Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

DOI:

10.3791/65452

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożona sieć mitochondrialna sprawia, że segmentacja, śledzenie i analizowanie żywych komórek jest bardzo trudne. Narzędzia MATLAB pozwalają na analizę mitochondriów w plikach timelapse, co znacznie upraszcza i przyspiesza proces przetwarzania obrazu. Niemniej jednak istniejące narzędzia generują dużą objętość wyjściową, wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej, a podstawowe konfiguracje eksperymentalne mają dane wyjściowe tysięcy plików, z których każdy wymaga obszernej i czasochłonnej obsługi.

Aby rozwiązać te problemy, opracowano rutynową optymalizację, zarówno w kodzie MATLAB, jak i w formie skryptów na żywo, co pozwoliło na szybką analizę plików i znacznie ograniczyło odczytywanie dokumentów i przetwarzanie danych. Dzięki prędkości 100 plików/min optymalizacja pozwala na ogólną szybką analizę. Optymalizacja osiąga wyniki poprzez uśrednianie danych specyficznych dla poszczególnych mitochondriów w różnych ramach czasowych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z danymi wyjściowymi z istniejących narzędzi. Obrazowanie konfokalne na żywo przeprowadzono przy użyciu estru metylowego barwnika tetrametylorodaminy, a rutynowa optymalizacja została potwierdzona poprzez leczenie komórek neuronalnych agonistami receptora kwasu retinowego (RAR), których wpływ na mitochondria neuronalne ustalono w literaturze. Wyniki były zgodne z literaturą i pozwoliły na dalszą charakterystykę zachowania sieci mitochondrialnej w odpowiedzi na modulację RAR specyficzną dla izoformy.

Ta nowa metodologia pozwoliła na szybką i zweryfikowaną charakterystykę sieci mitochondriów całego neuronu, ale pozwala również na różnicowanie mitochondriów aksonów i komórek ciała, co jest istotną cechą do zastosowania w dziedzinie neuronauki. Co więcej, protokół ten może być stosowany w eksperymentach z wykorzystaniem szybko działających metod leczenia, umożliwiając obrazowanie tych samych komórek przed i po zabiegach, wykraczając poza dziedzinę neuronauki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórkowe mitochondria znajdują się w centrum wszystkich stanów fizjologicznych, a dokładne zrozumienie ich homeostazy (mitotazy) i zachowania jest niezbędne do pomocy w identyfikacji leczenia farmakologicznego dla szerokiego zakresu chorób, w tym raka i choroby Alzheimera1,2.

Mitochondria odgrywają kluczową rolę komórkową w homeostazie energetycznej, wytwarzaniu ATP, buforowaniu wapnia i regulacji ROS, a mitostaza jest niezbędna do utrzymania homeostazy białek, ponieważ molekularne białka opiekuńcze są zależne od energii3. Wymagają one stałej i dynamicznej modulacji i adaptacji sieci, aby skutecznie zaspokajać potrzeby komórkowe, a transport mitochondriów jest regulowany przez różne szlaki sygnałowe; Poprzednie prace opisywały jeden z takich szlaków, receptory kwasu retinowego (RAR)4,5. Kwas retinowy (RA) wspomaga wzrost aksonów i neurytów poprzez aktywację RAR. W pierwotnych neuronach korowych myszy aktywacja RAR-β pobudza wzrost, szybkość i ruchliwość mitochondriów w klasie neurite6.

Biorąc pod uwagę zdolność adaptacyjną i dynamikę sieci mitochondrialnej, możliwość oceny mitotazy w "czasie rzeczywistym" jest niezbędna nie tylko do badania homeostazy energetycznej, ale także do ochrony proteostazy, zdrowia komórek, proliferacji czy sygnalizacji. Powszechnie stosowana metoda oceny mitostazy opiera się na mikroskopii konfokalnej po podświetleniu mitochondriów za pomocą barwnika fluorescencyjnego lub markera, a także na specyficznej konfiguracji mikroskopii umożliwiającej regulację temperatury i/lub CO2 7. Ten typ konfiguracji eksperymentalnej zakłada, że jednorazowo wykonywana jest jedna replika eksperymentalna. Oprócz eksperymentalnego powtarzania różnych zabiegów, należy wziąć pod uwagę, że większość eksperymentów powinna mieć swoje techniczne powtórzenia (gdzie więcej niż jedna pozycja jest obrazowana na płytce), z serią płaszczyzn ogniskowych (z-stacks) rejestrowanych w szeregu punktów czasowych. Tak więc, eksperymentalny projekt z trzema powtórzeniami jednej kontroli i dwoma zabiegami, z pięcioma pozycjami obrazowania na płytkę i 15 punktami czasowymi, daje 225 stosów do przetworzenia. Klasycznie, filmy z żywymi mitochondriami były analizowane za pomocą wykresów kymograficznych, które były indywidualnie analizowane8, w czasochłonnym procesie wymagającym obszernego ręcznego wprowadzania, nawet w przypadku polegania na narzędziach komputerowych.

