Przesiewanie miazgi owocowej w celu wykrycia niedojrzałych muszek owocowych Tephritid na polu

Podsumowanie

Zwiększenie wykrywalności niedojrzałych muszek owocowych tefrytów na polu może w porę uruchomić działania mające na celu wyeliminowanie populacji tych niszczycielskich szkodników. Wykrywanie larw w późnym stadium rozwoju jest szybsze i dokładniejsze w przypadku rozdrabniania owoców żywiciela w torbie i przepuszczania miąższu przez szereg sit, niż podczas ręcznego cięcia i kontroli wzrokowej.

Streszczenie

Muszki owocowe z rodziny Tephritidae są jednymi z najbardziej destrukcyjnych i inwazyjnych szkodników rolniczych na świecie. Wiele krajów podejmuje kosztowne programy eliminacji w celu wyeliminowania początkowych populacji. Podczas programów zwalczania dokłada się wszelkich starań w celu wykrycia larw, ponieważ wskazuje to na populację lęgową i pomaga ustalić przestrzenny zasięg inwazji. Wykrycie niedojrzałych etapów rozwojowych uruchamia dodatkowe działania kontrolne i regulacyjne w celu powstrzymania i zapobieżenia dalszemu rozprzestrzenianiu się szkodnika. Tradycyjnie, wykrywanie larw odbywa się poprzez krojenie poszczególnych owoców żywiciela i oglądanie ich. Ta metoda jest pracochłonna, ponieważ można przetworzyć tylko ograniczoną liczbę owoców, a prawdopodobieństwo pominięcia larwy jest wysokie. Przetestowano technikę ekstrakcji, która łączy i) miażdżenie owoców żywiciela w plastikowej torbie, ii) przecedzenie miazgi przez szereg sit, iii) umieszczenie zatrzymanej miazgi w roztworze wody z brązowym cukrem oraz iv) zbieranie larw, które unoszą się na powierzchni. Metoda została oceniona na Florydzie z guawą zebraną w terenie, naturalnie porażoną przez Anastrepha suspensa. Aby naśladować niskie populacje, bardziej reprezentatywne dla programu zwalczania muszek owocowych, mango i papaja na Hawajach zostały zaatakowane znaną, niską liczbą larw Bactrocera dorsalis. Możliwość zastosowania metody została przetestowana w terenie na guawie naturalnie zaatakowanej przez B. dorsalis w celu oceny metody w warunkach, jakich doświadczyli pracownicy podczas awaryjnego programu muszek owocowych. Zarówno w badaniach polowych, jak i laboratoryjnych, rozdrabnianie i przesiewanie miąższu było bardziej wydajne (wymagało mniej czasu) i bardziej wrażliwe (znaleziono więcej larw) niż krojenie owoców. Pływanie miazgi w roztworze wody z brązowym cukrem pomogło wykryć wcześniejsze larwy w stadium rozwojowym. Rozdrabnianie i przesiewanie miazgi owocowej ważnych żywicieli tefrytowych może zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia larw podczas programów awaryjnych.

Wprowadzenie

Muszki owocowe Tephritid należą do najbardziej destrukcyjnych szkodników rolniczych, a największe zagrożenie stanowią rodzaje Anastrepha, Bactrocera i Ceratitis¹. Wiele obszarów jest narażonych na wysokie ryzyko osiedlenia się egzotycznych muszek owocowych, w oparciu o 1) historyczne wtargnięcia i związane z nimi programy delimitacji i eliminacji, 2) wysoki wskaźnik przybycia materiału żywicielskiego muszki owocowej do portów wjazdu oraz 3) warunki klimatyczne sprzyjające tworzeniu się populacji rozrodczych. Stan Kalifornia doświadcza wielu wtargnięć i wykryć tefrytidów rocznie². W ciągu ostatniego stulecia na całym świecie miało miejsce ponad 200 inwazji i programów zwalczania tefrytidów, a w ostatnich dziesięcioleciach liczba ta znacznie przyspieszyła³. Chociaż zdecydowana większość tych programów odnosi sukcesy w zwalczaniu inwazji muszek owocowych^3,4, obciążenie ekonomiczne i środowiskowe tych inwazji pozostaje nadal wysokie, a możliwość powstania jest zawsze obecna; niedawnym katastrofalnym przykładem jest zakażenie Bactrocera dorsalis na kontynencie afrykańskim⁵.

Podczas programów awaryjnych dla muszek owocowych, podejmowane są wspólne wysiłki w celu wykrycia i kontroli populacji lęgowych inwazyjnych gatunków. Na przykład stan Floryda reaguje na inwazje tefrytów, stosując zraszacze glebowe (pod linią kroplującą roślin żywicielskich owocujących) i usuwając owoce żywiciela w promieniu 200 m wokół miejsc, w których znajdują się kryte samice i/lub larwy⁶. Te działania i taktyki służą zabijaniu larw i poczwarek w glebie oraz usuwaniu wszelkich jaj i larw z owoców na tym obszarze. W niektórych programach zwalczania usuwa się znaczną ilość owoców żywiciela. W 2015 roku ponad 100 000 kg owoców zostało zniszczonych podczas programu zwalczania B. dorsalis na Florydzie⁶. Straty ekonomiczne poniesione przez plantatorów i powiązane branże na samym obszarze objętym kwarantanną oszacowano na ponad 10,7 miliona dolarów⁷.

