Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65515

⸱

22 września 2023

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Streszczenie

Trójwymiarowa (3D) enkapsulacja sferoidów jest kluczowa dla odpowiedniej replikacji mikrośrodowiska guza dla optymalnego wzrostu komórek. Tutaj zaprojektowaliśmy model glejaka 3D in vitro do enkapsulacji sferoidalnej, aby naśladować zewnątrzkomórkowe mikrośrodowisko guza. Najpierw uformowaliśmy kwadratowe piramidalne formy mikrostudzienkowe przy użyciu polidimetylosiloksanu. Te formy mikrostudzienkowe zostały następnie wykorzystane do wytworzenia sferoid guza o ściśle kontrolowanych rozmiarach od 50 do 500 μm. Po uformowaniu sferoid zebrano je i zatorbiono w hydrożelach na bazie glikolu polietylenowego (PEG). Hydrożele PEG są wszechstronną platformą do enkapsulacji sferoidowej, ponieważ właściwości hydrożelu, takie jak sztywność, degradowalność i adhezjalność komórek, można dostrajać niezależnie. W tym przypadku użyliśmy reprezentatywnego miękkiego (~8 kPa) hydrożelu do kapsułkowania sferoid glejaka. Na koniec opracowano metodę barwienia i obrazowania sferoid w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ze względu na gęste sferoidalne jądro i stosunkowo rzadkie peryferium, obrazowanie może być trudne, ale zastosowanie roztworu oczyszczającego i konfokalnego przekroju optycznego pomaga złagodzić te trudności z obrazowaniem. Podsumowując, pokazujemy metodę wytwarzania jednolitych sferoid, kapsułkowania ich w hydrożelach PEG i wykonywania mikroskopii konfokalnej na zamkniętych sferoidach w celu zbadania wzrostu sferoidów i różnych interakcji komórka-macierz.

Wprowadzenie

Sferoidy nowotworowe okazały się użytecznymi narzędziami in vitro do badania etiologii, patologii i reakcji na leki w nowotworach1. Tradycyjnie, sferoidy były hodowane w warunkach takich jak płytki o niskiej przyczepności lub bioreaktory, gdzie adhezja komórka-komórka jest faworyzowana nad adhezją na powierzchni komórki2. Jednak obecnie uznaje się, że aby wierniej odtworzyć mikrośrodowisko guza, modele sferoidalne in vitro powinny uchwycić zarówno interakcje komórka-komórka, jak i komórka-macierz. To skłoniło wiele grup do zaprojektowania rusztowań, takich jak hydrożele, w których sferoidy mogą być zamknięte3,4. Takie hydrożelowe modele sferoidalne umożliwiają wyjaśnienie interakcji komórka-komórka i komórka-matryca na różne zachowania komórek, takie jak żywotność, proliferacja, łodyga lub responsywność terapii3.

Tutaj opisujemy protokół enkapsulacji sferoidów glejaka w hydrożelach z glikolu polietylenowego (PEG). Istnieje wiele doniesień literaturowych na temat enkapsulacji sferoidalnej komórek glejaka w hydrożelach. Na przykład, sferoidy zostały utworzone przez zamknięcie komórek U87 w hydrożelach PEG ozdobionych ligandem adhezyjnym RGDS i usieciowanych enzymatycznie rozszczepialnym peptydem w celu określenia wpływu sztywności hydrożelu na zachowanie komórki5. Komórki U87 zostały również utworzone w innych hydrożelach na bazie PEG lub na bazie kwasu hialuronowego w celu rozszerzenia populacji nowotworowych komórek macierzystych6 lub w celu zbadania mechanizmów oporności na chemioterapię za pośrednictwem macierzy7,8,9. Sferoidy glejaka zostały również zamknięte w hydrożelach żelatynowych w celu zbadania wzajemnych oddziaływań między mikroglejem a komórkami nowotworowymi i ich wpływu na inwazję komórek10. Ogólnie rzecz biorąc, takie badania wykazały przydatność modeli in vitro opartych na hydrożelu w zrozumieniu patologii glejaka wielopostaciowego i opracowaniu metod leczenia.

Ponadto, istnieją różne metody wytwarzania sferoidów nowotworowych i enkapsulacji hydrożelowej11. Na przykład, rozproszone komórki mogą być zasiane w hydrożelach i pozwolić im tworzyć sferoidy w czasie5,12. Jedną z wad takiej metody jest polidyspersyjność utworzonych sferoid, co może prowadzić do zróżnicowanych odpowiedzi komórek. Aby wytworzyć jednolite sferoidy, komórki można zamknąć w mikrożelach i hodować przez dłuższy czas, aż zaatakują i przemodelują gel13, lub komórki można umieścić w szablonowych żelach ze sferycznymi "otworami" i pozwolić na agregację14. Wadą tych metod jest ich względna złożoność, potrzeba generatora kropel lub innych środków do tworzenia mikrożeli lub "" w żelu oraz czas potrzebny na wzrost i dojrzewanie sferoid. Alternatywnie, sferoidy mogą być wstępnie uformowane w mikrostudzienkach9,15,16 lub w wiszących płytach17,18, a następnie zamknięte w hydrożelu, podobnie jak w opisanej tutaj technice. Te metody są prostsze i można je wykonać w sposób o wyższej przepustowości. Co ciekawe, wykazano, że metoda tworzenia sferoidów może wpływać na zachowania komórek sferoidalnych, takie jak ekspresja genów, proliferacja komórek czy reaktywność leków19,20.

