Method Article

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

DOI:

10.3791/65461

⸱

June 9th, 2023

 ,  , 
1Program in Physical Therapy, Washington University in St. Louis, 2Departments of Neurology, Orthopaedic Surgery and Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naciek tłuszczowy to nagromadzenie adipocytów między włóknami mięśniowymi w mięśniach szkieletowych i jest charakterystyczną cechą wielu miopatii, zaburzeń metabolicznych i dystrofii. Klinicznie w populacjach ludzkich naciek tłuszczowy ocenia się za pomocą metod nieinwazyjnych, w tym tomografii komputerowej (CT), rezonansu magnetycznego (MRI) i ultrasonografii (USG). Chociaż w niektórych badaniach wykorzystano tomografię komputerową lub rezonans magnetyczny do ilościowego określenia nacieku tłuszczu w mięśniach myszy, koszty i niewystarczająca rozdzielczość przestrzenna pozostają wyzwaniem. Inne metody na małych zwierzętach wykorzystują histologię do wizualizacji poszczególnych adipocytów; Jednak metodologia ta cierpi z powodu błędu systematycznego w patologii heterogenicznej. Protokół ten opisuje metodologię jakościowego oglądania i ilościowego pomiaru nacieku tłuszczowego kompleksowo w nienaruszonych mięśniach myszy i na poziomie poszczególnych adipocytów za pomocą decelularyzacji. Protokół nie jest ograniczony do konkretnych mięśni lub określonych gatunków i może być rozszerzony na biopsję człowieka. Ponadto oceny jakościowe i ilościowe brutto można przeprowadzać za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego przy niewielkich kosztach, dzięki czemu procedura ta jest bardziej dostępna we wszystkich laboratoriach badawczych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagromadzenie adipocytów między włóknami mięśniowymi w mięśniach szkieletowych jest charakterystyczną cechą różnych schorzeń, od cukrzycy typu 2 przez sarkopenię po urazy mięśniowo-szkieletowe1,2,3,4,5,6,7. Kompleksowa ocena tej domięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy tych schorzeń, ponieważ odkładanie się IMAT jest silnie skorelowane z insulinoopornością3,8,9,10 i słaba funkcja mięśni szkieletowych11,12,13,14,15. Chociaż powiązania te są obserwowane od dziesięcioleci, mechanizmy związane z IMAT i jego pochodzenie nadal pozostają obszarem intensywnych badań. Dzieje się tak częściowo dlatego, że większość badań oceniających naciek tłuszczowy mięśni szkieletowych przeprowadzono na ludziach, gdzie badania mechanistyczne są ograniczone16,17. Jednak ostatnio małe modele zwierzęce, w tym myszy, zostały wykorzystane do określenia komórkowej regulacji rozwoju i sygnalizacji IMAT18,19,20. Prace te mają na celu dostarczenie nowego narzędzia do wykorzystania z małymi modelami zwierzęcymi do jakościowej wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych.

Klinicznie w populacjach ludzkich, naciek tłuszczowy jest oceniany za pomocą metod nieinwazyjnych, w tym tomografii komputerowej (CT)6,21, rezonans magnetyczny (MRI)16,17,22,23 i ultrasonografia (US)17,24. Te techniki obrazowania zazwyczaj identyfikują zdefiniowany obszar zainteresowania (ROI) w mięśniu i uzyskują wycinki obrazu w tym regionie, chociaż zastosowano również kompleksowe podejścia25,26,27. Te wycinki obrazu są poddawane gradacji jakościowej6 i określane ilościowo za pomocą progowania pikseli28. Podobne podejścia stosowano wcześniej u zwierząt29,30; Są one jednak kosztowne i wymagają dostępu do systemów obrazowania małych zwierząt. Rozdzielczość przestrzenna za pomocą tomografii komputerowej i rezonansu magnetycznego również stanowi poważny problem, ponieważ nie są one w stanie oddzielić adipocytów IMAT od włókien mięśni szkieletowych w wokselu, a zamiast tego polegają na subiektywnym oddzieleniu głównie regionów mięśniowych i głównie regionów IMAT31,32. W związku z tym niemożność dokładnej identyfikacji tkanki tłuszczowej lub mięśniowej powoduje również niedokładne określenie ilościowe reprezentatywnych ilości tych tkanek.

Ze względu na te ograniczenia, obecne techniki oceny naciekania tłuszczu mięśni szkieletowych w małych modelach zwierzęcych najczęściej polegają na histologii jako taniej i dostępnej alternatywie33,34. Standardowe procedury barwienia, w tym hematoksylina i eozyna (H&E), czerwień olejowa O (ORO) oraz barwienie immunologiczne markerów adipocytów, takich jak perylipida, pozwalają na proste wykrycie i wizualizację adipocytów zawierających naciek tłuszczowy w mięśniach. Jednak podejścia histologiczne rzadko są kompleksowe i zazwyczaj ocena jakościowa lub ilościowa IMAT jest ograniczona do jednej sekcji34. Ekstrakcja lipidów została również wykorzystana do ilościowego określenia całkowitej ilości lipidów mięśniowych35; jednak ta technika nie rozróżnia między wewnątrzmięśniowokomórkowymi magazynami lipidów (IMCL) i śródmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT)36. Podsumowując, obecne metodologie wizualizacji i ilościowego oznaczania tkanki tłuszczowej w mięśniach pozostają ograniczone albo przez koszty finansowe, albo specyficzne wykrywanie IMAT.

