i pozwala na znacznie wyższą wydajność niż zwykle dopuszcza się w przypadku kultur kolb wstrząsających. Odnotowano plony bliskie 3 g rekombinowanego białka na litr kultury kolbowej, przy czym wydajność >100 razy wyższa niż w przypadku równoważnych białek pozbawionych znacznika VNp. Te rekombinowane pęcherzyki wzbogacone w białko mogą być szybko oczyszczone i zagęszczone z pożywki hodowlanej i zapewniają stabilne środowisko do przechowywania. Technologia ta stanowi duży przełom w produkcji rekombinowanych białek E. coli. Pęcherzyki dzielą toksyczne i zawierające wiązania dwusiarczkowe białka w rozpuszczalną i funkcjonalną formę oraz wspierają proste, wydajne i szybkie oczyszczanie funkcjonalnych białek upakowanych w pęcherzyki do długotrwałego przechowywania lub bezpośredniego przetwarzania1.

Główne zalety tej technologii w porównaniu z obecnymi technikami to: (1) możliwość zastosowania do różnych rozmiarów (od 1 kDa do >100 kDa) i typów białek; (2) ułatwianie tworzenia między- i wewnątrzbiałkowych wiązań dwusiarczkowych; (3) ma zastosowanie do kompleksów wielobiałkowych; (4) może być stosowany z różnymi promotorami i standardowymi laboratoryjnymi szczepami >E. coli; (5) wytwarzanie plonów białek z kolb do wytrząsania, zwykle obserwowane tylko w przypadku kultur fermentacyjnych; Białka są eksportowane i pakowane w pęcherzyki połączone błoną, które (6) zapewniają stabilne środowisko do przechowywania aktywnego rozpuszczalnego białka; oraz (7) upraszcza dalsze przetwarzanie i oczyszczanie białek. To proste i ekonomiczne narzędzie do rekombinacji białek prawdopodobnie będzie miało pozytywny wpływ na przemysł biotechnologiczny i medyczny, a także na odkrycia naukowe.

Tutaj szczegółowy protokół, rozwijany przez kilka lat, opisuje optymalne warunki do produkcji rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem z bakterii za pomocą technologii VNp. Pokazano przykładowe obrazy tego systemu w praktyce, z ekspresją białka fluorescencyjnego, co pozwala na wizualizację obecności pęcherzyków na różnych etapach produkcji, oczyszczania i zagęszczania. Na koniec przedstawiono wytyczne dotyczące wykorzystania obrazowania żywych komórek do walidacji wytwarzania pęcherzyków zawierających fuzję VNp z bakterii.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace bakteryjne prowadzone zgodnie z lokalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, dostosowanymi do konkretnego poziomu zagrożenia bezpieczeństwa biologicznego każdego szczepu.

1. Wybór różnych VNps

  1. Zidentyfikuj sekwencje VNp.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zidentyfikowano trzy sekwencje VNp1, które skutkują maksymalną wydajnością i eksportem pęcherzykowym badanych do tej pory białek: VNp2, VNp6 i VNp15. Obecnie nie jest jasne, dlaczego niektóre warianty VNp działają wydajniej z niektórymi białkami niż inne; dlatego zaleca się, aby generowane były fuzje między nowym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania z każdym wariantem VNp (tj. VNp2, 6 lub 15).
    VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
    AGKTKEGVL
    VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA
    AEKTKEGVM
    VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
    Plazmidy, które umożliwiają ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania z różnymi fuzjami aminokońcowymi VNp, zostały udostępnione na rynku (patrz tabela materiałów).
  2. Zaprojektuj strategię klonowania w celu wstawienia interesującego genu na końcu 3' cDNA kodującego VNp w jednym z tych konstruktów lub zaadaptuj istniejący plazmid, integrując zsyntetyzowany cDNA VNp przed pierwszym kodonem ATG genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania. Użyj metod opisanych w1.
  3. W przypadku białek toksycznych należy użyć wektora z represyjnym promotorem ekspresji lub promotora z minimalnym nieindukowanym szumem ekspresji.
  4. Sklonuj znacznik sekwencji VNp na końcu aminowym białka fuzyjnego. Upewnij się, że znaczniki powinowactwa, sekwencje rozszczepienia proteazy itp. oraz białko będące przedmiotem zainteresowania znajdują się po stronie karboksylowej znacznika VNp. Zaleca się oddzielenie VNp od dalszego peptydu za pomocą elastycznego regionu łącznikowego, takiego jak dwa lub trzy powtórzenia sekwencji polipeptydowej -G-G-S-G- (Rysunek 1).
    UWAGA: Używaj plazmidów z doborem antybiotyków, które nie są ukierunkowane na peptydoglikan, który osłabia powierzchnię komórki i zmniejsza wydajność pęcherzyków. Kanamycyna i chloramfenikol (patrz tabela materiałów) były preferowanymi antybiotykami stosowanymi w tym badaniu.