Tutaj skupiamy się na glejaku, ponieważ jest to guz, którego naturalnym środowiskiem jest miękka, nanoporowata matryca mózgu21, który może być naśladowany przez miękki, nanoporowaty hydrożel. Glejak wielopostaciowy jest również najbardziej śmiertelnym nowotworem mózgu, na który nie ma dostępnego lekarstwa22. Jednak opisany tutaj protokół może być stosowany do enkapsulacji sferoid reprezentujących dowolny guz lity. Zdecydowaliśmy się użyć hydrożeli PEG, które powstają w wyniku reakcji addycji typu Michael23. PEG to syntetyczny, niedegradowalny i biokompatybilny hydrożel, który jest obojętny i służy jako rusztowanie i fizyczne wsparcie komórki, ale nie obsługuje przyczepiania komórek23. Adhezjalność komórek może być dodawana oddzielnie poprzez wiązanie całych białek lub ligandów adhezyjnych24, a degradowalność może być dodawana poprzez chemiczne modyfikacje łańcucha polimerowego PEG lub hydrolitycznie lub enzymatycznie degradowalnych środków sieciujących25,26. Pozwala to na dostrojenie właściwości biochemicznych niezależnie od mechanicznych lub fizycznych właściwości hydrożelowych, co może być korzystne w badaniu interakcji komórka-macierz. Chemia żelowania typu Michaela jest selektywna i zachodzi w warunkach fizjologicznych; W związku z tym pozwala na enkapsulację sferoidów poprzez proste zmieszanie sferoidów z roztworem prekursora hydrożelu.

