Method Article

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

DOI:

10.3791/65525

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwasy sjalowe to ujemnie naładowane monosacharydy, zazwyczaj znajdujące się na końcach glikanów na powierzchni komórki. Ze względu na swoją hydrofilowość i cechy biofizyczne biorą udział w wielu procesach biologicznych, takich jak modulacja odpowiedzi immunologicznej, rozpoznawanie antygenów własnych i obcych, interakcje węglowodanowo-białkowe itp. Zawartość komórkowa kwasu sjalowego jest regulowana przez sialidazę, która katalizuje usuwanie reszt kwasu sjalowego. Kilka badań wykazało, że glikany sialo odgrywają kluczową rolę w monitorowaniu nadzoru immunologicznego poprzez angażowanie się w receptory hamujące cis i trans Siglec na komórkach odpornościowych. Podobnie, glikoimmunologiczne punkty kontrolne w nowotworach stają się kluczowymi celami dla rozwoju immunoterapii. Ponadto komórki dendrytyczne (DC) są uważane za ważny składnik immunoterapii, zwłaszcza w badaniach nad rakiem, ze względu na ich wyjątkową rolę jako profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) i ich zdolność do wywoływania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych i generowania pamięci immunologicznej. Niemniej jednak funkcja DC jest uzależniona od ich pełnej dojrzałości. Niedojrzałe DC pełnią funkcję przeciwstawną do dojrzałych DC i mają wysoką zawartość kwasu sjalowego, co dodatkowo osłabia ich poziom dojrzewania. Zmniejsza to zdolność niedojrzałych DC do aktywacji limfocytów T, co prowadzi do osłabienia odpowiedzi immunologicznej. W konsekwencji usunięcie kwasu sjalowego z powierzchni komórek ludzkich DC indukuje ich dojrzewanie, zwiększając w ten sposób ekspresję cząsteczek MHC i prezentację antygenu. Ponadto może przywrócić ekspresję cząsteczek kostymulujących i IL-12, co powoduje, że DC mają większą zdolność do polaryzacji limfocytów T w kierunku fenotypu Th1 i specyficznej aktywacji cytotoksycznych komórek T w celu zabicia komórek nowotworowych. W związku z tym kwas sjalowy stał się kluczowym modulatorem DC i jest stosowany jako nowy cel w celu rozwoju ich zastosowania terapeutycznego. Badanie to zapewnia unikalne podejście do leczenia sialidazą DC pochodzących z monocytów in vitro, mające na celu wygenerowanie populacji DC o różnych fenotypach kwasu sjalowego na powierzchni komórek oraz dostosowanych profilach dojrzewania i kostymulacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikany przenoszące kwas sjalowy (sialoglikany) zyskały duże zainteresowanie ze względu na ich rolę immunomodulującą. Monosacharydowy kwas sjalowy, który jest najbardziej rozpowszechniony u ludzi w postaci kwasu N-acetyloneuraminowego, przedstawia podstawowe ligandy dla lektyn o uznanej roli w immunologii, takich jak selektyny i Siglecs. Te lektyny rozpoznają sialoglikany na tej samej komórce (cis) lub na różnych komórkach (trans) i odgrywają znaczącą rolę w interakcjach gospodarz-patogen oraz różnych fizjologicznych i patologicznych czynnościach komórkowych1,2,3. Ponadto, ponieważ kwas sjalowy zajmuje końcowe pozycje glikokoniugatów na powierzchni komórki, może ukrywać leżące poniżej struktury, hamując w ten sposób kontakt między komórkami poprzez niespecyficzne efekty odpychające lub utrudniając wykrywanie przez inne lektyny4. Aktywność różnych sjalilotransferaz (przenoszących kwasy sjalowe) i sialidaz (które rozszczepiają wiązania kwasu sjalowego) w komórce określa ilość kwasu sjalowego obecnego na powierzchni. Ponadto rozpuszczalne sjalilotransferazy i sialidazy ulegające ekspresji przez gospodarza lub patogeny mogą zewnętrznie modyfikować ilość kwasu sjalowego na powierzchni komórki5,6.

Nieprawidłowa sjalacja jest cechą kilku stanów patologicznych. W chorobach autoimmunologicznych hipozjalia może przyczyniać się do niepohamowanej aktywacji immunologicznej i uszkodzenia narządów, ponieważ kwas sjalowy pomaga rozróżniać własne antygeny i regulować reakcje zapalne7. I odwrotnie, hipersjalizacja powoduje nadekspresję sialoglikanów, takich jak sialyl-Tn, antygeny sialyl-Lewisa, kwas polisjalowy i gangliozydy, co stanowi cechę charakterystyczną niektórych nowotworów8,9. Hipersjalizacja zależy również od zwiększonej ekspresji specyficznych enzymów, takich jak N-acetyloglukozaminylotransferaza (GNT-V), która generuje hipersjalizowane tri- i/lub tetra-antenowe glikany sprzężone z N, które są związane ze wzrostem raka i przerzutami10. Zawartość kwasu sjalowego reguluje również stabilność i funkcję białek, co ma kluczowe znaczenie dla roli odpowiednich graczy onkogennych11. Dlatego zwiększona sjalilacja może ułatwiać rozwój guza, przerzuty, oporność na leki i unikanie odporności. Co więcej, regulacja w górę syloglikanów umożliwia nowotworom interakcję z hamującymi receptorami Siglec na komórkach odpornościowych i uniknięcie nadzoru immunologicznego. Z tego powodu syloglikany są obecnie uważane za glikoimmunologiczne punkty kontrolne i atrakcyjne cele terapeutyczne. Na przykład inhibitory osi immunologicznej Siglec są już we wczesnych badaniach klinicznych, ponieważ receptor komórek odpornościowych Siglec (wiążąca kwas sjalowy LECtina podobna do immunoglobuliny) odgrywa rolę immunohamującą12.

Enzymy zostały użyte do modulacji profilu glikanów jako narzędzia do badań lub strategii terapeutycznych13,14. Sialidaza jest stosowana do zmiany złośliwości komórek rakowych, ponieważ glikany sjalylowane, takie jak sialyl Lewis X, mają kluczowe znaczenie dla migracji komórek i przerzutów raka15. W tym samym czasie inhibitory sialidazy, które hamują rozszczepianie kwasu sjalowego, dotarły do klinik zajmujących się leczeniem infekcji wirusowych zależnych od kwasu sjalowego16. Ostatnio modulacja kwasem sjalowym zyskała dalsze zainteresowanie ze względu na kluczową rolę kwasów sjalowych jako ligandów w osi immunologicznej Siglec, co oznacza, że oferują one nowe sposoby zmniejszania ucieczki raka przed odpowiedziami immunologicznymi. Zainteresowanie to zostało dodatkowo wzmocnione przez laureatkę Nagrody Nobla z 2022 r. Bertozzi i jej zespół, którzy wnieśli wkład kilku strategii, które selektywnie rozszczepiają różne sialoglikany i poprawiają przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne17. W związku z tym strategie oparte na sialidazie stanowią obiecującą metodę terapii glikoimmunologicznych punktów kontrolnych. Glikofenotyp komórek układu odpornościowego zależy od rodzaju komórki i jej stanu aktywacji. Jeśli chodzi o limfocyty T, glikany odgrywają kluczową rolę w patofizjologicznych etapach rozwoju limfocytów T i selekcji tymocytów, aktywności, różnicowaniu i proliferacji limfocytów T18. Na przykład polilaktozamina na glikoproteinach wpływa na podstawowe poziomy limfocytów B i limfocytów T oraz aktywację makrofagów19. W makrofagach wyraźne wzorce ekspresji glikanów odgrywają ważną rolę w rekrutacji makrofagów do mikrośrodowiska guza (TME)20. W związku z tym ekspresja glikanów sprzężonych z O i N przez komórki odpornościowe może być wykorzystana jako potencjalne glikobiomarkery dla podejść terapeutycznych w leczeniu nowotworów i chorób autoimmunologicznych.