Tutaj opisujemy szczegółową metodę oceny nacieku tłuszczowego mięśni szkieletowych, zarówno poprzez jakościową wizualizację, jak i wieloskalową kwantyfikację. Metodologia ta wykorzystuje prostą technikę decelularyzacji, która usuwa struktury mięśniowokomórkowe, w tym IMCL, ale utrzymuje nienaruszone większe kropelki lipidów pochodzące z adipocytów IMAT. Opublikowano walidację specyficzności tej techniki37, w tym za pomocą ekstrakcji lipidów w celu wykazania zubożenia IMCL z decelularyzacją, μCT w celu pokazania zachowania wzorca IMAT z decelularyzacją oraz histologii w celu pokazania podobnego rozkładu wielkości kropelek lipidów IMAT w porównaniu z tymi zidentyfikowanymi za pomocą decelularyzacji. Po decelularizacji mięśnie można zabarwić barwnikami rozpuszczalnymi w tłuszczach w celu jakościowej wizualizacji wzoru i zakresu nacieku tłuszczowego i/lub obrazowania ilościowego poszczególnych kropelek lipidów IMAT. Barwniki można następnie ekstrahować izopropanolem, a gęstość optyczną (OD) otrzymanego roztworu można wykorzystać do oszacowania objętości lipidów IMAT. Rygorystyczna walidacja tej techniki została opublikowana w innym miejscu37. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół stosowania tej metodologii z mięśniami myszy i zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, które wspierają przyjęcie tej metody w innych zastosowaniach, takich jak mięśnie innych gatunków lub inne tkanki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka i ofiarowanie myszy zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Wszystkie prace zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis School of Medicine. Samce myszy C57BL/6J w wieku 2-3 miesięcy (patrz Tabela Materiałów) zostały wykorzystane do wygenerowania przykładowych obrazów zawartych w tym protokole. Wszystkie opisane poniżej czynności wykonywane są w temperaturze pokojowej.

1. Decelularyzacja mięśni

  1. Przygotować 1% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS; patrz Tabela Materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Mieszaj roztwór, aż do całkowitego wymieszania.
    UWAGA: 1% SDS można przygotować luzem i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc.
  2. Przeanalizuj interesujące Cię mięśnie zgodnie z wcześniejszym opisem38,39.
    1. Odsłoń interesujące Cię mięśnie, zwilżając włosy i skórę 70% roztworem etanolu, następnie wykonując nacięcie przezskórne o długości około 2 cm, a następnie usuwając pokrywającą skórę kleszczami i nożyczkami sprężynowymi.
      UWAGA: Interesujące tutaj mięśnie obejmują piszczel przedni (TA), prostownik długi palca (EDL) i przeponę. Niektóre mięśnie mogą leżeć głęboko w innych mięśniach, co wymaga rozwarstwienia innych mięśni (np. rozwarstwienie EDL wymaga usunięcia TA).
    2. Wypreparuj interesujący mięsień (mięśnie) za pomocą ostrych nożyczek lub ostrzy (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że uzyskano cały zakres mięśnia, a krawędzie są gładkie.
      UWAGA: Najlepiej zrobić to pod mikroskopem preparacyjnym, aby poprawić wizualizację.
    3. Sprawdź mięśnie, aby upewnić się, że nie ma odłamków kości ani postrzępionych krawędzi, a następnie w razie potrzeby odetnij je ostrymi nożyczkami.
    4. Zważ mięsień za pomocą wagi analitycznej i zapisz wagę.
  3. Umieść wypreparowany mięsień w co najmniej 0,1 ml 1% SDS na miligram masy; płytki 6-, 12- lub 24-dołkowe działają dobrze odpowiednio na mięśnie przepony, TA i myszy EDL. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych.
    UWAGA: Roztwór SDS czasami powoduje deformację mięśni, więc upewnij się, że mięsień jest płaski/rozciągnięty przy początkowym zanurzeniu.
  4. Umieść płytkę studzienki (lub inne naczynia) na wytrząsarce na biegunach ustawionej na 50-80 Hz.
  5. Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS. Gdy roztwór stanie się mętny, usuń roztwór pipetą (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąp go równą objętością świeżej 1% SDS. Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, decelularyzacja jest zakończona.
    UWAGA: Częstotliwość wymagana do zmiany roztworu różni się w zależności od wielkości mięśni i początkowej objętości roztworu. Większe mięśnie, takie jak TA, potrzebują nowego SDS w ciągu kilku godzin, a mniejsze mięśnie, takie jak EDL, mogą przejść przez noc w oryginalnym roztworze.
  6. Usunąć końcowy roztwór SDS z mięśni pozbawionych komórek za pomocą pipety (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąpić go równą objętością PBS.
  7. Sprawdź wzrokowo pozbawione komórek mięśnie pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć wszelkie włosy lub zanieczyszczenia, które przykleiły się do mięśnia.
    UWAGA: Zwróć również uwagę na klarowność zdecelularizowanego mięśnia na tym etapie. Jeśli bezkomórkowy mięsień nie jest w pełni przezroczysty, a roztwór SDS nie zwiększa zmętnienia w ciągu 24 godzin, oznacza to, że decelularyzacja nie była skuteczna. Tworzy to artefakt w ocenach jakościowych i ilościowych, dlatego decelularyzacja powinna być zawsze optymalizowana na próbkach treningowych przed przystąpieniem do eksperymentalnych mięśni.
  8. Ostrożnie wyjmij PBS, zastąp go równą objętością 3,7% formaldehydu lub 4% roztworu paraformaldehydu i włóż płytkę z powrotem do wytrząsarki na 24 godziny
    UWAGA: Upewnij się, że roztwór formaldehydu całkowicie pokrywa pozbawiony komórek mięsień, w przeciwnym razie barwienie będzie nierówne.

