Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Soja (Glycine max) to cenna roślina uprawna w rolnictwie, która ma tysiące zastosowań przemysłowych. Korzenie soi są głównym miejscem interakcji z drobnoustrojami przenoszonymi przez glebę, które tworzą symbiozę w celu wiązania azotu i patogenów, co sprawia, że badania nad genetyką korzeni soi mają pierwszorzędne znaczenie dla poprawy jej produkcji rolnej. W transformacji genetycznej owłosionych korzeni soi (HRs) pośredniczy szczep Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) i jest ona skutecznym narzędziem do badania funkcji genów w korzeniach soi, trwającym zaledwie 2 miesiące od początku do końca. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który przedstawia metodę nadekspresji i wyciszania interesującego genu w HR soi. Metodologia ta obejmuje sterylizację nasion soi, zakażenie liścieni K599 oraz selekcję i zbiór genetycznie przekształconych HR w celu izolacji RNA i, w uzasadnionych przypadkach, analiz metabolitów. Przepustowość tego podejścia jest wystarczająca do jednoczesnego badania kilku genów lub sieci i może określić optymalne strategie inżynieryjne przed zaangażowaniem się w długoterminowe stabilne podejścia transformacyjne.
Wprowadzenie
Soja (Glycine max) jest jedną z najcenniejszych upraw w rolnictwie. Ma tysiące zastosowań komercyjnych i przemysłowych, takich jak żywność, pasza dla zwierząt, ropa naftowa i jako źródło surowców do produkcji1. Jego zdolność do tworzenia symbiotycznego związku z mikroorganizmami glebowymi wiążącymi azot, a mianowicie rhizobia, dodatkowo podnosi znaczenie badań nad genetyką soi2. Na przykład precyzyjne dostrojenie właściwości wiązania azotu w korzeniach soi może prowadzić do zmniejszenia emisji dwutlenku węgla i znacznie zmniejszyć wymagania dotyczące nawozów azotowych3. Tak więc zrozumienie genetyki, która kontroluje aspekty biologii korzeni soi, w szczególności, ma szerokie zastosowanie w rolnictwie i przemyśle. Biorąc pod uwagę te korzyści, ważne jest, aby mieć wiarygodny protokół do analizy funkcji genów soi.
Agrobacterium tumefaciens jest prawdopodobnie najczęściej używanym narzędziem do genetycznej transformacji roślin, ponieważ ma zdolność integracji transferu DNA (T-DNA) z genomem jądrowym wielu gatunków roślin. Kiedy Agrobacterium infekuje roślinę, przenosi plazmid indukujący nowotwór (Ti) do chromosomu gospodarza, prowadząc do powstania guza w miejscu infekcji. Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium, jest szeroko stosowana od dziesięcioleci do analizy funkcjonalnej genów i w celu modyfikacji cech upraw4. Chociaż każdy gen będący przedmiotem zainteresowania może być łatwo przeniesiony do komórek roślinnych gospodarza poprzez transformację, w której pośredniczy A. tumefaciens, metoda ta ma kilka wad; Jest to czasochłonne, kosztowne i wymaga rozległej wiedzy specjalistycznej w przypadku wielu gatunków roślin, takich jak soja. Chociaż kilka odmian soi można przekształcić za pomocą metody węzłów liścieniowych przy użyciu A. tumefaciens, nieskuteczność tego podejścia wymaga zastosowania alternatywnej technologii transformacji genetycznej, która jest szybka i wysoce wydajna4,5. Nawet laik może skorzystać z tej metody transformacji owłosionego korzenia (HR) za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, aby przezwyciężyć te wady.
