Artykuł metodologiczny

Metody osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w hydrożelach w makroskali

DOI:

10.3791/65500

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w makroskalowych matrycach hydrożelowych bez potrzeby stosowania zewnętrznej fazy płynnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieci syntetycznych genów stanowią platformę dla naukowców i inżynierów do projektowania i budowania nowatorskich systemów z funkcjonalnością zakodowaną na poziomie genetycznym. Podczas gdy dominującym paradygmatem wdrażania sieci genowych jest obudowa komórkowa, syntetyczne sieci genowe mogą być również wdrażane w środowiskach bezkomórkowych. Obiecujące zastosowania bezkomórkowych sieci genowych obejmują bioczujniki, ponieważ wykazano, że urządzenia te są odporne na cele biotyczne (wirusy Ebola, Zika i SARS-CoV-2) i abiotyczne (metale ciężkie, siarczki, pestycydy i inne zanieczyszczenia organiczne). Systemy bezkomórkowe są zwykle stosowane w postaci ciekłej w naczyniu reakcyjnym. Możliwość osadzenia takich reakcji w matrycy fizycznej może jednak ułatwić ich szersze zastosowanie w szerszym zestawie środowisk. W tym celu opracowano metody osadzania reakcji bezkomórkowej syntezy białek (CFPS) w różnych matrycach hydrożelowych. Jedną z kluczowych właściwości hydrożeli sprzyjających tej pracy jest wysoka zdolność materiałów hydrożelowych do rekonstytucji w wodzie. Dodatkowo hydrożele posiadają właściwości fizyczne i chemiczne, które są korzystne funkcjonalnie. Hydrożele można liofilizować do przechowywania i ponownie nawodnić do późniejszego wykorzystania. Przedstawiono dwa protokoły krok po kroku dotyczące włączania i oznaczania reakcji CFPS w hydrożelach. Po pierwsze, system CFPS można włączyć do hydrożelu poprzez ponowne uwodnienie lizatem komórkowym. System w hydrożelu może być następnie indukowany lub wyrażany konstytutywnie w celu pełnej ekspresji białka przez hydrożel. Po drugie, lizat komórkowy może zostać wprowadzony do hydrożelu w punkcie polimeryzacji, a cały system może być liofilizowany i ponownie uwodniony w późniejszym momencie roztworem wodnym zawierającym induktor układu ekspresyjnego zakodowanego w hydrożelu. Metody te mają potencjał, aby umożliwić tworzenie bezkomórkowych sieci genów, które nadają zdolności sensoryczne materiałom hydrożelowym, z możliwością zastosowania poza laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia syntetyczna integruje różne dyscypliny inżynieryjne w celu projektowania i konstruowania biologicznie opartych części, urządzeń i systemów, które mogą wykonywać funkcje, które nie występują w naturze. Większość podejść biologii syntetycznej jest nadal związana z żywymi komórkami. W przeciwieństwie do tego, bezkomórkowe systemy biologii syntetycznej zapewniają bezprecedensowy poziom kontroli i swobody w projektowaniu, umożliwiając większą elastyczność i skrócony czas inżynierii systemów biologicznych, jednocześnie eliminując wiele ograniczeń tradycyjnych metod ekspresji genów opartych na komórkach1,2,3. CFPS jest wykorzystywany w coraz większej liczbie zastosowań w wielu dyscyplinach, w tym w konstruowaniu sztucznych komórek, prototypowaniu obwodów genetycznych, opracowywaniu bioczujników i wytwarzaniu metabolitów4,5,6. CFPS okazał się również szczególnie przydatny do produkcji rekombinowanych białek, które nie mogą być łatwo wyrażane w żywych komórkach, takich jak białka podatne na agregację, białka transbłonowe i białka toksyczne6,7,8.

