Zwiększenie wykrywalności niedojrzałych muszek owocowych tefrytów na polu może w porę uruchomić działania mające na celu wyeliminowanie populacji tych niszczycielskich szkodników. Wykrywanie larw w późnym stadium rozwoju jest szybsze i dokładniejsze w przypadku rozdrabniania owoców żywiciela w torbie i przepuszczania miąższu przez szereg sit, niż podczas ręcznego cięcia i kontroli wzrokowej.
Artykuł metodologiczny
Przesiewanie miazgi owocowej w celu wykrycia niedojrzałych muszek owocowych Tephritid na polu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muszki owocowe z rodziny Tephritidae są jednymi z najbardziej destrukcyjnych i inwazyjnych szkodników rolniczych na świecie. Wiele krajów podejmuje kosztowne programy eliminacji w celu wyeliminowania początkowych populacji. Podczas programów zwalczania dokłada się wszelkich starań w celu wykrycia larw, ponieważ wskazuje to na populację lęgową i pomaga ustalić przestrzenny zasięg inwazji. Wykrycie niedojrzałych etapów rozwojowych uruchamia dodatkowe działania kontrolne i regulacyjne w celu powstrzymania i zapobieżenia dalszemu rozprzestrzenianiu się szkodnika. Tradycyjnie, wykrywanie larw odbywa się poprzez krojenie poszczególnych owoców żywiciela i oglądanie ich. Ta metoda jest pracochłonna, ponieważ można przetworzyć tylko ograniczoną liczbę owoców, a prawdopodobieństwo pominięcia larwy jest wysokie. Przetestowano technikę ekstrakcji, która łączy i) miażdżenie owoców żywiciela w plastikowej torbie, ii) przecedzenie miazgi przez szereg sit, iii) umieszczenie zatrzymanej miazgi w roztworze wody z brązowym cukrem oraz iv) zbieranie larw, które unoszą się na powierzchni. Metoda została oceniona na Florydzie z guawą zebraną w terenie, naturalnie porażoną przez Anastrepha suspensa. Aby naśladować niskie populacje, bardziej reprezentatywne dla programu zwalczania muszek owocowych, mango i papaja na Hawajach zostały zaatakowane znaną, niską liczbą larw Bactrocera dorsalis. Możliwość zastosowania metody została przetestowana w terenie na guawie naturalnie zaatakowanej przez B. dorsalis w celu oceny metody w warunkach, jakich doświadczyli pracownicy podczas awaryjnego programu muszek owocowych. Zarówno w badaniach polowych, jak i laboratoryjnych, rozdrabnianie i przesiewanie miąższu było bardziej wydajne (wymagało mniej czasu) i bardziej wrażliwe (znaleziono więcej larw) niż krojenie owoców. Pływanie miazgi w roztworze wody z brązowym cukrem pomogło wykryć wcześniejsze larwy w stadium rozwojowym. Rozdrabnianie i przesiewanie miazgi owocowej ważnych żywicieli tefrytowych może zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia larw podczas programów awaryjnych.
Wprowadzenie
Muszki owocowe Tephritid należą do najbardziej destrukcyjnych szkodników rolniczych, a największe zagrożenie stanowią rodzaje Anastrepha, Bactrocera i Ceratitis1. Wiele obszarów jest narażonych na wysokie ryzyko osiedlenia się egzotycznych muszek owocowych, w oparciu o 1) historyczne wtargnięcia i związane z nimi programy delimitacji i eliminacji, 2) wysoki wskaźnik przybycia materiału żywicielskiego muszki owocowej do portów wjazdu oraz 3) warunki klimatyczne sprzyjające tworzeniu się populacji rozrodczych. Stan Kalifornia doświadcza wielu wtargnięć i wykryć tefrytidów rocznie2. W ciągu ostatniego stulecia na całym świecie miało miejsce ponad 200 inwazji i programów zwalczania tefrytidów, a w ostatnich dziesięcioleciach liczba ta znacznie przyspieszyła3. Chociaż zdecydowana większość tych programów odnosi sukcesy w zwalczaniu inwazji muszek owocowych3,4, obciążenie ekonomiczne i środowiskowe tych inwazji pozostaje nadal wysokie, a możliwość powstania jest zawsze obecna; niedawnym katastrofalnym przykładem jest zakażenie Bactrocera dorsalis na kontynencie afrykańskim5.
Podczas programów awaryjnych dla muszek owocowych, podejmowane są wspólne wysiłki w celu wykrycia i kontroli populacji lęgowych inwazyjnych gatunków. Na przykład stan Floryda reaguje na inwazje tefrytów, stosując zraszacze glebowe (pod linią kroplującą roślin żywicielskich owocujących) i usuwając owoce żywiciela w promieniu 200 m wokół miejsc, w których znajdują się kryte samice i/lub larwy6. Te działania i taktyki służą zabijaniu larw i poczwarek w glebie oraz usuwaniu wszelkich jaj i larw z owoców na tym obszarze. W niektórych programach zwalczania usuwa się znaczną ilość owoców żywiciela. W 2015 roku ponad 100 000 kg owoców zostało zniszczonych podczas programu zwalczania B. dorsalis na Florydzie6. Straty ekonomiczne poniesione przez plantatorów i powiązane branże na samym obszarze objętym kwarantanną oszacowano na ponad 10,7 miliona dolarów7.