Komórki dendrytyczne (DCs) to specyficzne komórki prezentujące antygen z unikalną zdolnością do wywoływania odpowiedzi immunologicznych, takich jak odporność przeciwnowotworowa21. DC muszą przejść regulację w górę swoich cząsteczek MHC prezentujących antygen, aby prezentować antygeny limfocytom T (sygnał 1), cząsteczki kostymulujące do aktywacji limfocytów T (sygnał 2) i cytokiny prozapalne, takie jak IL-12, aby wywołać proliferację limfocytów T pomocniczych typu 1 (sygnał 3)22. Uzyskany w ten sposób profil immunologiczny jest ściśle regulowany, a punkty kontrolne są niezbędne, aby zapobiec atakom na zdrowe komórki. Ponieważ DC mogą stymulować różne odpowiedzi immunologiczne przeciwko komórkom nowotworowym, są one stosowane jako szczepionki komórkowe, a znaczna liczba badań klinicznych wykazała ich potencjalne korzyści23,24. Po tym, jak FDA zatwierdziła pierwszą szczepionkę na bazie DC w 2010 roku25,26, opracowano wiele innych szczepionek opartych na DC. Szczepionki oparte na DC są produkowane głównie ex vivo i podawane pacjentom w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko nowotworom. Jednak niewystarczające lub krótkie dojrzewanie jest obecnie jednym z czynników ograniczających skuteczność kliniczną DC i oznacza, że konieczne jest stosowanie drogich koktajli cytokinowych. Bez odpowiedniej dojrzałości DC nie mogą aktywować limfocytów T w warunkach klinicznych. Zamiast tego DC wyrażają immunologiczne punkty kontrolne i wywołują tolerogenną odpowiedź immunologiczną, która zapobiega działaniu cytotoksycznych komórek T przeciwko komórkom nowotworowym.

Ludzkie DC mają silnie sjalowane powierzchnie, a ta sjalacja zmniejsza się wraz z dojrzewaniem i podczas ogólnej odpowiedzi immunologicznej27. Dojrzewanie DC można indukować poprzez eliminację tych kwasów sjalowych za pomocą sialidazy. Desialylacja znacznie zwiększa regulację różnych cytokin, w tym IL-12, ze względu na translokację czynnika transkrypcyjnego NF-kB do jądra6,28. Ponadto desialylacja poprawia krzyżową prezentację antygenu poprzez MHC-I i przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne29,30. W związku z tym, nokaut sialylotransferaz ST3Gal.l i ST6Gal.l, które odgrywają główną rolę w sialylacji DC, generuje bardziej dojrzały fenotyp u mysich DCs31.

Leczenie sialidazą dostarcza metody stymulowania wszystkich aspektów dojrzewania DC, w tym zwiększonej prezentacji antygenu, zwiększonej ekspresji cząsteczek kostymulujących i zwiększonej produkcji cytokin, aby zaradzić niedociągnięciom wspomnianym powyżej i umożliwić DC wywołanie skutecznych odpowiedzi. W artykule przedstawiono procedurę otrzymywania żywotnych desialylowanych ludzkich DC za pomocą sialidazy bakteryjnej. Odizolowane DC wykazują lepszy profil dojrzewania i mogą być wykorzystywane jako modele komórkowe w celu wzmocnienia przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej in vitro. DC uzyskuje się z monocytów krwi, które są następnie różnicowane in vitro w obecności cytokiny interleukiny-4 (IL-4) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF). W pracy opisano również oparte na lektynie metody analizy kwasu sjalowego na powierzchni komórki oraz metody immunofenotypowania poziomu dojrzewania DC. Opisana tutaj procedura może być wykorzystana do desialiacji innych typów komórek, zapewniając w ten sposób podejście do badania roli sialoglikanów, które są ważnymi glikoimmunologicznymi punktami kontrolnymi i są istotne w immunomodulacji.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zostały wyizolowane z kożuchów zdrowych anonimowych dawców krwi, którzy byli ochotnikami dostarczonymi przez krajowy bank krwi, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), po uzyskaniu pisemnej i świadomej zgody dawcy (IMP.74.52.4). Stosowanie krwi zostało zatwierdzone przez komisję etyczną (IPST 30072015) zgodnie z dyrektywą 2004/23/WE w sprawie norm jakości i bezpiecznego oddawania, pobierania, testowania, przetwarzania, konserwowania, przechowywania i dystrybucji tkanek i komórek ludzkich (portugalska ustawa 22/2007, 29 czerwca). Biobank IPST zbiera i przechowuje krew w specjalnej plastikowej torbie do pobierania zawierającej dekstrozę fosforanu cytrynianu (CPD), roztwór konserwujący i przeciwzakrzepowy, w celu utrzymania integralności krwi do czasu przetworzenia. Aby ocenić, czy materiał biologiczny nadaje się do manipulacji, przeprowadza się kontrolę serologiczną w kierunku Treponema pallidum, wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), z których wszystkie muszą być ujemne. Na potrzeby niniejszego badania kożuchowiec został dostarczony przez IPST do celów badawczych, wraz z informacjami dotyczącymi daty pobrania, wyników serologicznych, grupy krwi i wieku dawcy32. Sierść buffy może pozostać w temperaturze pokojowej maksymalnie 1 dzień.

1. Uzyskiwanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów

UWAGA: Ważne jest, aby wspomnieć, że gdy manipulowana jest ludzka krew obwodowa, należy rozważyć konkretne uniwersalne środki bezpieczeństwa i odpowiednią utylizację materiałów. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie niezbędne odczynniki i materiały są przygotowane i gotowe do użycia.