CFPS jest zazwyczaj wykonywany w reakcjach cieczy. Może to jednak ograniczyć ich zastosowanie w niektórych sytuacjach, ponieważ każde urządzenie bezkomórkowe w płynie musi być umieszczone w naczyniu reakcyjnym. Uzasadnieniem dla opracowania przedstawionych tu metod było zapewnienie solidnych protokołów osadzania bezkomórkowych urządzeń biologii syntetycznej w hydrożelach, nie jako platformy do produkcji białek per se, ale zamiast tego, aby umożliwić wykorzystanie hydrożeli jako fizycznego podłoża do wdrażania urządzeń bezkomórkowych poza laboratorium. Zastosowanie hydrożeli jako podwozia CFPS ma kilka zalet. Hydrożele to materiały polimerowe, które pomimo wysokiej zawartości wody (czasami przekraczającej 98%) posiadają właściwości stałe9,10,11. Mają zastosowanie jako pasty, smary i kleje i są obecne w produktach tak różnorodnych, jak soczewki kontaktowe, opatrunki na rany, morskie taśmy klejące, polepszacze gleby i pieluchy dla niemowląt9,11,12,13,14. Hydrożele są również aktywnie badane jako pojazdy dostarczające leki9,15,16,17. Hydrożele mogą być również biokompatybilne, biodegradowalne i posiadać pewne własne reakcje na bodźce9,18,19,20. Dlatego celem jest stworzenie synergii między funkcjonalnością wywodzącą się z biologii molekularnej a materiałoznawstwem. W tym celu podjęto wysiłki w celu zintegrowania bezkomórkowej biologii syntetycznej z szeregiem materiałów, w tym kolagenem, laponitem, poliakrylamidem, fibryną, peptydem PEG i agarozą11,21,22, a także do powlekania powierzchni ze szkła, papieru i tkanin11,23,24 z urządzeniami CFPS. Przedstawione tu protokoły pokazują dwie metody osadzania reakcji CFPS w matrycach hydrożelowych w skali makro (tj. >1 mm), wykorzystując agarozę jako materiał wzorcowy. Agaroza została wybrana ze względu na jej wysoką zdolność wchłaniania wody, kontrolowane właściwości samożelujące i regulowane właściwości mechaniczne11,24,25,26. Agaroza wspiera również funkcjonalny CFPS, jest tańsza niż wiele innych alternatyw hydrożelowych i ulega biodegradacji, co czyni ją atrakcyjnym wyborem jako eksperymentalny system modelowy. Metody te zostały jednak wcześniej wykazane jako odpowiednie do osadzania CFPS w szeregu alternatywnych hydrożeli11. Biorąc pod uwagę szeroki zakres zastosowań hydrożeli i funkcjonalność CFPS, zademonstrowane tu metody mogą stanowić podstawę, na podstawie której naukowcy są w stanie opracować biologicznie ulepszone materiały hydrożelowe dostosowane do ich własnych celów.

W poprzednich badaniach, systemy mikrożelowe o zakresie wielkości od 1 μm do 400 μm były używane do wykonywania CFPS w hydrożelach zanurzonych w buforze reakcyjnym23,27,28,29,30,31. Wymóg zanurzania hydrożeli w reakcyjnych CFPS ogranicza jednak możliwości ich wykorzystania jako materiałów samych w sobie. Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na zachodzenie reakcji CFPS w hydrożelach bez konieczności zanurzania żeli w reakcyjnych. Po drugie, zastosowanie żeli w makroskali (o wielkości od 2 mm do 10 mm) pozwala na badanie fizycznej interakcji między hydrożelami a ekspresją genów w wolnych komórkach. Na przykład za pomocą tej techniki można zbadać, jak matryca hydrożelowa wpływa na reakcje CFPS11 i jak reakcje CFPS mogą wpływać na matrycę hydrożelową31. Większe rozmiary hydrożeli pozwalają również na opracowywanie nowych, bioprogramowalnych materiałów32. Wreszcie, dzięki osadzeniu reakcji CFPS w hydrożelach, istnieje również potencjalne zmniejszenie zapotrzebowania na plastikowe naczynia reakcyjne. W przypadku stosowania czujników bezkomórkowych ma to wyraźną przewagę nad urządzeniami zależnymi od wyrobów z tworzyw sztucznych. Podsumowując, osadzanie reakcji CFPS w hydrożelach zapewnia szereg korzyści w zakresie wdrażania urządzeń bezkomórkowych poza laboratorium.