2. Wizualizacja IMAT z czerwonym olejem O

  1. Przygotuj roztwór ORO.
    1. Rozpuścić 0,5 g proszku ORO (patrz tabela materiałów) w 100 ml izopropanolu w celu wytworzenia roztworu podstawowego.
      UWAGA: Dodaj delikatne ciepło do roztworu, aby całkowicie go rozpuścić. Ten bulion można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc.
    2. Połączyć roztwór podstawowy ORO i wodę dejonizowaną w stosunku 60:40, aby uzyskać roztwór roboczy potrzebny dla wszystkich mięśni o objętości co najmniej 0,1 ml / mg masy mięśniowej. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych.
      UWAGA: Sprawdź roztwór podstawowy przed zmieszaniem. Jeśli roztwór podstawowy zawiera znaczne ilości cząstek stałych, należy przygotować świeży bulion.
    3. Przykryj roztwór roboczy na 10 minut, aby cząstki stałe mogły się osadzić.
    4. Przefiltrować roztwór roboczy przez siatkę 40 μm, a następnie przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
      UWAGA: Filtr strzykawkowy 0,22 μm szybko się zapycha i należy go wymienić, jeśli roztwór roboczy nie przepycha się łatwo.
  2. Usuń roztwór formaldehydu lub paraformaldehydu i umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.
  3. Zastąp PBS równą objętością 60% roztworu izopropanolu i inkubuj na kołyszącym się wytrząsarce przez 5 minut.
  4. Zastąp 60% roztwór izopropanolu roztworem roboczym ORO i inkubuj na wytrząsarce bujającej przez 10 min.
    UWAGA: Upewnij się, że roztwór roboczy ORO całkowicie pokrywa mięsień pozbawiony komórek, w przeciwnym razie barwienie będzie nierówne.
  5. Zastąp roztwór roboczy ORO równą objętością 1% SDS. Okresowo sprawdzaj wzrokowo roztwór SDS. Gdy roztwór stanie się zauważalnie różowy, usuń roztwór pipetą (uważając, aby nie zassać mięśnia) i zastąp go świeżym 1% SDS.
  6. Gdy roztwór pozostaje klarowny przez 24 godziny, zastąp 1% SDS PBS i sprawdź zabarwiony mięsień pod mikroskopem preparacyjnym/stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu. Usuń wszelkie widoczne zanieczyszczenia lub cząstki przyklejone na zewnątrz mięśnia. Jeśli jest to rozległe, pozbawiony komórek mięsień można delikatnie zwinąć na chusteczkę czyszczącą, aby usunąć zanieczyszczenia/cząstki.
  7. Jeśli barwienie jest zadowalające (jaskrawoczerwone kule unoszące się w przezroczystej matrycy), uzyskaj obrazy barwienia zgodnie z potrzebami za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Jeśli mikroskop sekcyjny nie ma dołączonej kamery, do robienia zdjęć przez okular można użyć aparatu w telefonie.

3. Wizualizacja kropelek lipidów IMAT za pomocą BODIPY

UWAGA: Obrazowanie konfokalne jest najbardziej skuteczne w przypadku cienkich mięśni, takich jak EDL lub przepona (~2 mm grubości). Alternatywnie można zastosować paski mięśni o porównywalnej grubości, takie jak TA.

  1. Przygotować roztwór fluorescencyjny BODIPY 493/503 w stężeniu 1:200 (patrz tabela materiałów) w PBS, aby uzyskać objętość roztworu roboczego co najmniej 0,1 ml/mg masy mięśniowej. Typowe objętości to 6 ml, 3 ml i 1,5 ml odpowiednio dla płytek 6-, 12- i 24-dołkowych.
  2. Usuń formaldehyd, paraformaldehyd lub 1% SDS i umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.
  3. Zastąp PBS roztworem roboczym BODIPY i inkubuj na wytrząsarce na biegunach przez 20 minut.
  4. Umyj pozbawione komórek mięśnie trzema podmianami roztworu o równej objętości PBS.
  5. Umieść mięsień w naczyniu o przezroczystym dnie, które jest kompatybilne z dostępnym mikroskopem konfokalnym. Idealnie byłoby, gdyby naczynie miało zagłębione dno, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na mięśniu bez jego deformacji (patrz Tabela materiałów).
  6. Uzyskać stosy obrazów za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) przy użyciu lasera 488. Typowe rozmiary stosów dla EDL to 0,5-1 mm przy grubości warstwy 10 μm, co daje 50-100 obrazów na stos.
    UWAGA: Aby określić ilościowo całkowitą objętość lipidów, całkowitą liczbę kropelek lipidów IMAT i najbliższy sąsiedni wskaźnik grupowania, zobrazuj całą objętość mięśnia, zwracając uwagę na pozostawienie pewnego zachodzenia na siebie w celu rejestracji obrazu. Aby określić ilościowo średnią objętość kropelek lipidów, jeden stos może być wystarczający
    7. .
  7. W razie potrzeby zabarwić mięśnie ORO, zgodnie z sekcją 2, aby uzyskać uzupełniający obraz rozkładu IMAT w całych mięśniach.
    UWAGA: Ponieważ BODIPY jest fluorescencyjny, nie będzie widoczny pod mikroskopem świetlnym podczas pozyskiwania obrazów OR.

