Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65452

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

W tym artykule

Podsumowanie

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Streszczenie

Złożona sieć mitochondrialna sprawia, że segmentacja, śledzenie i analizowanie żywych komórek jest bardzo trudne. Narzędzia MATLAB pozwalają na analizę mitochondriów w plikach timelapse, co znacznie upraszcza i przyspiesza proces przetwarzania obrazu. Niemniej jednak istniejące narzędzia generują dużą objętość wyjściową, wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej, a podstawowe konfiguracje eksperymentalne mają dane wyjściowe tysięcy plików, z których każdy wymaga obszernej i czasochłonnej obsługi.

Aby rozwiązać te problemy, opracowano rutynową optymalizację, zarówno w kodzie MATLAB, jak i w formie skryptów na żywo, co pozwoliło na szybką analizę plików i znacznie ograniczyło odczytywanie dokumentów i przetwarzanie danych. Dzięki prędkości 100 plików/min optymalizacja pozwala na ogólną szybką analizę. Optymalizacja osiąga wyniki poprzez uśrednianie danych specyficznych dla poszczególnych mitochondriów w różnych ramach czasowych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z danymi wyjściowymi z istniejących narzędzi. Obrazowanie konfokalne na żywo przeprowadzono przy użyciu estru metylowego barwnika tetrametylorodaminy, a rutynowa optymalizacja została potwierdzona poprzez leczenie komórek neuronalnych agonistami receptora kwasu retinowego (RAR), których wpływ na mitochondria neuronalne ustalono w literaturze. Wyniki były zgodne z literaturą i pozwoliły na dalszą charakterystykę zachowania sieci mitochondrialnej w odpowiedzi na modulację RAR specyficzną dla izoformy.

Ta nowa metodologia pozwoliła na szybką i zweryfikowaną charakterystykę sieci mitochondriów całego neuronu, ale pozwala również na różnicowanie mitochondriów aksonów i komórek ciała, co jest istotną cechą do zastosowania w dziedzinie neuronauki. Co więcej, protokół ten może być stosowany w eksperymentach z wykorzystaniem szybko działających metod leczenia, umożliwiając obrazowanie tych samych komórek przed i po zabiegach, wykraczając poza dziedzinę neuronauki.

Wprowadzenie

Komórkowe mitochondria znajdują się w centrum wszystkich stanów fizjologicznych, a dokładne zrozumienie ich homeostazy (mitotazy) i zachowania jest niezbędne do pomocy w identyfikacji leczenia farmakologicznego dla szerokiego zakresu chorób, w tym raka i choroby Alzheimera1,2.

Mitochondria odgrywają kluczową rolę komórkową w homeostazie energetycznej, wytwarzaniu ATP, buforowaniu wapnia i regulacji ROS, a mitostaza jest niezbędna do utrzymania homeostazy białek, ponieważ molekularne białka opiekuńcze są zależne od energii3. Wymagają one stałej i dynamicznej modulacji i adaptacji sieci, aby skutecznie zaspokajać potrzeby komórkowe, a transport mitochondriów jest regulowany przez różne szlaki sygnałowe; Poprzednie prace opisywały jeden z takich szlaków, receptory kwasu retinowego (RAR)4,5. Kwas retinowy (RA) wspomaga wzrost aksonów i neurytów poprzez aktywację RAR. W pierwotnych neuronach korowych myszy aktywacja RAR-β pobudza wzrost, szybkość i ruchliwość mitochondriów w klasie neurite6.

Biorąc pod uwagę zdolność adaptacyjną i dynamikę sieci mitochondrialnej, możliwość oceny mitotazy w "czasie rzeczywistym" jest niezbędna nie tylko do badania homeostazy energetycznej, ale także do ochrony proteostazy, zdrowia komórek, proliferacji czy sygnalizacji. Powszechnie stosowana metoda oceny mitostazy opiera się na mikroskopii konfokalnej po podświetleniu mitochondriów za pomocą barwnika fluorescencyjnego lub markera, a także na specyficznej konfiguracji mikroskopii umożliwiającej regulację temperatury i/lub CO2 7. Ten typ konfiguracji eksperymentalnej zakłada, że jednorazowo wykonywana jest jedna replika eksperymentalna. Oprócz eksperymentalnego powtarzania różnych zabiegów, należy wziąć pod uwagę, że większość eksperymentów powinna mieć swoje techniczne powtórzenia (gdzie więcej niż jedna pozycja jest obrazowana na płytce), z serią płaszczyzn ogniskowych (z-stacks) rejestrowanych w szeregu punktów czasowych. Tak więc, eksperymentalny projekt z trzema powtórzeniami jednej kontroli i dwoma zabiegami, z pięcioma pozycjami obrazowania na płytkę i 15 punktami czasowymi, daje 225 stosów do przetworzenia. Klasycznie, filmy z żywymi mitochondriami były analizowane za pomocą wykresów kymograficznych, które były indywidualnie analizowane8, w czasochłonnym procesie wymagającym obszernego ręcznego wprowadzania, nawet w przypadku polegania na narzędziach komputerowych.