Ogólnym celem przedstawionych tutaj metod jest umożliwienie przeprowadzenia reakcji CFPS w matrycach hydrożelowych. Zademonstrowano dwie różne metody osadzania bezkomórkowych reakcji produkcji białek w materiałach hydrożelowych w skali makro (Rysunek 1). W metodzie A składniki CFPS są wprowadzane do liofilizowanych hydrożeli agarozowych w celu utworzenia układu aktywnego. W metodzie B stopiona agaroza jest mieszana ze składnikami reakcji CFPS w celu utworzenia kompletnego systemu hydrożelowego CFPS, który jest następnie liofilizowany i przechowywany do czasu, gdy będzie potrzebny. Systemy te można ponownie uwodnić za pomocą pewnej ilości wody lub buforu i analitu w celu rozpoczęcia reakcji.

To badanie wykorzystuje systemy oparte na lizacie komórek Escherichia coli. Są to jedne z najpopularniejszych eksperymentalnych systemów CFPS, ponieważ przygotowanie lizatu komórek E. coli jest proste, niedrogie i pozwala osiągnąć wysoką wydajność białka. Lizat komórkowy jest uzupełniony składnikami makromolekularnymi potrzebnymi do przeprowadzenia transkrypcji i translacji, w tym rybosomami, tRNA, syntetazami aminoacylo-tRNA oraz czynnikami inicjacji, wydłużenia i terminacji. W szczególności w artykule przedstawiono produkcję eGFP i mCherry w hydrożelach agarozowych przy użyciu lizatów komórek E. coli oraz monitorowano pojawienie się fluorescencji za pomocą czytnika płytek i mikroskopii konfokalnej. Reprezentatywne wyniki dla czytnika płytek do mikromiareczkowania można zobaczyć w Whitfield et al.31, a dane bazowe są publicznie dostępne33. Ponadto ekspresja białek fluorescencyjnych w żelach została potwierdzona za pomocą mikroskopii konfokalnej. Dwa protokoły przedstawione w tym artykule pozwalają na montaż i przechowywanie urządzeń genetycznych opartych na CFPS w materii, a ostatecznym celem jest stworzenie odpowiedniego środowiska fizycznego do dystrybucji obwodów genowych wolnych od komórek w sposób wspierający rozmieszczenie w terenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bufor lizatu komórkowego i przygotowanie pożywki

  1. Przygotowanie 2x agaru YT+P i podłoża
    1. Przygotuj 2x agar YT+P, odmierzając 16 g/L tryptonu, 10 g/L ekstraktu drożdżowego, 5 g/L NaCl, 40 mL/L 1 M K2HPO4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 i 15 g/L agaru. W przypadku bulionu 2x YT+P postępuj zgodnie z poprzednim składem, ale pomiń agar.
    2. Sterylizuj przez autoklawowanie 2x YT+P.
  2. Przygotowanie bufora S30A
    1. Przygotuj bufor S30A z 5,88 g/l Mg-glutaminianu, 12,195 g/l K-glutaminianu i 25 ml/l 2 M Tris, dostosowany do pH 7,7 z kwasem octowym.
    2. Bufor S30A należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  3. Przygotowanie bufora S30B
    1. Przygotuj bufor S30B z 5,88 g/l Mg-glutaminianu i 12,195 g/l K-glutaminianu, dostosowany do pH 8,2 za pomocą 2 M Tris.
    2. Przechowywać bufor S30B w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.