Aby znaleźć larwy tefrytów w obszarach kwarantanny, mały zespół entomologów zbiera owoce żywiciela w promieniu 200 m wokół obszaru wykrywania samic much, a następnie tnie i wizualnie sprawdza każdy owoc pod kątem larw⁶. Przy ograniczonych zasobach kadrowych i setkach potencjalnych gospodarzy zadanie staje się trudne, szczególnie na obszarach, gdzie różnorodność roślin zarówno w obszarach produkcji komercyjnej, jak i na placach mieszkalnych jest wysoka. Ponadto larwy mogą zostać pominięte podczas krojenia owoców żywicielskich. W badaniu oceniającym krojenie owoców w portach wejściowych stwierdzono, że krojenie owoców nie jest tak skuteczne w wykrywaniu A. suspensa w porównaniu z przetrzymywaniem porażonych owoców przez kilka tygodni i liczeniem larw i poczwarek znalezionych w podłożu do przepoczwarzenia⁸.

Istnieją alternatywy dla cięcia owoców do wykrywania inwazji9^,10,11,12,13. Na przykład, unoszenie się brązowego cukru i metoda gorącej wody są akceptowanymi procedurami stosowanymi do wykrywania muszek owocowych wiśni zachodnich w zebranych wiśniach^9,10. Metoda brązowego cukru polega na umieszczeniu zmiażdżonych owoców w roztworze wody z cukrem i zebraniu larw, które unoszą się na wierzchu. Metoda flotacji brązowego cukru została opracowana specjalnie w celu spełnienia przepisów regulacyjnych dotyczących eksportowanych wiśni, które wymagają od pakowalni monitorowania szkodników muszek owocowych w czasie kwarantanny. Istnieje również zatwierdzony amerykańsko-kanadyjski program certyfikacji borówek, który obejmuje pływanie w wodzie z brązowym cukrem, pływanie w słonej wodzie lub gotowanie w celu wsparcia fitosanityzacji¹⁴. Testując dokładność unoszenia się cukru i gorącej wody, naukowcy wykorzystali metodę przesiewania, aby określić, ile larw zostało pominiętych^{9,10,11,12,13}. Badanie wykazało, że zmieszanie zmiażdżonych jagód w roztworze soli i przefiltrowanie roztworu przez filtr do kawy wielokrotnego użytku było czterokrotnie lepsze w wykrywaniu larw Drosophila suzukii niż wizualne sprawdzanie powierzchni roztworów soli i cukru¹⁴. Ponadto chromatografia gazowa została wykorzystana do wykrycia larw A. suspensa w citrus¹⁵. Podejścia te nie zostały przetestowane pod kątem możliwości zastosowania w badaniach terenowych.

Naszym celem było opracowanie i przetestowanie metody znajdowania larw tefrytów w terenie za pomocą przesiewania i pływania wodą z cukrem. Metoda ta pozwala na skuteczniejsze wykrywanie niedojrzałych muszek owocowych niż tradycyjna metoda cięcia owoców, wspierając terminową kontrolę populacji lęgowych podczas programów zwalczania muszek owocowych.

Protokół

1. Wybór owoców

1. Określ, jakie owoce są dostępne na obszarze, który ma być badany.
2. Wybierz owoc żywiciela na podstawie listy znanych żywicieli dla docelowego gatunku tefrytów.
3. Wybieraj dojrzałe owoce o miękkim miąższu, takie jak mango, papaja i guawa. Niedojrzałe lub owoce o twardym miąższu, takie jak tropikalne migdały, należy sprawdzić inną metodą, taką jak krojenie owoców.
4. Wybierz opadłe, przejrzałe owoce lub dojrzałe owoce na drzewach, które mają ślady uszkodzeń, blizny po złożeniu jaj i miękkie miejsca.
5. Jednorazowo należy przetworzyć około 2 l owoców (np. 5 guaw lub 5 średniej wielkości mango stanowi odpowiednie próbki dla tej metody). Liczba owoców, które można przetworzyć za jednym razem, zależy od wielkości owoców (Rysunek 1A).

2. Czyszczenie

1. Pokrój owoce na duże kawałki i umieść je w 4-litrowej torbie do przechowywania z zamkiem błyskawicznym (Rysunek 1B).
2. Wlej wodę do torebki, aż woda pokryje posiekany owoc na 25-50 mm (Rysunek 1C).
3. Delikatnie ściskaj owoce ręcznie, aż cały miąższ oderwie się od skórki i uzyska gładką konsystencję (tj. bez dużych kawałków) (Rysunek 1D).