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metodologia ma kilka godnych uwagi cech. Po pierwsze, wytwarzanie sferoid guza w zespole wielodołkowym jest wydajne, szybkie, a koszt wymaganych materiałów jest niski. Po drugie, sferoidy są produkowane w dużych partiach w różnych rozmiarach o niskiej polidyspersyjności. Wreszcie, wymagane są tylko materiały dostępne na rynku. Użyteczność metodologii zilustrowano poprzez zbadanie wpływu właściwości substratu na żywotność komórek sferoidalnych, cyrkularność i macierzystość komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie roztworu prekursorowego polidimetylosiloksanu (PDMS)
    1. Przygotować negatywny roztwór prekursorowy PDMS (wykorzystywany również jako roztwór prekursora kleju). Nabrać elastomer szpatułką do łódki wagowej i zważyć. Dodać czynnik sieciujący do bazy elastomerowej w stosunku 1:10. Delikatnie i dokładnie wymieszać PDMS z czynnikiem sieciującym za pomocą szpatułki w plastikowej łódce wagowej.
      UWAGA: Ten roztwór prekursorowy PDMS jest wlewany do 6-dołkowej kwadratowej piramidalnej płytki z mikrowydłębieniami w celu utworzenia formy negatywowej. Jest to ten sam roztwór, który służy jako roztwór prekursora kleju.
    2. Przygotować pozytywny roztwór prekursorowy PDMS. Nabrać bazę elastomerową szpatułką do łódki wagowej i zważyć. Dodać czynnik sieciujący do bazy elastomerowej w stosunku 1:9. Delikatnie i dokładnie wymieszać PDMS z czynnikiem sieciującym za pomocą szpatułki w plastikowej łódce wagowej.
      UWAGA: Ten roztwór prekursorowy PDMS jest później wlewany na formę negatywową w celu utworzenia formy pozytywowej.
  2. Przygotowanie buforu trietanolaminowego (TEA) 0,3 M o pH 8
    1. Za pomocą pipety z pipetorem odmierzyć 1 mL TEA i 9 mL 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do probówki stożkowej 50 mL, aby przygotować roztwór TEA 0,75 M. Miareczkować roztwór do osiągnięcia pH 8, używając 1 N HCl lub 1 N NaOH. Następnie dodać odpowiednią ilość 1x PBS, aby uzyskać końcową objętość 25 mL, co pozwoli osiągnąć końcowe stężenie TEA 0,3 M przy pH 8.
      OSTROŻNIE: Roztwory HCl i NaOH przechowywać w szafce na materiały łatwopalne w temperaturze pokojowej (RT). Podczas pracy stosować środki ochrony osobistej.
  3. Przygotowanie pożywek kompletnych
    1. Aby przygotować pożywkę kompletną, dodać 10% (w/v) lub 56 mL płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% (w/v) lub 5,6 mL penicyliny i streptomycyny do 500 mL pożywki RPMI.
    2. Przed użyciem pozostawić roztwór w temperaturze 37 °C przez 10-20 min lub do momentu jego ogrzania.
    3. Roztwór przechowywać w temperaturze 0-4 °C do 6 miesięcy.
  4. Przygotowanie roztworów zapasowych 20% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG)
    UWAGA: Obliczenia oparto na roztworach o objętości 100 µL, którą można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od potrzeb.
    1. Aby przygotować 100 µL roztworu zapasowego 20% w/v 4-ramiennego PEG-akrylanu (4-arm PEG-Ac), zważyć 20 mg proszku 4-arm PEG-Ac do probówki do wirówki. Dodać 70 µL buforu TEA 0,3 M, a następnie mieszać roztwór na wortexie przez około 30 s lub do całkowitego rozpuszczenia. Uwzględnić zmianę objętości wynikającą z rozpuszczenia proszku, dodając odpowiednią ilość buforu TEA (~27 µL), aby uzyskać końcową objętość roztworu 100 µL.
    2. Aby przygotować 100 µL roztworu zapasowego 20% w/v PEG-diSH, zważyć 20 mg proszku PEG-diSH do probówki do wirówki. Dodać 70 µL buforu TEA, a następnie mieszać roztwór na wortexie przez około 30 s lub do całkowitego rozpuszczenia. Uwzględnić zmianę objętości wynikającą z rozpuszczenia proszku, dodając odpowiednią ilość buforu TEA (~27 µL), aby uzyskać końcową objętość roztworu 100 µL.
      UWAGA: Proszek PEG jest bardzo higroskopijny i musi być przechowywany w szczelnym pojemniku w temperaturze -20 °C. Po wyjęciu z zamrażarki pozwolić proszkowi PEG odtajać przez 10 min przed otwarciem butelki w celu odważenia proszku. Przed ponownym umieszczeniem w zamrażarce przepłukać butelkę gazem obojętnym, takim jak azot lub argon, aby usunąć wilgotne powietrze. Roztwór zapasowy 4-arm PEG-Ac można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed użyciem. Roztwór zapasowy PEG-diSH należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i nie można go przechowywać, ponieważ grupy tiolowe reagują ze sobą, tworząc wiązania disiarczkowe.
  5. Przygotowanie 2% v/v roztworu macierzy błony podstawnej
    1. Aby przygotować 2% v/v roboczy roztwór macierzy błony podstawnej, dodać 20 µL macierzy błony podstawnej (wolnej od LDEV) do 9,98 mL pożywki kompletnej i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół około 10 razy. Przygotować roztwór w temperaturze 4 °C (na lodzie), a następnie ogrzać go do 37 °C (w piecu lub inkubatorze) i natychmiast użyć.
      UWAGA: Macierz błony podstawnej zaczyna żelować w temperaturze >10 °C, dlatego należy mieszać roztwór macierzy błony podstawnej z pożywką kompletną w temperaturze 2-6 °C. Skład pożywki kompletnej opisano w kroku 1.3.
  6. Przygotowanie roztworu utrwalającego komórki
    1. Aby przygotować 1 mL roztworu utrwalającego zawierającego 4% w/v paraformaldehydu i 0,1% v/v surfaktanta niejonowego, najpierw wymieszać 891 µL 1x PBS i 108 µL paraformaldehydu (stężenie 37% w/v), a następnie dodać 1 µL surfaktanta niejonowego (stężenie 100%). Dokładnie wymieszać roztwór.
      UWAGA: Roztwór utrwalający powinien być przygotowywany na świeżo przed każdym przeprowadzeniem utrwalania.
      OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest łatwopalny i może tworzyć w powietrzu stężenia pyłu zdolnego do zapłonu. Powoduje podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Unikać wdychania, ponieważ może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Paraformaldehyd należy obsługiwać w dygestorium chemicznym i stosować środki ochrony osobistej. Po pracy dokładnie umyć ręce. Surfaktant niejonowy powoduje podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu. Podczas pracy stosować rękawice ochronne oraz ochronę oczu lub twarzy. Aby uniknąć przedostania się substancji do środowiska, otwierać butelkę w dygestorium chemicznym. Po pracy dokładnie umyć ręce.
  7. Przygotowanie roztworów barwiących
    1. Aby przygotować roztwór 3 mM jodku 3,3'-diheksylo-oksakarbocyaniny (DiOC), wymieszać 2,65 mg DiOC w 1 mL DMSO.
    2. Aby przygotować roztwór jodku propidyny (PI) 1,5 mM, wymieszać 1 mg PI w 1 mL wody dejonizowanej.
  8. Przygotowanie roztworu do klarowania sferoidów
    1. Przygotować roztwory klarujące zawierające 20%, 40% i 80% v/v formamidu w 1x PBS do klarowania sferoidów.
      1. Aby przygotować 10 mL 20% v/v formamidu, wymieszać 8 mL 1x PBS, a następnie dodać 2 mL formamidu. Aby przygotować 10 mL 40% v/v formamidu, wymieszać 6 mL 1x PBS, a następnie dodać 4 mL formamidu. Aby przygotować 10 mL 80% v/v formamidu, wymieszać 2 mL 1x PBS, a następnie dodać 8 mL formamidu.
      2. Po połączeniu formamidu i 1x PBS wymieszać roztwór na wortexie przez około 30 s.