2. Przygotowanie lizatu komórkowego (protokół 4-dniowy)

  1. Dzień 1
    1. Wlej 2x YT+P do płytek agarowych uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny.
    2. Usunąć E. coli z wywaru glicerolu w temperaturze -80 °C i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Dzień 2
    1. Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki 2x YT+P do 400 ml bulionu 2x YT+P (uzupełnionego ampicyliną) w kolbie o pojemności 1 l.
    2. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 220 obr./min.
  3. Dzień 3
    1. Zmierzyć i zapisać OD600 z 24-godzinnych kultur; wzrost jest wystarczający przy OD600 wynoszącym 3-4,
      UWAGA: Weź 1 ml porcji kultury bakteryjnej i wykonaj seryjne rozcieńczenie pożywką (2x bulion YT+P) przed pomiarem średnicy zewnętrznej600 nm. Uwzględnij efekt rozcieńczenia przy obliczaniu średnicy zewnętrznej600.
    2. Przenieś kulturę równomiernie między wstępnie schłodzonymi butelkami wirówkowymi o pojemności 500 ml.
    3. Odwirować przy 4 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
    4. Podczas wirowania zakończ przygotowanie buforu S30A, dodając 2 ml/l 1 M DTT do wcześniej przygotowanego buforu S30A, mieszając i utrzymując bufor na lodzie.
    5. Ponownie zawiesić granulki komórek w 200 ml buforu S30A.
    6. Energicznie wiruj butelki, aż cała granulka zostanie całkowicie rozpuszczona, utrzymując komórki na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
    7. Odwirować przy 4 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
    8. Powtórz kroki 2.3.5-2.3.7 (włącznie).
    9. Dodać 40 ml buforu S30A do każdej butelki wirówki, ponownie zawiesić granulki i przenieść do wstępnie zważonych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    10. Wirować przy 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez dekantację i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety, utrzymując go w jak największym stopniu na lodzie.
    11. Ponownie zważyć probówki wirówkowe, zapisać nową masę i obliczyć masę granulek.
    12. Granulki należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Dzień 4
    1. Rozmrozić granulki na lodzie.
    2. Na 1 g osadu dodać: 1,2 ml buforu S30A (DTT dodano przed użyciem), 275 μl inhibitora proteazy (8 mM zapasu) i 25 μl lizozymu (10 mg/ml bulionu).
    3. Energicznie wiruj, aż granulki zostaną całkowicie rozpuszczone bez pozostałych grudek, utrzymując je na lodzie tak bardzo, jak to możliwe.
    4. W probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml należy poddać sonifikacji zawiesin komórek przy 120 W, 20 kHz, 30% amplitudzie i impulsach włączania/wyłączania 20 s/40 s przez 5 minut sonikacji.
    5. Wirować przy 4 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórek.
    6. Przenieść sklarowany osad do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    7. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min przez 80 min.
    8. Przygotuj materiały do dializy, dodając 1 ml/l 1 M DTT do buforu S30B. Wymieszaj i dodaj 900 ml do sterylnej zlewki o pojemności 1 l. Dodać mieszadło magnetyczne i utrzymywać je w temperaturze 4 °C.
    9. Po reakcji spływu przenieść ekstrakt komórkowy z etapu 2.4.7 do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Skonsolidować bezgranulowany supernatant na lodzie w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    11. Określ całkowitą objętość wyprodukowanego ekstraktu komórkowego i uwodnij niezbędną liczbę kaset dializacyjnych 10K MWCO, zanurzając je w S30B na 2 minuty.
    12. Załaduj kasety za pomocą strzykawki z maksymalnie 3 ml ekstraktu. Dializować do trzech kaset na 1 litrową zlewkę, mieszając w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
    13. Po zakończeniu dializy, która klaruje ekstrakt, przenieś ekstrakt do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Wirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    14. Skonsolidować oczyszczony ekstrakt w świeżej probówce wirówkowej na lodzie i krótko zmieszać, aby wymieszać.
    15. Oznaczyć stężenie białka w ekstrakcie za pomocą fluorometru.
    16. Rozcieńczyć ekstrakt do stężenia 44,5 mg/ml przy użyciu wstępnie schłodzonego ddH2O.
    17. Podwielokrotność rozdzielić na 200 μl podwielokrotności, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie liofilizowanych hydrożeli (Metoda A)

  1. Odważyć 0,75 g agarozy, dodać ddH2O do objętości 100 ml i podgrzewać w kuchence mikrofalowej w ciągu 30 sekund w wysokich temperaturach, aby uzyskać stopiony bulion agarozowy.
  2. Za pomocą pipety przenieś 50 μl stopionej agarozy do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i pozostaw żel do polimeryzacji przez 20-30 minut (polimeryzacja zachodzi szybciej, jeśli żele zostaną przeniesione do lodówki).
  3. Błyskawiczne zamrożenie probówek do mikrowirówek, zawierających spolimeryzowane żele, w ciekłym azocie.
  4. Zdejmij pokrywkę probówek wirówkowych, przykryj otwory probówki wirówkowej folią woskową i kilkakrotnie przekłuj folię końcówką igły lub pipety.
  5. Przenieść probówki do mikrowirówek zawierające spolimeryzowane żele do przechowywania w temperaturze -80 °C przez 1-2 godziny.
  6. Odzyskać probówki wirówkowe z przechowywania w temperaturze -80 °C i umieścić w liofilizatorze, upewniając się, że probówki są całkowicie suche.
  7. Włączyć liofilizator z następującymi ustawieniami: temperatura: −20 °C, ciśnienie: 0,1 mbar.
  8. Pozostaw żel do wyschnięcia na noc do wyschnięcia.
  9. Odzyskać żele z liofilizatora i umieścić je w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
    UWAGA: Żele można przechowywać w stanie liofilizowanym przez okres do 1 roku.

