Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Określenie fenotypu metabolicznego komórek nerki pochodzących z biopsji

636 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje unikalną metodę prowadzenia profilowania metabolicznego komórek nerkowych pochodzących z biopsji. Zaprezentowane podejście zostało zoptymalizowane na zdrowych, dorosłych świniach płci męskiej i może usprawnić ocenę żywotności alloprzeszczepu nerki w czasie rzeczywistym. Metoda ta może również pomóc w odkryciu nowej biologii w wielu chorobach nerek opartych na metabolizmie.

Streszczenie

Przeszczep nerki jest optymalnym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności nerek; jednak przeszczepione nerki są często tracone przedwcześnie, z utratą do 50% przeszczepu po 10 latach od przeszczepu. Jedną z głównych przyczyn przedwczesnej utraty przeszczepu jest uraz odniesiony przez przeszczep w momencie przeszczepu, znany jako uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IRI). Opóźniona funkcja przeszczepu (DGF), definiowana jako konieczność dializy w pierwszym tygodniu po przeszczepie, jest objawem ciężkiego IRI, który wykazuje funkcjonalne i histologiczne cechy ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Chociaż mechanizmy napędzające AKI pozostają niejasne, coraz więcej dowodów sugeruje, że zmieniona funkcja metaboliczna w przeszczepie allogenicznym pośredniczy w AKI i może być przyczyną DGF. W związku z tym rozszyfrowanie i monitorowanie metabolicznych podstaw IRI poprawi naszą zdolność do diagnozowania i zapobiegania AKI. W artykule opisano unikalną metodę oceny oddychania mitochondrialnego (za pomocą szybkości zużycia tlenu), glikolizy (szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego) i wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w zawiesinach komórek nerki pochodzących z biopsji igłowej. Metodologia została zoptymalizowana na zdrowych dorosłych świniach płci męskiej i zwalidowana w modelu automatycznego przeszczepu świń. Przedstawione podejście może przyczynić się do poprawy oceny żywotności przeszczepu allogenicznego nerki w czasie rzeczywistym w warunkach klinicznych. Profilowanie metabolizmu w biopsjach pobranych od pacjentów może również odkryć nową biologię w innych chorobach nerek opartych na metabolizmie.

Wprowadzenie

Przeszczep nerki jest optymalnym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności nerek1,2,3,4; jednak przeszczepione nerki są często tracone przedwcześnie, z utratą do 50% przeszczepu po 10 latach od przeszczepu5. Pacjenci dotknięci chorobą mają zwiększoną zachorowalność i śmiertelność oraz stanowią poważne obciążenie ekonomiczne dla systemów opieki zdrowotnej6. Główną przyczyną przedwczesnej utraty przeszczepu jest uraz odniesiony przez przeszczep w momencie przeszczepu, znany jako uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IRI). IRI to nieunikniony uraz spowodowany zmniejszonym przepływem krwi, po którym następuje reperfuzja7. Niedokrwienie charakteryzuje się akumulacją bursztynianu tkankowego, który napędza odwrotny przepływ elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, prowadząc do produkcji ponadtlenków i późniejszego uszkodzenia wcześnie po reperfuzji8. IRI w przeszczepionych narządach zwiększa ryzyko pierwotnego braku funkcji, opóźnionej funkcji przeszczepu (DGF), odrzucenia i gorszych wyników przeszczepu8,9. DGF, zdefiniowany jako konieczność dializy w pierwszym tygodniu po przeszczepie9, jest przejawem ciężkiej IRI10. Histologicznie DGF związany z IRI objawia się ostrą martwicą kanalików (ATN) i uszkodzeniem mikrokrążenia. Funkcjonalnie występuje spadek współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) i wydalania moczu, cechy ostrego uszkodzenia nerek (AKI) w alloprzeszczepie11. Pomimo jego znaczenia, obecnie nie ma metod leczenia AKI związanej z niedokrwieniem i reperfuzją po przeszczepie. Brak metod leczenia wynika z niepełnego zrozumienia mechanizmów choroby i braku markerów do identyfikacji pacjentów o najwyższym ryzyku dysfunkcji przeszczepu w krytycznych punktach czasowych, w których uraz może być odwracalny12.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że zmieniony metabolizm energetyczny w allogenicznym przeszczepie pośredniczy w AKI i może stanowić podstawę DGF13,14,15. Komórki nerkowe wytwarzają energię za pomocą dwóch głównych mechanizmów: oddychania mitochondrialnego i glikolizy16. W IRI reperfuzja powoduje dysfunkcję mitochondriów17. W związku z tym glikoliza staje się głównym źródłem energii13,18,19,20. Przesunięcie metaboliczne w IRI sprzyja śmierci komórek śródbłonka kanalików i mikronaczyń, prowadząc do AKI21,22,23,24. W poprzedniej pracy ATN był związany ze zwiększoną ekspresją enzymów glikolitycznych i zmienionymi poziomami białek mitochondrialnych25, zgodnie z IRI w klasie graft13,18. Co więcej, w modelu automatycznego przeszczepu nerki świni, niedokrwienie, po którym następuje przechowywanie w chłodni, prowadziło do obniżonego poziomu białek mitochondrialnych nerek i zwiększonego wydalania mleczanu26. Podsumowując, odkrycia te potwierdzają kliniczne znaczenie monitorowania fenotypu metabolicznego alloprzeszczepów nerki, nawet przed przeszczepem, ponieważ podstawowe cechy metaboliczne alloprzeszczepu mogą być predyktorem dysfunkcji alloprzeszczepu27.