2. Wytwarzanie kwadratowych mikrootworów w kształcie piramidy

  1. Wykonanie negatywowej formy PDMS z mikrootworami w kształcie ostrosłupa kwadratowego, zgodnie z Rysunkiem 1.
    1. Przygotować 2 g (~1 mL) roztworu prekursora PDMS i wlać go do jednego otworu 6-dołkowej matrycy z ostrosłupami kwadratowymi. Należy pamiętać, że 1 mL całkowicie pokrywa jeden otwór płytki. Po pokryciu matrycy PDMS-em, odgazować roztwór prekursora PDMS przez 30 min, umieszczając 6-dołkową płytkę z ostrosłupami kwadratowymi w desykatorze próżniowym. Następnie utwardzić PDMS, umieszczając płytkę w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 24 h.
      UWAGA: Podczas odgazowywania należy zdjąć pokrywę płytki, a przed utwardzaniem założyć ją z powrotem. Odgazowanie roztworu można przeprowadzić w desykatorze próżniowym lub poprzez przepłukiwanie gazem obojętnym, takim jak azot lub argon. Jeśli w roztworze prekursora formy negatywowej po 30 min nadal znajdują się pęcherzyki, co wskazuje na niewystarczające odgazowanie, należy umieścić go w desykatorze próżniowym na kolejne 30 min. Do przygotowania jednej lub większej liczby negatywowych form PDMS można jednocześnie użyć jednego lub wielu otworów płytki. Można zastosować mikrootwory w kształcie ostrosłupa kwadratowego o różnych rozmiarach, np. o długości krawędzi 400 i 800 µm, jak pokazano w Tabeli 1. Niezależnie od rozmiaru ostrosłupa kwadratowego, stosuje się tę samą ilość PDMS.
    2. Po utwardzeniu PDMS, gdy jest on jeszcze ciepły, ostrożnie wyjąć negatywową formę PDMS z matrycy za pomocą szpatułki i wyciąć z niej krążek o średnicy 35 mm za pomocą wycinaka do biopsji. Umieścić krążek w szalce Petriego, przykryć pokrywą i pozostawić do dalszego utwardzania w temperaturze RT przez kolejne 24 h.
      UWAGA: Aby wyjąć formy negatywowe, należy wsunąć szpatułkę między płytkę a formę PDMS i delikatnie wyciągnąć formę negatywową z matrycy. Formę wycina się w krążki o średnicy 35 mm, aby pasowały do 35 mm szalki Petriego. Formy mogą być wykonywane w innych rozmiarach, aby pasowały do płytek o różnych średnicach. Krążki negatywowej formy o średnicy 35 mm można przechowywać w temperaturze RT, chroniąc je przed kurzem, i ponownie wykorzystywać przez 6 miesięcy.
  2. Przygotowanie pozytywowej formy PDMS z mikrootworami w kształcie ostrosłupa kwadratowego.
    1. Umieścić 35 mm krążki negatywowej formy PDMS w 35 mm szalce Petriego teksturą mikrootworów skierowaną do góry.
    2. Przygotować 2,5 g (~1,2 mL) roztworu prekursora pozytywowego PDMS w opisany wyżej sposób i wlać go na formę negatywową w 35 mm szalce Petriego, aby całkowicie ją pokryć. Następnie odgazować roztwór prekursora przez 30 min w opisany wyżej sposób i umieścić go w piekarniku w temperaturze 60 °C na 3-4 h.
      UWAGA: Ponieważ PDMS jest lepki, pod formą negatywową może utworzyć się pęcherzyk z uwięzionego powietrza. Jeśli pod formą negatywową powstanie pęcherzyk, należy delikatnie docisnąć formę szpatułką, aby go usunąć. Jeśli pęcherzyki powietrza nadal występują, należy kontynuować odgazowanie przez 30 min lub delikatnie wymieszać roztwór formy pozytywowej szpatułką, aż pęcherzyki pękną.
    3. Po utwardzeniu pozytywowej formy PDMS, wyjąć formy z 35 mm szalki Petriego i natychmiast oddzielić formę pozytywową od negatywowej.
      UWAGA: Czas jest istotny dla pomyślnego oddzielenia formy pozytywowej. Najlepiej zrobić to, lekko nacinając formę pozytywową żyletką, aby odsłonić styk między formą pozytywową a negatywową, a następnie odkleić formy od siebie. Następnie odkleić krawędzie okrągłej formy. Delikatnie oddzielić formę negatywową od pozytywowej.
  3. Przyklejenie form do dna otworów 48-dołkowej płytki.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano płytkę 48-dołkową, ale można użyć innych płytek, pod warunkiem, że krążki form zostaną wycięte o odpowiednich średnicach (na przykład o średnicy 6 mm dla płytki 96-dołkowej).
    1. Wyciąć z form pozytywowych krążki za pomocą 10 mm wycinaka do biopsji.
      UWAGA: Z jednej pozytywowej formy o średnicy 35 mm można wyciąć około 4 form (każda o średnicy 10 mm).
    2. Aby przykleić formy do dna 48-dołkowej płytki, przygotować roztwór prekursora kleju PDMS (~0,5 mL lub 1 g) zgodnie z wcześniejszym opisem27. Za pomocą pęsety delikatnie zanurzyć płaską stronę (nie stronę z wzorem mikrootworów) 10 mm formy pozytywowej w roztworze prekursora PDMS. Ostrożnie umieścić jedną formę w każdym otworze 48-dołkowej płytki i delikatnie docisnąć każdą formę do dna otworu za pomocą pęsety. Umieścić tak przygotowaną płytkę w piekarniku w temperaturze 60 °C na 4-24 h, aby klej PDMS mógł utwardzić.
      UWAGA: Jeśli roztwór prekursora kleju PDMS dostanie się do mikrootworów formy pozytywowej, można go wytrzeć miękką chusteczką higieniczną i powtórzyć ten krok. Podczas przyklejania należy upewnić się, że klej nie zakrywa mikrootworów.
    3. Zesterylizować formy, dodając 300 µL 70% etanolu do każdego otworu 48-dołkowej płytki za pomocą pipety 1000 µL. Odessać 70% etanol i umieścić nieprzykrytą 48-dołkową płytkę w komorze do hodowli tkankowych pod promieniowaniem UV (302 nm) na 2 h.
      UWAGA: Formy można używać przez 6 miesięcy i w razie potrzeby ponownie sterylizować.