3. Przesiewanie do późnej zbiórki

1. Ułóż sita w stos. Do przetwarzania dużych ilości owoców (~ 5 owoców na raz) należy używać dużych sit (o średnicy 457 mm), a do pojedynczych owoców lub mniejszych próbek (< 5 owoców).
2. Ułóż sito z sitkiem o dużych oczkach (nr 8; 2,36 mm) na sitku o małych oczkach (nr 20; 0,85 mm). W celu wykrycia wczesnych stadiów należy umieścić trzecie sito (nr 45; 0,35 mm) na dnie stosu (Rysunek 1E).
3. Wlej miazgę na górne sito (Rysunek 1F).
4. Dokładnie umyj miazgę przez stos sit, używając wody z kranu, węża lub butelki, aż drobna miazga przejdzie przez sita (Rysunek 1G).
5. Wizualnie przeskanuj górne sita w poszukiwaniu larw w późnym stadium rozwojowym, które mogły zostać zatrzymane wraz ze skórką lub jakimikolwiek dużymi kawałkami owoców (Rysunek 1H).
6. Dokładnie sprawdź drugie sito pod kątem larw w późnym stadium rozwojowym. W przypadku dużych ilości drobnej miazgi może być konieczne dodatkowe płukanie.
7. Zebrać larwy z sit za pomocą kleszczy larwalnych i umieścić je w fiolkach z 70% EtOH.

4. Flotacja cukru dla wczesnej kolekcji instar

1. Roztwór cukru należy wstępnie wymieszać, rozpuszczając 453 g (1 pudełko) ciemnobrązowego cukru w 2 litrach wody z kranu, co daje odczyt Brixa 19°¹⁰.
2. Umyj miazgę z sit o drobnych oczkach (np. nr 20 i nr 45) do krawędzi sita wodą z kranu, a następnie przenieś materiał do plastikowej patelni (11 l).
3. Dodaj roztwór brązowego cukru, aż pokryje miazgę na 25-50 mm i dodaj 2 krople środka przeciwpieniącego. Pozostaw miazgę w roztworze brązowego cukru na około 5 minut.
4. Larwy, które unoszą się na powierzchni roztworu, zebrać za pomocą kleszczyków larwalnych do fiolek z 70% EtOH.

5. Opieka nad larwami

1. Oznacz fiolkę miejscem pobrania, datą, rodzajem owocu i pojemnikiem na śmieci w celu późniejszego zbadania i identyfikacji.

Wyniki

Wczesny i późny rozwój Anastrepha suspensa ekstrakcja z owoców zebranych na polu
W tym eksperymencie porównaliśmy metody krojenia owoców oraz rozdrabniania, przesiewania i pływania (MSF) pod względem proporcji wykrytych larw i średniego czasu potrzebnego do ich wykrycia. Guawa, silnie zarażona larwami Anastrepha suspensa, została zebrana z rośliny znajdującej się na Uniwersytecie Florydy, w Instytucie Nauk o Żywności i Rolnictwie, w Tropikalnym Centrum Badań i Edukacji, Homestead, FL. Owoce zostały losowo posortowane w grupy po 5 sztuk i przydzielone do 1 z 2 metod ekstrakcji larw: 1) cięcia ręcznego lub 2) metody MSF. Zarejestrowano czas zbierania wszystkich larw widocznych gołym okiem przy użyciu każdej metody ekstrakcji.

Metoda ręcznego cięcia była zgodna z metodą obecnie stosowaną w programie eliminacji. Każdemu z 5 pracowników (n=5) przydzielono 5 owoców, aby wyszukać wszystkie stadia larw poprzez pokrojenie owoców na mniejsze kawałki i wizualną kontrolę miąższu. Aby ustalić, czy larwy zostały pominięte podczas oględzin, ręcznie ścięte kawałki owoców zostały ponownie sprawdzone za pomocą mikroskopu preparacyjnego (10x).

Dla metody MSF, 5 owoców zostało pokrojonych na duże kawałki (50-80 cm), umieszczonych w torebkach strunowych i delikatnie ściśniętych ręcznie, aż cała miazga została usunięta ze skórki, a miąższ miał gładką konsystencję (tj. bez dużych kawałków). Rozdrobnione owoce przecedziono przez szereg dużych (45,7 cm) mosiężnych sit. Na górze ułożono największą siatkę (nr 8), następnie sito o nr 20 i sito o oczkach nr 45. Personel przydzielony do tego zabiegu przemył miazgę przez siatkę za pomocą wody z węża podłączonego do kranu zlewozmywakowego. Larwy w późnym stadium rozwojowym były widoczne na sitach. Mniejsze instars zostały zmieszane z miazgą, co utrudniało ich dostrzeżenie i usunięcie. W związku z tym mieszaninę miazgi i larw z sit umieszczono w wiadrach z 1 litrem roztworu wody z brązowym cukrem. Larwy natychmiast wypłynęły na powierzchnię. Roztwór delikatnie wymieszano, a po 5 minutach larwy wyjęto z wiader i policzono. Czas przetwarzania owoców był kombinacją mushingu, przesiewania i usuwania larw z roztworu wody z cukrem. Dane dotyczące liczby larw znalezionych metodami ręcznego cięcia lub przesiewania i pływania analizowano za pomocą testu nieparametrycznego Kruskala-Wallisa (p = 0,05)¹⁶.