Opracowano kliniczne modele predykcyjne krótkoterminowego ryzyka odrzucenia i utraty przeszczepu allogenicznego28,29. Modelom tym brakuje jednak precyzji i nie uwzględniają cech molekularnych klasy graft30,31,32. Ostatnie badania miały na celu zaspokojenie tej niezaspokojonej potrzeby poprzez identyfikację wzorców molekularnych na poziomie tkanki, które są związane z gorszymi wynikami przeszczepu, takimi jak dysfunkcja przeszczepu allogenicznego i odrzucenie13,14,15,25,33,34. Badania te opierają się na pomiarach molekularnych w stanie ustalonym w genie33,34,35, protein25,26, oraz poziom metabolitu13,14, pozostawiając niepełny obraz fenotypu metabolicznego alloprzeszczepu. Ta luka w wiedzy wynika częściowo z niemożności zmierzenia funkcji metabolicznej i stanu energetycznego próbek pochodzących z nerek w określonym momencie. Uzasadnione jest opracowanie znormalizowanego protokołu w celu określenia fenotypu metabolicznego komórek nerkowych pochodzących z biopsji, który potencjalnie można przełożyć na badanie próbek pobranych od pacjentów. W tym artykule opisano unikalny przepływ pracy do oceny oddychania mitochondrialnego (za pomocą szybkości zużycia tlenu), glikolizy (szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego) i wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w zawiesinach komórek nerkowych pochodzących z biopsji. Metodologia została zoptymalizowana przy użyciu biopsji nerek pobranych od zdrowych dorosłych samców świń. Aby ułatwić przyszłe wdrożenie kliniczne, rdzenie biopsyjne uzyskano przy użyciu igły 18 G, tak jak w standardowych protokołach klinicznych pobierania próbek przeszczepu nerki36,37. Wreszcie, użyteczność implementacji protokołu w rozróżnianiu warunków eksperymentalnych została zweryfikowana w modelu autotransplantacji świń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego w Toronto (numer Protokołu Użytkowania Zwierząt: 3652). Zwierzęta były opiekowane zgodnie z National Society of Medical Research and Guide for care of laboratory animals, National Institute of Health (NIH), Ontario, Kanada. W badaniu wykorzystano pięć 3-miesięcznych samców świń rasy Yorkshire, ważących około 30 kg każda. Protokół tej metodologii jest podzielony na następujące etapy: (1) Dysocjacja pojedynczych rdzeni z biopsji nerki na zawiesiny komórkowe; (2) Profilowanie metaboliczne komórek nerki pochodzących z biopsji; oraz (3) Pomiar zawartości ATP w komórkach nerkowych pochodzących z biopsji. Wszystkie próbki biopsji pobrane do pomiaru funkcji metabolicznych lub zawartości ATP zostały zdysocjowane w ciągu 3 godzin od pobrania w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przebieg pracy metodologii jest pokazany w Rysunek 1. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Dysocjacja pojedynczych rdzeni z biopsji nerki na zawiesiny komórkowe