Aby znaleźć larwy tefrytów w obszarach kwarantanny, mały zespół entomologów zbiera owoce żywiciela w promieniu 200 m wokół obszaru wykrywania samic much, a następnie tnie i wizualnie sprawdza każdy owoc pod kątem larw6. Przy ograniczonych zasobach kadrowych i setkach potencjalnych gospodarzy zadanie staje się trudne, szczególnie na obszarach, gdzie różnorodność roślin zarówno w obszarach produkcji komercyjnej, jak i na placach mieszkalnych jest wysoka. Ponadto larwy mogą zostać pominięte podczas krojenia owoców żywicielskich. W badaniu oceniającym krojenie owoców w portach wejściowych stwierdzono, że krojenie owoców nie jest tak skuteczne w wykrywaniu A. suspensa w porównaniu z przetrzymywaniem porażonych owoców przez kilka tygodni i liczeniem larw i poczwarek znalezionych w podłożu do przepoczwarzenia8.
Istnieją alternatywy dla cięcia owoców do wykrywania inwazji9,10,11,12,13. Na przykład, unoszenie się brązowego cukru i metoda gorącej wody są akceptowanymi procedurami stosowanymi do wykrywania muszek owocowych wiśni zachodnich w zebranych wiśniach9,10. Metoda brązowego cukru polega na umieszczeniu zmiażdżonych owoców w roztworze wody z cukrem i zebraniu larw, które unoszą się na wierzchu. Metoda flotacji brązowego cukru została opracowana specjalnie w celu spełnienia przepisów regulacyjnych dotyczących eksportowanych wiśni, które wymagają od pakowalni monitorowania szkodników muszek owocowych w czasie kwarantanny. Istnieje również zatwierdzony amerykańsko-kanadyjski program certyfikacji borówek, który obejmuje pływanie w wodzie z brązowym cukrem, pływanie w słonej wodzie lub gotowanie w celu wsparcia fitosanityzacji14. Testując dokładność unoszenia się cukru i gorącej wody, naukowcy wykorzystali metodę przesiewania, aby określić, ile larw zostało pominiętych9,10,11,12,13. Badanie wykazało, że zmieszanie zmiażdżonych jagód w roztworze soli i przefiltrowanie roztworu przez filtr do kawy wielokrotnego użytku było czterokrotnie lepsze w wykrywaniu larw Drosophila suzukii niż wizualne sprawdzanie powierzchni roztworów soli i cukru14. Ponadto chromatografia gazowa została wykorzystana do wykrycia larw A. suspensa w citrus15. Podejścia te nie zostały przetestowane pod kątem możliwości zastosowania w badaniach terenowych.
Naszym celem było opracowanie i przetestowanie metody znajdowania larw tefrytów w terenie za pomocą przesiewania i pływania wodą z cukrem. Metoda ta pozwala na skuteczniejsze wykrywanie niedojrzałych muszek owocowych niż tradycyjna metoda cięcia owoców, wspierając terminową kontrolę populacji lęgowych podczas programów zwalczania muszek owocowych.
Protokół
1. Wybór owoców
- Określ, jakie owoce są dostępne na obszarze, który ma być badany.
- Wybierz owoc żywiciela na podstawie listy znanych żywicieli dla docelowego gatunku tefrytów.
- Wybieraj dojrzałe owoce o miękkim miąższu, takie jak mango, papaja i guawa. Niedojrzałe lub owoce o twardym miąższu, takie jak tropikalne migdały, należy sprawdzić inną metodą, taką jak krojenie owoców.
- Wybierz opadłe, przejrzałe owoce lub dojrzałe owoce na drzewach, które mają ślady uszkodzeń, blizny po złożeniu jaj i miękkie miejsca.
- Jednorazowo należy przetworzyć około 2 l owoców (np. 5 guaw lub 5 średniej wielkości mango stanowi odpowiednie próbki dla tej metody). Liczba owoców, które można przetworzyć za jednym razem, zależy od wielkości owoców (Rysunek 1A).
2. Czyszczenie
- Pokrój owoce na duże kawałki i umieść je w 4-litrowej torbie do przechowywania z zamkiem błyskawicznym (Rysunek 1B).
- Wlej wodę do torebki, aż woda pokryje posiekany owoc na 25-50 mm (Rysunek 1C).
- Delikatnie ściskaj owoce ręcznie, aż cały miąższ oderwie się od skórki i uzyska gładką konsystencję (tj. bez dużych kawałków) (Rysunek 1D).
3. Przesiewanie do późnej zbiórki
- Ułóż sita w stos. Do przetwarzania dużych ilości owoców (~ 5 owoców na raz) należy używać dużych sit (o średnicy 457 mm), a do pojedynczych owoców lub mniejszych próbek (< 5 owoców).
- Ułóż sito z sitkiem o dużych oczkach (nr 8; 2,36 mm) na sitku o małych oczkach (nr 20; 0,85 mm). W celu wykrycia wczesnych stadiów należy umieścić trzecie sito (nr 45; 0,35 mm) na dnie stosu (Rysunek 1E).
- Wlej miazgę na górne sito (Rysunek 1F).
- Dokładnie umyj miazgę przez stos sit, używając wody z kranu, węża lub butelki, aż drobna miazga przejdzie przez sita (Rysunek 1G).
