Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65529

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine, 2Independent scholar, 3Center for Neurodegenerative Disease, Emory University School of Medicine, 4Department of Dermatology, Emory University School of Medicine, 5Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine, 6Atlanta Veterans Affairs Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Zrozumienie normalnych i nieprawidłowych zachowań komórek in vivo jest niezbędne do opracowania klinicznych interwencji udaremniających inicjację i postęp choroby. Dlatego tak ważne jest zoptymalizowanie metod obrazowania, które ułatwiają obserwację dynamiki komórek in situ, gdzie struktura i skład tkanek pozostają niezakłócone. Naskórek jest najbardziej zewnętrzną barierą organizmu, a także źródłem najczęstszych nowotworów u ludzi, a mianowicie raków skóry. Dostępność tkanki skórnej stwarza wyjątkową okazję do monitorowania zachowań komórek nabłonka i skóry właściwej u nienaruszonych zwierząt przy użyciu nieinwazyjnej mikroskopii przyżyciowej. Niemniej jednak to wyrafinowane podejście do obrazowania zostało osiągnięte przede wszystkim przy użyciu pionowych mikroskopów wielofotonowych, które stanowią istotną barierę wejścia dla większości badaczy. Badanie to przedstawia specjalnie zaprojektowaną, wydrukowaną w 3D wkładkę stolika mikroskopu, odpowiednią do stosowania z odwróconymi mikroskopami konfokalnymi, usprawniając długoterminowe przyżyciowe obrazowanie skóry ucha u żywych myszy transgenicznych. Wierzymy, że ten wszechstronny wynalazek, który może być dostosowany do marki i wybranego modelu mikroskopu odwróconego oraz przystosowany do obrazowania dodatkowych układów narządów, okaże się nieoceniony dla szerszej społeczności naukowej, znacznie zwiększając dostępność mikroskopii przyżyciowej. Ten postęp technologiczny ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat dynamiki żywych komórek w kontekście normalnym i chorobowym.

Wprowadzenie

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które pozwala na monitorowanie zachowań komórek w ich niezakłóconym środowisku in vivo. Ta unikalna metoda dostarczyła kluczowych informacji na temat wewnętrznego funkcjonowania złożonych układów narządów ssaków, w tym płuc1, brain2, liver3, gruczoł sutkowy4, intestine5 i skin6. Co więcej, podejście to ujawniło zmiany w zachowaniu komórek podczas rozwoju nowotworu7, gojenie się ran8,9, zapalenie10 i inne różne patologie in situ. W tym badaniu koncentrujemy się na zwiększeniu dostępności mikroskopii przyżyciowej do obrazowania żywej dynamiki nabłonka i zrębu w nienaruszonej skórze myszy. Zrozumienie zachowań komórek w skórze ssaków ma duże znaczenie kliniczne ze względu na niezwykłą zdolność regeneracyjną i rakotwórczą tej tkanki.

Obrazowanie przyżyciowe u myszy zostało wykonane głównie przy użyciu pionowych mikroskopów wielofotonowych ze względu na ich zdolność do dostarczania obrazowania w wysokiej rozdzielczości na głębokości tkanek >100 μm11,12. Niemniej jednak instrumentom tym brakuje wszechstronności i bardziej ogólnej dostępności odwróconych mikroskopów konfokalnych, które są bardziej przyjazne dla użytkownika i opłacalne, zapewniają możliwość obrazowania hodowanych komórek, nie wymagają całkowitej ciemności podczas akwizycji obrazu i są ogólnie bezpieczniejsze, wśród innych godnych uwagi zalet13,14. W tym badaniu prezentujemy nowe narzędzie, które znacznie zwiększa dostępność obrazowania przyżyciowego poprzez dostosowanie tego podejścia do odwróconych mikroskopów konfokalnych.