  1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
    1. Uzyskaj dostęp do ludzkiego płaszcza buffy.
      UWAGA: Sierść Buffy jest produktem ubocznym pochodzącym z krwi pobranej za pomocą leukaferezy32, który jest wzbogacany w białe krwinki poprzez wirowanie. Wszystkie etapy zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z pionowym przepływem (BSC).
    2. Otwórz opakowanie kożuchowca, przecinając zapieczętowaną rurkę wylotową skalpelem, a następnie przenieś zawartość do probówki o pojemności 50 ml. Przenieść 7 ml próbki kożucha na sterylną stożkową probówkę o pojemności 15 ml i dodać 6 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami (PBS) w celu przeprowadzenia wstępnego płukania. Ten wstępny etap płukania jest konieczny w celu oczyszczenia próbki ze znacznej ilości czerwonych krwinek (RBC) i osocza, tak aby próbka była zoptymalizowana pod kątem separacji gradientowej za pomocą ośrodka o gradientnym natężeniu gęstości (patrz tabela materiałów).
    3. Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 1 100 x g w wirówce z wirnikiem obrotowym i przy wyłączonym hamulcu (patrz tabela materiałów).
    4. Po odwirowaniu zebrać zawiesinę leukocytów (biały pierścień między osoczem a krwinkami czerwonymi) za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
    5. Napełnij zawiesinę leukocytów do 10 ml PBS, aby wspomóc następny etap separacji, i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół.
    6. Przygotuj roztwór pożywki o gradiencie gęstości (gęstość: 1,077 g/ml): Umieść 3 ml pożywki o gradiencie gęstości w nowej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej.
    7. Dodać 5 ml rozcieńczonej zawiesiny leukocytów (z kroku 1.1.5) do stożkowej probówki zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości (5:3) w celu przeprowadzenia separacji gradientu gęstości. Dodawaj próbkę powoli, kropla po kropli, używając ścianek probówki, aby uniknąć zakłócenia ośrodka o gradiencie gęstości.
    8. Separacja gradientowa: Odwirować zawiesinę pożywki o gradiencie gęstości w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy stężeniu 1 100 x g w wirówce z wirnikiem obrotowym i przy wyłączonym hamulcu.
    9. Po odwirowaniu ostrożnie wyjmij stożkowe probówki z wirówki. Po tym etapie widoczny jest szereg dobrze zdefiniowanych warstw, w tym następujące, zaczynając od dołu: warstwa czerwona (RBC i granulocyty), podłoże gradientu gęstości, cienka blada warstwa komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i osocze.
    10. Zebrać cienką warstwę PBMC za pomocą pipety Pasteura i unikać pobierania pożywki o gradientu gęstości poniżej lub zbyt dużej ilości osocza powyżej. Umieść próbkę PBMC w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, napełnij ją do 25 ml PBS i wymieszaj próbkę, delikatnie pipetując w górę iw dół.
    11. Odwirować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 x g (normalny hamulec) w celu zmycia resztek komórek i zanieczyszczeń, a następnie wyrzucić supernatant ostrożnie odwracając probówkę.
      UWAGA: Jeśli zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi jest zbyt duże, co można zaobserwować, gdy osadek komórkowy lub kożucha nie są całkowicie oddzielone lub wydają się czerwonawe, zaleca się lizę pozostałych krwinek czerwonych. W takim przypadku dodać 5 ml buforu do lizy RBC (patrz tabela materiałów), dokładnie wymieszać i inkubować przez 5 minut. Napełnić do 40 ml PBS, odwirować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 900 x g (normalny hamulec) i wyrzucić supernatant ostrożnie odwracając probówkę.
    12. Napełnij próbkę do 10 ml PBS i weź podwielokrotność, aby policzyć komórki. W celu usunięcia płytek krwi należy odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 400 x g (normalny hamulec) i wyrzucić supernatant, ostrożnie odwracając probówkę.
      UWAGA: W przypadku znacznej liczby płytek krwi, należy dwukrotnie odwirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 200 x g (normalny hamulec). Płytki krwi są identyfikowane poprzez wizualizację próbki podczas liczenia komórek.
  2. Izolacja monocytów metodą separacji immunomagnetycznej
    1. Przygotować bufor mikrogranulek, uzupełniając PBS 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Wysterylizować roztwór przez filtrację (0,2 μm) i przechowywać bufor w lodówce (2-8 °C).
    2. Wykonaj izolację monocytów CD14 + przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS).
      1. Po zliczeniu komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (etap 1.4.1) należy obliczyć wymaganą odpowiednią objętość buforu mikrogranulek i kulek immunomagnetycznych CD14 (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że te roztwory są trzymane na lodzie. Dodać 80 μl buforu mikrogranulek na 1 x 107 komórek i 20 μl kulek CD14 na 1 x 107 komórek.
      2. Zawiesić osad komórkowy w wcześniej ustalonych objętościach i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C (2-8 °C).
        UWAGA: W przypadku, gdy konieczna jest weryfikacja poziomów monocytów w próbkach PBMC, należy przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową przy użyciu przeciwciał barwiących (np. CD14 [Monoklonalny TÜK4]). Wykonaj krok 3.2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat analizy cytometrii przepływowej.
      3. Dodać 1-2 ml buforu mikrogranulek na 1 x 107 komórek, wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 x g (normalny hamulec) w celu usunięcia niezwiązanych kulek i wyrzucić supernatant, ostrożnie odwracając probówkę.
      4. Przygotuj kolumnę LS. Kolumny LS zawierają ferromagnetyczne kule, które po umieszczeniu na magnesie umożliwiają pozytywne, delikatne zatrzymywanie magnetycznie znakowanych komórek33. Bezpośrednio przed użyciem umieść kolumnę LS (patrz Tabela Materiałów) na magnesie, spłucz 3 ml buforu mikrogranulek bez całkowitego wysuszenia i natychmiast przejdź do następnego kroku.
        UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby kolumna wyschła podczas zabiegu, aby uniknąć pogorszenia wydajności.
      5. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu mikrogranulek na 1 x10 8 komórek. Jeśli liczba komórek jest wyższa niż 4 x 108, użyj sitka do komórek 40 μm, aby zapobiec agregacji komórek.
      6. Dodać zawiesinę komórek do wlotu kolumny, umieścić stożkową rurkę o pojemności 15 ml poniżej wylotu kolumny, aby zebrać ujemną frakcję komórek, i przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu mikrogranulek. Frakcja ujemna obejmuje komórki, które nie zostały zebrane za pomocą kulek CD14 (tj. komórek CD14).
      7. Po końcowym płukaniu wyjmij kolumnę z magnesu, umieść ją na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odpipetuj 5 ml buforu mikrogranulek do wlotu kolumny i natychmiast włóż tłok strzykawki do wlotu kolumny i naciśnij, aby dozować komórki docelowe.
      8. Zebrać komórki znakowane magnetycznie (komórki CD14+) i pobrać podwielokrotność, aby policzyć komórki, jak opisano w kroku 1.4.1.
      9. Odwirować obie frakcje komórek, komórki CD14− i CD14+, w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 x g (normalny hamulec). Odrzucić supernatant, zachować frakcję CD14+ do następnych kroków i przechowywać frakcję CD14− do przyszłych testów, takich jak testy współhodowlane, jeśli to konieczne. W razie potrzeby komórki z frakcji CD14− można kriokonserwować w RPMI-1640 20% FBS i 10% DMSO w temperaturze −80 °C.
  3. Różnicowanie monocytów w komórki dendrytyczne
    1. Przygotuj kompletną pożywkę RPMI-1640, uzupełniając pożywkę zasadową RPMI-1640 (zawierającą 11,1 mM glukozy) 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% z 2 mM L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% pirogronianu sodu i 1% 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny (patrz Tabela Materiałów).
    2. Przeprowadź różnicowanie monocytów do mo-DC, które zachodzi w ciągu ~5-6 dni.
      1. Oblicz objętość pożywki niezbędną do uzyskania liczby otrzymanych komórek CD14+ i pokryj komórki zgodnie z następującą konfiguracją eksperymentu.
        UWAGA: W tym protokole komórki posiano w stężeniu 1,3 x 106 komórek/ml, aby uwzględnić śmierć komórki i błędy pomiaru, a pożywkę przygotowano przez dodanie 1,000 U/ml GM-CSF i 750 U/ml IL-4 (patrz Tabela materiałów) do kompletnej pożywki i dokładne wymieszanie.
      2. Dodać odpowiednią objętość pożywki do kuwety CD14+ i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety Pasteura. Zawiesinę komórkową umieścić na płytkach 24-dołkowych (na dołek: 1,3 x 106 komórek/ml) i inkubować w inkubatorze hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
      3. Zmień pożywkę hodowlaną i uzupełniaj ją świeżymi cytokinami co 2-3 dni (zwykle raz na proces różnicowania). Aby to zrobić, ostrożnie usuń połowę pożywki hodowlanej, nie naruszając komórek. Dodać taką samą ilość świeżej pożywki o odpowiednim stężeniu cytokin, jak opisano poprzednio w uwadze do kroku 1.3.2.1, i inkubować przez pozostały okres różnicowania.
        UWAGA: DC, różnicując się od monocytów, są luźno przylegającymi komórkami. W pełni zróżnicowane niedojrzałe mo-DC są wrzecionowatymi, swobodnie pływającymi i luźno przylegającymi komórkami. Komórki mogą również tworzyć rozety, zwłaszcza gdy mature34.
      4. Aby zebrać komórki po różnicowaniu, użyj mikropipety, aby przenieść całą zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki i umyj dołki płytki dwukrotnie PBS, delikatnie stukając w dno (Rysunek 1A).
        UWAGA: Unikaj zbierania silnie przylegających komórek, ponieważ prawdopodobnie są to makrofagi. Aby uniknąć niewłaściwego dojrzewania lub aktywacji komórek, należy obchodzić się z nimi z najwyższą ostrożnością.
      5. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 180 x g (normalny hamulec) w celu usunięcia wszelkich pozostałości lub martwych komórek, a następnie ponownie zawiesić w odpowiednim pożywce/buforze dla układu doświadczalnego.
    3. Przeprowadź dojrzewanie mo-DC.
      1. W przypadku, gdy wymagane jest dojrzewanie mo-DC, należy użyć płytki dołkowej lub kolby, biorąc pod uwagę przykładowe stężenie komórek, które zostało użyte wcześniej (1,3 x 106 komórek/ml) i podać koktajl cytokin, uzupełniając pożywkę koktajlem cytokin zawierającym IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (1,000 U/ml), prostaglandynę E2 (PGE2; 1 μg/ml), i czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α; 10 ng/ml) (patrz tabela materiałów). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny lub 48 godzin.
  4. Zliczanie komórek i żywotność
    1. Wykonaj liczenie komórek i barwienie niebieskim trypanem.
      1. W celu określenia liczby komórek i żywotności zawiesiny komórkowej należy pobrać podwielokrotność 10 μl z zawiesiny komórek i zmieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:1).
      2. Weź 10 μl poprzedniej mieszanki i użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
        UWAGA: Jeśli stężenie komórek jest zbyt wysokie, rozcieńczyć podwielokrotność, a po zliczeniu komórek uwzględnić współczynnik rozcieńczenia w obliczeniach.
      3. Dostosuj numer komórki i nośnik/bufor dla konfiguracji eksperymentalnej.
    2. Określ żywotność i apoptozę komórki30.
      UWAGA: W niniejszej pracy, po leczeniu sialidazą (sekcja 2), przeprowadzono test żywotności.
      1. Wybarwić mo-DC 5 μg/ml 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD) i aneksyny V i określić apoptozę zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
      2. Przeanalizuj wyniki za pomocą cytometrii przepływowej29,30.