4. Przygotowanie zapasu 14x roztworu energetycznego

  1. Połączyć wszystkie składniki reakcji (Tabela 1) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie, aby uzyskać 14-krotny roztwór energetyczny.
  2. Porcję 14-krotnego roztworu energetycznego rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C (można użyć porcji o mniejszej objętości).
    UWAGA: Roztwór 14x energy może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C, jeśli unika się wielokrotnego zamrażania i rozmrażania probówek.

5. Przygotowanie 4x zapasu aminokwasów

  1. Rozmrozić na lodzie wszystkie 20 składników aminokwasowych zestawu RTS Amino Acid Sampler. Zmieszaj aminokwasy, aby upewnić się, że są całkowicie rozpuszczone.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml połącz wszystkie 20 aminokwasów i dodaj 12 ml sterylnego ddH2O. Wiruj, aż roztwór stanie się klarowny, z lekką mgiełką białego zabarwienia.
  3. Porcjować 4x aminokwasy do 1,5 ml probówek do mikrowirówek (500 μl podwielokrotności).
  4. Błyskawiczne zamrożenie 4x podwielokrotności roztworu aminokwasów w ciekłym azocie i przeniesienie podwielokrotności do przechowywania w temperaturze -80 °C.

6. Bezkomórkowa kalibracja bufora

UWAGA: Bufor CFPS używany do reakcji hydrożelowych został skalibrowany dla optymalnych stężeń DTT, Mg-glutaminianu i K-glutaminianu zgodnie z protokołem w Banks et al.34 zmodyfikowany z Sun et al.35. Kompozycje reakcji kalibracyjnych zostały wybrane metodą projektowania eksperymentów (DOE), przy czym wybrano siedem poziomów czynnikowych dla K-glutaminianu (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1000 mM, 1200 mM, 1400 mM), Mg-glutaminianu (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) oraz DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). JMP Pro 15 został wykorzystany do wygenerowania niestandardowego projektu DOE (Tabela 2) i przeprowadzenia analizy w celu określenia optymalnych stężeń czynników.

  1. Odzyskaj bezkomórkowy ekstrakt z przechowywania w temperaturze -80 °C i rozmroź na lodzie.
  2. Rozmrozić na lodzie 4x aminokwasy, 14x roztwór energetyczny, 40% PEG-8000, plazmidowe DNA, 3 M K-glutaminianu, 100 mM Mg-glutaminianu i 100 mM DTT.
  3. Stwórz wzorcową mieszankę kalibracyjną, łącząc 12,5 μl 4x aminokwasów, 3,57 μl 14x roztworu energetycznego, 2,5 μl 40% PEG-8000, 3 μg plazmidowego DNA i 10 μl ekstraktu bezkomórkowego (44,5 mg/ml) i uzupełnij do 35 μl na reakcję z ddH2O.
  4. Rozprowadzić 35 μl mieszanki wzorcowej do dołków czarnej 384-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.
  5. Postępując zgodnie z projektem DOE, dodaj odpowiednią objętość Mg-glutaminianu, K-glutaminianu i DTT do każdej reakcji, wraz z ddH2O, aby każda reakcja osiągnęła do 50 μL.
  6. Przenieść płytkę mikromiareczkową do czytnika płytek w celu wykrycia i analizy fluorescencji przy użyciu opisanych ustawień czytnika płytek (dla mCherry): wzbudzenie: 587 nm, emisja: 610 nm, szerokość pasma długości fali: 12 nm, optyka: góra, temperatura: 37 °C, przy czym odczyty fluorescencji są zbierane co 5 minut przez 4 godziny całkowitego czasu odczytu. Inkubować płytki, wstrząsając na pulsacyjnym ustawieniu z prędkością 60 obr./min.
  7. Prześlij wyniki do projektu JMP DOE i wygeneruj profil predykcyjny w celu określenia optymalnych poziomów stężenia dla K-glutaminianu, Mg-glutaminianu i DTT w oparciu o pożądane zmienne odpowiedzi; w tym przypadku zmiennymi odpowiedzi były maksymalna fluorescencja i szybkość reakcji.
  8. Połączyć odczynniki, jak pokazano w tabeli 3, aby utworzyć bufor 2X CFPS
  9. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C