  1. Pobrać trzy rdzenie biopsyjne tkanki z kory nerkowej za pomocą igły współosiowej (tj. zewnętrznej igły prowadzącej i wewnętrznej igły do biopsji) gun system38. Do tłumaczenia klinicznego zaleca się użycie pistoletu do igieł do biopsji 18 G39.
    UWAGA: Podczas wykonywania biopsji kory nerkowej należy przestrzegać kąta nachylenia igły do biopsji (~45 °C) i głębokości nakłucia (~20 mm).
  2. Ostrożnie umieść każdy rdzeń biopsji w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml RPMI 1640 na lodzie.
    1. Tkankę z biopsji należy rozdrobnić na małe kawałki (o długości ≤2 mm) za pomocą skalpela na 6-centymetrowej szalce Petriego umieszczonej na lodzie. Za pomocą ultracienkiej zakrzywionej pęsety z cienką końcówką umieść fragmenty tkanek z każdej biopsji w innej probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml pożywki dysocjacyjnej.
      UWAGA: Pożywka dysocjująca składa się z pożywki RPMI 1640 zawierającej 0,1 mg/ml DNazy I, 10 mg/ml kolagenazy i 2990 jednostek/ml neutralnej proteazy z Bacillus polymyxa. Udowodniono, że dysocjacja biopsji ludzkiej nerki przy użyciu tej kompozycji pożywki maksymalizuje żywotność komórek i zachowuje reprezentację rzadkich i delikatnych populacji komórek40.
  3. Pozostawić dysocjację na 30 minut w temperaturze 37 °C (blok grzewczy) z przerywanym mieszaniem (zaleca się wirowanie rurek co 5 minut).
  4. Po dysocjacji przefiltruj zawiesiny komórek przez probówki z filtrem siatkowym o średnicy 35 μm.
  5. Przepłukać sitko objętością 1:1 100% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  6. Połącz trzy zawiesiny komórek nerki pochodzące z biopsji w jednej probówce o pojemności 15 ml.
  7. Osadzać komórki przez odwirowanie (400 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić je w 1 ml RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Ta zawiesina komórek zwykle daje 0,8-1,2 × 106 komórek.

2. Profilowanie metaboliczne komórek nerki pochodzących z biopsji

UWAGA: Krok profilowania metabolicznego integruje pomiar glikolizy (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w analizatorze funkcji metabolicznych, a także wewnątrzkomórkowe poziomy ATP za pomocą komercyjnego zestawu.