4. Oszacowanie całkowitej objętości lipidów przez ekstrakcję lipidów

  1. Po uzyskaniu obrazu przenieś mięśnie do 200 μl izopropanolu w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki lub dostosuj dołek/objętość, jeśli mięsień jest zbyt duży, aby się zmieścić.
  2. Mieszać roztwór, stukając w płytkę, pipetując roztwór w górę iw dół i/lub mechanicznie miażdżąc mięsień końcówką pipety, aż pod mikroskopem w mięśniu pozbawionym komórek nie będzie widać czerwonych/fluorescencyjnych kulek.
    UWAGA: Traktuj wszystkie mięśnie tą samą kombinacją stukania, pipetowania i miażdżenia, aby uzyskać najlepszą niezawodność. Należy również pamiętać o ograniczeniu czasu spędzonego na stukaniu, pipetowaniu i kruszeniu, ponieważ izopropanol szybko odparuje.
  3. Wymieszać roztwór w każdym dołku, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść 75 μl do dwóch czystych dołków płytki.
  4. Przykryć płytkę i odczytać absorbancję zduplikowanych studzienek o pojemności 75 μl za pomocą spektrofotometru lub czytnika płytek. Jeśli konstrukt został zabarwiony ORO, odczytać roztwór przy 500 nm; jeśli był zabarwiony BODIPY 493/503, odczytaj tabliczkę pod kątem 493 nm.
    UWAGA: Jeśli konstrukt został wybarwiony zarówno BODIPY, jak i ORO, zaleca się odczytanie płytki przy 500 nm, ponieważ odczyty 500 nm dają podobne wyniki między konstruktami barwionymi tylko ORO i ORO plus BODIPY.
  5. W razie potrzeby podzielić odczyt absorbancji przez zarejestrowaną masę mięśnia, aby skorygować różnice w wielkości między próbkami.

5. Kwantyfikacja wskaźników kropelek lipidów IMAT na podstawie obrazów konfokalnych

UWAGA: Ta sekcja wymaga dostępu do ImageJ w wersji 1.47 (zobacz Spis materiałów) lub nowszej oraz podstawowych umiejętności ImageJ40.

  1. Otwieranie stosów konfokalnych w ImageJ.
    UWAGA: Różne mikroskopy konfokalne mogą zapisywać obrazy konfokalne w różnych formatach. ImageJ może wymagać dodatkowej wtyczki lub wariantu, takiego jak Fiji, aby otworzyć stacks41. Zastosowane algorytmy są częścią pakietu oprogramowania ImageJ.
  2. Uruchom algorytm progowy w ImageJ, aby zidentyfikować dodatnie piksele BODIPY. Spowoduje to przekonwertowanie bieżącego obrazu na obraz binarny.
    1. Otwórz interfejs użytkownika progu, wybierając opcję Obraz > Dostosuj > Próg. W interfejsie użytkownika wybierz Intermodes jako typ progowania i upewnij się, że wybrano opcję Ciemne tło. Nie trzeba wybierać żadnych innych opcji. Następnie kliknij Zastosuj.
    2. Otworzy się okno dialogowe, w którym można przekonwertować stos na binarny. Upewnij się, że wybrano następujące opcje: Metoda: Intermodes; Tło: ciemne. Oblicz próg dla każdego obrazu i czarnego tła (masek binarnych). Spowoduje to wygenerowanie stosu binarnego, gdzie biały oznacza dodatnie piksele BODIPY, a oznacza ujemne piksele BODIPY.
      UWAGA: Algorytm progowania Intermodes może nie być najlepszym wyborem dla wszystkich użytkowników. Subiektywna kontrola wbudowanych opcji progowania ImageJ pomaga wybrać optymalny algorytm separacji pikseli dodatnich i ujemnych BODIPY.
  3. Uruchom algorytm Watershed w ImageJ, aby oddzielić dotykające się kropelki lipidów. Wybierz pozycję Process > binary > Watershed (Zlewnia binarna). Otworzy się okno dialogowe z pytaniem, czy wszystkie obrazy w stosie powinny zostać przetworzone. Wybierz opcję Tak. Spowoduje to dodanie cienkich czarnych linii dzielących większe obszary jednolitej bieli.
  4. Zidentyfikuj zwrot z inwestycji za pomocą algorytmu analizy cząstek w ImageJ.
    1. Wybierz opcję Analizuj > Analizuj cząstki. Otworzy się okno dialogowe, w którym można ustawić ustawienia wyboru.
      UWAGA: Wybór zakresu rozmiarów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania najlepszego oszacowania zwrotu z inwestycji w krople lipidów. Dolna granica eliminuje obszary, które są prawdopodobnie zbyt małe, aby mogły być kropelkami lipidów pochodzącymi z IMAT (artefakt tła), a górna granica eliminuje regiony, które są prawdopodobnie zbyt duże, aby być pojedynczymi kropelkami lipidów pochodzącymi z IMAT (dotykającymi kropelek lipidów, które nie zostały oddzielone przez algorytm Watershed).
    2. Aby ustawić te wartości, otwórz oryginalny obraz i obrysuj najmniejszą i największą kroplę lipidu w polu widzenia za pomocą narzędzia Owal. Następnie dodaj te kształty do menedżera ROI, wpisując "t". Wybierz opcję Analizuj, a następnie Ustaw pomiary. Otworzy się okno dialogowe, w którym można wybrać ustawienia.
      1. Zaznacz opcję Tylko obszar i kliknij przycisk OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji. Użyj dwóch miar powierzchni z tego okna Wyniki jako zakresu rozmiarów w polu Analizuj cząstki.
    3. Upewnij się, że opcja Dodaj do menedżera jest zaznaczona. Nie są potrzebne żadne inne opcje.
  5. Nałóż ROI na stos konfokalny, zaznaczając opcję Pokaż wszystko w Menedżerze ROI. Użyj suwaka, aby sprawdzić każdy plasterek stosu z osobna i ręcznie dodać brakujące regiony za pomocą narzędzia Owal (znajdującego się na pasku narzędzi ImageJ).
  6. Wyprowadzaj pomiary ROI. Wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Obszar, Środek ciężkości, Dopasuj elipsę i Położenie stosu. Kliknij OK. Następnie wybierz opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji. Dane w tabeli Wyniki można wybrać i skopiować do Matlaba lub Excela w celu dalszej analizy.
  7. Doprecyzuj ROI w każdym stosie do pojedynczego ROI za pomocą Refine.m Matlab code37 lub podobnego algorytmu.
    UWAGA: Ten krok jest wymagany, ponieważ kroki 5.2-5.4 identyfikują tę samą kroplę lipidu w sąsiednich warstwach jako różne ROI. Jednak ROI można alternatywnie zidentyfikować tylko ręcznie, a zduplikowane ROI można wyeliminować ręcznie w ImageJ, aby uniknąć konieczności korzystania z Matlaba.
  8. Uzyskaj statystyki podsumowujące w ROI za pomocą Matlaba lub Excela.
    1. Oszacuj całkowitą liczbę kropelek lipidów jako całkowitą liczbę ROI.
    2. Oszacuj objętość kropelki lipidów jako objętość elipsy dopasowanej do każdego ROI 2D, zakładając, że głębokość kształtu jest średnią z głównych i drugorzędnych osi elipsy.
    3. Oszacuj całkowitą objętość lipidów, która jest sumą indywidualnych szacowanych objętości kropelek lipidów.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakościowa wizualizacja infiltracji tłuszczowej mięśni szkieletowych
Prawidłowo pozbawione komórek mięśnie są białe i półprzezroczyste (sekcja 1; Rysunek 1). Kiedy pozbawione komórek mięśnie są barwione ORO w celu wizualizacji IMAT (sekcja 2), kropelki lipidów IMAT są widoczne w czystych strukturach mięśniowych jako czerwone kule (Rysunek 1). Zdrowe mięśnie tylnych kończyn myszy mają niewiele naturalnego IMAT, o czym świadczy niewielka lub żadna czerwona, ORO dodatnia zawartość lipidów (Rysunek 1A). Dla porównania, mięśnie kończyn tylnych, którym wstrzyknięto kardiotoksynę (CTX; Rysunek 1B) lub glicerolu (GLY; Rysunek 1C) 14 dni przed decelularyzacją mają zwiększoną akumulację IMAT, przy czym większe stężenie IMAT następuje po CTX w porównaniu z GLY, jak wcześniej zauważono37.