2. Leczenie komórek sialidazą

UWAGA: Po różnicowaniu na mo-DC, szóstego dnia, komórki są gotowe do testu leczenia sialidazą.

  1. Biorąc pod uwagę pożądaną konfigurację eksperymentalną, zbierz ~10 x 106 mo-DC z 10 dołków 24-dołkowych płytek z 1,3 x 106 komórek / dołek i przenieś je do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Załóżmy pewną utratę komórek; zazwyczaj na tym etapie stwierdzone stężenie wynosi 1,3 x 106 komórek/ml, ponieważ mo-DC i ich prekursory nie proliferują i doświadczają 20% utraty żywotności podczas różnicowania w mo-DC.
  2. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5-7 minut przy 300 x g (normalny hamulec) i wyrzucić supernatant w celu usunięcia martwych komórek i zanieczyszczeń.
  3. Dodać 10 ml pożywki RPMI-1640 (zawierającej 11,1 mM glukozy), wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 300 x g (normalny hamulec), wyrzucić supernatant, dodać 2 ml RPMI-1640 i dokładnie wymieszać.
  4. Umieść 1 ml komórek w RPMI-1640 w nowych sterylnych mikroprobówkach, #1 i #2; każda mikroprobówka będzie zawierała około 5 x 106 komórek.
  5. Do mikroprobówki #1 dodaj 500 mU sialidazy z Clostridium perfringens (patrz Tabela Materiałów). Do mikroprobówki #2 dodaj symulowaną sialidazę, która jest kontrolą ujemną, aby potwierdzić, czy zaobserwowane efekty są bezpośrednio związane z usuwaniem kwasu sjalowego i nie są spowodowane artefaktami. Sialidaza poddana próbie jest sialidazą inaktywowaną termicznie, którą otrzymuje się przez gotowanie enzymu przez 20 minut w temperaturze 100 °C.
  6. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Po inkubacji umieść komórki w nowych sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml o tym samym numerze, #1 i #2. Dodaj około 4 ml kompletnej pożywki RPMI-1640 (zawierającej 10% FBS) do obu probówek, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
  8. Wirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 300 x g (normalny hamulec) i odrzucić supernatant.
  9. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki RPMI-1640 do każdej probówki i rozłóż 1 ml komórek na dołek.

3. Oznaczanie profilu kwasu sjalowego

  1. Barwienie lektyny
    1. Zbierz i umyj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g (normalny hamulec).
    2. Ponownie zawiesić ogniwa w RPMI-1640 + 10% FBS i rozprowadzić komórki (100 000/100 μL) do mikroprobówek.
    3. Wykonać barwienie do cytometrii przepływowej w RPMI-1640 10% FBS przy użyciu stężenia 0,01 mg/ml dla każdej lektyny: lektyny Sambucus nigra (SNA), lektyny aglutyniny orzeszków ziemnych (PNA) i lektyny Maackia amurensis (MAA) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Umyć komórki 1 ml PBS zawierającego 10% FBS lub 10% BSA i odwirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 300 x g (normalny hamulec).
    5. Do komórek wybarwionych biotynylowanymi lektynami dodać 0,0005 mg/ml streptawidyny-PE (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przemyć komórki 1 ml PBS i odwirować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 300 x g (normalny hamulec).
    6. Odrzucić sklarowany osad i do każdej probówki dodać 300 μl 2% paraformaldehydu (PFA 2%). Chronić probówki przed światłem i, w razie potrzeby, przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania danych.
    7. Uzyskaj dane za pomocą cytometru przepływowego w ciągu 1 tygodnia od przygotowania próbki29,30.
  2. Cytometria przepływowa
    1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i pobrać próbkę za pomocą cytometru przepływowego w celu natychmiastowego uzyskania danych.
    2. W przypadku opóźnionego pozyskiwania danych należy ponownie zawiesić w 300 μl 2% PFA i pozyskać dane w ciągu 1 tygodnia.
  3. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa
    1. Ułożyć komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną o średnicy 12 mm i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odwirować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 100 x g (normalny hamulec), aby zwiększyć przyczepność komórek.
    3. Utrwal w temperaturze pokojowej przez 30 minut z 4% PFA przed umyciem z 1% BSA w PBS.
    4. Użyj lektyny SNA sprzężonej z FITC (0,01 mg / ml) do barwienia kwasów sjalowych związanych z α2,6 na powierzchni komórek (patrz Tabela materiałów).
    5. Uzyskać obrazy pod mikroskopem konfokalnym (patrz tabela materiałów).
    6. Po przetworzeniu stosu Z wybierz reprezentatywne obrazy przekrojów konfokalnych.
    7. Analitycznie określ ilościowo intensywność barwienia za pomocą skorygowanej całkowitej fluorescencji komórek (CTCF).
      UWAGA: CTCF = Gęstość zintegrowana − (Obszar wybranej komórki × Średnia fluorescencja odczytów tła)29.