  1. Nawodnienie i kalibracja płytki użytkowej wkładu
    1. Na jeden dzień przed pobraniem próbki dodać 200 μl ddH2O do każdej studzienki płytki użytkowej wkładu analizatora funkcji metabolicznych.
    2. Inkubować płytkę użytkową z wkładem w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. W dniu pobrania próbki usunąć ddH2O przez aspirację za pomocą pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego i dodać 200 μl roztworu kalibru (pH = 7,4) do każdego dołka płytki użytkowej wkładu.
    4. Inkubować płytkę użytkową z wkładem w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Posiewanie komórek i przygotowanie pożywek testowych i związków stresorowych do pomiarów funkcji metabolicznych
    1. Dodaj 100 μl RPMI z 10% FBS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do oznaczania funkcji metabolicznych.
    2. Oddzielić małą podwielokrotność (np. 10 μl) zawiesiny komórek (otrzymanej w kroku 1) w innej probówce i wybarwić komórki za pomocą barwnika wykluczającego żywotność błękitu trypanowego.
    3. Za pomocą komory zliczającej określić stężenie żywych komórek (trypan blue negative)41 w oryginalnej zawiesinie.
    4. Zasiać komórki w każdym z badanych dołków płytki do oznaczania funkcji metabolicznych, o gęstości 1,0 x 105 żywych komórek / studzienkę. Ten numer komórki został określony po optymalizacji (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki).
      UWAGA: Nie należy rozsiewać komórek w żadnym z czterech rogów płytki do oznaczania funkcji metabolicznych, ponieważ są one używane jako ślepe próby.
    5. Pozwól komórkom przylegać, inkubując płytkę do oznaczania funkcji metabolicznych w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc (~ 16 godzin).
    6. Następnego dnia potwierdź pod mikroskopem, że komórki są w minimalnym zbiegu 70%-80% (zdrowa monowarstwa komórek jest ważna dla optymalnego określenia parametrów funkcji metabolicznej).
    7. Rozmrażać podwielokrotność (40–50 ml) pożywki podstawowej wolnej od czerwieni fenolowej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut.
    8. Przygotuj 35 ml pożywki do oznaczania, dodając 2 mM glutaminy (350 μL), 1 mM pirogronianu (350 μL) i 5,55 mM glukozy (385 μL) w 33,915 ml wstępnie rozmrożonego podłoża podstawowego.
    9. Za pomocą pipety jedno- lub wielokanałowej delikatnie usuń pożywkę RPMI z każdej studzienki badawczej z płytki do oznaczania funkcji metabolicznych. Następnie dodaj 100 μl podłoża podstawowego, aby przepłukać komórki.
    10. Delikatnie usunąć podłoże podstawowe i dodać 150 μl pożywki do oznaczania do każdej studzienki, w tym studzienek bez komórek.
      UWAGA: Pozostawienie studzienek bez pożywki testowej może wpłynąć na warunki wilgotności w środowisku płytki i prowadzić do niespójnych pomiarów funkcji metabolicznych (rysunek uzupełniający 1).
    11. Umieścić płytkę do oznaczania funkcji metabolicznych w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C na ~1 godzinę (etap aklimatyzacji). Weź płytkę użytkową wkładu (uprzednio inkubowaną w roztworze kalibru) z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    12. Podczas aklimatyzacji należy przygotować następujące cztery roztwory związków stresorowych w pożywkach do oznaczania: 7 μM oligomycyny (7x, dla końcowego stężenia 1 μM oligomycyny); 2,4 μM cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) (8x, dla stężenia końcowego 0,3 μM FCCP); 450 mM 2-deoksy-glukozy (2-DG) (9x, dla końcowego stężenia 50 mM 2-DG); 10 μM Rotenonu i 10 μM antymycyny A (Rot + AA) (10x, dla stężenia końcowego 1 μM Rot + 1 μM AA).
      UWAGA: Oligomycyna hamuje aktywność syntazy ATP i tym samym przerywa łańcuch transportu elektronów (ETC). Obniża to OCR i napędzany przez syntazę ATP napływ protonów do mitochondriów. W rezultacie, glikoliza staje się głównym źródłem produkcji ATP42. FCCP jest lekiem cyjankowym (ładunek ujemny), który działa jako rozprzęgacz fosforylacji oksydacyjnej, przyciągając protony (ładunek dodatni) i indukując ciągły napływ protonów do mitochondriów, co umożliwia zużycie tlenu przez ETC niezależnie od aktywności syntazy ATP43. 2-DG jest syntetycznym strukturalnym analogiem glukozy, w którym grupa 2-hydroksylowa jest zastąpiona wodorem i działa jako kompetycyjny inhibitor glikolizy44. Rot i AA są lekami hamującymi odpowiednio kompleksy I i III łańcucha transportu elektronów45. Skutki wstrzykiwania każdego leku na różnych etapach testu funkcji metabolicznej przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2.