Niepełną decelularyzację można zidentyfikować natychmiast po początkowym leczeniu SDS lub po wypłukaniu barwienia ORO jako półprzezroczyste, jasnoróżowe włókna (Rysunek 2B w porównaniu z Rysunek 2A). Niepełny klirens ORO można zidentyfikować po wypłukaniu ORO jako różowe lub czerwone jednolite tło, a nie wyraźne linie włókien (Rysunek 2C). Rysunek 2A,B zawiera również tkankę tłuszczową nabłonkową (gwiazdki), zlepek kropelek lipidów poza zdecelularyzowanym mięśniem. Rysunek 2C pokazuje również fałdowanie mięśni, które może wystąpić, jeśli mięśnie nie są rozłożone podczas decelularyzacji. Niepełna decelularyzacja, niepełny klirens ORO i resztkowa tkanka tłuszczowa namięśniowa w rzeczywistości zwiększają (OD) wyekstrahowanego lipidu, ale niekoniecznie utrudniają jakościową ocenę nacieku tłuszczowego, jeśli zostaną rozpoznane jako artefakt.

Ilościowe obrazowanie naciekania tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych
Znakowane fluorescencyjnie kropelki lipidów BODIPY można obrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu bardziej szczegółowej oceny wskaźników i dystrybucji poszczególnych kropelek lipidów (Rysunek 3). Ten proces jest częściowo zautomatyzowany, jak opisano wcześniej, w tym Matlab code37. Dobre barwienie BODIPY skutkuje jasnymi eliptycznymi kształtami odgraniczonymi od sąsiednich kształtów, gdy są obrazowane w płaszczyźnie (Rysunek 3A). Progowanie i segmentacja kształtu zapewniają dobre pierwsze przejście do generowania ROI dla każdej kropli lipidów (Rysunek 3B), ale do skorygowania błędów potrzebne są ręczne edycje. Najbardziej rozpowszechnionym błędem są kropelki lipidów, które znajdują się głęboko w tkance i dlatego nie są jasne na żadnym plasterku (Rysunek 3B; różowe podwójne strzałki). Można temu zaradzić, dodając ROI ręcznie za pomocą narzędzia Oval w ImageJ (Rysunek 3C). Drugi to identyfikacja grupy kropelek lipidów jako pojedynczego ROI (Rysunek 3B; czerwona gwiazdka). Można to skorygować, usuwając i zastępując oryginalny zwrot z inwestycji wieloma nowymi wskaźnikami zwrotu z inwestycji (Rysunek 3D). Wreszcie, pojedyncza kropla lipidu jest identyfikowana jako unikalny zwrot z inwestycji w wielu warstwach, więc zduplikowane zwroty z inwestycji muszą zostać skonsolidowane w jeden zwrot z inwestycji (Rysunek 3E; niebieska strzałka). Najłatwiej jest to zrobić za pomocą narzędzia do przetwarzania danych, takiego jak Matlab, ale można to również zrobić ręcznie, identyfikując największy zwrot z inwestycji i usuwając resztę. Średnie wartości dla każdej metryki w myszy C57BL6/J i 129Sv można znaleźć w Biltz et al.37.