4. Profilowanie dojrzewania mo-DC

  1. Barwienie przeciwciałami i cytometria przepływowa
    1. Zbierz nową próbkę komórek będących przedmiotem zainteresowania, aby przeprowadzić barwienie przeciwciałami. Myj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g (normalny hamulec) i rozprowadź komórki w mikroprobówkach (100 000 komórek w probówce).
    2. Wykonaj barwienie do cytometrii przepływowej przy użyciu pożądanych przeciwciał (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 i CD86 (patrz tabela materiałów).
    3. Inkubować sprzężony z fluorescencją ab przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    4. Umyj komórki 1 ml PBS i odwiruj w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g (normalny hamulec).
      UWAGA: W przypadku stosowania nieznakowanego ab dodaj fluorescencyjnie sprzężone wtórne ab i inkubuj w ciemności przez 15 minut zgodnie z instrukcjami producenta. Umyć komórki 1 ml PBS i odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g (normalny hamulec).
    5. Do wszystkich mikroprobówek dodać do 100 μl PBS, ponownie zawiesić komórki w 300 μl 2% paraformaldehydu (PFA 2%) i trzymać probówki w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania danych.
    6. Uzyskaj dane za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: Po barwieniu i utrwaleniu próbki można pobrać za pomocą cytometrii przepływowej natychmiast lub w ciągu 1 tygodnia. W takim przypadku probówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

5. Test immunoenzymatyczny (ELISA)

UWAGA: W tej pracy produkcja IFN-γ została zmierzona za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).

  1. W celu pokrycia płytki buforem powlekającym, należy rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące (1:100, przeciwciało wychwytujące w PBS), przenieść 100 μl tego roztworu roboczego do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Całkowicie odrzucić przeciwciało wychwytujące.
  3. Dodać bufor blokujący (np. PBS + 2% BSA + 0,05% Tween20) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed usunięciem buforu blokującego.
  4. Dodać wzorzec i próbkę z odpowiednią mieszanką i rozcieńczeniami i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć pięć razy buforem myjącym.
  5. Dodać biotynylowane przeciwciało detektora i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wykonać pięć płukań.
  6. Dodać poli-HRP-streptawidynę-HS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie pięć przemyć buforem do mycia.
  7. Dodać substrat TMB (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez maksymalnie 60 minut w temperaturze pokojowej, biorąc pod uwagę stosowany system testowy. Umyć pięć razy buforem myjącym.
  8. Odczyt próbek na czytniku mikropłytek przy długości fali 450 nm.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja monocytów i różnicowanie monocytów na mo-DCs
Zgodnie z protokołem, ludzkie PBMC wyizolowano z kożucha za pomocą separacji gradientu gęstości za pomocą pożywki o gradiencie gęstości i dokładnie przemyto. Błękit trypanowy użyto do przeprowadzenia liczenia żywotnych komórek w dniu izolacji, jak opisano wcześniej w kroku 1.4.1. Następnie przeprowadzono izolację monocytów CD14 + poprzez selekcję pozytywną. Aby to osiągnąć, PBMC inkubowano z kulkami magnetycznymi zawierającymi przeciwciało, które rozpoznaje antygen CD14. Wybrane monocyty CD14 + hodowano w pożywce uzupełnionej GM-CSF i IL-4 przez 5-6 dni27 w celu różnicowania się w niedojrzałe mo-DC (Figura 1A). Dojrzewanie mo-DC można uzyskać, stosując koktajl cytokin, w tym IL-6, IL-1β, TNF-α i PGE235 (Rysunek 1A).

Podczas procesu różnicowania, w wyniku stymulacji IL-4 i GMCSF, oczekuje się, że fenotyp komórki ulegnie zmianie. Dane pokazują, że mo-DC tracą ekspresję markera powierzchniowego CD14, głównie wyrażanego przez monocyty ( Figura 1B) i zyskują znaczącą ekspresję CD1a, markera wyrażonego przez ludzkie DCs36,37. mo-DC uzyskują również wyższą ekspresję MHC-II (HLA-DR), cząsteczki prezentującej antygen wyrażanej przez ludzkie DC i inne komórki prezentujące antygen38 (Rysunek 1B).

Zawartość kwasu sjalowego na powierzchni komórki
Traktowanie mo-DC sialidazą zmniejsza zawartość kwasu sjalowego na powierzchni mo-DC, co można potwierdzić poprzez barwienie lektynami, które są białkami zdolnymi do wiązania się z węglowodanami39. Ponieważ zastosowany enzym usuwa z powierzchni komórki zarówno kwasy sjalowe sprzężone z α2,3, jak i α2,6, mo-DC wybarwiono PNA, który rozpoznaje antygen T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, a także lektyny MAA i SNA, które wiążą się odpowiednio z α2,3- i α2,6-sjalowym. Skuteczność leczenia sialidazą oceniano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej (Ryc. 2). Jak pokazano na Rysunek 2A, leczenie sialidazą znacznie zmniejszyło wiązanie MAA i SNA, jednocześnie zwiększając barwienie PNA. Spadek barwienia SNA po leczeniu sialidazą został dodatkowo potwierdzony przez analizę mikroskopii konfokalnej, która wykazała znacznie zmniejszone barwienie SNA na powierzchni komórki (Figura 2B).

Charakterystyka funkcjonalna mo-DCs
Aby ocenić, w jaki sposób leczenie sialidazą wpływa na funkcje mo-DC, oceniono poziom dojrzewania mo-DC po leczeniu sialidazą. Jak pokazano w Rysunek 3A, leczenie sialidazą prowadzi do znacznego wzrostu ekspresji cząsteczek prezentujących antygen MHC I i MHC II oraz ekspresji cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86. Aby ocenić wpływ usuwania kwasu sjalowego na zdolność mo-DC do indukowania odpowiedzi limfocytów T, zastosowano mo-DC traktowane sialidazą obciążone lizatami komórek nowotworowych do przygotowania autologicznych limfocytów T (Figura 3). Następnie scharakteryzowano profil powstałych limfocytów T w oparciu o ich zdolność do wydzielania cytokiny Th1 IFN-γ. Jak pokazano w Rysunek 3B, w porównaniu z limfocytami T zaszczepionymi przez w pełni sjalizowane mo-DC, limfocyty T zaszczepione przez mo-DC traktowane sialidazą wydzielały znacznie wyższe poziomy IFN-γ. Wyniki te sugerują, że mo-DC traktowane sialidazą mają lepszą zdolność do przygotowania autologicznych limfocytów T.