Niedawno opisano algorytm9, który umożliwia automatyczną segmentację i śledzenie mitochondriów w plikach poklatkowych 2D i 3D z żywymi komórkami. Dostępne są inne techniki kwantyfikacji, ale wszystkie mają swoje ograniczenia10. Mitometer, zautomatyzowana aplikacja typu open source, jest szczególnie odpowiednia do analizy poklatkowej i dynamiki mitochondriów, wymagającej niewielkiego wkładu użytkownika. Aplikacja ta ma szereg zalet w porównaniu z innymi istniejącymi narzędziami opartymi na MATLAB, a mianowicie umożliwia automatyczne przetwarzanie poszczególnych stosów TIF przy użyciu do 13 różnych parametrów, co jest szczególnie interesujące dla neuronauki, ponieważ rozróżnia mitochondria okołojądrowe i telejądrowe.

Jednak dla eksperymentu takiego jak opisany powyżej, te 13 parametrów zastosowanych do 225 stosów daje w wyniku 2 925 indywidualnych plików wyjściowych. Wymagają one czterech indywidualnych wejść komputerowych, co daje w sumie ponad 10 000 ręcznych danych wejściowych wymaganych do pobrania wszystkich plików wyjściowych. W przypadku dużych projektów eksperymentalnych powoduje to niepotrzebną, niezwykle czasochłonną analizę każdego pliku i integrację danych. W niniejszym artykule przedstawiamy rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików, znacznie ograniczając odczyt dokumentów i przetwarzanie danych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z wynikami z istniejących narzędzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów: etapu laboratoryjnego, obejmującego hodowlę komórek oraz konfokalną mikroskopię żywych komórek w celu uzyskania obrazów żywych mitochondriów (Rycina 1) oraz an in silico kroki analizy uzyskanych obrazów (Rycina 2). Do zautomatyzowanej analizy danych z obrazowania 3D żywych mitochondriów wykorzystano aplikację MATLAB Mitometer udostępnioną przez Lefebvre i wsp.9Procedura optymalizacji została napisana w języku MATLAB. Oprogramowanie, jego zaktualizowane wersje oraz makra ImageJ do przetwarzania obrazu są bezpłatnie dostępne w internecie za pośrednictwem serwisu GitHub pod adresem https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB. 