figure-results-1
Rysunek 1: Przykład barwienia krwią olejową O (ORO) zdecelularyzowanych mięśni. Mięśnie zabarwione ORO 14 dni po wstrzyknięciu solą fizjologiczną (SAL), kardiotoksyną (CTX) lub glicerolem (GLY). Mięśnie prostownika długiego palca myszy (EDL) i piszczelowe przednie (TA) mają mało IMAT (czerwone kule) po leczeniu SAL (A), ale gromadzą IMAT w odpowiedzi na leczenie CTX (B) i GLY (C). Następuje całkowita decelularyzacja i wymywanie ORO, o czym świadczą wyraźne kropelki lipidów ORO dodatnich na przezroczystym białym tle mięśni. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykłady słabych wyników barwienia OR. Niepełna decelularyzacja lub niepełny klirens ORO prowadzi do półprzezroczystego różowo-czerwonego tła. W porównaniu z przezroczystym białym tłem w pełni zdekomórkowego mięśnia przepony myszy (A), niepełna decelularyzacja charakteryzuje się jasnoróżowymi / czerwonymi ścieżkami włókien (B), a niepełny klirens ORO charakteryzuje się rozproszonym różowo-czerwonym tłem (C). Podziałka: górne panele = 1 mm; dolne panele = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykłady identyfikacji pojedynczych kropelek lipidów za pomocą barwienia fluorescencyjnego BODIPY i mikroskopii konfokalnej Pojedyncze kropelki lipidów barwione metodą BODIPY mogą być identyfikowane i oznaczane ilościowo w zdecellularnych mięśniach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pojedyncze warstwy w stosie konfokalnym pokazują kropelki lipidów w płaszczyźnie jako jasnozielone elipsy, a kropelki lipidów poza płaszczyzną jako słabsze kształty (A; niebieskie strzałki). Progowanie w połączeniu z segmentacją obiektów zlewni i identyfikacją ROI może odwzorować ROI zabarwione BODIPY (B). Progowanie może pominąć niektóre słabsze kropelki lipidów (B; różowa podwójna strzałka), co wymaga ręcznej identyfikacji (C). Segmentacja działu wodnego może grupować razem kilka kropelek lipidów (B; czerwona gwiazdka), co wymaga usunięcia ROI i ponownego ręcznego oszacowania (D). Ta sama kropla lipidu jest identyfikowana w wielu warstwach wymagających rejestracji obrazu (E) w celu usunięcia zduplikowanych ROI. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metody jakościowej wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczowego mięśni szkieletowych w małych modelach zwierzęcych, które można zastosować do dalszego zrozumienia patogenezy rozwoju i patologicznej ekspansji wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT). Zastosowanie decelularizacji całych mięśni i barwienia rozpuszczalnego w tłuszczach pozwala na opłacalną, powtarzalną i prostą metodologię kompleksowej oceny obecności IMAT w całych mięśniach.

Podstawą tego protokołu jest to, że decelularyzacja mięśni za pomocą SDS usuwa składniki komórkowe włókien mięśniowych, w tym małe kropelki lipidów IMCL, ale oszczędza duże kropelki lipidów w adipocytach wewnątrzmięśniowokomórkowych. SDS jest szeroko stosowany42 w inżynierii tkankowej do decelularyzacji matryc. Tkanki takie jak tkanka tłuszczowa i mięśnie szkieletowe zazwyczaj wymagają dodatkowej dysocjacji mechanicznej i/lub ekstrakcji alkoholowej w celu usunięcia resztkowego lipidu adipocytów42,43. Wcześniej wykazaliśmy, że dzieje się tak dlatego, że podczas gdy decelularyzacja za pomocą SDS eliminuje IMCL, oszczędza dużą kroplę lipidu w adipocytach37. Obrazowanie nienaruszonych mięśni przed i po decelularyzacji zabarwionych tetratlenkiem osmu za pomocą μCT potwierdziło, że przestrzenny wzór IMAT nie został zakłócony przez decelularyzację. Co więcej, kwantyfikacja triglicerydów domięśniowych w mięśniu pozbawionym komórek ze znikomym IMAT wynosiła ~ 5% wartości nienaruszonych mięśni, co potwierdza usunięcie IMCL. W związku z tym metodologia ta zachowuje kropelki lipidów IMAT w ich pierwotnym rozmieszczeniu anatomicznym poprzez półprzezroczystą macierz mięśniową.