Niedawno opisano algorytm9, który umożliwia automatyczną segmentację i śledzenie mitochondriów w plikach poklatkowych 2D i 3D z żywymi komórkami. Dostępne są inne techniki kwantyfikacji, ale wszystkie mają swoje ograniczenia10. Mitometer, zautomatyzowana aplikacja typu open source, jest szczególnie odpowiednia do analizy poklatkowej i dynamiki mitochondriów, wymagającej niewielkiego wkładu użytkownika. Aplikacja ta ma szereg zalet w porównaniu z innymi istniejącymi narzędziami opartymi na MATLAB, a mianowicie umożliwia automatyczne przetwarzanie poszczególnych stosów TIF przy użyciu do 13 różnych parametrów, co jest szczególnie interesujące dla neuronauki, ponieważ rozróżnia mitochondria okołojądrowe i telejądrowe.

Jednak dla eksperymentu takiego jak opisany powyżej, te 13 parametrów zastosowanych do 225 stosów daje w wyniku 2 925 indywidualnych plików wyjściowych. Wymagają one czterech indywidualnych wejść komputerowych, co daje w sumie ponad 10 000 ręcznych danych wejściowych wymaganych do pobrania wszystkich plików wyjściowych. W przypadku dużych projektów eksperymentalnych powoduje to niepotrzebną, niezwykle czasochłonną analizę każdego pliku i integrację danych. W niniejszym artykule przedstawiamy rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików, znacznie ograniczając odczyt dokumentów i przetwarzanie danych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z wynikami z istniejących narzędzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół składa się z dwóch głównych etapów: mokrego laboratorium, obejmującego hodowlę komórkową i żywą mikroskopię konfokalną w celu uzyskania obrazów żywych mitochondriów (Rysunek 1) oraz krok in silico do analizy uzyskanych obrazów (Rysunek 2). Do automatycznej analizy danych mitochondriów obrazowanych na żywo w 3D użyto aplikacji MATLAB Mitometer, dostarczonej przez Lefebvre et al.9. Optymalizacja rutyny jest napisana w MATLAB. Oprogramowanie, zaktualizowane wersje i makra ImageJ są dostępne bezpłatnie online za pośrednictwem GitHub, pod adresem https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.