- Wizualnie przeskanuj górne sita w poszukiwaniu larw w późnym stadium rozwojowym, które mogły zostać zatrzymane wraz ze skórką lub jakimikolwiek dużymi kawałkami owoców (Rysunek 1H).
- Dokładnie sprawdź drugie sito pod kątem larw w późnym stadium rozwojowym. W przypadku dużych ilości drobnej miazgi może być konieczne dodatkowe płukanie.
- Zebrać larwy z sit za pomocą kleszczy larwalnych i umieścić je w fiolkach z 70% EtOH.
4. Flotacja cukru dla wczesnej kolekcji instar
- Roztwór cukru należy wstępnie wymieszać, rozpuszczając 453 g (1 pudełko) ciemnobrązowego cukru w 2 litrach wody z kranu, co daje odczyt Brixa 19°10.
- Umyj miazgę z sit o drobnych oczkach (np. nr 20 i nr 45) do krawędzi sita wodą z kranu, a następnie przenieś materiał do plastikowej patelni (11 l).
- Dodaj roztwór brązowego cukru, aż pokryje miazgę na 25-50 mm i dodaj 2 krople środka przeciwpieniącego. Pozostaw miazgę w roztworze brązowego cukru na około 5 minut.
- Larwy, które unoszą się na powierzchni roztworu, zebrać za pomocą kleszczyków larwalnych do fiolek z 70% EtOH.
5. Opieka nad larwami
- Oznacz fiolkę miejscem pobrania, datą, rodzajem owocu i pojemnikiem na śmieci w celu późniejszego zbadania i identyfikacji.
Wyniki
Ekstrakcja wczesnych i późnych stadiów larwalnych Anastrepha suspensa z owoców zebranych w terenie
W tym eksperymencie porównano metodę krojenia owoców oraz metodę rozgniatania, przesiewania i flotacji (MSF) pod kątem proporcji wykrytych larw oraz średniego czasu potrzebnego na ich wykrycie. Guawy, silnie zainfekowane larwami Anastrepha suspensa, zostały zebrane z rośliny znajdującej się w University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL. Owoce zostały losowo podzielone na grupy po 5 sztuk i przypisane do jednej z dwóch metod ekstrakcji larw: 1) ręcznego krojenia lub 2) metody MSF. Zarejestrowano czas potrzebny na zebranie wszystkich larw widocznych gołym okiem przy użyciu każdej z metod ekstrakcji.
Metoda ręcznego krojenia była zgodna z procedurą stosowaną obecnie w programie zwalczania. Każdemu z 5 pracowników (n=5) przydzielono 5 owoców w celu poszukiwania larw we wszystkich stadiach rozwoju poprzez pokrojenie owoców na mniejsze kawałki i wizualną inspekcję miąższu. Aby ustalić, czy podczas wizualnej inspekcji pominięto larwy, ręcznie pokrojone fragmenty owoców poddano ponownej kontroli przy użyciu mikroskopu stereoskopowego (10x).
W metodzie MSF 5 owoców pocięto na duże kawałki (50-80 cm), umieszczono w woreczkach strunowych i delikatnie zgnieciono ręcznie, aż cały miąższ oddzielił się od skórki i uzyskał gładką konsystencję (tj. bez dużych grudek). Rozgnieciony owoc przesiano przez szereg dużych (45,7 cm) sit mosiężnych. Na górze ułożono sito o największych oczkach (nr 8), a następnie sito nr 20 i nr 45. Pracownik odpowiedzialny za tę procedurę wypłukał miąższ przez siatki, używając wody z węża podłączonego do kranu w zlewie. W sitach widoczne były larwy w późniejszych stadiach rozwojowych. Mniejsze stadia były wymieszane z miąższem, co utrudniało ich dostrzeżenie i usunięcie. Dlatego mieszaninę miąższu i larw z sit przeniesiono do wiader z 1 L roztworu wody z brązowym cukrem. Larwy natychmiast wypłynęły na powierzchnię. Roztwór delikatnie wymieszano, a po 5 min larwy usunięto z wiader i przeliczono. Czas przetwarzania owoców obejmował rozgniatanie, przesianie oraz usuwanie larw z roztworu cukru. Dane dotyczące liczby larw znalezionych metodą ręcznego cięcia lub przesiewania i flotacji analizowano za pomocą nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa (p = 0,05)16.
Metoda MSF pozwoliła uzyskać większą liczbę larw (Rysunek 2A) oraz większą liczbę larw na minutę (Rysunek 2B) niż metoda ręcznego krojenia. Choć w niniejszym badaniu nie ilościowo określono detekcji poszczególnych stadiów rozwojowych, zaobserwowano, że przy użyciu sit znaleziono wszystkie stadia (pierwsze, drugie i trzecie), podczas gdy przy ręcznym krojeniu dostrzeżono jedynie późniejsze stadia (drugie i trzecie). Podczas ponownej inspekcji próbek, które wcześniej przecięto i poddano ocenie wizualnej, przy użyciu mikroskopu stereoskopowego pominięto 40% larw późniejszych stadiów żerujących w owocach. Jednakże podczas ponownej inspekcji znaleziono przede wszystkim stadia wcześniejsze.