    13. Załaduj 25 μl każdego leku do odpowiedniego portu na górze każdej studzienki płytki użytkowej wkładu, w tym studzienek bez komórek. Załaduj leki zgodnie z następującą sekwencją: 7x oligomycyna (port A), 8x FCCP (port B), 9x 2-DG (port C), 10x Rot + AA (port D).
    14. Inkubować płytkę użytkową z wkładem w inkubatorze wolnym od CO2 do momentu, gdy będzie to konieczne do skonfigurowania testu funkcji metabolicznej.
  3. Oznaczanie zużycia tlenu i szybkości glikolitycznej w komórkach nerkowych pochodzących z biopsji
    1. Sprawdź, czy analizator funkcji metabolicznych jest włączony i połączony z oprogramowaniem sterownika w dodatkowym komputerze.
    2. Uruchom oprogramowanie.
    3. Kliknij przycisk Szablon > Pusty.
    4. W pierwszej zakładce kliknij przycisk Strategia iniekcji. Kliknij każdy przycisk z literami A, B, C lub D, które odpowiadają czterem portom wtrysku. Zapisz nazwę leku, który będzie wstrzykiwany przez każdy port: oligomycyna (port A), FCCP (port B), 2-DG (port C), Rot + AA (port D).
    5. W drugiej zakładce zdefiniuj wszystkie warunki eksperymentalne. Kliknij przycisk Dodaj warunek, aby wprowadzić nowy warunek. Oprogramowanie automatycznie przypisze kolor do każdego warunku. Kliknij przycisk Mapa płytowa i przypisz odpowiedni warunek doświadczalny do każdej studzienki, która zostanie odpowiednio pokolorowana.
      UWAGA: Cztery studzienki narożne muszą pozostać przypisane jako puste (kolor), ponieważ są one używane do odejmowania sygnału tła.
    6. W trzeciej zakładce kliknij przycisk Injection cztery razy, aby cztery wstrzyknięcia (porty A, B, C i D) zostały dodane do sekwencji. Test można przeprowadzić przy użyciu domyślnej sekwencji iniekcji (A, B, C, D), liczby pomiarów (3 pomiary podstawowe + 3 pomiary po każdym wstrzyknięciu) oraz czasu między pomiarami (3 min).
    7. W czwartej zakładce wypełnij pola z niezbędnymi informacjami o badaniu i kliknij Uruchom. Taca otworzy się, a oprogramowanie poprosi użytkownika o zamontowanie płytki narzędziowej kasety. Upewnij się, że zdjęłeś zieloną pokrywę przed umieszczeniem talerza na tacy.
    8. Po kalibracji (~15 min) taca otworzy się ponownie, a oprogramowanie poprosi użytkownika o wyjęcie płytki użytkowej wkładu i umieszczenie płytki testowej funkcji metabolicznej na tacy. Ponownie zdejmij pokrywę talerza przed zamontowaniem płytki na tacy. Tabliczkę użytkową wkładu można wyrzucić.
    9. Test zakończy się za około 2 godziny. Po tym czasie zapisz odpowiedni plik ".asyr". Przeanalizuj pliki .asyr obliczeniowo, aby zbadać krzywe ECAR i OCR. Eksportuj dane do preferowanego formatu.
  4. Pomiar zawartości DNA w celu normalizacji danych dotyczących funkcji metabolicznych
    1. Określić ilość DNA w komórkach w każdym dołku po oznaczeniu funkcji metabolicznej przy użyciu określonego zestawu do oznaczania proliferacji komórek (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotuj wymaganą objętość 1x buforu do lizy komórek, rozcieńczając 20x bufor do lizy komórek w wodzie dejonizowanej.
    3. Aby przygotować krzywą wzorcową, należy przygotować 100 μl próbek wzorca bakteriofaga λ DNA (zawartego w zestawie do oznaczania proliferacji komórek) seryjnie rozcieńczonych w buforze do lizy komórek do stężeń w zakresie 0 ng/mL, 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/mL, 100 ng/ml, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL. Każde rozcieńczenie należy załadować do innego dołka z czarnej 96-dołkowej mikropłytki.
    4. Przygotuj 1x roztwór wiążący barwnik, rozcieńczając 400x odczynnik barwnika w 1x buforze do lizy komórek. Dla każdej studzienki krzywej wzorcowej i studzienki do badania funkcji metabolicznej wymagane będzie 100 μl.
    5. Rozprowadź 100 μl 1x roztworu barwnika do pierwszej kolumny, która zawiera już wzorce. UWAGA: Proces do tego momentu można rozpocząć 30 minut przed zakończeniem testu funkcji metabolicznej.
    6. Usunąć pożywkę do oznaczania z płytki do oznaczania funkcji metabolicznych za pomocą pipety jedno- lub wielokanałowej.
    7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl 1x roztworu wiążącego barwnik do każdej studzienki badawczej płytki do oznaczania funkcji metabolicznych. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby zlizować komórki, a następnie przenieś zawartość na czarną płytkę.
    8. Chronić mikropłytkę przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut.
    9. Zmierzyć intensywność fluorescencji każdej próbki za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych ze wzbudzeniem przy 480 nm i detekcją emisji przy 520 nm.