Metoda MSF dała większą liczbę larw (Rysunek 2A) i więcej larw na minutę (Rysunek 2B) niż ręczne cięcie. Chociaż wykrywanie różnych stadiów nie zostało określone ilościowo w tym badaniu, zaobserwowaliśmy, że wszystkie stadium (pierwsze, drugie i trzecie) znaleziono za pomocą sit, podczas gdy dopiero późniejsze stadium (drugie i trzecie) zaobserwowano przy użyciu cięcia ręcznego. Kiedy wcześniej pocięte i wizualnie skontrolowane próbki zostały ponownie zbadane za pomocą mikroskopu preparacyjnego, 40% późnych larw w stadium rozwojowym atakujących owoce zostało pominiętych. Jednak wcześniejsze instars zostały przede wszystkim znalezione podczas ponownej inspekcji.

Ten eksperyment pokazał, że użycie metody MSF jest bardziej skuteczne i efektywne w poszukiwaniu larw w wysoce zainfekowanych owocach. Jednak owoce zaatakowane mniejszą liczbą larw są częściej spotykane w programie zwalczania, w którym gatunki inwazyjne byłyby bardzo rzadkie. W związku z tym przeprowadziliśmy badanie laboratoryjne, w którym owoc żywiciela został zaatakowany znaną, niewielką liczbą larw.

Ręczne porażanie mango i papai w celu symulacji niskiej inwazji Bactrocera dorsalis
W eksperymencie tym porównano metody krojenia owoców i MSF w odniesieniu do odsetka wykrytych larw i czasu potrzebnego do ich wykrycia, gdy porażenie było stosunkowo niskie. Ręczne porażenie zastosowano jako narzędzie eksperymentalne do oceny skuteczności każdej metody, ponieważ liczba obecnych larw była znana z całą pewnością.

Świdra korkowa (1,0 cm średnicy) została użyta do zrobienia 5 otworów w pojedynczych owocach mango i papai, które były wolne od larw muszek owocowych. Pojedyncza larwa B. dorsalis w późnym drugim do początku trzeciego stadium rozwojowego została umieszczona w każdym z 5 otworów podzbioru owocu. Otwory zostały zakryte za pomocą kawałka wywierconego z owocu, a pozostałe owoce zostały zakryte bez wkładania larwy, aby wizualnie symulować ręczną inwazję. Owoce przechowywano w temperaturze 27 °C przez 48 godzin, aby umożliwić rozwój larwalny. Eksperyment przeprowadzono w laboratorium ARS w Hilo na Hawajach (n = 5 pracowników) oraz w laboratorium APHIS-PPQ na wyspie Oahu na Hawajach (n = 4 pracowników).

Do krojenia owoców, każdy pracownik otrzymał 5 mango (1 zainfekowane 1 larwą i 4 niezainfekowane) oraz 4 papaje (jedna zainfekowana i 3 niezainfekowane). Pracownik kroił każdy owoc z osobna na coraz mniejsze kawałki i stale sprawdzał miąższ pod kątem niedojrzałych muszek owocowych. Poszukiwania przerwano po dokładnym oględzinach miazgi. Zarejestrowano całkowitą liczbę znalezionych larw i czas spędzony przez każdego pracownika na przetworzeniu wszystkich owoców przez cięcie (Rysunek 3) i (Rysunek 4).

Każdy pracownik otrzymał inny podobny zestaw owoców (5 mango i 4 papai) do rozdrabniania lub przesiewania (bez konieczności krojenia owoców), z 2 kawałkami zainfekowanymi, jak opisano wcześniej. Miazgę wsypywano do górnego sita i przemywano przez stos sit przy użyciu wody z kranu i usuwano larwy, jak opisano w protokole. Eksperyment przeprowadzono dwukrotnie, z flotacją cukru i bez flotacji cukru, aby ustalić, czy usunięcie etapu flotacji zwiększy szybkość procesu bez utraty czułości (tj. znaleziono wszystkie lub większość larw) (Rysunek 3). Rejestrowano liczbę znalezionych larw i czas poświęcony przez każdego pracownika na przetworzenie owocu metodą cięcia, MSF lub MS.

Zarówno dla mango, jak i papai, pełna metoda MSF (w tym flotacja) skutkowała większą liczbą wykrytych larw i była szybsza niż krojenie owoców (Tabela 1). Pracownicy stosujący tradycyjną metodę krojenia owoców pominęli 32% i 35% larw umieszczonych odpowiednio w mango i papai (tab. 1). Przetwarzanie owoców luzem przy użyciu techniki MSF wymagało o 30% mniej czasu niż krojenie pojedynczych mango i o 35% mniej czasu niż krojenie pojedynczych papai (Rysunek 3). Więcej larw znaleziono na minutę przy użyciu metody MSF dla papai (Rysunek 3C) i mango (Rysunek 3D) w porównaniu z metodą krojenia owoców. Wszystkie znalezione larwy były żywe.