Żywotność komórki
Po leczeniu sialidazą przeprowadzono test żywotności, aby upewnić się, że leczenie nie jest cytotoksyczne dla komórek. Po leczeniu mo-DC wybarwiono 7-AAD i aneksyną V, aby wykryć komórki niezdolne do życia i apoptotyczne, a następnie przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 4). Dane nie wykazują znaczącej różnicy w żywotności komórek między komórkami nieleczonymi (Rysunek 4, lewy panel) a komórkami traktowanymi sialidazą (Rysunek 4, prawy panel).

figure-results-1
Rysunek 1: Różnicowanie izolowanych monocytów na mo-DC. (A) monocyty CD14+ wyizolowano z okrywy koralowej i hodowano w stężeniu 1,3 x 106 komórek/ml w temperaturze 37 °C. Monocyty różnicowano w pożywce uzupełnionej 750 U/ml IL-4 i 1000 U/ml GM-CSF. Analiza mikroskopowa morfologii monocytów wyizolowanych z ludzkiej kożuchy koralowej w dniu 0 (górne zdjęcie). Niedojrzałe mo-DC; komórki różnicowano w okresie 5 dni za pomocą IL-4 i GM-CSF (środkowy obraz). Dojrzałe mo-DC uzyskano przy użyciu cytokin IL-6, IL-1β, TNF-α i PGE2 przez 24 godziny (dolny obraz). Paski skali: 100 μm. (B) Komórki analizowano w dniu 0, dniu 2 i dniu 5 przez cały okres różnicowania przy użyciu cytometrii przepływowej. Do scharakteryzowania markerów powierzchniowych komórek użyto następujących przeciwciał: (a-c) CD14; (d-f) CD1a i (g-i) HLA-DR (MHC klasa II). Rysunek przedstawia reprezentatywne histogramy co najmniej trzech niezależnych testów. Panel (B) został zmodyfikowany z Videira et al.40, patent WO2017002045A1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Leczenie ludzkimi mo-DC sialidazą w celu usunięcia kwasów sjalowych sprzężonych z α2,6 i α2,3 z powierzchni komórki. (A) Analiza mo-DC za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem barwienia lektyną w celu sprawdzenia skuteczności leczenia sialidazą. Ludzkie mo-DC traktowano sialidazą (szare paski) lub pozostawiono nieleczone (białe paski) i wybarwiono lektyną SNA (rozpoznającą [2,6]-kwasy sjalowe), lektyną MAA (rozpoznającą [2,3]-kwasy sjalowe) i lektyną PNA (rozpoznającą antygen T-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Wartości reprezentują średnią intensywność fluorescencji (MFI) z co najmniej trzech niezależnych testów. Istotność statystyczną określono za pomocą dwustronnego sparowanego testu t (*P < 0,05 lub ***P < 0,0001), odnosząc się do różnicy między DC nieleczonymi a traktowanymi sialidazą. Leczenie sialidazą zmniejszało wiązanie MAA i zwiększało barwienie PNA w ludzkich mo-DC, wynikające z usunięcia kwasów sjalowych związanych z α(2,3); usunięcie kwasów sjalowych związanych z α(2,6) po leczeniu sialidazą wykryto poprzez zmniejszenie barwienia SNA. (B) Mikroskopia konfokalna mo-DC traktowanych sialidazą i przygotowanych na szkiełkach nakrywkowych do obserwacji. Z różnych komórek pobrano szereg obrazów stosu z różnych komórek i przetworzono je w celu uwzględnienia średniej intensywności barwienia. Podziałka skali: 20 μm. Panel (A) został zmodyfikowany z Silva et al.30; panel (B) został zmodyfikowany z Silva et al.29. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Leczenie mo-DC sialidazą indukujące wyższą ekspresję markerów dojrzewania. (A) mo-DC leczone sialidazą wykazywały wyższy fenotyp dojrzewania niż w pełni sjalowane mo-DC. Cytometria przepływowa została wykorzystana do oceny ekspresji kilku markerów dojrzewania. Mo-DC traktowano sialidazą przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C; wartości na wykresie reprezentują średnią intensywność fluorescencji (MFI) (średnią ± SEM) z co najmniej trzech niezależnych testów. Statystycznie istotne różnice obliczono za pomocą testu t (*P < 0,05, **P < 0,01), odnosząc się do różnicy między stanami nieleczonymi a leczonymi sialidazą. (B) Desialowane ludzkie mo-DC załadowane całymi antygenami nowotworowymi indukowały specyficzne odpowiedzi komórek T. Mo-DC traktowano sialidazą przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub pozostawiono bez leczenia, a następnie załadowano lizatami MCF-7 (TL) jako źródłem antygenów całych komórek nowotworowych. Kohodowlę między mo-DC a autologicznymi limfocytami T prowadzono przez 4-8 dni w obecności IL-2 (10 U/mL). Limfocyty T zaszczepione desialylowanymi mo-DC wykazywały znacznie większe wydzielanie cytokiny Th1, IFN-γ. Po stymulacji limfocytów T mo-DC, cytokiny wydzielane do supernatantów z kokultury mierzono metodą ELISA (n = 7). Wartości na wykresie reprezentują stężenie (pg/ml) (średnia ± SEM). Różnice istotne statystycznie obliczono za pomocą testu t (*P < 0,05). Rysunek został zmodyfikowany z Silva et al.30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Brak wpływu leczenia sialidazą na żywotność ludzkich mo-DCs. Nieleczone mo-DC (lewy panel) i mo-DC traktowane sialidazą (prawy panel) poddano podwójnemu barwieniu aneksyną V i 7-AAD, a barwienie analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Dane nie wykazały znaczącej różnicy w żywotności komórek między komórkami nieleczonymi a komórkami leczonymi sialidazą, co sugeruje, że mo-DC mogą tolerować leczenie sialidazą i zachować żywotność, aby pełnić swoją funkcję immunologiczną. Rysunek został zmodyfikowany z Silva et al.30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja monocytów
W tym manuskrypcie opisano protokół generowania mo-DC z izolowanych przez człowieka monocytów CD14 + (Figura 1A), a następnie wykonanie leczenia sialidazą w celu zmniejszenia zawartości kwasu sjalowego na powierzchni tych komórek.

Istnieją różne sposoby pozyskiwania ludzkich DC, na przykład bezpośrednio z krwi lub tkanek obwodowych lub poprzez różnicowanie od prekursorów, takich jak komórki macierzyste lub monocyty. Uzyskanie DC zróżnicowanych od monocytów wyizolowanych z krwi obwodowej jest znacznie prostsze ze względu na łatwość uzyskania dużych ilości monocytów w porównaniu z innymi źródłami DC41. Mimo to, aby uzyskać wysoki odsetek izolowanych monocytów, należy dokładnie przestrzegać wszystkich kroków protokołu. Na przykład podłoże o gradiencie gęstości może być toksyczne dla komórek i aby zapobiec śmierci komórek, należy unikać długotrwałego kontaktu komórek z podłożem o gradiencie gęstości i dokładnie umyć komórki. Manipulacja komórkami musi być wykonywana tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć utraty żywotności komórek. Z PBMC monocyty można wyizolować poprzez selekcję pozytywną przy użyciu metody sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), która jest odpowiednią technologią do uzyskania dużej liczby monocytów. Ponadto, w porównaniu z innymi metodami selekcji monocytów, mo-DC pochodzące z monocytów izolowanych MACS mają większą zdolność do stymulowania aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T42. W tym protokole, po wyizolowaniu, monocyty inkubowano z IL-4 i GM-CSF przez okres 5-6 dni, aby osiągnąć różnicowanie w niedojrzałe mo-DC (ryc. 1). Wyniki wykazały, że morfologicznie (Figura 1A) i fenotypowo (Figura 1B) izolowane monocyty różnicowały się w niedojrzałe mo-DC. Co więcej, podczas różnicowania mo-DC straciły ekspresję markerów CD14 i uzyskały ekspresję CD1a i MHC-II (Figura 1B), które są wymagane do prezentacji antygenu limfocytom T.