2. Hodowla komórek bakteryjnych i indukcja białek

UWAGA: Szczepy bakterii zazwyczaj używane w tym protokole to Escherichia coli BL21 (DE3) lub W3110. Komórki E. coli są hodowane w bulionie lizogenicznym (LB) (10 g/l tryptonu; 10 g/l NaCl; 5 g/l ekstraktu drożdżowego) lub wspaniałym bulionie (TB) (12 g/l tryptonu; 24 g/l ekstraktu drożdżowego; 4 mL/L 10% glicerolu; 17 mM KH2PO4; 72 mM K2HPO4, sole autoklawowane oddzielnie) (patrz tabela materiałów). Przykładowe obrazy przedstawiające każdy etap indukcji białka oraz następujący po nim proces izolacji i oczyszczania są pokazane na Rysunek 2.

  1. Wyhodować 5 ml LB starterów ze świeżych przemian bakteryjnych w temperaturze 37 °C do nasycenia i użyć ich do zaszczepienia 25 ml gruźlicy w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml, przy odpowiednim doborze antybiotyków.
  2. Stosunek powierzchni do objętości jest ważnym czynnikiem w optymalizacji tego systemu. Użyć kolby o jak największej objętości (np. kolby o pojemności 5 litrów zawierającej 1 l kultury; w przypadku przebiegów optymalizacyjnych należy użyć 25 ml pożywki w kolbie o pojemności 500 ml).
  3. Inkubować większe kultury kolb wytrząsających w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min (≥25 mm rzutu orbitalnego), aż do osiągnięcia wartości gęstości optycznej 600 nm (OD600) wynoszącej 0,8–1,0.
    UWAGA: Pęcherzyki są optymalne, gdy komórki rosną w temperaturze 37 °C. Jednak niektóre białka rekombinowane wymagają ekspresji w niższych temperaturach. W takim przypadku w przypadku białka będącego przedmiotem zainteresowania należy użyć znacznika VNp6, ponieważ umożliwia to wysokowydajny eksport pęcherzyków w temperaturach do 25 °C.
  4. Aby indukować ekspresję białka rekombinowanego z promotora T7, dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia do 20 μg/ml (84 μM) (patrz tabela materiałów). Indukcja ekspresji białka rekombinowanego musi nastąpić w późnej fazie logarytmicznej (tj. typowy OD600 0,8-1,0) w celu wytworzenia pęcherzyków.
    UWAGA: Długość okresu indukcji może się różnić w zależności od białka, przy czym niektóre osiągają maksymalną produkcję po 4 godzinach, a inne przez noc (18 godzin). Do tej pory maksymalny eksport pęcherzyków uzyskiwano w kulturach nocnych.