Identyfikacja morfologiczna larw jest możliwa tylko dla późnych stadium rozwojowych. Powtórzyliśmy powyższy eksperyment, ale pominęliśmy procedurę flotacji, aby określić, czy odzysk larw pozostał wysoki, a szybkość przetwarzania owoców wzrosła. Metoda MS (z pominięciem flotacji) skutkowała większą liczbą wykrytych larw papai (Ryc. 4A) i mango (Ryc. 4B) w porównaniu z cięciem i oględzinami. Dodatkowo, technika ta była szybsza niż cięcie i wizualne sprawdzanie papai (Rysunek 4C) i mango (Rysunek 4D). Usunięcie etapu flotacji z metody MSF skróciło czas poszukiwania larw w późnym stadium rozwojowym o 90% w przypadku papai i o 48% w przypadku mango (tabela 2). Odsetek znalezionych larw był wysoki w przypadku obu metod i konsekwentnie wyższy w przypadku SM (pominięto flotację). W przypadku papai 80% i 85% larw odzyskano odpowiednio metodami MSF i MS (tabela 1 i tabela 2). W przypadku mango 88% i 95% odzyskano odpowiednio metodami MSF i MS (Tabela 1 i Tabela 2).

Porównanie metod krojenia owoców i MSF
Celem tego eksperymentu było porównanie metod krojenia owoców i MSF w warunkach polowych, naśladując program awaryjnego muszki owocowej. Przetwarzanie owoców odbywało się bez wygody i infrastruktury laboratorium w celu przetestowania gotowości polowej obu metod ekstrakcji larw. Prace prowadzono w sadzie guawy znajdującym się na terenie USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit Germplasm w pobliżu Hilo. W sumie zebrano 40 guaw wykazujących oznaki porażenia i podzielono je na 2 grupy. Łącznie 20 guaw poddano cięciu/oględzinom, a następnie MSF (w tym flotację), co pozwoliło na ocenę wrażliwości metody cięcia w porównaniu z metodą MSF. Sekcja przebiegła w sposób opisany powyżej. Po wykryciu larwy usuwano i liczono. Czterech robotników rozcinało po 5 guaw, a czas potrzebny na cięcie i kontrolę był rejestrowany dla każdego pracownika. Płukanie MSF po cięciu przeprowadzono jak wyżej, z tą różnicą, że oprócz sit nr 8 i nr 20 do zbierania mniejszych larw użyto trzeciego sita o mniejszych oczkach (nr 40, 0,420 mm). Drugi zestaw 20 guaw umieszczono w 2 torebkach strunowych (10 owoców w woreczku) i poddano je wyłącznie MSF (tj. bez krojenia), co pozwoliło na porównanie czasu potrzebnego na krojenie owoców w porównaniu z MSF. Jak wyżej, w tej procedurze użyto trzech sit. Zarejestrowano liczbę znalezionych larw i całkowity czas przetwarzania owoców (rozdrabnianie i przetrzymywanie owoców przez 5 minut w worku/przesiewanie/pływanie w roztworze cukru).

Jak stwierdzono w laboratorium, cięcie owoców zaniżało porażenie owoców i było bardzo zmienne, wykrywając o 25%-83% mniej larw niż te, które można było odzyskać przy użyciu metod MSF (Tabela 3). Co więcej, w próbce z małą liczbą larw MSF odzyskał o 500% więcej larw, zapewniając wyższą czułość testu i większą szansę na zidentyfikowanie zarażającego organizmu. Owoce były przetwarzane znacznie szybciej przy użyciu metody MSF w porównaniu do krojenia; Krojenie i sprawdzanie 5 owoców wymagało mniej więcej tyle samo czasu, co przetwarzanie 10 owoców za pomocą MSF.