1. Mikroskopia na żywo

figure-protocol-1
Rysunek 1: Protokół eksperymentalny. Komórki SH-SY5Y różnicowano i traktowano retinoidami. (A) TMRM wykorzystano do obrazowania na żywo zdrowych mitochondriów w leczonych komórkach za pomocą mikroskopu konfokalnego, rejestrując poklatkowy stos z pięciu pól widzenia. (B) Aplikacja mitometru MATLAB automatycznie segmentuje i analizuje obrazy mitochondriów. Oprócz analizy, to oprogramowanie automatycznie rozróżnia mitochondria ze względu na bliskość jądra. Niebieskie kropki to mitochondrialne pozycje początkowe; Czerwone kropki to pozycje końcowe. Podziałka = 30 μm. Skrót: TMRM = tetrametylorodamina, ester metylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Inkubować komórki SH-SY5Y w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się z 5% CO2 i 95% powietrza, hodowanych w równych częściach pożywki MEM (Minimal Essential Balance) i F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    2. Płytki komórek SH-SY5Y w naczyniach ze szklanym dnem o gęstości 15 × 104 komórek/ml.
    3. Różnicowanie komórek po 5 dniach leczenia 10 μM kwasem all-trans-retinowym w 1% pożywce hodowlanej zawierającej FBS, a następnie 2 dni leczenia czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF) o stężeniu 10 ƞg / mL.
  2. Leczenie komórkowe
    1. Umyj komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i traktuj przez 72 godziny 10-7 M agonistami izoformy RAR, w równych częściach pożywki MEM (Minimal Essential Media) i F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionych 1% FBS.
      UWAGA: Zastosowanym agonistą RARα był AM580; Stosowanym agonistą RARβ był CD2314; Ch55 był stosowany jako agonista jako RARα i β koagonista; przyRZS stosowano jako kontrolę pozytywną; BMS493 był używany jako pan-antagonista RAR.
  3. Obrazowanie konfokalne na żywo
    1. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżą 1% pożywką zawierającą FBS estrem metylowym (TMRM) o zawartości 20 nM tetrametylorodaminy (TMRM) przez 45 min.
      UWAGA: TMRM jest barwnikiem fluorescencyjnym przenikającym komórkę, sekwestrowanym przez aktywne mitochondria, a ten okres inkubacji pozwala TMRM osiągnąć równowagę i zostać wchłoniętym przez spolaryzowane mitochondria11. Obrazowanie należy rozpocząć przed ustaleniem równowagi, ponieważ intensywność sygnału TMRM może sztucznie wzrosnąć podczas obrazowania.
    2. Umieścić komórki w inkubatorze podłączonym do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego w temperaturze 37 °C.
    3. Rejestruj obrazy za pomocą apochromatycznego obiektywu olejowego z 63-krotnym zanurzeniem w oleju, o rozmiarze obrazu 512 x 512 pikseli uzyskanym z aperturą otworkową 1 przewiewnej jednostki, rejestrując serię czasową 15 klatek z pięciu różnych pól widzenia w każdej płytce komórkowej i stosie z 8 równoodległych płaszczyzn z. Wynikowy plik .lsm to stos czasu, pozycji i z.
      UWAGA: Ustawienia wzmocnienia, kontrastu i jasności muszą być początkowo zoptymalizowane przy użyciu minimalnej mocy lasera niezbędnej do wykorzystania całego zakresu dynamiki detektora i utrzymywane na stałym poziomie przez cały czas trwania badania, zapewniając, że wszystkie obrazowania są wykonywane w tych samych warunkach. W tej kombinacji sprzętowo-programowej można zarejestrować do dziewięciu różnych pozycji, a mikroskop automatycznie przełącza się między pozycjami obrazowania.