Transformacja HR jest stosunkowo szybkim narzędziem, nie tylko do analizy funkcji genów, ale także do zastosowań biotechnologicznych, takich jak produkcja wyspecjalizowanych metabolitów i chemikaliów wysokowartościowych oraz złożonych bioaktywnych glikoprotein6. Produkcja HR soi nie wymaga rozległej wiedzy specjalistycznej, ponieważ mogą one być generowane przez zranienie powierzchni liścieni, a następnie zaszczepienie Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes wyraża geny wirulencji (Vir) kodowane przez plazmid Ti, które przenoszą, przenoszą i integrują jego segment T-DNA z genomem komórek roślinnych, jednocześnie stymulując ektopowy wzrost korzeni8.
W porównaniu z innymi systemami ekspresji genów soi, takimi jak biolistyka czy transformacja tkanek komórkowych, komórkowych i narządowych oparta na A. tumefaciens, system ekspresji HR wykazuje kilka zalet. Po pierwsze, HR są genetycznie stabilne i szybko produkowane na podłożach wolnych od hormonów1,9,10. Dodatkowo, HR mogą wytwarzać wyspecjalizowane metabolity w ilościach równych lub większych niż rodzime korzenie11,12. Te zalety sprawiają, że HR są pożądanym narzędziem biotechnologicznym dla gatunków roślin, które są niezgodne z A. tumefaciens lub które wymagają specjalnych warunków hodowli tkankowej w celu utworzenia kompatybilnych tkanek. Metoda HR jest skutecznym podejściem do analizy interakcji białko-białko, lokalizacji subkomórkowej białek, produkcji rekombinowanych białek, fitoremediacji, mutagenezy i efektów całego genomu przy użyciu sekwencjonowania RNA13,14,15. Może być również wykorzystany do badania produkcji wyspecjalizowanych metabolitów, które mają wartość w branży, w tym gliceolin, które leczą obronę soi przed ważnym patogenem mikrobiologicznym Phytophthora sojae i mają imponujące działanie przeciwnowotworowe i neuroprotekcyjne u ludzi16,17.
Ten raport demonstruje łatwy i efektywny protokół do produkcji HR soi. W porównaniu z poprzednimi metodami transformacji HR, ten protokół zapewnia znaczną (33%-50%) poprawę tempa powstawania HR poprzez wstępne badanie transformantów A. rhizogenes na obecność plazmidu Ti przed inokulacją liścieni soi. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu poprzez transformację kilku wektorów binarnych, które nadmiernie eksprymują lub wyciszają geny czynnika transkrypcyjnego soi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie kroki postępowania były przeprowadzane w sterylnych warunkach.
1. Sterylizacja nasion soi
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść 16-20 okrągłych nasion soi Williams 82 w nieskazitelnym stanie (tj. bez pęknięć i skaz) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Dodaj 30 ml 70% alkoholu izopropylowego, delikatnie wstrząsaj przez 30 s, a następnie zdekantuj alkohol.
- Delikatnie potrząsaj nasionami z 30 ml 10% wybielacza przez 10 s i pozostaw nasiona w roztworze na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C). Po 5 minutach odcedź wybielacz.
- Powtórz wytrząsanie trzy razy z 30 ml sterylnego ultraczystegoH2Oprzez 1 minutę na płukanie i wyrzućH2Omiędzy każdym płukaniem.
- Wysterylizowane nasiona umieścić na bibule filtracyjnej nasączonej 5 ml pożywki do kiełkowania i kouprawy (GC) (autoklaw o połowie płynu Murashige i Skoog [MS] z 1% sacharozą [pH = 5,8], a następnie dodać 2,5 ml / l witamin) na sterylnych szalkach Petriego.
- Umieść płytki w ciemności w temperaturze nasłonecznej (25 °C) na 3 dni przed przeniesieniem płytek w temperaturze 22 °C pod 16 godzin chłodnych białych lamp fluorescencyjnych T5 (100 μE m-2·s-1) przez 4 dni, aby nasiona mogły wykiełkować.
UWAGA: Wyrzuć nasiona, które są pomarszczone lub popękane. Najlepsze nasiona to te, które są duże i jednolicie żółte. Wysterylizuj co najmniej dwukrotnie więcej nasion niż jest to wymagane do eksperymentu, aby wybrać nasiona dobrej jakości, ponieważ niektóre nasiona mogą nie być optymalne z powodu uszkodzeń, chorób lub braku kiełkowania.