Ta izolacja i różnicowanie monocytów w mo-DC są ograniczeniami tego protokołu. Proces izolacji jest wrażliwym krokiem, który musi być wykonany ostrożnie i szybko, aby uniknąć śmierci komórki, a także ten krok musi być wykonywany za każdym razem, gdy potrzebne są mo-DC do nowego eksperymentu. Proces różnicowania trwa 5-6 dni, co stanowi trudność w zastosowaniu tej metody do analiz wysokoprzepustowych. Niemniej jednak metoda izolacji i wykorzystanie cytokin do różnicowania mo-DC są przydatne do generowania dużej liczby funkcjonalnych mo-DC in vitro do celów eksperymentalnych. Mo-DC wygenerowane w tym protokole są w stanie przejść leczenie sialidazą, cytometrię przepływową, ELISA, mikroskopię konfokalną i tak dalej, podkreślając w ten sposób znaczenie i przydatność tej metody30.

Leczenie niedojrzałych mo-DC i sialidazy
Sialidazy są niezbędne w regulacji sjalalacji i są odpowiedzialne za usuwanie kwasów sjalowych z glikanów na powierzchni komórki. W mo-DC usunięcie kwasu sjalowego przez sialidazę prowadzi do dojrzewania tych komórek, co zwiększa prezentację krzyżową antygenu, a następnie aktywację limfocytów T i aktywność przeciwnowotworową30.

Niedojrzałe ludzkie mo-DC wykazują wysoką zawartość kwasów sjalowych związanych z powierzchnią komórek α(2,6)- i α(2,3)27 w porównaniu z dojrzałymi mo-DC31,43. Ponadto usuwanie kwasów sjalowych poprzez traktowanie mo-DC sialidazą poprawia dojrzewanie DC 28,30,31. Sialidaza wybrana do tego eksperymentu pochodziła z bakterii Clostridium perfringens. Jeszcze inne organizmy również wytwarzają sialidazy, takie jak bakterie Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae lub Salmonella typhimurium44, pijawka Macrobdella decora45, a nawet Homo sapiens46, a sialidazy z tych organizmów są również używane eksperymentalnie. Jednak każda sialidaza ma inną specyficzność substratową. Dodatkowo, stosowanie enzymu sialidazy może mieć swoje ograniczenia; na przykład manipulacja mo-DC podczas leczenia może dodatkowo stymulować te komórki. Ponadto ilość sialidazy i czas inkubacji muszą być zoptymalizowane w oparciu o rodzaj używanych komórek i ich skład kwasu sjalowego. Usunięcie kwasu sjalowego nie jest trwałym efektem, ale raczej zjawiskiem przejściowym, ponieważ komórka przywróci zawartość kwasu sjalowego na powierzchni komórki. Oprócz sialidazy istnieją inne metody redukcji cząsteczek kwasu sjalowego na powierzchni komórek, takie jak stosowanie inhibitorów sjaltransferazy, nokautów genów sjalotransferazy lub blokady metabolicznej kwasu sjalowego za pomocą mimetyki kwasu sjalowego 47,48,49. Niemniej jednak metody te mogą mieć wyraźny wpływ na komórki, a oprócz desialylacji należy wziąć pod uwagę żywotność komórek. Leczenie enzymem sialidazy jest praktyczną metodą skutecznego i przejściowego usuwania kwasów sialowych z powierzchni komórek przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek.

W tej pracy sialidazę dodano do niedojrzałych mo-DC w stężeniu 500 mU/5 x 106 komórek/ml, a komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Zabieg przeprowadzono przy użyciu RPMI-1640 bez surowicy, aby zachować żywotność komórek i uniknąć interakcji między cząsteczkami sjalowanymi obecnymi w surowicy30. Leczenie sialidazą można przeprowadzić z innymi oprócz RPMI, takimi jak octan sodu 50 mM o pH 5,1 (w przypadku sialidazy C. perfingens) lub PBS 50,51,52. Niemniej jednak, RPMI-1640 jest najpowszechniejszym podłożem hodowlanym dla DC, ponieważ utrzymuje stałe warunki eksperymentalne podczas procedury, unika indukowania dojrzewania i zmniejsza stres, który może być spowodowany przez sialidazy lub PBS 53,54,55,56. Po inkubacji z sialidazą bardzo ważne jest dokładne umycie komórek pożywką uzupełnioną surowicą, aby zagwarantować, że reakcja enzymatyczna została zatrzymana. Obecność sjalowanych cząsteczek w surowicy będzie konkurować jako substraty dla sialidazy, zapewniając w ten sposób szybkie zatrzymanie reakcji.

Charakterystyka markerów powierzchniowych za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej
Do określenia profilu kwasu sjalowego, w sekcji 3 protokołu, wykorzystano barwienie lektyną, a następnie cytometrię przepływową i konfokalną laserową mikroskopię skaningową. W przypadku procedury barwienia komórek, w obu przypadkach, stężenia lektyny i warunki inkubacji zostały zoptymalizowane, aby uniknąć aglutynacji i śmierci komórek. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzić inkubację w temperaturze 4 °C w zawierających co najmniej 2% FBS lub BSA, aby uniknąć niespecyficznego wiązania lektyn. W tym protokole zastosowano RPMI-1640 zawierający 10% FBS w celu utrzymania stałych warunków eksperymentalnych i uniknięcia stresu komórkowego. Jeśli chodzi o mikroskopię konfokalną, utrwalenie komórek przed barwieniem jest niezbędne do zachowania morfologii, zapobiegania autolizie i utrzymania antygenowości.

Analiza fenotypu mo-DC za pomocą cytometrii przepływowej wykazała, że mo-DC traktowane sialidazą miały znacznie większą ilość lektyny PNA związanej z powierzchnią komórki w porównaniu z lektynami MMA i SNA, która zmniejszyła się po leczeniu sialidazą (Figura 2A). Zgodnie z oczekiwaniami barwienie PNA wzrosło, ponieważ PNA rozpoznaje antygeny niesjalizowane, w przeciwieństwie do MAA i SNA, które wiążą się bezpośrednio z kwasami α2,3- i α2,6-sjalowymi, odpowiednio30. Barwienie to potwierdza skuteczne usuwanie kwasów sjalowych z powierzchni komórki za pomocą tego protokołu. Inną metodą, którą można zastosować do walidacji leczenia i analizy zawartości kwasu sjalowego na powierzchni komórki, jest barwienie lektyny, a następnie mikroskopia konfokalna, jak pokazano na rysunku 2B.