Rysunek 1: Etapy protokołu ekstrakcji larw muszek owocowych. (A) Przetwarzaj jednorazowo około 2 L objętości owoców (np. 5 guaw lub 5 średnich mango stanowi odpowiednie próbki dla tej metody). (B) Pokrój owoce na duże kawałki i umieść je w 4-litrowej torbie do przechowywania z zamkiem błyskawicznym. (C) Dodaj wodę do torebki, aż woda pokryje posiekany owoc na 25-50 mm. (D) Delikatnie ściskaj owoce ręcznie, aż cały miąższ oderwie się od skórki i uzyska gładką konsystencję (tj. bez dużych kawałków). (E) Ułożyć sito w stos z sitkiem o dużych oczkach (nr 8; 2,36 mm) na górze, a następnie sitkiem o małych oczkach (nr 20; 0,85 mm). W przypadku wczesnych stadiów umieść trzecie sito (nr 45; 0,35 mm) na dnie stosu. (F) Wlej miazgę na górne sito. (G) Dokładnie umyj miazgę przez stos sit, używając wody z kranu, węża lub butelki, aż drobna miazga przejdzie przez pierwsze sito. (H) Proszę wzrokowo przeskanować górne sita w poszukiwaniu larw w późnym stadium rozwojowym, które mogły zostać zatrzymane wraz ze skórką lub dużymi kawałkami owoców. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wczesna i późna ekstrakcja Anastrepha suspensa z owoców zebranych na polu. Średnia liczba (± błąd standardowy średniej [SE]) larw Anastrepha suspensa z pięciu owoców guawy zebranych przez rozbiór i oględziny (rozbicie: 70,4 ± 11,9) lub przemycie miazgi przez szereg trzech sit, a następnie namoczenie miazgi w roztworze wody z cukrem (MSF: 175,6 ± 21,91) (A). Średnia liczba larw (±SE) pobranych na minutę z 5 guaw przetworzonych przez cięcie (1,21 ± 0,16) i przez MSF (3,71 ± 0,50) (B). Każda metoda została powtórzona 5 razy, a gwiazdki nad słupkami wskazują na istotne różnice w liczbie larw (χ² = 6,81, p < 0,01) i czasie przetwarzania (χ² = 6,80, p < 0,01) na podstawie testu Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Walidacja pełnej metody przesiewania-pływania z użyciem ręcznego porażenia mango i papai w celu symulacji niskiego porażenia Bactrocera dorsalis. Średnia liczba larw Bactrocera dorsalis (±SE) znalezionych w owocach papai (cięcie: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) i mango (cięcie: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) oraz średnia liczba larw (±SE) zbieranych na minutę z papai (cięcie: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) i mango (cięcie: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) (D). Owoce, które zostały przetworzone przy użyciu metody rozbioru lub metody MSF (w tym flotacja, n = 5) ręcznie porażone przez 5 larw trzeciego stadium rozwojowego. Gwiazdki nad słupkami wskazują na istotne różnice w liczbie larw występujących w papai (χ² = 5,39, p = 0,02) i mango (χ² = 3,94, p = 0,05) w porównaniu z krojeniem owoców na podstawie testów Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Walidacja metody przesiewania grzybów (usunięta flotacja) przy użyciu ręcznego porażenia mango i papai w celu symulacji niskiego porażenia Bactrocera dorsalis. Średnia liczba larw (±SE) znalezionych w owocach papai (cięcie: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) i mango (cięcie: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25) (B) oraz średnia liczba larw zbieranych na minutę (±SE) w papai (cięcie: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) i mango (cięcie: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Owoce zostały ręcznie porażone 5 larwami Bactrocera dorsalis w trzecim stadium i przetworzone przez krojenie i oględziny (krojenie) lub rozdrobnione w torbie i przemyte przez sita (tylko grzybienie i przesiewanie, bez pływania, n = 4). Gwiazdki nad słupkami wskazują na istotne różnice w liczbie larw występujących w papai (χ² = 5,46, p = 0,02) i mango (χ² = 5,25, p = 0,02) oraz czasie przetwarzania papai (χ² = 5,39, p = 0,02) i mango (χ² = 5,39, p = 0,02) w porównaniu z krojeniem owoców, na podstawie testów Kruskala-Wallisa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

TGLI

owoc	# Przetworzone owoce	#Larvae Dodano	Metoda przetwarzania	#Larvae znalezione	Czas przetwarzania (min)*	% odzysku
mango	25	25	cięcie	17	Rozdział 158	68%
mango	25	25	Msf	22 Rozdział 22	Rozdział 113	88%
papaja	16	20	cięcie	13	62	65%
papaja	16	20	Msf	16	Rozdział 40	80%
*Całkowity czas zsumowany przez 5 pracowników.

Tabela 1: Liczba odzyskanych larw i czas do przetworzenia owoców za pomocą krojenia i oględzin (krojenia) lub metody pełnego rozdrabniania, przesiewania i pływania (MSF). Badany owoc został ręcznie poinasiany 5 larwami trzeciego stadium rozwojowego zmieszanymi z owocami tylko znudzonymi i zakrytymi (1 z 5 mango, 1 z 4 papai).

.

owoc	# Przetworzone owoce	#Larvae Dodano	Metoda przetwarzania	#Larvae znalezione	Czas przetwarzania (min)*	% odzysku
mango	20	20	cięcie	10	Rozdział 66	50%
mango	20	20	Ms	Rozdział 19	Rozdział 44	95%
papaja	16	20	cięcie	5	38 Rozdział 38	25 proc
papaja	16	20	Ms	17	25	85%
*Całkowity czas zsumowany przez 4 pracowników.

Tabela 2: Liczba odzyskanych larw i czas przetwarzania owoców tylko przez krojenie lub rozdrabnianie i przesiewanie, z pominięciem flotacji (MS). Badane owoce zostały ręcznie poinasione pięcioma larwami trzeciego stadium rozwojowego zmieszanymi z owocami nudnymi i okrytymi tylko (1 na 5 mango, 1 na 4 papaję).