1. Mikroskopia żywych komórek

Obrazowanie na żywo komórek SH-SY5Y; inkubacja z TMRM; analiza za pomocą Mitometer; automatyczna metoda segmentacji.
Rysunek 1: Protokół eksperymentalny. Komórki SH-SY5Y zostały zróżnicowane i poddane działaniu retinoidów. (A) Do obrazowania na żywo zdrowych mitochondriów w potraktowanych komórkach z użyciem mikroskopu konfokalnego wykorzystano TMRM, rejestrując z-stack w trybie time-lapse z pięciu pól widzenia. (B) Aplikacja Mitometer w środowisku MATLAB automatycznie segmentuje i analizuje obrazy mitochondriów. Oprócz analizy oprogramowanie to automatycznie rozróżnia mitochondria w zależności od bliskości jądra. Niebieskie kropki oznaczają początkowe pozycje mitochondriów; czerwone kropki oznaczają pozycje końcowe. Pasek skali = 30 µm. Skrót: TMRM = tetrametylorodamina, ester metylowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Inkubować komórki SH-SY5Y w 37 °C w uwilgotnionej atmosferze z dodatkiem 5% CO22 oraz 95% powietrza, hodowane w równej objętości pożywki MEM (Minimal Essential Medium) i pożywki F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Wysiać komórki SH-SY5Y w szalkach hodowlanych z szklanym dnem z gęstością 15 × 104 komórek/ml
    3. Diferencjuj komórki poprzez 5-dniową inkubację z 10 µM wszystko-trans kwas retinowy w pożywce hodowlanej zawierającej 1% FBS, a następnie 2-dniowa inkubacja z czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF) w stężeniu 10 ƞg/mL.
  2. Obróbka komórek
    1. Przemyć komórki sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanowo (PBS) i inkubować przez 72 h z 10-7 Agoniści izoform RAR w równych częściach pożywki MEM (Minimal Essential Medium) i pożywki F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionej o 1% FBS.
      UWAGA: Jako agonistę RARα zastosowano AM580; jako agonistę RARβ zastosowano CD2314; natomiast Ch55 wykorzystano jako agonistę oraz koagonistę RARα i β; wRA zastosowano jako kontrolę pozytywną, a BMS493 jako antagonistę RAR pan-antagonista.
  3. Obrazowanie konfokalne żywych komórek
    1. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą 1% FBS i 20 nM esteru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) na 45 min.
      UWAGA: TMRM jest przenikającym przez błony komórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, który jest sekwestrowany przez aktywne mitochondriach, a ten okres inkubacji pozwala na osiągnięcie stanu równowagi TMRM oraz jego pobranie przez spolaryzowane mitochondria11Obrazowanie należy rozpocząć przed osiągnięciem stanu równowagi, ponieważ intensywność sygnału TMRM może sztucznie wzrosnąć w trakcie obrazowania.
    2. Umieść komórki w inkubatorze podłączonym do konfokalnego mikroskopu skanującego laserowo w 37 °C.
    3. Obrazy należy zarejestrować przy użyciu obiektywu apochromatycznego z imersją olejową o powiększeniu 63x, przy rozmiarze obrazu wynoszącym 512 x 512 pikseli uzyskane za pomocą przysłona otworkowa z 1 jednostka Airy'ego, rejestrując szereg czasowy 15 klatek z pięciu różnych pól widzenia w każdej płytce komórkowej, oraz stos Z** z 8 równoodległe płaszczyzny zOtrzymany plik .lsm stanowi stos obrazów w czasie, pozycji i w osi z.
      UWAGA: Ustawienia wzmocnienia, kontrastu i jasności muszą zostać początkowo zoptymalizowane przy użyciu minimalnej mocy lasera niezbędnej do wykorzystania pełnego zakresu dynamicznego detektora i utrzymane na stałym poziomie przez cały czas trwania badania, aby zapewnić przeprowadzenie wszystkich obrazowań w tych samych warunkach. W tej kombinacji sprzętowo-programowej można zarejestrować do dziewięciu różnych pozycji, a mikroskop automatycznie przełącza się między pozycjami obrazowania.