Oprócz poprzednich przykładów, istnieją alternatywne podejścia do oceny i charakterystyki zawartości kwasu sjalowego, takie jak sondowanie lektyny za pomocą western blot. Dostępne są również alternatywne lektyny specyficzne dla kwasu sjalowego, takie jak Siglecs, grupa lektyn, które mają wyraźną preferencję dla typów i wiązań kwasu sjalowego57. Oprócz stosowania lektyn w obu technikach (cytometria przepływowa, mikroskopia lub western blot), możliwe jest również scharakteryzowanie zawartości kwasu sjalowego za pomocą przeciwciał; Na przykład kwasy α2,8-sjalowe można ocenić za pomocą przeciwciał, takich jak klon 735, który jest specyficzny dla kwasu polisjalowego58. Ponadto, po leczeniu sialidazą, komórki mogą być testowane funkcjonalnie pod kątem ich skuteczności biologicznej lub terapeutycznej, oceniając ich fenotyp i zdolność do aktywacji limfocytów T40. W rzeczywistości, jak pokazano w podanych przykładach, mo-DC traktowane sialidazą wykazywały wyższy fenotyp dojrzewania, a także podwyższoną ekspresję cząsteczek prezentujących antygen i kostymulujących.

Co więcej, mo-DC traktowane sialidazą mogą być ładowane antygenami i współhodowane z limfocytami T lub innymi komórkami, a następnie mogą być badane pod kątem fenotypu, profilu wydzielania cytokin lub innych cech. W podanym przykładzie dane pokazują, że mo-DC leczone sialidazą mogą być ładowane antygenami nowotworowymi, a następnie wykorzystywane do aktywacji limfocytów T. W rzeczywistości powstałe limfocyty T wykazywały zwiększone wydzielanie IFN-γ, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami na temat wpływu niedoboru kwasu sjalowego na zwiększenie zdolności mo-DC do aktywacji limfocytów T 27,28,29,30,31.

Podsumowując, protokół ten pokazuje wykonalną, wykonalną i praktyczną metodę generowania mo-DC do manipulacji zawartością kwasu sjalowego poprzez leczenie sialidazą. Protokół ten przedstawia metodologię, która może służyć różnym celom i zastosowaniom. Metoda ta może nie tylko odgrywać kluczową rolę w zrozumieniu roli kwasów sjalowych w dojrzewaniu i odpowiedzi komórek odpornościowych, ale może być również stosowana jako narzędzie immunomodulujące.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie przez Komisję Europejską GLYCOTwinning GA 101079417 i EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, w ramach grantów FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) oraz LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. i Stemmatters zostały również sfinansowane przez Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), za pośrednictwem Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) dla SI I& Projekt DT DCMatters (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Uznajemy zakład Biolabs w FCT-NOVA i GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rurka stożkowa 15 mlAstiK' sCTGP-E15-050Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek
24-dołkową płytkąGreiner Bio-one662 160Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą
50 ml stożkowa rurkaAstiK' sCTGP-E50-050Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)BioLegend420404Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Aneksyna VNarzędzia immunologiczne31490013Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Attune Akustyczny cytometr przepływowy z ogniskowaniemThermo Fisher Scientific Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Profilowanie dojrzewania mo-DCs
BSASigma - AldrichA3294-100GOtrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
CD14 (monoklonalny TÜ K4)Miltenyi Biotec130-080-701Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Narzędzia immunologiczneCD8021270803Profilowanie dojrzewania mo-DC
Narzędzia immunologiczneCD8621480863Profilowanie dojrzewania mo-DC
Szkiełka do liczenia komórek i błękit trypanowyEVE EVS-050Otrzymywanie wirówki do komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Eppendorf5430 ROtrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Dojrzewanie Profilowanie mo-DC
Pożywka gradientu gęstości (histopaka)Sigma - Aldrich10771-100MLOtrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
EDTAGibco, ThermoFisher15400054Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Zestaw Elisa (IFN-γ)Immunotools31673539Profilowanie dojrzewania mo-DCs
EVE automatyczne liczenie komórekNanoEntek10027-452Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Surowica bydlęca płodu (FBS)10500064Otrzymywaniekomórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF)Miltenyi Biotec  130-093-864Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Ludzkie mikrokulki CD14 (kulki immunomagnetyczne)Miltenyi Biotec130-050-201Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Interleukina (IL)-1βSigma - AldrichI9401Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Interleukina (IL)-4Miltenyi Biotec130-093-919Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Interleukina (IL)-6Sigma - AldrichSRP3096Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
L-glutaminaGibcoA2916801Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Kolumna LS i tłokMiltenyi Biotec130-042-401Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Maackia amurensis ( MAA) lektyna (lektyna MAA - biotynylowana)Vector labsB-1265-1Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
MHC-I (HLA-ABC)Immunotools21159033Profilowanie dojrzewania mo-DC
MHC-II (HLA-DR)ImmunostepHLADRA-100TProfilowanie dojrzewania mikroprobówek mo-DC
AstiK' sPCRP-E015-500Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Dojrzewanie Profilowanie
neuraminidazy mo-DC (Sialidaza)11585886001Leczenie komórek sialidazą
Aminokwasy endogenne (NEAA) Gibco11140-050Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Paraformaldehyd (PFA 2%)Polysciences Europe25085-1Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Dojrzewanie Profilowanie mo-DCs
Paraformaldehyd (PFA 4%)Biotium22023Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Pipety PasteuraLabboxPIPP-003-500Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Peanut (Arachis hypogaea) Aglutynina ( PNA) lektyna (lektyna PNA - FITC)Vector labsFL-1071Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Penicylina/streptomycynaGibco15140163Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
buforowana fosforanami (PBS)NZYTech  MB18201otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Profilowanie dojrzewania mo-DC
Prostaglandyna E2 (PGE2)Sigma - AldrichP0409Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Bufor do lizyRBC BioLegend420302Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
RPMI-1640 medium ( zawierające 11,1 mM glukozy)Gibco31870074Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów; Leczenie komórek sialidazą; Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Sambucus nigra lektyna (lektyna SNA - biotynylowana)Vector labs  B-1305-2Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Sambucus nigra lektyna (lektyna SNA - FITC)Vector labsFL-1301-2Oznaczanie profilu kwasu sjalowego
Pirogronian soduThermofisher11360-070Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
SpectroMax190UrządzeniaDojrzewanie Profilowanie mo-DC
Streptawidyna-PEBioLegend  405203Oznaczanie profilu kwasu sjalowego; Profilowanie dojrzewania mo-DC
Tetrametylobenzydyna (TMB)Sigma - AldrichT0440Profilowanie dojrzewania mo-DC
Czynnik martwicy nowotworu-&alfa; (TNF-&alfa;)Sigma - AldrichH8916Otrzymywanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM710Oznaczanie profilu kwasu sjalowegoZeiss
sialidazy akustycznym Roche Sól fizjologiczna molekularne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).">Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).">Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).">Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).">Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).">Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).">Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402(2021).">Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402(2021).
  8. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).">Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248(2022).">Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248(2022).
  10. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).">Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).">Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).">Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).">Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).">Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731(2023).">Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731(2023).
  16. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).">von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).">Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).">Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).">Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).">Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).">Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).">Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).">Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).">Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).">So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).">Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).">Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).">Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249(2020).">Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249(2020).
  30. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).">Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).">Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).">Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).">LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).">Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).">Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).">Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).">Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).">Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188(2021).">Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188(2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).">Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4(2018).">Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4(2018).
  43. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).">Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).">Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).">Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491(2013).">Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491(2013).
  47. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).">Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).">Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502(2017).">Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502(2017).
  50. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).">Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).">Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).">Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).">Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).">Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363(2021).">Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363(2021).
  56. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).">Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).">Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).">Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte Derived Dendritic CellsSialic Acid ModulationSialidase TreatmentDendritic Cell MaturationGlycan ProfilingFlow CytometryConfocal MicroscopyAntigen PresentationCD14 IsolationCo Stimulatory Molecules

Related Articles