Tutaj prezentujemy wydrukowany w 3D niestandardowy projekt wkładki scenicznej, który zawiera kilka kluczowych funkcji ułatwiających stabilne, długoterminowe obrazowanie przyżyciowe skóry uszu myszy pod odwróconym mikroskopem konfokalnym (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, oraz Rysunek 5). Te specjalistyczne funkcje obejmują przesunięty otwór obiektywu, który pozwala na całkowite ułożenie ciała dorosłej myszy całkowicie płasko podczas obrazowania. Minimalizuje to zakłócenia wibracyjne ruchów ciała myszy podczas obrazowania i eliminuje potrzebę podawania ketaminy i ksylazyny w celu stłumienia oddechu, co często jest praktyką połączoną z obrazowaniem przyżyciowym6. Ponadto wsporniki narożne na wkładce prawidłowo ustawiają stożek nosowy izofluranu, aby wyrównał się z twarzą myszy, metalowy klips na ucho unieruchamia ucho myszy do specjalnie zbudowanego dysku nakrywkowego, a opcjonalna odłączana płytka grzewcza biofeedback w zamkniętej pętli leży równo z wkładką, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas długich sesji obrazowania. Niestandardowy krążek szkiełka nakrywkowego, który zapewnia płaską powierzchnię niezbędną do płaskiego ułożenia głowy i ucha myszy, został wygenerowany w warsztacie mechanicznym poprzez usunięcie ścianek ogólnego naczynia do hodowli komórkowych zawierającego szkiełko nakrywkowe. Zastosowanie soczewki zanurzeniowej z 40-krotnym olejkiem silikonowym (apertura numeryczna 1,25 [N.A.], odległość robocza 0,3 mm) w połączeniu z dyskiem nakrywkowym i niestandardową wkładką sceniczną zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości >50 μm w głąb skóry właściwej ucha.

Aby przetestować funkcjonalność tej nowej wkładki do stolika mikroskopu z odwróconym mikroskopem, przechwyciliśmy stosy z obejmujące wszystkie warstwy nabłonka naskórka w ciągu 3 godzin w uchu żywego transgenicznego K14-H2B-mCherry15 dorosłych myszy (jądra nabłonkowe w tej linii myszy zawierają czerwoną fluorescencyjną etykietę) (Rysunek 6A-A'). Uchwyciliśmy również stosy z obejmujące kilka warstw fibroblastów w skórze właściwej w ciągu 3-godzinnego kursu czasowego w uchu żywego transgenicznego Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 dorosła mysz (jądra fibroblastów w tej linii myszy zawierają zieloną fluorescencyjną etykietę po indukcji doksycykliny) (Rysunek 6B-D'). Nasze dane o wysokiej rozdzielczości wykazują stałą stabilność dzięki brakowi dryftu w płaszczyznach x, y i z, udowadniając w ten sposób skuteczność tego nowego narzędzia do obrazowania przyżyciowego do stosowania w mikroskopach odwróconych. Co ważne, wymiary tej wydrukowanej w 3D wkładki scenicznej można dostosować, zgodnie z opisem w Pliku Uzupełniającym 1, Pliku Uzupełniającym 2 i Pliku Uzupełniającym 3, aby pasowały do każdego mikroskopu odwróconego, a położenie otworu obiektywu można przesunąć w alternatywne miejsca we wkładce, aby lepiej dopasować się do obrazowania określonej tkanki i / lub modelu zwierzęcego będącego przedmiotem zainteresowania. Wynalazek ten może zatem umożliwić poszczególnym laboratoriom lub badaczom z dostępem konfokalnym do podstawowej placówki dostosowanie tego narzędzia do ich unikalnych potrzeb w zakresie obrazowania przyżyciowego, usprawniając w ten sposób ocenę różnorodnej biologii komórki in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Emory University i Atlanta Veterans Affairs Medical Center i zostało zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Instalowanie wkładki do obrazowania na żywo na stoliku mikroskopu odwróconego