Niniejszy eksperyment wykazał, że zastosowanie metody MSF jest bardziej skuteczne i efektywne w poszukiwaniu larw w owocach o wysokim stopniu porażenia. Jednakże w ramach programu eradykacji, gdzie gatunek inwazyjny byłby bardzo rzadki, częściej napotyka się owoce porażone mniejszą liczbą larw. W związku z tym przeprowadziliśmy badanie laboratoryjne, w którym owoce gospodarza zostały zainfekowane znaną, niską liczbą larw.
Ręczne zaszczepianie mango i papai w celu symulacji niskiego stopnia infestacji Bactrocera dorsalis
W niniejszym doświadczeniu porównano metodę przekrawania owoców oraz metodę MSF pod kątem proporcji wykrytych larw oraz czasu wymaganego do ich wykrycia w warunkach stosunkowo niskiej infestacji. Ręczne zaszczepianie zostało wykorzystane jako narzędzie eksperymentalne do oceny skuteczności każdej z metod, ponieważ liczba obecnych larw była znana z całkowitą pewnością.
Do wykonania 5 otworów w poszczególnych owocach mango i papai, które były wolne od larw muszki owocówki, użyto korkociągu (średnica 1,0 cm). Do każdego z 5 otworów w podgrupie owoców wprowadzono pojedynczą larwę B. dorsalis w późnym drugim lub wczesnym trzecim stadium instaru. Otwory zamknięto za pomocą wyciętego z owocu kawałka, a pozostałe owoce zamknięto bez wprowadzania larw, aby wizualnie symulować ręczną infestację. Owoce utrzymywano w temperaturze 27 °C przez 48 h, aby umożliwić rozwój larw. Eksperyment przeprowadzono w laboratorium ARS w Hilo na wyspie Hawaii (n = 5 pracowników) oraz w laboratorium APHIS-PPQ na wyspie Oahu na Hawajach (n = 4 pracowników).
W celu przecięcia owoców każdemu pracownikowi przekazano 5 mango (1 zainfekowane 1 larwą i 4 niezainfekowane) oraz 4 papaje (jedna zainfekowana i 3 niezainfekowane). Pracownik przecinał każdy owoc indywidualnie na coraz mniejsze kawałki, nieustannie sprawdzając miąższ pod kątem obecności niedojrzałych much owocówek. Przeszukiwanie przerwano po dokładnym obejrzeniu całego miąższu. Odnotowano całkowitą liczbę znalezionych larw oraz czas poświęcony przez każdego pracownika na przetworzenie wszystkich owoców poprzez ich krojenie (Rysunek 3) oraz (Rysunek 4).
Każdy pracownik otrzymał kolejny podobny zestaw owoców (5 mango i 4 papaje) do rozgniatania lub przesiewania (bez krojenia owoców), z czego 2 sztuki były zainfekowane zgodnie z wcześniejszym opisem. Miąższ wlewano do górniejszego sita i przemywano przez stos sit wodą z kranu, a następnie usuwano larwy zgodnie z opisem w protokole. Eksperyment przeprowadzono dwukrotnie – z zastosowaniem flotacji cukrowej oraz bez niej – aby ustalić, czy pominięcie etapu flotacji zwiększy szybkość procesu bez utraty czułości (tj. czy wszystkie lub większość larw zostanie odnaleziona) (Rysunek 3). Odnotowano liczbę znalezionych larw oraz czas poświęcony przez każdego pracownika na obróbkę owoców metodą krojenia, MSF lub MS.
W przypadku zarówno mango, jak i papai, pełna metoda MSF (z uwzględnieniem flotacji) pozwoliła na wykrycie większej liczby larw i była szybsza niż krojenie owoców (Tabela 1). Pracownicy stosujący tradycyjną metodę krojenia owoców przeoczyli odpowiednio 32% i 35% larw umieszczonych w mango i papai (Tabela 1). Przetwarzanie owoców masowo z wykorzystaniem techniki MSF wymagało o 30% mniej czasu niż krojenie pojedynczych owoców mango i o 35% mniej czasu niż krojenie pojedynczych owoców papai (Rysunek 3). Więcej larw znajdowano w ciągu minuty stosując metodę MSF dla papai (Rysunek 3C) i mango (Rysunek 3D) w porównaniu z metodą krojenia owoców. Wszystkie znalezione larwy były żywe.
Identyfikacja morfologiczna larw jest możliwa jedynie w przypadku późniejszych stadiów rozwojowych. Powtórzyliśmy powyższy eksperyment, pomijając procedurę flotacji, aby ustalić, czy odzyskiwanie larw nadal pozostanie na wysokim poziomie, a szybkość przetwarzania owoców wzrośnie. Metoda MS (bez flotacji) pozwoliła na wykrycie większej liczby larw w papai (Rycina 4A) i mango (Rycina 4B) w porównaniu do krojenia i inspekcji wizualnej. Ponadto technika ta była szybsza niż krojenie i wizualna inspekcja papai (Rycina 4C) oraz mango (Rycina 4D). Usunięcie etapu flotacji z metody MSF skróciło czas wyszukiwania larw w późnych stadiach rozwojowych o 90% dla papai i o 48% dla mango (Tabela 2). Procent odnalezionych larw był wysoki dla obu metod i konsekwentnie wyższy dla metody MS (bez flotacji). W przypadku papai odzyskano odpowiednio 80% i 85% larw za pomocą metod MSF i MS (Tabela 1 oraz Tabela 2). W przypadku mango odzyskano odpowiednio 88% i 95% larw za pomocą metod MSF i MS (Tabela 1 oraz Tabela 2).