2. Analiza obrazu

figure-protocol-2
Rysunek 2: Optymalizacja procedur. (A) Reprezentatywny kod optymalizacji procedury. (B) Rutynowa optymalizacja Live-Script. (C) Rutynowy przepływ pracy optymalizacyjny. (D) Rutynowa walidacja wyników optymalizacji: reprezentatywny obraz mitochondriów w komórkach nieleczonych (lewy panel), traktowanych wRA (10-7 M, 72 h, panel środkowy) i leczonych antagonistą RAR BMS493 (10-7 M, 72 h, prawy panel), zobrazowany po inkubacji TMRM (20 nM, 45 min inkubacji). Pasek skali = 30 μm. (E) Intensywność TMRM w mitochondriach ciała komórkowego. Istotne zmniejszenie po leczeniu kwasem all-trans retinoes (wRZS, 10-7 M, 72 h) w porównaniu z kontrolą (p = 0,0062), nie obserwowane w przypadku leczenia antagonistą RAR (BMS493, 10-7 M, 72 godziny). Pięć komórek określono ilościowo z każdego z trzech powtórzeń na warunek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przetwarzanie obrazu
    1. Otwórz pliki w ImageJ 2.1.0 i oddziel stosy pozycji według pola wizualnego: Otwórz ImageJ i kliknij Pasek menu | Obraz | Duplikat | Wprowadzanie wycinków/numeru klatki | OK.
      UWAGA: Aby zmniejszyć liczbę powtarzających się danych wejściowych do oprogramowania, opracowano makro ImageJ, które ułatwia powielanie i zapisywanie obrazów pola widzenia.
  2. Protokół makr
    1. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki za pomocą bezpłatnego narzędzia do zaznaczania.
    2. Uruchom makro, otwierając ImageJ i przechodząc do Pasek menu | Wtyczki | Makra | Uruchom Wyczyść tło i zapisz obrazy makro.
      UWAGA: W tym procesie obrazy mogą być losowo klasyfikowane, przechowując klucz rozwiązania zgodnie z wymaganiami optymalizacji.
    3. Określ rozmiar piksela i głębokość wokseli: Otwórz ImageJ | Obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.
  3. Alternatywny protokół bezpośredni
    UWAGA: Ta alternatywa nie używa makro do przetwarzania obrazów
    1. Znajdowanie rozmiaru piksela i głębokości woksela: Otwórz ImageJ | Otwórz Obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.
    2. Narysuj ROI wokół komórki za pomocą bezpłatnego narzędzia do zaznaczania, upewniając się, że obejmuje ono całą komórkę w 15 klatkach.
    3. Przejdź do paska menu | Edycja | Czysty na zewnątrz.
    4. Przejdź do paska menu | Plik | Zapisz jako | Wybierz opcję Tiff.
    5. Wybierz Zapisywanie folderu i kliknij Zapisz.
      UWAGA: Obrazy mogą być w tym momencie zaślepione/randomizowane ręcznie przed kontynuowaniem analizy.
  4. Zautomatyzowana analiza obrazu
    1. Przygotuj foldery dla plików analizy.
      1. Utwórz trzy główne foldery zatytułowane "Wszystkie ścieżki", "Ścieżki okołojądrowe" i "Ścieżki telenuklearne".
        UWAGA: Są one zgodne z głównymi opcjami automatycznego śledzenia.
      2. W każdym folderze głównym utwórz podfolder dla każdego obrazu do przetworzenia, identyfikowany numerycznie od 1 w górę.
      3. Dodaj kopię dwóch rutynowych plików uzupełniających optymalizacji (mitometer2table.m i getTXTfiles.m) do każdego folderu obrazów.
        UWAGA: Pliki te pomagają w analizie danych i ostatecznym ułożeniu formatu. Liczba folderów musi być zgodna z liczbą elementów w losowym arkuszu kalkulacyjnym (.xlsx). Po utworzeniu wszystkich ponumerowanych podfolderów z plikami uzupełniającymi dla jednego zestawu danych, można je skopiować wsadowo i wkleić do pozostałych zestawów danych.
  5. Użyj aplikacji MATLAB Mitometer do analizy obrazów.
    UWAGA: Ten protokół został uruchomiony na mitometrze, zainstalowanym na MATLAB R2022a. Ładuj obrazy w partiach po 30 sztuk, aby uzyskać optymalny czas pracy i równowagę wyjściową. Maksymalny rozmiar pliku MAT jest narzucany przez natywny system plików: domyślnie operacje "zapisu" mogą utworzyć plik < 231 bajtów (~2 GB); Zamiast tego można użyć formatu zapisu MAT-Files w wersji 7.3, ponieważ pozwala on na maksymalne zmienne rozmiary większe niż 2 GB.
    1. Zidentyfikuj/zmień domyślną wersję pliku MAT: Na karcie Narzędzia główne w sekcji Środowisko kliknij Preferencje i wybierz MATLAB | Ogólne | Pliki MAT.
    2. Użyj narzędzia MATLAB Mitometer do analizy: Otwórz MATLAB i przejdź do Pasek menu | APLIKACJE | Otwórz mitometr | Wybierz Start 3D | Dane wejściowe (Rozmiar piksela (μm): 0.1395089/Czas między klatkami (s): 2/Liczba płaszczyzn z: 8/Odległość osiowa między płaszczyznami Z (μm): 0.418809 | Wybierz obrazy do wprowadzenia.
    3. Przejdź do menu bocznego mitometru, wybierz Obraz, kliknij Wybierz podświetlony, przejdź do paska menu mitometru | Wybierz ścieżki | Widoki ścieżek | wybierz Wszystkie ścieżki, Telenuclear lub Perinuclear | Pasek menu mitometru | Wybierz punkt menu Analiza | Wybierz element (np. Długość) | wybierz Zapisz w ".txt".
      UWAGA: Można pobrać więcej niż jeden parametr jednocześnie, jeśli zostanie wybrany jednocześnie.
    4. Wyodrębnij pliki wynikowe do utworzonych folderów (2.2.1).
  6. Rutynowa optymalizacja i analiza danych
    1. Przygotuj/dostosuj plik "Randomization.xlsx" zawierający klucz do kodowania obrazu.
      1. Wstawić listę kolejnych liczb całkowitych, od 1 w górę, w kolumnie A.
        UWAGA: Zaleca się przechowywanie zduplikowanego folderu z oryginalnie nazwanymi obrazami.
      2. Umieść zmienne analityczne w kolumnie B składającej się ze znaków alfanumerycznych.
        UWAGA: Liczba wierszy w dokumencie musi być zgodna z liczbą folderów znajdujących się w głównym zestawie danych. Skopiuj i wklej ten plik "Randomization.xlsx" do pozostałych dwóch głównych zestawów danych.
    2. Zoptymalizowana analiza danych
      1. Kliknij dwukrotnie "executable.mlx", wprowadź liczbę folderów, określ katalog folderów (skopiuj katalog z góry folderu) | katalog zapisu (skopiuj katalog z góry folderu) | nazwę arkusza kalkulacyjnego w pliku wyjściowym i kliknij Uruchom.
      2. W razie potrzeby wykonaj analizę statystyczną.
        UWAGA: Można wybrać opcję opcjonalnego tworzenia pliku .xlsx w każdym folderze z danymi .txt i alertem dźwiękowym do zakończenia analizy. Live Script generuje pojedynczy plik arkusza kalkulacyjnego w formacie tabeli. W tych danych wyjściowych kolumny reprezentują analizowane parametry (np. "Długość osi głównej"; "Intensywność"), a linie reprezentują pola wizualne zmiennych analitycznych (np. "Kontrola").