3. Izolacja pęcherzyków rekombinowanych

  1. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g (4 °C) przez 20 minut.
  2. Aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania, przepuść oczyszczoną pożywkę hodowlaną przez sterylny i wolny od detergentów filtr polieterosulfonowy (PES) 0,45 μm (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W celu zbadania wykluczenia żywych komórek z filtratu zawierającego pęcherzyki, należy umieścić płytkę na agarze LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Aby zagęścić pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr 0,1 μm mieszanych estrów celulozy (MCE) (patrz tabela materiałów).
  4. Delikatnie umyj membranę 0,5-1 ml sterylnego PBS za pomocą skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieść do świeżej probówki do mikrofuge.
    UWAGA: Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w sterylnym podłożu lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C. Istnieją przykłady rekombinowanych białek przechowywanych w tych pęcherzykach przez 6 miesięcy, w ten sposób bez utraty aktywności enzymatycznej.

4. Uwalnianie rozpuszczalnego białka z izolowanych pęcherzyków

  1. Po wyizolowaniu pęcherzyków zawierających białko w sterylnym pożywce/buforze, należy poddać pęcherzykowe błony lipidowe sonikacji, stosując odpowiedni harmonogram dla aparatu (np. 6 x 20 s cykli włączania i wyłączania) i wirować przy 39 000 x g (4 °C) przez 20 minut w celu usunięcia resztek pęcherzyków.
    UWAGA: Szok osmotyczny lub detergent mogą być stosowane jako alternatywa dla rozbijania pęcherzyków, ale należy wziąć pod uwagę wpływ na funkcjonalność białek i/lub dalsze zastosowanie.
  2. Jeśli fuzja VNp pozostaje cytozolowa i nie uwalnia się do pożywki, wyizoluj białko przy użyciu standardowych protokołów (np. ponownie zawieś osady komórkowe w 5 ml odpowiedniego buforu ekstrakcyjnego (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonikatuj i usuń resztki komórek przez odwirowanie).

5. Oznaczanie stężenia białka

  1. Określ stężenie białek za pomocą analizy densytometrii żelowej próbek potrójnych1. Stosować razem z wzorcami ładowania albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na żelach do elektroforezy w żelu do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) barwionym coomassie. Zeskanuj i przeanalizuj żele za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Obraz J; patrz Tabela materiałów).

6. Wizualizacja powstawania pęcherzyków i izolowanych pęcherzyków za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Jeśli komórki zawierają fluorescencyjnie znakowane markery fuzji VNp lub błony, obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do śledzenia tworzenia pęcherzyków. Alternatywnie, fluorescencyjne barwniki lipidowe mogą być używane do wizualizacji pęcherzyków w celu potwierdzenia produkcji i oczyszczania.