Porównanie polowe metod przecinania owoców i MSF
Celem tego eksperymentu było porównanie metod przecinania owoców oraz MSF w warunkach polowych, symulujących program zwalczania muszycy owocówki w sytuacjach kryzysowych. Przetwarzanie owoców przeprowadzono bez dostępu do udogodnień i infrastruktury laboratoryjnej, aby przetestować gotowość obu metod ekstrakcji larw do zastosowania w terenie. Prace prowadzono w sadzie gujawy zlokalizowanym w USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm w pobliżu Hilo. Zebrano łącznie 40 owoców gujawy wykazujących oznaki infestacji i podzielono je na 2 grupy. Łącznie 20 owoców poddano przecinaniu/inspekcji wizualnej, a następnie metodzie MSF (wraz z flotacją), co pozwoliło na ocenę czułości metody przecinania w porównaniu z metodą MSF. Disekcję przeprowadzono zgodnie z opisem powyżej. Wykryte larwy usunięto i policzono. Czterej pracownicy przeprowadzili dysekcję po 5 owoców każdy, a dla każdego z nich odnotowano czas potrzebny na przecinanie i inspekcję. Po przecinaniu przeprowadzono MSF zgodnie z wcześniejszym opisem, z wyjątkiem zastosowania trzeciego sita o mniejszej oczce (No. 40, 0.420 mm) oprócz sit No. 8 i No. 20, w celu zebrania mniejszych larw. Druga grupa 20 owoców została umieszczona w 2 woreczkach strunowych (po 10 owoców na woreczek) i poddana wyłącznie metodzie MSF (bez przecinania), co pozwoliło na porównanie czasu potrzebnego na przecinanie owoców w stosunku do MSF. Podobnie jak wcześniej, w tej procedurze zastosowano trzy sita. Odnotowano liczbę znalezionych larw oraz całkowity czas przetwarzania owoców (rozgniecenie i pozostawienie owoców na 5 min w woreczku/przesiewanie/flotacja w roztworze cukru).
Jak wykazano w warunkach laboratoryjnych, przekrawanie owoców prowadziło do niedoszacowania stopnia ich porażenia i charakteryzowało się dużą zmiennością, wykrywając od 25% do 83% mniej larw niż udało się odzyskać przy użyciu metod MSF (Tabela 3). Co więcej, w próbce z niską liczbą larw, metoda MSF pozwoliła odzyskać o 500% więcej larw, zapewniając wyższą czułość analizy i większą szansę na zidentyfikowanie organizmu wywołującego porażenie. Owoce były przetwarzane znacznie szybciej metodą MSF w porównaniu do przekrawania; przekrawanie i sprawdzanie 5 owoców wymagało mniej więcej tyle samo czasu, co przetworzenie 10 owoców via MSF.
Rysunek 1: Etapy protokołu ekstrakcji larw muchowatych owocówek. (A) Przetwarzaj jednorazowo około 2 L owoców (np. 5 gujaw lub 5 średnich mango stanowi odpowiednią próbkę dla tej metody). (B) Pokrój owoce na duże kawałki i umieść je w 4 L strunowym worku do przechowywania. (C) Dolewaj wodę do worka, aż poziom wody przekroczy pokrojone owoce o 25-50 mm. (D) Delikatnie ugniataj owoce ręcznie, aż cały miąższ oddzieli się od skórki i uzyska gładką konsystencję (tj. bez dużych grudek). (E) Ustaw sito z dużymi oczkami (No. 8; 2.36 mm) na górze, a pod nim sito z małymi oczkami (No. 20; 0.85 mm). W przypadku wczesnych stadiów larwalnych umieść trzecie sito (No. 45; 0.35 mm) na spodzie stosu. (F) Wlej miąższ do górnego sita. (G) Dokładnie wypłucz miąższ przez stos sit, używając wody z kranu, węża lub butelki, aż drobny miąższ przejdzie przez pierwsze sito. (H) Przejrzyj wzrokowo górne sita w poszukiwaniu larw późnych stadiów, które mogły zostać zatrzymane wraz ze skórką lub dużymi kawałkami owoców. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Wydobywanie wczesnych i późnych stadiów larwalnych Anastrepha suspensa z owoców zebranych w terenie. Średnia liczba (± błąd standardowy średniej [SE]) larw Anastrepha suspensa z pięciu owoców gujawy zebranych poprzez cięcie i inspekcję wizualną (cięcie: 70,4 ± 11,9) lub przemywanie miąższu przez serię trzech sit, a następnie moczenie miąższu w roztworze wody z cukrem (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Średnia liczba larw (±SE) zebranych na minutę z 5 gujaw przetworzonych metodą cięcia (1,21 ± 0,16) oraz metodą MSF (3,71 ± 0,50) (B). Każdą metodę powtórzono 5 razy, a gwiazdki nad słupkami wskazują istotne różnice w liczbie larw (χ2 = 6,81, p < 0,01) oraz czasie przetwarzania (χ2 = 6,80, p < 0,01) na podstawie testu Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Walidacja pełnej metody rozdrabniania-przesiewania-flotacji (MSF) z wykorzystaniem manualnego zakażenia mango i papai w