Pracownik/metoda	#Fruit przetworzone	Czas przetwarzania (min)	#Larvae znaleziono cięcie	#Larvae znaleziono MSF*	% ogólnej liczby larw znalezionych podczas cięcia
Pracownik 1: cięcie	5	Rozdział 18	33 Rozdział 33	14	70%
Pracownik 2: cięcie	5	Rozdział 18	1	5	17%
Pracownik 3: cięcie	5	26	9	11**	75%
Pracownik 4: cięcie	5	20	24
Pracownik 5: MSF	10	22 Rozdział 22	nie	22 Rozdział 22	nie
Pracownik 6: MSF	10	Rozdział 18	nie	37	nie
* Miazga z cięcia i oględzin ponownie przetworzona przy użyciu metody MSF w celu określenia liczby pominiętych larw w późnym stadium 2-3
** Miąższ z owoców robotnic 2 i 3 zebranych przed przetworzeniem przy użyciu metody MSF

Tabela 3: Liczba larw znalezionych w guawie zbieranej na polu przez cięcie i wizualną kontrolę owocu (krojenie) lub przez mushowanie, przesiewanie i pływanie (MSF) owocu.

Dyskusja

Naszym celem było opracowanie wydajnego i skutecznego sposobu na znajdowanie larw tefrytów w terenie. Motywacją do uruchomienia programu zwalczania lub ustanowienia obszaru kwarantanny jest wykrycie krytych samic lub larw⁶, co wskazuje na populację lęgową. Obecna metoda krojenia i wizualnego wyszukiwania owoców jest nieefektywna w znajdowaniu larw, ponieważ zwykle obecnych jest znacznie więcej owoców żywicielskich, niż można indywidualnie sprawdzić. Ponadto populacje tefrytów są prawdopodobnie niskie na obszarze nowej inwazji, co sprawia, że szanse na znalezienie larw w dużej ilości owoców są niezwykle trudne. Na przykład w 2015 r. w ramach programu zwalczania Bactrocera dorsalis na Florydzie zidentyfikowano 54 różne gatunki żywicieli i ścięto ponad 4000 owoców. W tym programie zwalczania znaleziono tylko kilka larw w mango i nie stwierdzono żadnych innych żywicieli⁶. Odkryliśmy, że metoda MSF/MS była zarówno bardziej czuła, jak i szybsza w wykrywaniu larw A. suspensa i B. dorsalis podczas przetwarzania owoców, które miały dużą ilość miąższu (mango, guawa i papaja) luzem w porównaniu z krojeniem owoców. Większa ilość owoców żywiciela, którą można zbadać metodą rozdrabniania i przesiewania, w połączeniu ze zwiększoną wykrywalnością rzadkich larw, może zwiększyć prawdopodobieństwo, że inwazja zostanie wcześnie wykryta. Wczesne wykrycie populacji lęgowej może zwiększyć prawdopodobieństwo eradykacji i obniżyć koszty programu.

Nasze eksperymenty wykazały, że liczba larw wykrytych przez pracowników zajmujących się krojeniem i oględzinami owoców znacznie się różniła. Pracownicy krojący owoce przegapili 50% i 75% larw B. dorsalis umieszczonych odpowiednio w mango i papai. Natomiast tylko 5% i 15% larw zostało pominiętych przy użyciu metody MS do przetwarzania odpowiednio owoców mango i papai. Podobnie badanie oceniające rozbiór owoców w portach wejścia wykazało, że istniały znaczne różnice w liczbie porażonych owoców i larw stwierdzonych przez inspektorów⁸ . Badanie wykazało, że doświadczeni inspektorzy portowi pominęli 64%-99% larw A. suspensa i 16%-82% porażonych owoców podczas krojenia owoców i oględzin⁸. Nasze wyniki sugerują, że metoda rozdrabniania i przesiewania może zmniejszyć prawdopodobieństwo, że pracownik nie wykryje porażonego owocu.

Unoszenie się na wodzie z cukrem i gorącą wodą jest akceptowanym protokołem w metodzie podejścia systemowego w celu zapewnienia, że wiśnie i jagody są wolne od muszek owocowych¹⁴. Podzbiór przesyłki jest kruszony w roztworze, po czym inspektor wizualnie bada powierzchnię roztworu cukru pod kątem obecności jaj i larw. Chociaż można przetworzyć większą liczbę owoców w porównaniu do krojenia pojedynczych owoców, na prawdopodobieństwo znalezienia larw przy użyciu tych technik nadal mają wpływ umiejętności inspektora, stadium i liczba obecnych larw oraz rodzaj owocu⁸. Odkryliśmy, że podobnie jak inne tefryty, B. dorsalis i A. suspensa odrywają się od miąższu owoców i wypływają na powierzchnię. Co ciekawe, odkryliśmy, że w przypadku większych larw w późnym stadium rozwojowym, które są celem programów awaryjnych i eradykacyjnych, ponieważ można je zidentyfikować morfologicznie, w tym flotacja cukru nie zwiększyła dokładności metody. W rzeczywistości dodanie metody flotacji wydłużyło czas przetwarzania o 90% w przypadku papai i o 48% w przypadku mango. Wydłużony czas przetwarzania oraz dodatkowe materiały (np. woda, pojemniki, cukier itp.) nie umożliwiają dodania tego kroku w przypadku poszukiwania dużych gwiazd w terenie. Metoda unoszenia cukru na rynku może być odpowiednia, gdy celem jest wykrycie wszystkich stadiów, w tym wczesnych stadiów, takich jak porty wejścia i pakownie. Filtrowanie roztworu cukru za pomocą sita o drobnych oczkach najprawdopodobniej zapewniłoby najdokładniejsze wykrywanie jaj i wczesnych stadiów larwalnych^11,12.