  1. Montaż ogniwa
    1. Wywołać ekspresję fuzji VNp przez kilka godzin przed zamontowaniem na szkiełku nakrywkowym.
    2. Metoda z podkładką agarozową (Rysunek 3A-C): odpipetować komórki na cienką (<1 mm), okrągłą podkładkę LB-agarozową (2%), którą pozostawiono do uformowania i ustawić na czystym szkiełku podstawowym. Pozwól, aby komórki osiadły i wyrównały się, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 mm na podkładce i komórkach. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej.
    3. Metoda polietylenoiminy (PEI) (Rysunek 3D-F): rozprowadzić 20 μl 0,05% PEI (w dH2O) na szkiełku nakrywkowym za pomocą końcówki pipety i pozostawić na 3-5 minut, aby związały się ze szkłem bez pozostawienia do wyschnięcia. Dodaj 50 μl hodowli komórkowej i pozostaw na 5-10 minut, aby upewnić się, że bakterie powiązały się z powierzchnią pokrytą PEI4. Umyj szkiełko nakrywkowe 100 μl podłoża przed umieszczeniem go na szkiełku podstawowym i przytrzymaj je za pomocą przekładek i taśmy klejącej.
  2. Montaż pęcherzyków
    1. Oczyszczone pęcherzyki odpipetować na cienką (<1 mm), okrągłą wacik LB-agarozy (2%), który pozostawiono do uformowania i umieścić na czystym szkiełku podstawowym. Po wyschnięciu płynu umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm x 25 mm na waciku i pęcherzykach. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe na miejscu za pomocą przekładek i taśmy klejącej.
    2. Fluorescencyjny barwnik lipidowy FM4-64 jest w stanie zabarwić błony5, a zatem może być używany do wizualizacji pęcherzyków. Dodać FM4-64 (patrz tabela materiałów) do oczyszczonych pęcherzyków w końcowym stężeniu 2 μM (z 2 mM zapasu rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku [DMSO]) i wytworzyć obraz po 10 minutach inkubacji. Jest to szczególnie przydatne do identyfikacji pęcherzyków zawierających ładunki nieznakowane fluorescencyjnie5.
    3. Przepłukać szkiełka nakrywkowe tym samym podłożem, które użyto do hodowli obserwowanych komórek.
      UWAGA: Niektóre złożone media (np. TB) mogą wykazywać autofluorescencję, co może skutkować nadmiarem sygnału tła.
  3. Obrazowanie pęcherzyków
    UWAGA: Przykładowe obrazy mikroskopowe pęcherzyków rekombinowanych VNp można zobaczyć na Rysunek 4.
    1. Zamontuj szkiełko na odwróconym mikroskopie (patrz tabela materiałów) za pomocą obiektywu zanurzeniowego w oleju i pozostaw na 2-3 minuty, aby próbka mogła się ustabilizować, a temperatura się zrównoważyła.
      UWAGA: Wszystkie obrazowania żywych komórek dla każdej próbki muszą zostać zakończone w ciągu 30 minut od zamontowania komórek na szkiełkach nakrywkowych, aby zminimalizować wpływ fototoksyczności i stresu beztlenowego. Z tego powodu obrazy jednopłaszczyznowe są preferowane zamiast stosów z.
    2. Używaj odpowiednich źródeł światła (np. diody elektroluminescencyjnej [LED] lub żarówki halogenowej; patrz Tabela materiałów) i kombinacji filtrów dla używanego białka (białek) fluorescencyjnego / barwnika (barwników)6.
    3. Użyj soczewki o dużym powiększeniu (tj. 100x lub 150x) i dużej aperturze numerycznej (tj. NA ≥1.4) do obrazowania komórek i pęcherzyków drobnoustrojów.
    4. Określ minimalne natężenie światła wymagane do wizualizacji sygnałów fluorescencyjnych z komórek i / lub pęcherzyków. Może to wymagać pewnej regulacji ustawień ekspozycji i wzmocnienia dla używanego aparatu.
      UWAGA: Typowe czasy naświetlania z obecnych kamer z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (CMOS) wahają się od 50 do 200 ms w zależności od systemu obrazowania.
    5. W przypadku obrazów z pojedynczą klatką należy użyć uśredniania trzech obrazów, aby zredukować losowy szum tła zależny od sprzętu.
    6. W przypadku zdjęć poklatkowych należy odczekać 3-5 minut między poszczególnymi klatkami.
      UWAGA: W zależności od konfiguracji mikroskopu, podczas dłuższych eksperymentów poklatkowych może być konieczna okresowa regulacja ostrości.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BL21 DE3 E. coli zawierające konstrukt ekspresji VNp6-mNeongreen zostały wyhodowane do późnej fazy logarytmicznej (Rysunek 2A). Ekspresję VNp6-mNeongreen indukowano przez dodanie IPTG do kultury (20 μg/ml lub 84 μM stężenie końcowe), którą następnie pozostawiono do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C z energicznym wytrząsaniem (200 obr./min, ≥25 mm rzut orbitalny). Następnego ranka hodowla wykazała fluorescencję mNeongreen7 (Figura 2B), która pozostała widoczna w pożywce po usunięciu komórek bakteryjnych przez odwirowanie (Figura 2C). Obecność VNp-mNeongreen w pożywce hodowlanej i oczyszczonej została potwierdzona przez SDS-PAGE (Rysunek 2D). Pęcherzyki zawierające mNeongreen wyizolowano na filtrze MCE 0,1 μm ( Figura 2E) i ponownie zawieszona w PBS ( Figura 2F). Oczyszczone pęcherzyki zostały następnie umieszczone na podkładce agarozowej (Ryc. 3A-C) i zobrazowane za pomocą szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej (Figura 4A). Obecność błon pęcherzykowych potwierdzono przy użyciu lipofilowego barwnika fluorescencyjnego FM4-64 (Rysunek 4B). Komórki E. coli wykazujące ekspresję białka błony wewnętrznej CydB połączonego z mNeongreen (zielony) i VNp6-mCherry2 (magenta)8 pokazują produkcję pęcherzyków i wprowadzanie ładunku w żywych komórkach bakteryjnych (Rysunek 4C). Rysunek 4A,B został uchwycony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu, natomiast Rysunek 4C został uzyskany przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM), przy użyciu metod opisanych wcześniej9,10.