celu symulacji niskiego poziomu infestacji Bactrocera dorsalis. Średnia liczba larw Bactrocera dorsalis (±SE) znalezionych w owocach papai (krojenie: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) i mango (krojenie: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) oraz średnia liczba larw (±SE) zebranych na minutę z papai (krojenie: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) i mango (krojenie: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Owoce przetworzone przy użyciu metody krojenia lub MSF (z uwzględnieniem flotacji, n = 5), manualnie zakażone 5 larwami trzeciego stadium. Gwiazdki nad słupkami wskazują istotne różnice w liczbie larw znalezionych w papai (χ2 = 5,39, p = 0,02) i mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) w porównaniu do krojenia owoców na podstawie testów Kruskala-Wallisa. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Walidacja metody rozgniatania i przesiewania (z pominięciem flotacji) przy użyciu manualnej infestacji mango i papai w celu symulacji niskiego poziomu infestacji Bactrocera dorsalis. Średnia liczba larw (±SE) znalezionych w owocach papai (przecinanie: 1.25 ± 0.48, MS: 4.25 ± 0.48) (A) i mango (przecinanie: 2.5 ± 0.5, MS: 4.75 ± 0.25) (B) oraz średnia liczba larw zebranych na minutę (±SE) w papai (przecinanie: 0.15 ± 0.05, MS: 0.76 ± 0.15) (C) i mango (przecinanie: 0.16 ± 0.04, MS: 0.44 ± 0.04) (D). Owoce zostały poddane manualnej infestacji 5 larwami Bactrocera dorsalis trzeciego stadium i przetworzone poprzez przecinanie i inspekcję wizualną (przecinanie) lub rozgniatanie w worku i przemywanie przez sita (wyłącznie rozgniatanie i przesiewanie, bez flotacji, n = 4). Gwiazdki nad słupkami wskazują istotne różnice w liczbie larw znalezionych w papai (χ2 = 5.46, p = 0.02) i mango (χ2 = 5.25, p = 0.02) oraz czasie przetwarzania papai (χ2 = 5.39, p = 0.02) i mango (χ2 = 5.39, p = 0.02) w porównaniu do przecinania owoców, na podstawie testów Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
| Owoc | # Przetworzone owoce | #Dodanie larw | Metoda przetwarzania | #Znalezione larwy | Czas przetwarzania (min)* | % odzysku |
| Mango | 25 | 25 | Wycinanie | 17 | 158 | 68% |
| Mango | 25 | 25 | MSF | 22 | 113 | 88% |
| Papaja | 16 | 20 | Wycinanie | 13 | 62 | 65% |
| Papaja | 16 | 20 | MSF | 16 | 40 | 80% |
| *Całkowity czas zsumowany dla 5 pracowników. | ||||||
Tabela 1: Liczba odzyskanych larw oraz czas przetwarzania owoców za pomocą metody krojenia i wizualnej inspekcji (krojenie) lub pełnego rozgniatania, przesiewania i flotacji (MSF). Badane owoce zostały ręcznie zainfekowane 5 larwami trzeciego stadium, zmieszane z owocami z otworami i jedynie zakrytymi (1 z 5 mango, 1 z 4 papai).
| Owoc | # Przetworzone owoce | #Dodanie larw | Metoda przetwarzania | #Znalezione larwy | Czas przetwarzania (min)* | % odzysku |
| Mango | 20 | 20 | Wycinanie | 10 | 66 | 50% |
| Mango | 20 | 20 | SM | 19 | 44 | 95% |
| Papaja | 16 | 20 | Wycinanie | 5 | 38 | 25% |
| Papaja | 16 | 20 | SM | 17 | 25 | 85% |
| *Całkowity czas zsumowany dla 4 pracowników. | ||||||
Tabela 2: Liczba odzyskanych larw oraz czas przetwarzania owoców poprzez cięcie lub rozgniatanie i przesiewanie, z pominięciem flotacji (MS). Owoce testowe zostały zainfekowane ręcznie pięcioma larwami trzeciego stadium, zmieszanymi z owocami wywierconymi i zamkniętymi (1 na 5 mango, 1 na 4 papai).
| Pracownik/metoda | #Przetworzone owoce | Czas przetwarzania (min) | #Larwy wykazujące żerowanie (przecinanie) | #Larwy znalezione w MSF* | % całkowitej liczby larw znalezionych metodą przecinania |
| Pracownik 1: cięcie | 5 | 18 | 33 | 14 | 70% |
| Pracownik 2: wycinanie | 5 | 18 | 1 | 5 | 17% |
| Pracownik 3: cięcie | 5 | 26 | 9 | 11** | 75% |
| Pracownik 4: cięcie | 5 | 20 | 24 | ||
| Pracownik 5: MSF | 10 | 22 | Brak danych | 22 | ND |
| Pracownik 6: MSF | 10 | 18 | N/D | 37 | ND |
| * Miąższ z wycinka i inspekcji wizualnej poddano ponownej obróbce metodą MSF w celu określenia liczby późnych 2nd-3rd pominięte stadia larwalne | |||||
| ** Miąższ owoców od pracowników 2 i 3 połączony przed procesowaniem metodą MSF | |||||
Tabela 3: Liczba larw znalezionych w gujawach zebranych w terenie poprzez przekrawanie i wizualną inspekcję owoców (przekrawanie) lub poprzez rozgniatanie, przesiewanie i flotację (MSF) owoców.