Techniki MS i MSF dobrze sprawdzają się w przypadku owoców, które można łatwo rozgnieść i mają dużą objętość miąższu. Larwy tefrytów mają tendencję do zakopywania się w miazgi owocowej, co utrudnia wykrycie wzrokowe. Krytycznym aspektem metod MS i MSF jest oddzielenie larw od miazgi. Proces przesiewania usuwa miazgę, odsłaniając w ten sposób larwy na sitach sitowych. Podobnie metoda wody z cukrem oddziela larwy od miazgi, sprawiając, że larwy unoszą się na wodzie, podczas gdy miazga opada na dno naczynia. Larwy oddzielone od miazgi metodą MS lub MSF można łatwo zaobserwować poruszające się na sicie sitowym lub powierzchni wody. Chociaż metoda mushingu, przesiewania i opcjonalnie pływającej znacznie poprawiła szybkość i dokładność wykrywania larw tefrytidaków w ważnych owocach żywiciela, proces ten może nie być odpowiedni dla wszystkich owoców. Na przykład owoce żywicielskie z twardym miąższem, takie jak zielone awokado lub owoce z dużym pestkiem/pestką i stosunkowo niewielką ilością miąższu, takie jak tropikalne migdały, mogą być łatwiejsze do przetworzenia dzięki ręcznemu krojeniu i oględzinom.

Stwierdziliśmy, że metody MS i MSF były szybsze, gdy przetwarzano stosunkowo niewielką liczbę owoców (5-10). Różnica byłaby prawdopodobnie większa, gdyby przetworzono większe ilości owoców, co może być konieczne i typowe dla programów awaryjnych dla muszek owocowych. Usunięcie etapu flotacji jeszcze bardziej zwiększyło szybkość wykrywania bez uszczerbku dla dokładności znajdowania dużych larw tefrytów (>3 mm). Wykazaliśmy, że techniki te można zastosować w terenie, który symulował warunki, jakich doświadczają pracownicy podczas programu awaryjnego zwalczania muszek owocowych. Nasze badania wskazują, że metody MS mogą pozwolić na szybsze wykrycie larw w późnym stadium rozwojowym, a następnie zwalczenie populacji lęgowych tefrytów. MSF może być używany do wykrywania jaj i wczesnych stadiów rozwojowych, które obecnie nie są objęte programami eradykacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Środek przeciwpieniący	MicroLubrol	ML200-50-4	MicroLubrol 2000 Płynny czysty olej silikonowy, https://www.microlubrol.com
Dominos		z brązowym cukrem	1 lb Pudełko  Ciemnobrązowe kryształki cukru,
deski do krojenia	KitchenAid	KE703NOSMGA	KitchenAid Klasyczna antypoślizgowa plastikowa deska do krojenia, 12x18 cali, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0 M& cv_ct_cx=cięcie%2Bboards& słowa kluczowe=cięcie%2Bboards & pd_rd_i=B091118V8T& pd_rd_r= 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313 2f8e34& pd_rd_w=li862& pd_rd_wg =KogbB& pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d& pf_rd_r=9ATJD6W QBF9DVRY889MP& qid=1673911 429& refresh=1& sprefix=cięcie%2Bboards%2Caps%2C198& sr=1-2-8b2f235a-ddf-4202-bbb9-592393927392& th = 1
Patelnie do naczyń	Sterilite	06578012	Biała 12 qrt Patelnia, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords = biała + 12 + qt + patelnia + sterylizit & qid=1673911729& s=home -ogród& sprefix=biały+12+qr+patelnia+sterlite%2Cgarden%2C184& sr=1-1
EthOH	Fisher Scientific	BP8202500	Roztwór etanolu 96%, klasa biologii molekularnej, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Fiolki szklane	Fisher Scientific	0333921H	Fisherbrand  Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła klasy B z zamknięciami,
noże	https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H Nóż uniwersalny Zyliss	31380	5,25", https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords= owoce%2Bcięcie%2Bnoże& qid=1673911609& s= dom-ogród& sprefix=owoc%2Bcięcie%2Bnoże%2Cogród%2C145& sr=1-7& th=1
Nr 20 Sita siatkowe	Hogentogler & Co. Inc.	4221	Norma amerykańska  Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
nr 45 Sita siatkowe	Hogentogler & Co. Inc.	4226	Norma amerykańska  Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
nr 8 Sita siatkowe	Hogentogler & Co. Inc.	4215	Norma amerykańska  Sita testowe, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
miękkie kleszcze	Instrumenty DR	DRENTF01	DR Instrumenty Lekkie kleszcze entomologiczne, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Torby do przechowywania z zamkiem błyskawicznym	Ziploc	682254	Marka Ziploc 2 galony przezroczyste torby do zamrażania, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords = ziploc + zamrażarka + torby + 2 + galon i qid=1674504602&