3. Pomiar zawartości ATP w komórkach nerki pochodzących z biopsji

UWAGA: Zmierz ilość ATP w komórkach nerkowych pochodzących z biopsji za pomocą określonego odczynnika do wykrywania ATP i wzorca rekombinowanego ATP (rATP) (patrz Tabela Materiałów).

  1. W przypadku zamrożenia odczynnik do wykrywania ATP należy rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Po pobraniu zawiesin komórkowych pochodzących z biopsji i zliczeniu komórek, umieść 1,0 x 104 żywe komórki/studzienki w każdym dołku białej 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 100 μl pożywki RPMI 1640 z 10% FBS. Pozostaw pierwszą kolumnę mikropłytki pustą, ponieważ następnego dnia zostanie ona użyta do załadowania wzorcowej krzywej rATP.
  3. Inkubować mikropłytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc.
  4. Następnego dnia podgrzej odczynnik do wykrywania ATP w temperaturze pokojowej.
  5. Wygeneruj krzywą standardową rATP. Przygotować 100 μl próbek wzorca rATP seryjnie rozcieńczonych w PBS do następujących stężeń: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Załadować 50 μl każdej próbki wzorcowej rATP do pierwszej kolumny mikropłytki.
  7. Usuń pożywkę RPMI 1640 zawierającą 10% FBS z każdej studzienki badawczej na mikropłytkach za pomocą pipety jedno- lub wielokanałowej.
  8. Każde badanie należy dobrze umyć 100 μl PBS (wstępnie podgrzanego w łaźni wodnej o temperaturze 37°C).
  9. Usuń PBS i dodaj 50 μl nowego PBS do każdego dołka badawczego.
  10. Dodaj 50 μl odczynnika do wykrywania ATP zarówno do studzienki wzorcowej, jak i do badania.
  11. Mieszać, inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  12. Odczyt i zapis luminescencji w czytniku mikropłytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg procesu przetestowano na komórkach nerkowych pochodzących z biopsji zdrowych, 3-miesięcznych samców świń rasy Yorkshire. Zastosowano protokół dysocjacji tkanek i wysiewu komórek zgodnie z powyższym opisem. Po 16 h, gdy komórki przylgnęły do podłoża, w komórkach nerkowych świni pochodzących z biopsji zmierzono w czasie rzeczywistym OCR oraz ECAR przy użyciu analizatora funkcji metabolicznych, odpowiednio jako wskaźniki oddychania mitochondrialnego i glikolizy.