  1. Skonstruuj wkładkę przy użyciu plików .stl (plik uzupełniający 1, plik uzupełniający 2 i plik uzupełniający 3) określających wymiary 3D i projekt (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2A), drukarki 3D i kwasu polimlekowego (PLA).
  2. Ostrożnie umieść wkładkę (Rysunek 2B,C) w dużym rowku stolika mikroskopu (Rysunek 2C i Rysunek 3A). Użyj, aby przymocować wkładkę za pomocą czterech otworów na znajdujących się w każdym rogu wkładki (Rysunek 2B-C).
    UWAGA: Wkładka jest dwukierunkowa i można ją obracać o 180° w zależności od orientacji stolika mikroskopu i aparatu anestezjologicznego.
  3. Wsuń płytę grzewczą do wtyczki wkładanej stroną do dołu (Rysunek 2D) tak, aby urządzenie leżało na dolnych rowkach wkładki z portem wtyczki przechodzącym pod spodem stage (Rysunek 3B).
  4. Dopasuj rowkowany okrągły otwór we wkładce do 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego z olejkiem silikonowym (Rysunek 3C) i nałóż olej silikonowy na środek obiektywu.
    1. W przypadku obrazowania przez dłuższy czas (>1 h) nałóż dużą porcję oleju, który utrzyma się na granicy szkiełka nakrywkowego / obiektywu przez cały czas obrazowania. Nie pozwól, aby olej rozlał się po krawędziach obiektywu.
  5. Za pomocą strzykawki nałóż niewielką ilość smaru próżniowego wzdłuż rowkowanego okrągłego otworu i połóż krążek szkiełka nakrywkowego na górze, aby uszczelnić wkładkę (Rysunek 3D).
    UWAGA: Krążek szkiełka nakrywkowego powstaje poprzez usunięcie ścianek naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem o wymiarach 35 mm x 10 mm (wykonywane przez warsztat mechaniczny).
  6. Podnieś obiektyw 40x, aż olej pocałuje spód szklanego szkiełka nakrywkowego.

2. Konfiguracja izofluranu i przygotowanie myszy

  1. Umieść elementy elektronicznego parownika o niskim przepływie (komora anestezjologiczna, rurka, parownik, kanister na węgiel drzewny) tak, aby stożek nosowy i dołączona rurka mogły dotrzeć do wkładu (Rysunek 3A).
    UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym wziewnym i należy obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć rozlania i zminimalizować narażenie ludzi.
  2. Zmierzyć masę butelki z izofluranem przed użyciem i zarejestrować. Przymocuj nakrętkę z waporyzatora elektronicznego do butelki z izofluranem.
  3. Podłącz przewód zasilający do parownika elektronicznego. Zamknij niebieskie zaciski stożka nosowego i otwórz białe zaciski komory indukcyjnej, aby umożliwić przepływ powietrza przez komorę do kanistra z węglem drzewnym. Zdejmij czerwoną nasadkę powietrza otoczenia z lewej strony urządzenia, aby umożliwić przepływ powietrza.
  4. Pozwól systemowi rozgrzać się przez 5 minut przy 200 ml/min (niski przepływ) i 2% izofluranu.
    UWAGA: Chociaż wybrano ustawienie stożka nosowego, niebieska linia stożka nosowego powinna pozostać zamknięta, a biała linia komory indukcyjnej powinna pozostać otwarta.
  5. Gdy system zostanie odpowiednio zrównoważony, należy oczyścić przewody, aby usunąć pozostały izofluran z komory.
  6. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wybierz opcję High Flow. Zakończ wszystkie przygotowania myszy (tj. depilację, miejscowe podawanie leków, aplikację maści do oczu itp.) przed umieszczeniem ciała zwierzęcia na wkładce. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona za pomocą metody odruchu szczypania palców u stóp.
    1. Przy wyprostowanej nodze użyj paznokcia, aby mocno uszczypnąć palec u nogi, nie powodując uszkodzeń fizycznych. Jeśli mysz wykaże pozytywną reakcję na bodziec (np. cofnięcie nogi, drganie stopy itp.), kontynuuj podawanie środka znieczulającego w komorze, aż nie zaobserwuje się żadnej reakcji. Po odpowiednim znieczuleniu częstość oddechów myszy powinna zwolnić do ~55-65 oddechów na minutę18.
  7. Gdy mysz jest w pełni znieczulona, ponownie wybierz opcję High Flow, aby zatrzymać podawanie izofluranu. Oczyść komorę przed otwarciem i wyreguluj zaciski (niebieski: otwarty; biały: zamknięty), aby dostarczyć izofluran przez stożek nosowy. Wybierz Low Flow, gdy stożek nosowy jest przymocowany do myszy, aby kontynuować podawanie izofluranu.
  8. Przewlecz rurkę izofluranu z dołączonym stożkiem nosowym przez narożny wspornik rurki na wkładce (Rysunek 3A i Rysunek 5).