3. Tworzenie, pozyskiwanie i enkapsulacja wielokomórkowych sferoidów nowotworowych w hydrożelach

UWAGA: Protokół opisany w tej sekcji dotyczy ludzkiej linii komórkowej glejaka U87 (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2), jednak podobny protokół można zastosować w przypadku innych typów komórek nowotworowych.

  1. Formowanie wielokomórkowych sferoidów nowotworowych
    1. Wypłucz formy z mikrowypustkami, używając roztworu płuczącego przeciwpriwieranego poprzez dodanie 300 µL roztworu do każdego dołka za pomocą pipety 1000 µL. Następnie wiruj przy 1620 x g przez 3 min i odessij roztwór za pomocą pompy próżniowej i pipety Pasteura.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać bezpośrednio przed wysianiem komórek.
    2. Poddaj komórki działaniu ~80 µL 0,25% trypsyny/EDTA na każdy cm2 powierzchni kolby hodowlanej przez 5 min w 37 °C. Na przykład dla kolby hodowlanej T-25 odpowiednie jest 1 mL trypsyny/EDTA. Zneutralizuj trypsynę, dodając taką samą objętość pełnej pożywki do hodowli komórkowej. Na przykład dodaj 1 mL pełnej pożywki do kolby T-25 zawierającej trypsynę. Zbierz komórki z kolby do hodowli tkanek.
    3. Przenieś 10 µL zawiesiny komórkowej do każdego otworu hemocytometru w celu policzenia komórek. Użyj mikroskopu odwróconego, aby policzyć całkowitą liczbę komórek i oblicz średnią z co najmniej 8 kwadratów, dbając o to, aby liczba komórek w każdym kwadracie hemocytometru wynosiła 20-50, co zapewni dobre wyniki liczenia. Pomnóż obliczoną liczbę przez 104, aby określić końcowe stężenie komórek.
    4. Resuspenduj zebrane komórki w pełnej pożywce RPMI uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny do pożądanego końcowego stężenia komórek, w zależności od planowanej wielkości sferoidów, zgodnie z Tabelą 1.
      UWAGA: Mikrowypustki 800 µm pozwolą na uzyskanie ~75 sferoidów w jednym dołku płytki 48-dołkowej, a mikrowypustki 400 µm pozwolą na uzyskanie ~300 sferoidów w jednym dołku płytki 48-dołkowej.
    5. Nanieś 500 µL zawiesiny komórkowej o pożądanym stężeniu do mikrowypustek i wiruj płytkę przy 1620 x g przez 3 min. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaniem w 37 °C i 5% CO2 na 24 h, aby umożliwić formowanie sferoidów.
      UWAGA: Jeśli sferoidy nie powstają, do resuspensji komórek można użyć 2% v/v macierzy błony podstawnej w połączeniu z pełną pożywką (więcej szczegółów w kroku 1.5).
  2. Zbieranie sferoidów
    1. Używając pipety 1000 µL, energicznie nanieś 500 µL pełnej pożywki do dołka. Pobierając 500 µL pożywki z dołka, wypłucz cztery kwadranty dołka (konkretnie kwadranty górny, dolny, lewy i prawy), pipetując w górę i w dół w kwadrantach trzy do czterech razy, aby odczepić sferoidy. Delikatnie odessij pożywkę zawierającą sferoidy (~1000 µL łącznie) do probówki do mikrocentryfugi za pomocą pipety 1000 µL i pozwól sferoidom osiąść na dnie.
    2. Usuń nadsącz i resuspenduj sferoidy do pożądanego stężenia końcowego. Na przykład, aby uzyskać ~8 sferoidów w 20 µL żelu po enkapsulacji, resuspenduj sferoidy w 100 µL pożywki, co da stężenie ~75 sferoidów/100 µL w zawiesinie sferoidów.
  3. Enkapsulacja sferoidów w hydrożelach, jak pokazano na Rysunku 2.
    1. Aby przygotować 100 µL 10% w/v roztworu prekursora hydrożelu PEG, połącz w probówce do mikrocentryfugi 50 µL zawiesiny sferoidów, następnie 30 µL 20% w/v 4-arm PEG-Ac i na koniec 20 µL 20% w/v PEG-diSH. Zapewni to stechiometryczny stosunek molowy grup akrylanowych (Ac) do tiolowych (SH), gwarantując optymalne sieciowanie. Wymieszaj roztwór prekursora żelu, pipetując w górę i w dół ~10 razy.
      UWAGA: Skład hydrożelu, objętość i stężenie polimeru można zmieniać według potrzeb. Otrzymane hydrożele będą powoli degradować i nie będą przylegać do komórek. Aby hydrożel był adhezyjny dla komórek, można dodać ligand adhezyjny, taki jak RGDS. Aby hydrożel był degradowalny enzymatycznie, można dodać sieciujący peptyd degradowalny enzymatycznie, zawierający reszty cysteiny na obu końcach. Podczas przenoszenia sferoidów delikatnie pipetuj roztwór dwukrotnie, aby odczepić sferoidy i wprowadzić je do zawiesiny, co zapewni ich równomierny rozkład.
    2. Nanieś 20 µL roztworu prekursora żelu pomiędzy dwa szkiełka przedmiotowe wyłożone parafilmem i oddzielone silikonowymi dystansami 1 mm, a następnie umieść szkiełka z roztworem prekursora żelu w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2 na 15 min, aby umożliwić żelowanie.
      UWAGA: Upewnij się, że oba szkiełka są pokryte parafilmem, aby stworzyć powierzchnię hydrofobową umożliwiającą łatwe odklejenie po żelowaniu. Zamiast parafilmu można użyć roztworu do powłok hydrofobowych. Objętość 20 µL roztworu prekursora hydrożelu spowoduje powstanie płytki hydrożelu o średnicy ~6 mm i wysokości 1 mm przed pęcznieniem. Można użyć dowolnego rodzaju i grubości dystansa, jednak zaleca się, aby grubość żelu wynosiła 1 mm lub mniej (grubsze hydrożele mogą ograniczać dyfuzję tlenu i transport składników odżywczych do komórek), ale była większa niż średnica sferoidów (aby sferoidy były całkowicie zamknięte w żelu). Można użyć dowolnej objętości roztworu prekursora hydrożelu. Żele 20-30 µL są odpowiednie do płytki 24-dołkowej.
    3. Po zakończeniu żelowania hydrożelu rozdziel dwa szkiełka i delikatnie odklej żele od płytki szklanej za pomocą szpachelki. Umieść żele w płytce 24-dołkowej, jeden na dołek, upewniając się, że powierzchnia zawierająca sferoidy jest skierowana do góry.
      UWAGA: Sferoidy opadną na dno żelu podczas żelowania, więc odwrócenie ich do hodowli zapewni, że sferoidy będą znajdować się blisko powierzchni hydrożelu, co poprawi dostęp do składników odżywczych i tlenu. Żelowanie można monitorować, obserwując pozostały w probówce do mikrocentryfugi roztwór prekursora hydrożelu, którego nie wykorzystano do tworzenia płytek, poprzez odwrócenie probówki i odnotowanie czasu, w którym żel przestaje płynąć.
    4. Dodaj pełną pożywkę (~500 µL) do każdego dołka i upewnij się, że hydrożel jest całkowicie zanurzony. Umieść płytkę wielodołkową w inkubatorze z nawilżaniem w 37 °C i 5% CO2 i hoduj komórki, wymieniając pożywkę co 2-3 dni.
      UWAGA: Hydrożele można hodować do 4 tygodni lub do momentu ich degradacji, wymieniając pożywkę co drugi dzień.