7. CFPS w uwodnionych liofilizowanych hydrożelach (Metoda A)

UWAGA: Plazmidy używane w reakcjach CFPS zostały stworzone przy użyciu komponentów z modułowego zestawu narzędzi EcoFlex dla E. coli36 i opisane w Whitfield et al.11 mCherry i eGFP były pod kontrolą konstytutywnego JM23100 promotora. Komponenty te są dostępne w firmie Addgene.

  1. Odzyskaj bezkomórkowy ekstrakt z przechowywania w temperaturze -80 °C i rozmrażaj na lodzie przez około 20 minut.
  2. Zbierz 2x bufor CFPS i plazmidowe DNA, a następnie rozmrozić na lodzie.
  3. Zbierz liofilizowane hydrożele i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przez 15 minut, pozostawiając żele na stole.
  4. Przenieś żele do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, w razie potrzeby przycinając je skalpelem, aby zmieściły się w studzienkach.
  5. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml połącz 10 μl ekstraktu bezkomórkowego z 25 μl buforu 2x CFPS i 4 μg plazmidowego DNA; uzupełnij do całkowitej objętości 50 μl ddH2O, aby utworzyć roztwór CFPS.
  6. Odpipetować roztwór CFPS na liofilizowane hydrożele.
  7. Pozostaw żele do nasiąknięcia w systemie CFPS przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Przenieść żele na czarną 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania za pomocą szpatułki.
  9. Przenieść płytkę do mikromiareczkowania do czytnika płytek w celu wykrycia i analizy fluorescencji przy użyciu ustawień czytnika płytek opisanych w kroku 6.6. Reprezentatywne wyniki są dostępne w poprzednich badaniach31,33.