Właściwa decelularyzacja jest najważniejszym krokiem w tym protokole. Jeśli decelularyzacja jest niekompletna, kropelki lipidów IMAT będą trudne do uwidocznienia, a resztkowy IMCL spowoduje wysokie zabarwienie tła za pomocą ORO lub BODIPY (ryc. 2). Typowe błędy popełniane przez niedoświadczonych użytkowników to niewystarczające pokrycie SDS na mięsień (w każdym dołku), tak że każdy mięsień nie jest całkowicie pokryty roztworem SDS, nieużywanie rockera do mieszania roztworu podczas decelularyzacji oraz niewystarczająco częste zmienianie roztworu. W tym manuskrypcie zaleciliśmy ilość SDS potrzebną na jednostkę masy mięśniowej, ale użytkownik nadal będzie musiał upewnić się, że mięśnie są całkowicie pokryte roztworami, ponieważ każdy mięsień ma unikalną geometrię. Użytkownikom zaleca się również swobodną zmianę roztworów (nawet dwa razy dziennie), aby zapewnić zakończenie decelularyzacji. Dobrej jakości barwienie kropelek lipidowych IMAT udało się osiągnąć już po 4 dniach leczenia SDS. Aby uzyskać wysokiej jakości wyniki barwienia ORO, ważne jest również odpowiednie utrwalenie i przygotowanie roztworu ORO. Podobnie jak w przypadku opisanej powyżej metody leczenia SDS, konieczne jest odpowiednie pokrycie 3,7% roztworem formaldehydu dla każdej próbki mięśni. Jeśli mięsień zostanie usunięty z utrwalacza zbyt wcześnie, kropelki lipidów będą tylko słabo zabarwiać się ORO. W sumie 1-2 godziny powinny wystarczyć, ale zaleca się utrwalenie przez noc, aby utrwalacz wniknął do środka mięśnia i w pełni związał wszystkie kropelki lipidów. Dodatkowym wyzwaniem związanym z barwieniem ORO jest to, że gdy stężenie alkoholu zostanie zmniejszone do 60%, zaczyna tworzyć się cząstka stała. Cząstki te mogą osadzać się na powierzchni i utknąć na granicy mięśni. Najlepszym sposobem, aby tego uniknąć, jest przygotowanie świeżego roztworu roboczego dla każdego barwienia i użycie zarówno filtrów o siatce 40 μm, jak i 0,22 μm. Następnie utrzymywanie mieszania z bujakiem i ograniczenie czasu barwienia do 10 minut pomoże zapobiec osadzaniu się powstających cząstek. Jeśli problem będzie się powtarzał, pomocne może być przygotowanie świeżego roztworu podstawowego ORO. Jeśli jakiś artefakt pozostaje przyklejony do zdecelularnej powierzchni mięśnia, do usunięcia tego artefaktu można użyć mikroskopu stereoskopowego, kleszczy i nożyczek chirurgicznych. Niewyeliminowanie artefaktów wpłynie na jakość obrazu mięśni i przeszacowa zawartość IMAT podczas części ekstrakcji lipidów w ramach przygotowań do odczytu OD.

Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest prosta i oferuje kilka zalet w porównaniu ze złotymi standardowymi metodami wizualizacji i ilościowego określania nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych. Techniki nieinwazyjne, takie jak tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny i USG, które są szeroko stosowane u ludzi, a czasem w modelach zwierzęcych, mają ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i nie są w stanie odróżnić kropelek lipidów od włókien mięśniowych. Tak więc piksel lub woksel o średniej intensywności sygnału jest przypisywany jako "mięsień" lub "tłuszcz", podczas gdy w rzeczywistości jest to prawdopodobnie mieszanka włókien mięśniowych i adipocytów. Częściej naciek tłuszczowy w mięśniach zwierzęcych ocenia się za pomocą histologii, najczęściej za pomocą ORO w kriosekcjach mięśni. Jednak zwykle wykonuje się to tylko w jednym reprezentatywnym przekroju i jest trudne do ilościowego określenia ze względu na rozproszenie lipidów w przekroju. W przeciwieństwie do tego, barwienie ORO całego mięśnia pozbawionego komórek zapewnia kompleksową ocenę IMAT przy podobnych kosztach i wysiłku, jak nienaruszona morfologia. Ponadto, oprócz poprawy wizualizacji, barwienie ORO decelularyzacji umożliwia ilościowe określenie nacieku tłuszczu przez ekstrakcję lipidów. Aby dokładniej zagłębić się w cechy nacieku tłuszczowego, można zastosować barwnik fluorescencyjny BODIPY w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Umożliwia to rekonstrukcję pojedynczych kropelek lipidów IMAT w celu odwzorowania krajobrazu 3D, co nie jest możliwe w przypadku histologii, chyba że odcinki są analizowane na całej długości mięśnia. Chociaż mikroskop konfokalny nie jest standardowym sprzętem laboratoryjnym, jest bardziej prawdopodobne, że będzie dostępny na uniwersytecie lub w przemyśle niż rezonans magnetyczny lub tomografia komputerowa małych zwierząt. Co więcej, wiele z tych procesów można zautomatyzować, co zmniejsza koszt czasu w porównaniu z sekwencyjną histologią. Optymalizacja ustawień w mikroskopie konfokalnym jest dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę przy barwieniu BODIPY. Są one unikalne dla każdego mikroskopu. Wartością krytyczną jest intensywność lasera, która musi być wystarczająco wysoka, aby wykryć kropelki lipidów na odległej powierzchni mięśnia, jednocześnie nie nasycając sygnału z kropelek lipidów po bliższej stronie. Z tego powodu sugeruje się, że stosowanie barwienia BODIPY z mikroskopią konfokalną najlepiej sprawdza się w przypadku cieńszych mięśni, w tym EDL lub przepony.