2. Zakażenie liścieni K599
UWAGA: Użyj wektorów serii pGWB, ponieważ ich podwójna selekcja zapewnia genomową integrację całej kasety T-DNA. Elektroporacja została wykorzystana do przekształcenia wektora binarnego zawierającego interesujący nas gen w A. rhizogenes pRi265918.
- Opierając się na sekwencji plazmidu A. rhizogenes pRi2659 class18, zaprojektuj startery do wykrywania genu plazmidu Ti VirD2 (VirD2 do przodu: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 rewers: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Oczekiwana wielkość amplifikacji: 221 pz). Po transformacji należy przetestować kolonie Agrobacterium pod kątem zatrzymywania VirD2 w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu zestawu do PCR (patrz tabela materiałów). Cykl PCR: 94 °C przez 3 min; 35 cykli (94 °C przez 1 min, 58 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 1 min); i 72 °C przez 10 min.
- Po dokonaniu selekcji kolonii A. rhizogenes, która zawiera zarówno VirD2, jak i gen będący przedmiotem zainteresowania (GOI), należy rozprowadzić trochę na płytkach Luria-Bertani (LB) zawierających odpowiednie antybiotyki (50 mg/l) dla interesującego plazmidu i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. W przypadku stosowania spektynomycyny należy dodać stężenie 100 mg/l.
- Za pomocą końcówki pipety P200 zeskrobać ~1,5 cm długości K599 Agrobacterium z płytek LB i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu fosforanowego (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Rozcieńczyć Agrobacterium w wysterylizowanym, ultraczystymH2O(v/v = 1:1) i acetosyringonie (AS; 100 mM zapas w dimetylosulfotlenku [DMSO], v/v = 1:1000). Zmierzyć absorbancję za pomocą rurki kuwetowej o gęstości optycznej 600 nm (OD600). Oczekiwany optymalny zakres wynosi od 0,5 do 0,8.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego zanurz wysterylizowany skalpel w roztworze K599 Agrobacterium i wykonaj kilka nacięć o głębokości 1 mm wzdłuż wewnętrznej powierzchni (adaksyjna, płaska strona) liścienia. Podczas inokulacji użyj wysterylizowanych kleszczy, aby ustabilizować liścienie.
- Umieść około 6-8 liścieni ściętą stroną do dołu na szalce Petriego zawierającej bibułę filtracyjną nasyconą pożywką GC z AS.
UWAGA: Do przygotowania 6 płytek wystarczy 50 ml pożywki GC i 50 μL 100 mM AS, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM. - Inkubować płytki w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 3 dni w 16 godzinnym fotoperiodzie (~65 μE).
- Przenieś zakażone liścienie na płytki wzrostu owłosionych korzeni (HRG) (autoklaw o połowie mocy MS z 3% sacharozą [pH = 5,8] i 2,6 g/l Gelzanu, a następnie dodaj 2,5 ml/l mieszaniny witamin i 500 mg/l timentyny).
UWAGA: Wystąpiły pewne problemy z timentiną od niektórych alternatywnych dostawców, z których K599 nie został wyeliminowany. Zaleca się stosowanie wyższych płytek Petriego (100 mm x 25 mm) dla podłoża HRG. - Inkubować płytki HRG w temperaturze 22 °C w komorze wzrostowej z parametrami ustawionymi na światło 100 μE przez 16 godzin fotoperiodu, aż do zaobserwowania korzeni pierwotnych z korzeniami wtórnymi o długości 2-3 cm (~3-4 tygodnie).
3. Selekcja i zbieranie HR
- Zbierz korzenie pierwotne (5-7 cm długości), które wyrastają z kalusa i zawierają korzenie wtórne (2-3 cm długości) za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Przenieść do selekcji HRG płytki zawierające odpowiednie antybiotyki. Pozwól HR rosnąć jeszcze przez 5 dni na wybranych płytkach HRG.