Dyskusja
Naszym celem było opracowanie wydajnego i skutecznego sposobu na znajdowanie larw tefrytów w terenie. Motywacją do uruchomienia programu zwalczania lub ustanowienia obszaru kwarantanny jest wykrycie krytych samic lub larw6, co wskazuje na populację lęgową. Obecna metoda krojenia i wizualnego wyszukiwania owoców jest nieefektywna w znajdowaniu larw, ponieważ zwykle obecnych jest znacznie więcej owoców żywicielskich, niż można indywidualnie sprawdzić. Ponadto populacje tefrytów są prawdopodobnie niskie na obszarze nowej inwazji, co sprawia, że szanse na znalezienie larw w dużej ilości owoców są niezwykle trudne. Na przykład w 2015 r. w ramach programu zwalczania Bactrocera dorsalis na Florydzie zidentyfikowano 54 różne gatunki żywicieli i ścięto ponad 4000 owoców. W tym programie zwalczania znaleziono tylko kilka larw w mango i nie stwierdzono żadnych innych żywicieli6. Odkryliśmy, że metoda MSF/MS była zarówno bardziej czuła, jak i szybsza w wykrywaniu larw A. suspensa i B. dorsalis podczas przetwarzania owoców, które miały dużą ilość miąższu (mango, guawa i papaja) luzem w porównaniu z krojeniem owoców. Większa ilość owoców żywiciela, którą można zbadać metodą rozdrabniania i przesiewania, w połączeniu ze zwiększoną wykrywalnością rzadkich larw, może zwiększyć prawdopodobieństwo, że inwazja zostanie wcześnie wykryta. Wczesne wykrycie populacji lęgowej może zwiększyć prawdopodobieństwo eradykacji i obniżyć koszty programu.
Nasze eksperymenty wykazały, że liczba larw wykrytych przez pracowników zajmujących się krojeniem i oględzinami owoców znacznie się różniła. Pracownicy krojący owoce przegapili 50% i 75% larw B. dorsalis umieszczonych odpowiednio w mango i papai. Natomiast tylko 5% i 15% larw zostało pominiętych przy użyciu metody MS do przetwarzania odpowiednio owoców mango i papai. Podobnie badanie oceniające rozbiór owoców w portach wejścia wykazało, że istniały znaczne różnice w liczbie porażonych owoców i larw stwierdzonych przez inspektorów8 . Badanie wykazało, że doświadczeni inspektorzy portowi pominęli 64%-99% larw A. suspensa i 16%-82% porażonych owoców podczas krojenia owoców i oględzin8. Nasze wyniki sugerują, że metoda rozdrabniania i przesiewania może zmniejszyć prawdopodobieństwo, że pracownik nie wykryje porażonego owocu.
Unoszenie się na wodzie z cukrem i gorącą wodą jest akceptowanym protokołem w metodzie podejścia systemowego w celu zapewnienia, że wiśnie i jagody są wolne od muszek owocowych14. Podzbiór przesyłki jest kruszony w roztworze, po czym inspektor wizualnie bada powierzchnię roztworu cukru pod kątem obecności jaj i larw. Chociaż można przetworzyć większą liczbę owoców w porównaniu do krojenia pojedynczych owoców, na prawdopodobieństwo znalezienia larw przy użyciu tych technik nadal mają wpływ umiejętności inspektora, stadium i liczba obecnych larw oraz rodzaj owocu8. Odkryliśmy, że podobnie jak inne tefryty, B. dorsalis i A. suspensa odrywają się od miąższu owoców i wypływają na powierzchnię. Co ciekawe, odkryliśmy, że w przypadku większych larw w późnym stadium rozwojowym, które są celem programów awaryjnych i eradykacyjnych, ponieważ można je zidentyfikować morfologicznie, w tym flotacja cukru nie zwiększyła dokładności metody. W rzeczywistości dodanie metody flotacji wydłużyło czas przetwarzania o 90% w przypadku papai i o 48% w przypadku mango. Wydłużony czas przetwarzania oraz dodatkowe materiały (np. woda, pojemniki, cukier itp.) nie umożliwiają dodania tego kroku w przypadku poszukiwania dużych gwiazd w terenie. Metoda unoszenia cukru na rynku może być odpowiednia, gdy celem jest wykrycie wszystkich stadiów, w tym wczesnych stadiów, takich jak porty wejścia i pakownie. Filtrowanie roztworu cukru za pomocą sita o drobnych oczkach najprawdopodobniej zapewniłoby najdokładniejsze wykrywanie jaj i wczesnych stadiów larwalnych11,12.