Kilka ograniczeń tego podejścia wymaga omówienia. Po pierwsze, chociaż przewiduje się, że technika ta ma szerokie zastosowanie poza modelami urazów (kardiotoksyna i glicerol) u prezentowanych tutaj myszy, nowe zastosowania (np. model mdx) mogą wymagać optymalizacji, ponieważ rozmiar i skład mięśnia (np. zwłóknienie) mogą wpływać na decelularyzację, wymagając zwiększonego stężenia SDS lub czasu inkubacji. Inne modele chorobowe ze zmienioną masą mięśniową również wymagałyby analizy zarówno bezwzględnych, jak i znormalizowanych (do masy mięśniowej) wskaźników nacieku tłuszczowego w celu określenia bezwzględnej ilości lipidów lub procentu lipidów w stosunku do objętości mięśni, aby zapewnić bardziej znaczącą miarę wyniku. Co więcej, przewiduje się, że technika ta będzie szeroko stosowana do większych modeli zwierzęcych i biopsji ludzkich, ale może to wymagać optymalizacji dla każdego nowego zastosowania. Po drugie, w tej strategii cały mięsień musi być poświęcony temu testowi i nie może być wykorzystany do oceny innej cechy patologicznej. Badania, które mają na celu ocenę zmian podłużnych w IMAT, są lepiej obsługiwane za pomocą nieinwazyjnych technik obrazowania, a badania, których główny cel wymaga mięśnia do innych celów (histologia, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy, western blotting) są lepiej obsługiwane przez ocenę histologiczną, ponieważ pozostałą część zamrożonego mięśnia można przypisać do innych testów. Jednak test ten dobrze nadaje się do łączenia z testami in vivo , takimi jak bieganie na bieżni lub testy skurczowe ex vivo , ponieważ pomiary te można wykonać przed decelularyzacją44. Po trzecie, chociaż zastosowanie barwienia BODIPY z mikroskopią konfokalną zapewnia wizualizację i kwantyfikację kropelek lipidów w wysokiej rozdzielczości, nie może jednoznacznie zidentyfikować kropelek lipidów jako pojedynczych adipocytów, ponieważ błona komórkowa jest usuwana, a endogenne białka adipocytów są tracone. Adipocyty wieloplamkowe, reprezentujące niedojrzałe adipocyty lub fenotyp "brązowo-beżowy", można zidentyfikować jako wiele kropelek lipidów. Wreszcie, protokół nie działa dobrze na wcześniej zamrożone mięśnie. Ograniczenia te są prawdopodobnie najgłębsze w przypadku biopsji u ludzi, ponieważ podczas gdy cała biopsja może być pozbawiona komórek, przestrzenny rozkład IMAT w biopsji prawdopodobnie nie będzie bardziej reprezentatywny dla całego mięśnia niż wycinek histologiczny. Ponieważ jednak technika ta jest stosunkowo niewrażliwa na warunki pracy z biopsją niezamrożoną (np. godziny na lodzie w PBS), biopsję można później podzielić na różne testy, w tym część do decelularyzacji, co zapewniłoby lepszą rozdzielczość poszczególnych kropelek lipidów.

Podsumowując, opracowano nowatorską metodę jakościowej i ilościowej analizy naciekania tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych poprzez barwienie i obrazowanie zatrzymanego lipidu konstruktów pozbawionych komórek. Metodologia ta oferuje ulepszenia w stosunku do metod opartych na złotym standardzie, ponieważ umożliwia kompleksowe obrazowanie trójwymiarowej infiltracji tłuszczu w mięśniach oraz szybką, tanią kwantyfikację za pomocą barwienia OR. W celu uzyskania bardziej szczegółowych pomiarów, drugie rozpuszczalne w tłuszczach barwienie BODIPY zapewnia bardziej szczegółową ocenę ilościową liczby kropel lipidów, objętości i wzorca dystrybucji, zgodnie z obrazem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Razem te pomiary zapewniają naukowcom sposób na precyzyjny pomiar nacieku tłuszczu mięśni szkieletowych na poziomie poszczególnych kropelek lipidów bez pobierania próbek lub kosztownego nieinwazyjnego obrazowania.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez R01AR075773 do GAM.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowyFisher ScientificSLGP033RS
1 ml LuerLockFisher Scientific
12 mmFisher Scientific12545F
Płytki 12-dołkoweFisher Scientific08-772-29
Płytki 24-dołkoweFisher Scientific08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol)Sigma AldrichI95160,5 mg/ml roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc. Roztwór roboczy musi być świeży.
37% roztwór formaldehyduSigma Aldrich8187081000
40 µ m Filtr siatkowyFisher Scientific87711
6-dołkowe płytkiFisher Scientific08-772-1B
96-dołkowe płytkiFisher Scientific08-772-2C
BODIPY 493/503Fisher ScientificD-3922
C57BL/6J MyszyJackson Laboratory000664
Czasza do obrazowania konfokalnegoVWR734-2905
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SPEII
Mikroskop preparacyjny/stereoskopowyZeiss4107009123001000
Nożyczki do preparacjiNarzędzia do nauki14060-09
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki o naukach11254-20
EtanolFisher Scientific033361.K2
ImageJNIH
MatlabMathworks
Oil Red O PowderSigma AldrichO0625
Czytnik płytekBio-tekSynergy II 
Rocker/ShakerNiezawodny naukowy55D
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL37711% roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 miesiąc
Pipety transferoweFisher Scientific137119D
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15000-00
Szkiełka nakrywkowe 14823434 precyzyjnej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).">Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
  2. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).">Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).">Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
  4. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).">Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
  5. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).">Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
  6. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).">Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
  7. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).">Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  8. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).">Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  9. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).">Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
  10. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).">Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
  11. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957(2012).">Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957(2012).
  12. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).">Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
  13. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).">Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
  14. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).">Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
  15. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).">Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
  16. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597(2022).">Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597(2022).
  17. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717(2023).">Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717(2023).
  18. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).">Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
  19. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).">Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
  20. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).">Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).">Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
  22. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).">Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
  23. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66(2022).">Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66(2022).
  24. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).">Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
  25. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).">Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
  26. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).">Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
  27. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).">Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
  28. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).">Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
  29. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).">Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
  30. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).">Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  31. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).">Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
  32. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).">Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
  33. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).">Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  34. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).">Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
  35. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).">Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
  36. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).">Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  37. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1(2017).">Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1(2017).
  38. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183(2013).">Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183(2013).
  39. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036(2013).">Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036(2013).
  40. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).">Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  41. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  42. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).">Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  43. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).">Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
  44. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).">Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fatty InfiltrationSkeletal MuscleDecellularization TechniqueIntermuscular Adipose TissueLipid Droplet QuantificationOil Red O StainingConfocal MicroscopyImageJ AnalysisMuscle HistologySpectrophotometric Measurement

Related Articles