3. Umieszczenie myszy na wkładce do obrazowania przyżyciowego

  1. Podłącz płytę grzewczą do kontrolera (zawierającego dołączoną sondę analną), włącz zasilanie i pozwól płycie osiągnąć 36 °C (Rysunek 4A).
  2. Wyjmij znieczuloną mysz z komory indukcyjnej i połóż ją na płycie grzewczej (Rysunek 4B i Rysunek 5A). Szybko przenieś się z komory do wkładki, aby zminimalizować czas aktywności myszy bez znieczulenia wziewnego.
  3. Przymocuj stożek nosowy do myszy ( Rysunek 4B, C i Rysunek 5). W razie potrzeby użyj taśmy, aby dodatkowo zabezpieczyć kąt i położenie stożka nosowego.
  4. Włóż sondę analną i wyreguluj temperaturę kontrolera, aż temperatura ciała myszy ustabilizuje się na poziomie ~36 °C (Rysunek 4A,B). Po prawidłowym ustawieniu myszy użyj plastikowej folii spożywczej, aby zatrzymać ciepło, jeśli to konieczne, aby dodatkowo utrzymać odpowiednią temperaturę ciała (Rysunek 4C).
  5. Ustaw mysz tak, aby głowa zrównywała się z krążkiem szkiełka nakrywkowego i unieruchamiaj ucho na środku szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą metalowego klipsa na ucho (Rysunek 5A,B) lub taśmy (Rysunek 5C).
    UWAGA: Docisk metalowego klipsa na ucho można regulować, poluzowując mocującą klips do wkładki. Można dodać metalową sprężynę, aby zwiększyć elastyczność dokręcania klipsów.
    1. Aby zmienić położenie klipsa na ucho, odkręć kluczem imbusowym 2,5 mm i przenieś do miejsca dodatkowego (Rysunek 2B, C). Podczas ponownego montażu klipsa na ucho umieść klips na wkładce, a następnie podkładkę na górze. Użyj, aby bezpiecznie przymocować klips z niewielką siłą, aby go obrócić.
  6. Dostosuj ustawienie obiektywu z do momentu, aż komórki znajdą się w ognisku (Rysunek 6A,D). Ustaw parametry z-stack i time-lapse zgodnie z celami eksperymentu i rozpocznij akwizycję obrazu.
    UWAGA: Jeśli zostanie osiągnięta prawidłowa konfiguracja, ucho myszy może być obrazowane przez co najmniej 3 kolejne godziny (Rysunek 6A',D').
    1. Po ustawieniu granic stosu z dostosuj moc lasera i wzmocnienie, aby upewnić się, że żadna płaszczyzna z nie jest przesycona, aby zminimalizować fotowybielanie. Określ parametry poklatkowe, korzystając z całkowitej grubości stosu z, numerów kroków (zalecane próbkowanie Nyquista) i przedziałów czasowych.
    2. Określ parametry obrazowania (przedziały czasowe, całkowity czas obrazowania itp.) przy użyciu wielu czynników, w tym żywotności zwierząt w znieczuleniu, fotowybielania/fototoksyczności wywołanej laserem oraz celu obrazowania na żywo (tj. dynamiki podziału komórki, interakcji komórka-komórka itp.).