UWAGA: Kanamycyna (50 mg/L), higromycyna (50 mg/L) lub fosfinotrycyna (10 mg/L) są zwykle używane do selekcji. W przypadku wektorów ekspresyjnych pGWB2 służy do nadekspresji, pANDA35HK służy do wyciszania RNAi, pGWB6 służy do lokalizacji subkomórkowej, a pMDC7 służy do indukowanej ekspresji. - W 5 dniu zbierz transgeniczne HR z korzeniami wtórnymi o długości 3-6 cm. Obserwując białka fluorescencyjne, korzenie wtórne mają niewielką autofluorescencję. W przypadku wykonywania zabiegów elicytorowych lub chemicznych należy pokroić korzenie wtórne na 1 cm kawałki i umieścić ~100 mg na agarze HRG w stosie. Następnie nasycić stosy 80 μl odpowiedniej substancji i pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej (25 °C).
- Po pożądanym czasie leczenia przystąp do ekstrakcji RNA lub metabolitów.
- W przypadku RNA szybko osusz korzenie na wysterylizowanym ręczniku papierowym i zbierz je bezpośrednio do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
- Natychmiast uszczelnij górną część rurki za pomocą parafilmu, wykonaj dwa małe otwory za pomocą spiczastych kleszczy i zanurz probówki w ciekłym azocie. Liofilizować przez 3 dni, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Konieczne jest, aby wybrać HR, które są białe. Po 5 dniach wzrostu na selektywnej płytce, transgeniczne HR pozostaną białe, ale nietransgeniczne korzenie zmienią kolor na brązowy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne wyniki pochodzą z opublikowanych danych19,20. Wyniki kolonialnej reakcji PCR (cPCR) dla transformowanego szczepu Agrobacterium K599 przedstawiono na Ryc. 1. Jak wskazują dodatnie kolonie na Ryc. 1, geny zainteresowania zostały wykryte za pomocą cPCR (Ryc. 1A). Jednakże od jednej trzeciej do jednej połowy kolonii okazały się ujemne w badaniu przesiewo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ciągu ostatniej dekady metoda HR soi została opracowana jako potężne narzędzie do badania genów zaangażowanych w wiązanie azotu22,23, tolerancję na stres biotyczny i abiotyczny24,25 oraz szlaki biosyntezy metabolitów26,27. Wiedza o tym, w jaki sposób rośliny wytwarzają metabolity, ma wiele zalet dla produkcji rolnej i przemysłu farmaceutycznego,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) grant numer RGPIN-2020-06111 oraz hojną darowiznę od Brada Lace'a. Chcielibyśmy podziękować Wayne'owi Parrottowi (University of Georgia) za K599 Agrobacterium i wstępny protokół, a także laboratorium Nakagawa & Hachiya (Shimane University) za puste wektory pGWB2, pGWB6 i pANDA35HK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Wybielacz | lavo | 21124 | |
| DMSO | Bioodczynniki Fisher | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycyna | Phytotech | HHA0397050B | |
| Alkohol izopropylowy | Fisher | chemiczny 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB w proszku | Bioodczynniki Fishera | 200318 | |
| proszku MS | Keson labs | 2210001 | |
| Bioreagenty | Na2HPO4 | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemiczny | 192946 | |
| szalki Petriego | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Fosfinotrycyna | Cedarlan | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sacharoza | Bioshop | 2D76475 | |
| Tymentyna | Keson labs | 12222002 | |
| Witaminy | Caisson labs | 2211010 |
Bibliografia
- Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619(2020).
- Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
- Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094(2022).
- Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186(2017).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
- Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195(2021).
- Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
- Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261(2017).
- Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73(2021).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
- Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427(2019).
- Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
- Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887(2022).
- Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
- Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545(2023).
- Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
- Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149(2019).
- Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171(2021).
- Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
- Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170(2021).
- Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
- Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118(2022).
- Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
- Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