4. Barwienie fluorescencyjne

  1. Żywotność komórek
    1. Aby określić żywotność komórek, należy zastosować barwnik 3,3'-diheksylo-oksakarbocyjaninę jodkową (DiOC), która barwi mitochondria i retikulum endoplazmatyczne wszystkich komórek. Należy użyć DiOC (3 mM) w stężeniu 0,02 µg/mL. W szczególności, za pomocą pipety 20 µL należy dodać 2 µL DiOC na każde 1000 µL pożywki do kolby z hodowlą dysocjowanych komórek (co najmniej 24 h przed procesem formowania sferoidów opisanym w sekcji 3). Należy odczekać 24 h, aby DiOC zabarwił komórki.
    2. Do barwienia jądra komórkowego i chromosomów należy użyć jodku propidyny, PI (1,50 mM), który przenika tylko do martwych komórek. Aby zabarwić komórki, najpierw należy odessać całą pożywkę i przepłukać żel, używając pipety 1000 µL do dodania 500 µL 1x PBS, tak aby żel był całkowicie zanurzony.
    3. Należy odessać PBS i dodać 500 µL świeżej pożywki, a następnie 30 µL roztworu PI do każdej studni (tj. 6 µL na każde 100 µL pożywki). Płytkę wielodobcową należy przykryć folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Płytkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na 30 min, aby PI zabarwił martwe komórki.
    4. Należy zdjąć folię i odessać pożywkę ze studni. Za pomocą pipety 1000 µL należy dodać 500 µL 1x PBS, aby zanurzyć hydrożel. Następnie należy odessać 1x PBS i powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy. Do każdej studni należy dodać 500 µL pożywki i wykonać obrazowanie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu odwróconego lub konfokalnego.
    5. Żywotność komórek oblicza się poprzez porównanie obszaru DiOC (wszystkie komórki) do obszaru PI (martwe komórki), zgodnie z równaniem 1, wykorzystując obrazy z serii z-stack z mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego mikroskopu odwróconego.
      Wzór na żywotność komórek, schemat; równanie określające % żywotności komórek przy użyciu pomiarów barwników fluorescencyjnych. Równ. 1.