2. Analiza obrazu

Przetwarzanie danych w MATLAB, potok analizy obrazu, schemat przebiegu eksperymentu, wyniki intensywności TMRM.
Rycina 2: Optymalizacja rutynowa. (A) Reprezentatywny kod optymalizacji rutynowej. (B) Live-Script optymalizacji rutynowej. (C) Schemat optymalizacji rutynowej. (D) Walidacja wyników optymalizacji rutynowej: reprezentatywny obraz mitochondriów w komórkach niepoddanych działaniu czynników (panel lewy), traktowanych atRA (10-7 M, 72 h, panel środkowy) oraz traktowanych antagonistą RAR BMS493 (10-7 M, 72 h, panel prawy), obrazowanych po inkubacji z TMRM (20 nM, inkubacja 45 min). Pasek skali = 30 µm. (E) Intensywność TMRM w mitochondriach ciała komórki. Istotny spadek po traktowaniu kwasem all-trans retinowym (atRA, 10-7 M, 72 h) w porównaniu z kontrolą (p=0,0062), niezaobserwowany po traktowaniu antagonistą RAR (BMS493, 10-7 M, 72 godziny). W każdej z trzech powtórek dla każdego stanu poddano kwantyfikacji pięć komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przetwarzanie obrazów
    1. Otwórz pliki w programie ImageJ 2.1.0 i rozdziel stosy pozycyjne według pól widzenia: Otwórz program ImageJ i kliknij Pasek menu | Obraz | Powiel | Wprowadź liczbę przekrojów/klatek | OK.
      UWAGA: Aby ograniczyć liczbę powtarzalnych operacji wprowadzanych do oprogramowania, opracowano makro ImageJ, które ułatwia duplikowanie i zapisywanie obrazów pola widzenia.
  2. Protokół główny
    1. Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki z narzędzie do zaznaczania dowolnego obszaru.
    2. Uruchom makro, otwierając program ImageJ i przechodząc do Pasek menu | Wtyczki | Makra | Uruchom makro Czyszczenie tła i zapisywanie obrazów.
      UWAGA: Obrazy w tym procesie mogą być randomizowane, a klucz odpowiedzi przechowywany zgodnie z wymogami optymalizacji.
    3. Wyznacz rozmiar piksela i głębokość woksela: Otwórz ImageJ | obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.
  3. Alternatywny protokół bezpośredni
    UWAGA: Ta alternatywna metoda nie wykorzystuje makr do przetwarzania obrazów
    1. Wyznacz rozmiar piksela i głębokość woksela: otwórz ImageJ | Otwórz obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.
    2. Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki z narzędzie do zaznaczania dowolnego obszaruaby upewnić się, że obejmuje ona całą komórkę przez wszystkie 15 klatek.
    3. Przejdź do Pasek menu | Edycja | Wyczyść obszar zewnętrzny.
    4. Przejdź do Pasek menu | Plik | Zapisz jako | Wybierz Tiff.
    5. Wybierz folder zapisu i kliknij Zapisz.
      UWAGA: Na tym etapie, przed przejściem do analizy, obrazy można poddać ślepemu badaniu lub randomizacji w sposób ręczny.
  4. Zautomatyzowana analiza obrazu
    1. Przygotuj foldery na pliki z analizą.
      1. Utwórz trzy główne foldery o nazwach „Wszystkie ślady”, „Ślady okojądrowe” i „Ślady telojądrowe”.
        UWAGA: Opcje te odpowiadają głównym opcjom ścieżki automatycznej.
      2. W każdym głównym folderze należy utworzyć podfolder dla każdego obrazu do przetworzenia, ponumerowane kolejno od 1 wzwyż.
      3. Dodaj kopię dwóch rutynowych plików uzupełniających do optymalizacji (mitometer2table.m oraz getTXTfiles.m) do każdego folderu z obrazami.
        UWAGA: Pliki te pomagają w analizie danych i końcowym formatowaniu układu. Liczba folderów musi odpowiadać liczbie elementów w zrandomizowanym arkuszu kalkulacyjnym (.xlsx). Po utworzeniu wszystkich ponumerowanych podfolderów z plikami uzupełniającymi dla jednego zestawu danych, można je skopiować i wkleić zbiorczo do pozostałych zestawów danych.
  5. Do analizy obrazów należy wykorzystać aplikację Mitometer w środowisku MATLAB.
    UWAGA: Protokół ten był uruchamiany w programie mitometer, zainstalowanym w środowisku MATLAB R2022a. W celu optymalizacji czasu pracy i zrównoważenia wyników należy wczytywać obrazy w partiach po 30 sztuk. Maksymalna wielkość pliku MAT jest ograniczona przez natywny system plików: domyślnie operacje „zapisz” mogą utworzyć plik < 231 bajty (~2 GB); zamiast tego można zastosować format zapisu MAT-Files Version 7.3, który umożliwia obsługę maksymalnych rozmiarów zmiennych przekraczających 2 GB.
    1. Identyfikacja/zmiana domyślnej wersji pliku MAT: Na Strona główna karta w Środowisko sekcja, kliknij Preferencje i wybierz MATLAB | Ogólne | Pliki MAT.
    2. Użyj narzędzia Mitometer w programie MATLAB, aby przeanalizować: otwórz program MATLAB i przejdź do Pasek menu | APLIKACJE | Otwórz Mitometer | Wybierz Start 3D | Wprowadź dane (Rozmiar piksela (µm): 0,1395089/Czas między klatkami (s): 2/Liczba płaszczyzn z: 8/Odległość osiowa między płaszczyznami z (µm): 0,418809 | Wybierz obrazy do wprowadzenia.
    3. Przejdź do menu bocznego Mitometer, wybierz Obraz, kliknij w Wybierz zaznaczoneprzejdź do mitometru Pasek menu | Wybierz ścieżki | Widoki ścieżek | wybierz Wszystkie ścieżki, telonuklearne lub perinuklearne | Pasek menu mitometer | Wybierz analizę | Wybierz element (t. j. Długość) | wybierz Zapisz do pliku „.txt”.