Techniki MS i MSF dobrze sprawdzają się w przypadku owoców, które można łatwo rozgnieść i mają dużą objętość miąższu. Larwy tefrytów mają tendencję do zakopywania się w miazgi owocowej, co utrudnia wykrycie wzrokowe. Krytycznym aspektem metod MS i MSF jest oddzielenie larw od miazgi. Proces przesiewania usuwa miazgę, odsłaniając w ten sposób larwy na sitach sitowych. Podobnie metoda wody z cukrem oddziela larwy od miazgi, sprawiając, że larwy unoszą się na wodzie, podczas gdy miazga opada na dno naczynia. Larwy oddzielone od miazgi metodą MS lub MSF można łatwo zaobserwować poruszające się na sicie sitowym lub powierzchni wody. Chociaż metoda mushingu, przesiewania i opcjonalnie pływającej znacznie poprawiła szybkość i dokładność wykrywania larw tefrytidaków w ważnych owocach żywiciela, proces ten może nie być odpowiedni dla wszystkich owoców. Na przykład owoce żywicielskie z twardym miąższem, takie jak zielone awokado lub owoce z dużym pestkiem/pestką i stosunkowo niewielką ilością miąższu, takie jak tropikalne migdały, mogą być łatwiejsze do przetworzenia dzięki ręcznemu krojeniu i oględzinom.
Stwierdziliśmy, że metody MS i MSF były szybsze, gdy przetwarzano stosunkowo niewielką liczbę owoców (5-10). Różnica byłaby prawdopodobnie większa, gdyby przetworzono większe ilości owoców, co może być konieczne i typowe dla programów awaryjnych dla muszek owocowych. Usunięcie etapu flotacji jeszcze bardziej zwiększyło szybkość wykrywania bez uszczerbku dla dokładności znajdowania dużych larw tefrytów (>3 mm). Wykazaliśmy, że techniki te można zastosować w terenie, który symulował warunki, jakich doświadczają pracownicy podczas programu awaryjnego zwalczania muszek owocowych. Nasze badania wskazują, że metody MS mogą pozwolić na szybsze wykrycie larw w późnym stadium rozwojowym, a następnie zwalczenie populacji lęgowych tefrytów. MSF może być używany do wykrywania jaj i wczesnych stadiów rozwojowych, które obecnie nie są objęte programami eradykacji.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Silvii Durand, Teri Allen, Jose Alegrii i Alejandrze Canon za pomoc w przetwarzaniu guawy na Uniwersytecie Florydy, Rickowi Kurashimie, Jeanowi Authowi i Bruce'owi Inafuku za pomoc w ocenie sztucznie zainfekowanego owocu na Hawajach oraz Michaelowi Stulbergowi za pomocne komentarze do wcześniejszych wersji rękopisu. Projekt ten był częściowo finansowany przez USDA APHIS i University of Florida Cooperative Agreement oraz częściowo wspierany przez USDA-ARS (projekt 2040-22430-027-00D). Ustalenia i wnioski zawarte w tej wstępnej publikacji nie zostały formalnie rozpowszechnione przez USDA i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące jakiekolwiek ustalenia lub politykę agencji. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony USDA. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Środek przeciwpieniący | MicroLubrol | ML200-50-4 | MicroLubrol 2000 Płynny czysty olej silikonowy, https://www.microlubrol.com |
| Dominos | z brązowym cukrem | 1 lb Pudełko Ciemnobrązowe kryształki cukru, | |
| deski do krojenia | KitchenAid | KE703NOSMGA | KitchenAid Klasyczna antypoślizgowa plastikowa deska do krojenia, 12x18 cali, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M& cv_ct_cx=cięcie%2Bboards& słowa kluczowe=cięcie%2Bboards & pd_rd_i=B091118V8T& pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34& pd_rd_w=li862& pd_rd_wg =KogbB& pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d& pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP& qid=1673911 429& refresh=1& sprefix=cięcie%2Bboards%2Caps%2C198& sr=1-2-8b2f235a-ddf-4202-bbb9-592393927392& th = 1 |
| Patelnie do naczyń | Sterilite | 06578012 | Biała 12 qrt Patelnia, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords = biała + 12 + qt + patelnia + sterylizit & qid=1673911729& s=home -ogród& sprefix=biały+12+qr+patelnia+sterlite%2Cgarden%2C184& sr=1-1 |
| EthOH | Fisher Scientific | BP8202500 | Roztwór etanolu 96%, klasa biologii molekularnej, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500 |
| Fiolki szklane | Fisher Scientific | 0333921H | Fisherbrand Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy B z zamknięciami, |
| noże | https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H Nóż uniwersalny Zyliss | 31380 | 5,25", https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= owoce%2Bcięcie%2Bnoże& qid=1673911609& s= dom-ogród& sprefix=owoc%2Bcięcie%2Bnoże%2Cogród%2C145& sr=1-7& th=1 |
| Nr 20 Sita siatkowe | Hogentogler & Co. Inc. | 4221 | Norma amerykańska Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| nr 45 Sita siatkowe | Hogentogler & Co. Inc. | 4226 | Norma amerykańska Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| nr 8 Sita siatkowe | Hogentogler & Co. Inc. | 4215 | Norma amerykańska Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp |
| miękkie kleszcze | Instrumenty DR | DRENTF01 | DR Instrumenty Lekkie kleszcze entomologiczne, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q |
| Torby do przechowywania z zamkiem błyskawicznym | Ziploc | 682254 | Marka Ziploc 2 galony przezroczyste torby do zamrażania, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords = ziploc + zamrażarka + torby + 2 + galon i qid=1674504602& |
Bibliografia
- White, I. M., Elson-Harris, M. M. Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).
- Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466(2013).
- Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
- Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
- Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492(2021).
- Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
- Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , FE988 (2016).
- Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
- Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
- Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
- Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23(2017).
- Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
- Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823(2022).
- CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , Ottawa, Canada. (2020).
- Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
- SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).
Przedruki i uprawnienia