5. Fixacja, barwienie, klarowanie i obrazowanie immunofluorescencyjne enkapsulowanych sferoidów

  1. Fiksacja i barwienie
    1. Odssać pożywkę z dołków, w których hodowane są hydrożele, a następnie opłukać hydrożele, nadając 500 µL 1x PBS bezpośrednio na hydrożele. Delikatnie odessać 1x PBS.
    2. Utrwalić sferoidy w płytce 24-dołkowej, dodając za pomocą pipety 1000 µL objętość 500 µL roztworu fiksacyjnego do każdego dołka. Pozostawić żele w fiksatywie na 30 min w RT. Usunąć roztwór fiksacyjny za pomocą pipety 1000 µL i przelać do wyznaczonego pojemnika na odpady.
    3. Opłukać hydrożele, dodając 500 µL 1x PBS do każdego dołka. Odessać 1x PBS za pomocą pipety 1000 µL i powtórzyć płukanie PBS jeszcze dwa razy. Przechowywać płytkę w 500 µL 1x PBS na dołek w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia lub użyć natychmiast.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie wciągnąć hydrożeli do pipety podczas odsysania PBS i roztworu fiksacyjnego. W tym celu należy przechylić płytkę pod kątem ok. 45 stopni, co ułatwi widoczność hydrożeli i zapobiegnie ich przypadkowemu odessaniu.
      OSTRZEŻENIE: Formaldehyd jest toksyczny przy wdychaniu i kontakcie skórnym. Należy z nim pracować w rękawicach, w komorze z wyciągiem chemicznym.
    4. Aby zbarwić komórki, inkubować sferoidy zamknięte w hydrożelu z przeciwciałami pierwotnymi przeciwko Nestin (200 µg/mL) i SOX2 (200 µg/mL) w rozcieńczeniu 1:200 (przeciwciało: PBS). Za pomocą pipety 1000 µL odessać 1x PBS z dołków. Do każdego dołka dodać 50 µL rozcieńczonego przeciwciała. Pozostawić na 24 h do zakończenia barwienia. Następnie usunąć roztwór barwiący za pomocą pipety 1000 µL i odpowiednio zutylizować odpady.
    5. Za pomocą pipety 1000 µL dodać 500 µL 1x PBS, co jest ilością wystarczającą do zanurzenia hydrożelu. Odessać PBS i powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy. Zbarwiony i zanurzony hydrożel przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed obrazowaniem lub obrazować natychmiast.
      UWAGA: W zależności od przeciwciała mogą być konieczne niewielkie optymalizacje w celu zapewnienia prawidłowego barwienia. Stężenie (1:200) i czas (24 h) są znacznie wyższe niż w typowych 2D hodowlach monowarstwowych, ponieważ barwienie 3D wymaga dyfuzji przez hydrożel i sferoidy.
  2. Po zbarwieniu sferoidów przeprowadzić ich klarowanie, aby zwiększyć przezroczystość do obrazowania, zastępując PBS sekwencyjnym zwiększaniem stężenia formamidu (opcjonalnie).
    1. Odessać 1x PBS z każdego dołka. Do każdego dołka dodać 500 µL 20% (v/v) formamidu i inkubować hydrożel przez 90 min. Odessać formamid za pomocą pipety 1000 µL i zebrać odpady w pojemniku na odpady.
    2. Dodać do dołka 500 µL 40% (v/v) formamidu. Inkubować hydrożel w roztworze przez 90 min. Odessać formamid i zebrać odpady w pojemniku na odpady.
    3. Do każdego dołka dodać 500 µL 80% (v/v) formamidu i inkubować przez 90 min. Odessać formamid i przelać do pojemnika na odpady. Dodać 500 µL 100% (v/v) formamidu i inkubować przez 24 h przed obrazowaniem. Po zakończeniu klarowania odpowiednio zutylizować odpady formamidu poprzez odpowiednie służby systemu gospodarki odpadami laboratoryjnymi.
      UWAGA: Klarowanie umożliwia obrazowanie konfokalne wnętrza sferoidu i jest opcjonalne, jeśli badana jest tylko peryferia sferoidu.
  3. Obrazowanie sferoidów zamkniętych w hydrożelu przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
    UWAGA: Do obrazowania komórek można użyć dowolnego mikroskopu – odwróconego, fluorescencyjnego lub konfokalnego; jednak mikroskop konfokalny pozwala na izolację pojedynczych płaszczyzn.
    1. Umieścić hydrożele w dołkach z szklanymi kryszkami i ustawić sferoidy jak najbliżej kryszki.
      UWAGA: Można stosować szklane kryszki lub dołki z szklanymi kryszkami na dnie. Kluczowe jest utrzymanie nawilżenia hydrożeli, ponieważ odwodnione próbki będą skutkować słabą jakością obrazowania.
    2. Obrazować próbki za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej (10x-20x), aby umożliwić obrazowanie głęboko w sferoidzie z wykorzystaniem stosów Z (Z-stacks) do rekonstrukcji 3D.
      UWAGA: Obiektywy o większym powiększeniu umożliwiają bardziej szczegółowe obrazowanie i sekcjonowanie optyczne, ale ograniczają głębokość obrazu.
    3. Ilościowo określić sygnał obecny w sekcji optycznej w stosunku do całkowitej powierzchni sferoidu dla sygnału sklarowanego i niesklarowanego, korzystając z równania 2.
      Wzór na obrazowany obszar sferoidu, analiza sekcji optycznej, równanie do kwantyfikacji danych mikroskopowych. Równ. 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Platformy do przesiewania leków oparte na sferoidach, służące do badania efektów chemioterapeutycznych, są coraz bardziej poszukiwane ze względu na nacisk na modulowanie mikrośrodowiska guza podczas enkapsulacji sferoidów w biomateriałach naśladujących natywną tkankę. W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę przygotowania wielokomórkowych sferoidów nowotworowych oraz ich późniejszej enkapsulacji i obrazowania w hydrożelu 3D. Sferoidy są przygotowywane w formach z mikrowellami (Ryc. 3A,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wielokomórkowe modele sferoidalne guzów oparte na hydrożelu są coraz częściej opracowywane w celu przyspieszenia odkryć w leczeniu nowotworów 11,13,29. Są one korzystne, ponieważ w kontrolowany sposób naśladują kluczowe parametry mikrośrodowiska guza i pomimo swojej złożoności są prostsze i tańsze w użyciu niż modele in vivo, a wiele z nich jest kompatybilnych z wysokoprzepustowymi technologiami badań przesiewowych. Biomateriały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z funduszy startowych dostarczonych dr Silviya P Zustiak przez Uniwersytet Saint Louis, a także z grantu zalążkowego od Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience na Uniwersytecie Saint Louis przyznanego dr Silviya P Zustiak.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70% etanolFisher Scientific LC22210-4