figure-results-1
Rysunek 1: Podsumowanie technologii VNp, od projektowania strategii klonowania do oczyszczania i przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. (A) Schemat typowego białka fuzyjnego VNp. VNp na końcu NH2, a następnie elastyczny łącznik i odpowiednia kombinacja znaczników powinowactwa i fluorescencji (Tag1, Tag 2, miejsce rozszczepienia proteazy [np. TEV]) i białka będącego przedmiotem zainteresowania. (B) Schemat ideowy podsumowujący protokół ekspresji i oczyszczania pęcherzyków błonowych wypełnionych rekombinowanym białkiem z E. coli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Etapy produkcji i oczyszczania pęcherzyków VNp6-mNg. Hodowle komórek E. coli zawierających ekspresję VNp-mNeongreen konstruują się w świetle niebieskim przed (A) lub po (B) indukowanej przez IPTG ekspresji białka fuzyjnego. Komórki z (B) usunięto przez odwirowanie, pozostawiając pęcherzyki wypełnione VNp-mNeongreen w pożywce (C). (D) Równoważne próbki z A, B i C analizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia coomassie. Pęcherzyki wyizolowano na filtrze 0,1 μm (E), a następnie wypłukano do odpowiedniej objętości buforu (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Procedura montażu komórek do obrazowania pęcherzyków i produkcji pęcherzyków. (A-C) Metoda podkładki agarozowej i (D-F) metoda PEI do mocowania komórek E. coli na szkiełku nakrywkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazy mikroskopowe rekombinowanych pęcherzyków VNp. Zielone (A) i czerwone (B) obrazy emisji z różnych pól pęcherzyków zawierających VNp6-mNeongreen oznaczone VNp6-mNeongreen zamontowane na podkładce agarozowej. (C) Obrazowanie komórek E. coli wykazujących ekspresję białka błony wewnętrznej CydB połączonego z mNeongreen (zielony) i VNp6-mCherry2 (magenta) pokazuje wytwarzanie pęcherzyków i wprowadzanie ładunku do żywych komórek bakteryjnych. (A,B) zostały zobrazowane za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego, podczas gdy (C) uzyskano za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM). Podziałka skali: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana powyżej metoda produkcji białek rekombinowanych znakowana peptydami aminokońcowymi jest prostym procesem, który konsekwentnie daje duże ilości białka, które można skutecznie wyizolować i/lub przechowywać przez miesiące.

Ważne jest, aby podkreślić kluczowe kroki w protokole, które są wymagane do optymalnego wykorzystania tego systemu. Po pierwsze, znacznikVNp 1 musi znajdować się na końcu N, a następnie białko będące przedmiotem zainteresowania i wszelkie odpowiednie znaczniki. Ważne jest również, aby unikać stosowania antybiotyków, które działają na warstwę peptydoglikanu, takich jak ampicylina.

Jeśli chodzi o warunki wzrostu, konieczne jest wzbogacenie pożywek (np. Pożywki LB lub TB) oraz wysoki stosunek powierzchni do objętości, aby zmaksymalizować produkcję pęcherzyków. Optymalna temperatura do produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wynosi 37 °C, ale należy również wziąć pod uwagę warunki zwykle wymagane do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku niższych temperatur indukcji należy użyć VNp6. Co najważniejsze, indukcja promotora T7 musi być osiągnięta przy użyciu nie więcej niż 20 μg/ml (84 μM) IPTG, gdy komórki osiągną OD600 0,8-1,0. Białka ulegające ekspresji za pomocą systemu osiągają maksymalną produkcję pęcherzyków po 4 godzinach lub po indukcji przez noc.