Pierwszy eksperyment miał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano unikalną metodę oceny funkcji metabolicznej komórek nerkowych uzyskanych z biopsji. Protokół uzyskiwania zawiesin pojedynczych komórek ze świeżych biopsji gruboigłowych nerek połączono z analizą funkcji metabolicznych i wewnątrzkomórkowych poziomów ATP. Glikolizę ocenia się, mierząc ECAR, a oddychanie mitochondrialne mierząc OCR. W celu optymalizacji metodologii wykorzystano biopsje nerki z użyciem poriny.

Aby skutecznie badać funkcję bioenergetyczną w komórkach uzyskanych <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden ze współautorów nie ma konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mógłby ujawnić.

Podziękowania

AK był wspierany przez Fundację University Health Network (nagrody 579067450776, 579072310776 i 579068260776). SC-F był wspierany przez program Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) (2019KPPDF637713 i 24KNIA-1291062).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134Konkurencyjny inhibitor glikolizy
5 ml Polistyren okrągłodenny
probówka, z sitkiem do komórek Snap Cap		Falcon352235Probówki dysocjacyjne
Antymycyna A z  Streptomyces  sp.SigmaA8674Inhibitor kompleksu III łańcucha oddechowego
AOF BP ProteazaVitaCyte003-1000Enzym dysocjacyjny
4-(trifluorometoksy)
cyjanek karbonylu (FCCP)		SigmaC2920Rozprzęgacz fosforylacji oksydacyjnej
Test CellTiter-Glo 2.0, 100 mlPromegaG9242Pomiar wewnątrzkomórkowego ATP
Kolagenaza MAVitaCyte001-2030Enzym dysocjacyjny
Test proliferacji komórek CyQUANT, dla komórek w hodowliInvitrogenC7026Pomiar wewnątrzkomórkowego
DNA D-GLUKOZA, bezwodnego, odczynnikaBioshopGLU501Podłoże metaboliczne
DNase IStemcell07469Enzym
dysocjacyjnyPłodowa surowica bydlęca, Premium,
Pochodzenie amerykańskie, inaktywowana termicznie, 500 ml		Żubr080-450Pożywka dysocjująca suplement
L-glutamina-200 mM (100x) płyn (100 ml)Gibco25030081Substrate metaboliczny
Oligomycyna ASigma75351Inhibitor syntazy ATP
PBS, -/-, 500 mlŻubr311-010-CLMycie komórek
rATP,  10 mM,  0?5 mLPromegaP1132Pomiar wewnątrzkomórkowego ATP
RotenonSigmaR8875Inhibitor kompleksu I łańcucha oddechowego
RPMI 1640Gibco11875119Media dysocjacyjne
Oprogramowanie kontrolera fal Seahorse 2.6AgilentN/AKonfiguracja pomiarów funkcji metabolicznych
Oprogramowanie komputerowe Seahorse Wave 2.6AgilentNie dotyczyAnaliza danych dotyczących funkcji metabolicznych
Pożywka bazowa Seahorse XF,  bez czerwieni fenolowej, 500 mlAgilent103335-100Pomiar funkcji metabolicznej
Konik morski XFe96 FluxPak  (20 płytek, 18 wkładów,
i 500 ml roztworu kalibru)		Agilent102416-100Pomiar funkcji
metabolicznej Analizator funkcji metabolicznych Seahorse XFe96Agilent101991-100Pomiar funkcji metabolicznej
Roztwór pirogronianu sodu 100 mM (100X), ciecz 100 mLGibco11360070Podłoże metaboliczne

Bibliografia

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przeszczepianie nerekuszkodzenie niedokrwienno-reperfozyjneopóźnione uruchomienie przeszczepuostre uszkodzenie nerekoddychanie mitochondrialneszybkość zużycia tlenuocena glikolizywewnątrzkomórkowe poziomy ATP

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.