15 ml StożkoweFALCON352097
24-dołkowa płytka Ultra Low Płytki FisherScientific07-200-602
35 mm Szalka PetriegoAmazon706011
4-ramienny poli(glikol etylenowy)-akrylowy (4-ramienny PEG-Ac; 10 kDa)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL StożkowyFisher Scinetific
6-dołkowy AggreWell 400 StemCell Technologies, Vancouver, Kanada34421Kwadratowe piramidalne mikrostudzienki 
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniuStemCell Technologies, Vancouver, KanadaKat #: 07010
Kwas asparaginowy-arginina-cysteina-glicyna-walina-prolina-metionina-seryna-metionina-arginina-arginina-glicyna-cysteina-arginina-kwas asparaginowy (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptydGenic Bio, Szanghaj, Chinyn/aNiestandardowa synteza
Chemiczny wyciągwyciągowy KEWAUNEE99151
Matryca membrany podstawnej Corning Matrigel, bez LDEV Corning356234Detergent do matrycy membrany podstawnej
- Triton-XSigma AldrichT8787Niejonowy środek powierzchniowo czynny
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher Scientific BP231-100
Pipety jednorazowe (1 ml, 2 ml, 5 mL, 10 mL, 25 ml, 50 ml)Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2 mL: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 mL: 13-678-11E, 25 mL: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Płodowa surowica bydlęcaHyklonSH30073-03
Formaldehyd 37% roztwórSigma AldrichF1635
Szklane talerzeSlumpysGBS4100SFSL
Szklane pipety transferoweFisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Peptyd glicyno-argininy-cysteiny-asparaginianu-glicyny-seryny (GRCD-RGDS)Genic Bio, Szanghaj, Chinynie dotyczyNiestandardowa synteza
HemacytometrBright-Line383684
Roztwór hydrofobowy - Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
InkubatorNUAIRENU-8500
Mikroskop odwrócony (Axiovert 25)Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3) (nadchloran 3,3'-diheksadecyloksakarbocyjaniny)Fisher Scientific D1125
Leica Confocal SP8Leica Microsystems Inc.
Mikroskop świetlny i fluorescencyjny (Axiovert 200M)Zeiss
MicroFisher Scientific2 mL: 02681258
Oprogramowanie mikroskopoweZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
ParafilmPARAFILM PM992
PBS (1x), pH 7,4HyCloneSH30256,01
Penicylina StreptomycynaMP Biomedicals1670046
Pomoc w pipetachDrummond Scientific Co.P-76864
Końcówki do pipet (1– 200 i mikro; L, 101– 1000 &mikro; L)Fisher Scinetific2707509
Plastikowe standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-9D
Plastikowe łodzie wagowe (100 ml)Amazon mdo-azoc-1030
poli(glikol etylenowy)-ditiol (PEG-diSH; 3,4 kDa)Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
Polidimehylsiloksan (PDMS) [Zestaw elastomerów Slygard 182]Elsworth Adhesives3097358-1004z polidimetylosiloksanu
Quest92897
Jodek propidyny, 1 mg/ml roztwór wodny. Fisher Naukowy 
RPMI-1640 Medium (1x)HyCloneSH30027-02
Dystanse silikonowe - Arkusz silikonowy o grubości 0,5 mm / 13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0,5
SOX2 Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnologysc-365823
Kaptur do hodowli tkanekNUAIRENU-425-600
Trietanoloamina, ≥ 99.0% (GC) Sigma Aldrich90279
U-87 MG ludzkie komórki glejakaKolekcja kultur typu amerykańskiego Zobacz materiał HTB-14
3181345107Probówki wirówkowe 3820005619 Bezpudrowe rękawice badawcze AAJ66584AB

Bibliografia

  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).
  3. Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998(2018).
  4. Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506(2020).
  5. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  6. Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
  7. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
  8. Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371(2019).
  9. Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
  10. Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).
  11. Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).
  12. Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
  13. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  14. Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
  15. Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).
  16. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).
  17. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
  18. Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).
  19. Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).
  20. Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
  21. Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).
  22. Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
  23. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  24. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
  25. Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085(2020).
  26. Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
  27. Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
  28. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  29. Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
  30. Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
  31. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  32. Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sferoidy nowotworowehydro ele PEGenkapsulacja sferoid wmodel glejaka wielopostaciowegoformy mikrootworowemikroskopia konfokalnabarwienie hydro eluocena ywotno ci kom rekmarkery kom rek macierzystych
Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.