      UWAGA: Można jednocześnie pobrać więcej niż jeden parametr, jeśli zostaną one zaznaczone równocześnie.
    4. Wypakuj pliki z wynikami do utworzonych folderów (2.2.1).
  6. Rutynowa optymalizacja i analiza danych
    1. Przygotuj/dostosuj plik „Randomization.xlsx” zawierający klucz do kodowania obrazów.
      1. Wprowadź do kolumny A listę kolejnych liczb całkowitych, zaczynając od 1.
        UWAGA: Zaleca się przechowywanie kopii zapasowej folderu z obrazami o oryginalnych nazwach.
      2. W kolumnie B należy umieścić zmienne analityczne złożone z tzw. znaków alfanumerycznych.
        UWAGA: Liczba linii w dokumencie musi być zgodna z liczbą folderów znajdujących się w głównym zbiorze danych. Skopiuj i wklej ten plik „Randomization.xlsx” do dwóch pozostałych głównych zbiorów danych.
    2. Zoptymalizowana analiza danych
      1. Kliknij dwukrotnie plik „executable.mlx”, wprowadź liczbę folderów, określ katalog folderów (skopiuj ścieżkę z górnej części okna folderu) | katalog zapisu (skopiuj ścieżkę z górnej części okna folderu) | nazwę arkusza w pliku wyjściowym i kliknij Uruchom.
      2. Przeprowadzić analizę statystyczną w razie potrzeby.
        UWAGA: Można wybrać opcjonalne tworzenie pliku .xlsx w każdym folderze z danymi .txt oraz sygnał dźwiękowy po zakończeniu analizy. Live Script generuje jeden plik arkusza kalkulacyjnego w formacie tabeli. W tym pliku wyjściowym kolumny reprezentują analizowane parametry (np. „Długość osi głównej”; „Intensywność”), a linie reprezentują pola widzenia zmiennych analitycznych (np., „Kontrola”).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu usprawnienia i przyspieszenia analizy plików wynikowych w formacie .txt, zaprogramowano rutynową optymalizację, która odczytuje dane zgodne z plikami wyjściowymi Mitometer w formacie .txt, w których kolumny reprezentują klatkę, a wiersze zidentyfikowane mitochondria. Rutynowa optymalizacja generuje dane w formie pojedynczej wartości na parametr poprzez uśrednianie klatek dla każdego zidentyfikowanego mitochondrium, a następnie uśrednianie wyników wszystkich mitochondriów w obrębie pola widzenia. Opracowana procedu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie żywych komórek generuje duże pliki, które wymagają poważnego przetwarzania obliczeniowego, ale nawet najnowsze narzędzia wymagają obszernego ręcznego wprowadzania danych do przetworzenia. Ta rutynowa optymalizacja koncentruje się na uproszczeniu procesu analizy mitochondriów za pomocą mitometru, ponieważ narzędzie to zapewnia bardzo dobrą równowagę między danymi wejściowymi użytkownika a danymi wyjściowymi. Kompleksowe porównanie różnych narzędzi do analizy obrazu mitochondriów zostało już wcześniej przeanali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Akwizycja obrazu została przeprowadzona w obiekcie LiM iBiMED, węzła PPBI (Portugalska Platforma BioObrazowania): POCI-01-0145-FEDER-022122. Prace te były wspierane przez FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), grant dla DT z Fundação para a Ciência e Tecnologia Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), grant od ATG-The Gabba Alumni Association dla VP oraz Institute for Biomedicine-iBiMED, Uniwersytet w Aveiro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Surowica bydlęca płoduThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0Oprogramowanie GraphPad, La Jollabez
szynki s F12 Mieszanka składników odżywczychThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal Essential MediumThermo-Fisher31095
Nunc Naczynia ze szklanym dnemThermo-Fisher150680
Bufor fosforanowy roztwór soliThermo-Fisher28372
Kwas retinowySigma-Aldrich  Przekaźnik Chłodniczy R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aWyposażony w komorę do obrazowania żywych komórek i obiektyw 63x zanurzeniowy w oleju 

Bibliografia

  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  3. Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
  4. Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
  5. Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
  6. Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
  7. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
  8. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).
  9. Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
  10. Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).
  11. Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
  12. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  13. Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).
  14. Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie ywych kom reksie mitochondrialnaalgorytmy uczenia maszynowegosegmentacja obrazumikroskopia wysokiej rozdzielczo cikwantyfikacja mitochondri w
Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.