8. Bezkomórkowa synteza białek w rozmieszczanych hydrożelach (Metoda B)

  1. Odzyskaj bezkomórkowy ekstrakt z przechowywania w temperaturze -80 °C i rozmrażaj na lodzie przez około 20 minut.
  2. Zbierz plazmidowe DNA i rozmroź na lodzie.
  3. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie połącz 10 μl ekstraktu bezkomórkowego z 3 μg plazmidowego DNA i 25 μl buforu 2x CFPS, co daje całkowitą objętość 37,5 μl.
  4. Odmierz 3 g agarozy i dodaj do 100 ml buforu ddH2O, aby uzyskać 3% agarozy.
  5. Mikrofale 3% agarozy w ciągu 30 sekund wybuchają z dużą mocą.
  6. Odpipetować 12,5 μl stopionej agarozy do 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających CFPS, wymieszać do całkowitej objętości 50 μl.
  7. Pozostawić stopioną agarozę do ostygnięcia, ale nie polimeryzować, pozostawiając agarozę w bloku grzewczym ustawionym na 50 °C.
  8. Połączyć stopioną agarozę z roztworem CFPS; wymieszać przez pipetowanie i mieszanie końcówką, a następnie upewnić się, że poruszasz się szybko, aby uniknąć polimeryzacji żelu przed zmieszaniem roztworu CFPS.
  9. Pozostaw żele do ostygnięcia w temperaturze pokojowej i polimeryzuj przez około 2 minuty.
  10. Przenieść spolimeryzowaną agarozę do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą szpatułki i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
  11. Umieścić zamrożone hydrożele w temperaturze -80 °C na 1 godzinę.
  12. Odzyskać żele z magazynu; zdjąć pokrywki probówek do mikrowirówek, przykryć probówki folią woskową i przekłuć folię, aby umożliwić wyschnięcie wilgoci.
  13. Włączyć liofilizator z następującymi ustawieniami: temperatura: −20 °C, ciśnienie: 0,1 mbar, liofilizacja przez 18 godzin (przez noc).
  14. Liofilizowane urządzenia CFPS należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  15. Liofilizowane urządzenia CFPS, o przybliżonej objętości mokrej 50 μl, można ponownie uwodnić 50 μl ddH2O bez nadmiaru płynu. Nawodnienie trwa około 30 minut.
  16. Przenieść żele na czarną 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania za pomocą szpatułki.
  17. Przenieść płytkę do mikromiareczkowania do czytnika płytek w celu wykrycia i analizy fluorescencji przy użyciu ustawień czytnika płytek opisanych w kroku 6.6. Reprezentatywne wyniki są dostępne w poprzednich publikacjach31,33.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje dwie metody osadzania reakcji CFPS w matrycach hydrożelowych, z Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd tych dwóch podejść. Obie metody nadają się do liofilizacji i długotrwałego przechowywania. Metoda A jest najczęściej stosowaną metodologią z dwóch powodów. Po pierwsze, wykazano, że jest to najbardziej odpowiednia metoda do pracy z różnymi materiałami hydrożelowymi11. Po drugie, metoda A pozwala na równoległe testowanie konstrukt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj dwa protokoły włączania reakcji CFPS opartych na lizacie komórek E. coli do hydrożeli agarozowych. Metody te pozwalają na jednoczesną ekspresję genów w całym materiale. Protokół może być dostosowany do innych systemów CFPS i został z powodzeniem przeprowadzony z dostępnymi na rynku zestawami CFPS oprócz laboratoryjnie przygotowanych lizatów komórkowych opisanych tutaj. Co ważne, protokół pozwala na ekspresję genów przy braku zewnętrznej fazy ciekłej. Oznacza to, że system jest samowystarczaln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy bardzo dziękują za wsparcie Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) i BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), a Rada ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych - Laboratoria Nauk Obronnych przyznają EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Dane na potrzeby niniejszej publikacji są publicznie dostępne pod adresem: 10.25405/data.ncl.22232452. Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej powstałej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez autora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Kwas octowySigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Zestaw do pobierania próbek aminokwasówVWR
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Koenzym A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Kwas folinowySigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutaminianSigma-AldrichG1149-100G
LizozymSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutaminianSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP2714-1BTL
Zestaw do zagęszczania białek kubitowychThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidynaSigma-Aldrich85558-1G
TryptonThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Ekstrakt z drożdżySigma-AldrichY1625-1KG
strong>Equipment
1,5 mL probówki do mikrowirówekSigma-AldrichHS4323-500EA
Kasety do dializy 10K MWCOThermo Fisher Scientific66381
Probówka wirówkowa 15 mlSarstedt62.554.502
Butelki wirówkowe 50 mlSarstedt62.547.254
Butelki wirówkowe 500 mlThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus liofilizatorChrystusCzęść nr 101521, 101522, 101527
Wirówka stołowaThermo Fisher ScientificH-X3R
Czarne 384-dołkowe płytki do mikromiareczkowaniaKuwety Fischer Scientific66
Thermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab Chorus MikrowirówkaElga#####
Eppendorf 5425REppendorfEP00532
Wirówka szybkoobrotowaBeckman CoulterB34183
Licencja JMPSAS Institute15
Mieszadło magnetyczneFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Fotospektrometr (biofotometr)Eppendorf16713
Pipety i końcówkiGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometrThermo Fisher ScientificQ32866
Inkubator z wytrząsaniemThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Termo Fisher Scientific12893543
Inkubator statycznySanyoMIR-162
Strzykawka i igłyThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (inkubator z wytrząsaniem)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Czytnik płytek Varioskan LuxThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° c miernikVWR662-1657
BTRABR1401801<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702(2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429(2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261(2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050(2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64(2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105(2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150(2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165(2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zatapianie w hydro elachsyntetyczne sieci genowehydro ele do ekspresji bia ekreakcje w lizatach kom rkowychliofilizowane hydro eledetekcja fluorescencyjnaele agarozyurz dzenia diagnostyczneanaliza za pomoc czytnika p ytek

Powiązane artykuły