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawić i przyspieszyć analizę plików wyjściowych w .txt formacie, zakodowano rutynową optymalizację, która odczytuje dane zgodne z Mitometer .txt plikach wyjściowych, z kolumnami reprezentującymi ramkę i liniami reprezentującymi zidentyfikowane mitochondria. Rutynowa optymalizacja generuje dane w jednej wartości dla każdego parametru, uśredniając klatki dla każdego zidentyfikowanego mitochondria, a następnie uśredniając wyniki wszystkich mitochondriów na pole widzenia. Opracowana procedura odczytuje pliki z folderó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek generuje duże pliki, które wymagają poważnego przetwarzania obliczeniowego, ale nawet najnowsze narzędzia wymagają obszernego ręcznego wprowadzania danych do przetworzenia. Ta rutynowa optymalizacja koncentruje się na uproszczeniu procesu analizy mitochondriów za pomocą mitometru, ponieważ narzędzie to zapewnia bardzo dobrą równowagę między danymi wejściowymi użytkownika a danymi wyjściowymi. Kompleksowe porównanie różnych narzędzi do analizy obrazu mitochondriów zostało już wcześniej przeanali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akwizycja obrazu została przeprowadzona w obiekcie LiM iBiMED, węzła PPBI (Portugalska Platforma BioObrazowania): POCI-01-0145-FEDER-022122. Prace te były wspierane przez FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), grant dla DT z Fundação para a Ciência e Tecnologia Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), grant od ATG-The Gabba Alumni Association dla VP oraz Institute for Biomedicine-iBiMED, Uniwersytet w Aveiro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Surowica bydlęca płoduThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0Oprogramowanie GraphPad, La Jollabez
szynki s F12 Mieszanka składników odżywczychThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal Essential MediumThermo-Fisher31095
Nunc Naczynia ze szklanym dnemThermo-Fisher150680
Bufor fosforanowy roztwór soliThermo-Fisher28372
Kwas retinowySigma-Aldrich  Przekaźnik Chłodniczy R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aWyposażony w komorę do obrazowania żywych komórek i obiektyw 63x zanurzeniowy w oleju 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  3. Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
  4. Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
  5. Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
  6. Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
  7. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
  8. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).
  9. Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
  10. Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).
  11. Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
  12. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  13. Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).
  14. Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie ywych kom reksie mitochondrialnaalgorytmy uczenia maszynowegosegmentacja obrazumikroskopia wysokiej rozdzielczo cikwantyfikacja mitochondri w

Powiązane artykuły