Pomimo prostoty tego protokołu, wymaga on optymalizacji. Fuzja wariantów VNp, temperatury ekspresji i okresy indukcji mogą się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto istnieje potrzeba optymalizacji oczyszczania, a następnie zagęszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywki. Obecna procedura nie jest skalowalna i może być czasochłonna. To są ograniczenia tej metodologii.

Technologia VNp ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami2. Pozwala na eksport pęcherzykowy różnych białek, przy czym maksymalny rozmiar z powodzeniem wyrażony do tej pory wynosi 175 kDa dla pęcherzyków, które pozostają wewnętrzne, i 85 kDa dla tych, które są eksportowane. Co więcej, technologia ta może znacznie zwiększyć wydajność rekombinowanych białek o różnych właściwościach fizycznych i aktywnościach. Wywożone pęcherzyki zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania mogą być wyizolowane przez prostą filtrację ze wstępnie oczyszczonej pożywki, a następnie mogą być przechowywane w sterylnej pożywce hodowlanej lub buforze w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.

Zastosowania tego systemu są różnorodne, od odkryć naukowych po biotechnologię stosowaną i medycynę (np. poprzez produkcję funkcjonalnych środków terapeutycznych)3. Łatwość produkcji, dalsze przetwarzanie i wysoka wydajność to atrakcyjne cechy w tych obszarach, a zwłaszcza w przemyśle.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują różnym użytkownikom Twittera, którzy zadawali pytania dotyczące protokołu przedstawionego w artykule opisującym technologię VNp. Rysunek 1A został wygenerowany przy użyciu ikon z flaticon.com. Prace te były wspierane przez University of Kent i finansowane przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/T008/768/1 i BB/S005544/1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinMelford69-52-3
ChloramfenikolAcros Organics (Thermofisher Scientific)56-75-7
E. coli BL21 (DE3)Lab StockN/A
E. coli DH10βLab StockN/A
Filtry do mikroskopuSondy
FM4-64(Invitrogen)T-3166Rozpuszczony w DMSO, stężenie zapasowe 2
mM ImageJOpen SourcePobrane z: https://imagej.net/ij/index.html
Mikroskop odwróconyOlympus
Isopropyl β- D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Melford367-93-1
Siarczan kanamycynyGibco (Thermofisher Scientific)11815-024
Źródło światła LED do mikopuCairn Research Ltd
Bulion lizogeniczny (LB) / LB agarLab StockN/A10 g/L Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Ekstrakt drożdżowy (1,5 g/L agar)
Oprogramowaniedo obrazowania metamorficznegoUrządzenia
MF-Millipore Filtr membranowy (0,1 i mikro; m, MCE)Filtr
Millipore Express PLUS (0,45 &mikro; m, PES)MerckHPWP04700
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Lab StockN/A
Plazmidy umożliwiające ekspresję interesującego białka z różnymi fuzjami aminokońcowymi VNp Addgenehttps://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/
Terrific Bulth (TB)Lab StockN/A12 g/L Trypton; 24 g/L Ekstrakt drożdżowy; 4 ml/L 10% glicerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4
molekularne Chroma molekularne membranowy Merck VCWP04700

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396(2023).">Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396(2023).
  2. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32(2011).">Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32(2011).
  3. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139(2019).">Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139(2019).
  4. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).">Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
  5. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).">Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
  6. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).">Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
  7. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).">Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  8. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257(2017).">Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257(2017).
  9. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183(2019).">Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183(2019).
  10. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).">Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein VesiclesE Coli ExpressionVesicle ProductionProtein ExportVesicle PurificationFluorescence MicroscopyStructured Illumination MicroscopyPeptide TaggingProtein StorageDownstream Processing

Related Articles