4. Zakończenie obrazowania

  1. Włącz poduszkę grzewczą z cyrkulacją wody i ustaw cykl ciągły i 35 °C na co najmniej 30 minut przed zakończeniem akwizycji obrazu.
  2. Po zakończeniu obrazowania wybierz Low Flow w parowniku elektronicznym, aby zatrzymać podawanie izofluranu i przesuń mysz na poduszkę grzewczą do czasu rozpoczęcia ruchu.
  3. Po przebudzeniu przenieś mysz z powrotem do pojemnika transferowego, kontynuując utrzymywanie na poduszce grzewczej, aż do pełnego poruszania się. Konsekwentnie monitoruj mysz na poduszce grzewczej, aż zacznie reagować.
  4. Na parowniku elektronicznym kliknij Wybierz Menu > Kontrola znieczulenia > Puste. Wyjąć butelkę z izofluranem z systemu i ponownie nałożyć na butelkę nakrętkę producenta.
  5. Zmierz wagę butelki z izofluranem i kanistra na węgiel drzewny i wprowadź odważniki do dziennika. Gdy pojemnik na węgiel drzewny waży 50 g powyżej wartości pomiarowej, wyrzuć pojemnik i wymień go na nową jednostkę. Zwróć izofluran do skrytki.
  6. Wyjmij krążek szkiełka nakrywkowego i wytrzyj do czysta papierem do soczewek i roztworem do soczewek. Przechowuj prawidłowo, aby uniknąć zadrapań do ponownego użycia.
  7. Wyjmij rurkę znieczulającą ze wspornika wkładki i odkręć wkładkę od stolika mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowy montaż wkładki do obrazowania żywych tkanek w odwróconym mikroskopie konfokalnym oraz odpowiednia orientacja transgenicznej myszy na wkładce są weryfikowane poprzez pozyskanie stosów z-stack z fluorescencyjnie znakowanej, żywej tkanki ucha w czasie ≥1 h, przy minimalnych dowodach na dryf w osiach x, y i z. Obrazy powinny być rejestrowane w stałych odstępach czasu (czas odstępu zależy od problemu biologicznego, siły sygnału fluorescencyjnego itp.), aby można było śledzić dynamikę komórek i dryf obrazu w czasie....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy prezentujemy nowe narzędzie, które ułatwia stabilne, długoterminowe obrazowanie przyżyciowe nienaruszonego nabłonka skóry myszy na odwróconych mikroskopach konfokalnych. Ten wynalazek jest wykonany z PLA, który jest najpowszechniejszym i najtańszym materiałem do druku 3D; wszystkie wewnętrzne koszty druku 3D dla tej wkładki wynoszą < 5 USD. Dwa oddzielne elementy wkładki (Rysunek 1, Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2) można łatwo ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Valentinie Greco za myszy K14-mCherry-H2B. Jesteśmy wdzięczni Warsztatowi Mechanicznemu Wydziału Fizyki Uniwersytetu Emory za wygenerowanie szklanych dysków nakrywkowych. Praca ta została sfinansowana przez Career Development Award #IK2 BX005370 od Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych BLRD Service dla LS, NIH Awards RF1-AG079269 i R56-AG072473 dla MJMR oraz I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award dla MJMR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3DQudi Techi-FastWydruki 3D przy użyciu materiału PLA
40x 1,25NA silikonowa soczewka obiektywowaNikon
AxR Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny
VWR76337-046Aplikacja kremu/maści
Hyklat doksycyklinySigma-AldrichD9891Indukuje znakowanie GFP jąder fibroblastów w Pdgfra-rtTA; Myszy pTRE-H2B-GFP
Śrubokręt płaski (2,5 mm)Wkładka Affiix do stolika mikroskopu
z płaskim x 4 (#6-32)NikonWkładka śrubowa do stolika mikroskopu
Naczynie do hodowli szkłachemglass Nauki biologiczneCLS-1811-002Zmodyfikowane przez usunięcie ścianek naczynia do użycia jako krążek nakrywkowy kompatybilny z wkładką na żywo; Dysk o szerokości 35 mm zawiera szklane szkiełko nakrywkowe o szerokości 20 mm; ścianki naczynia były usunięty przez warsztat mechaniczny
Kontroler płyty grzewczejPhysitempTCAT-2LVRegulator temperatury zwierząt - niskie napięcie; Nasadka sondy analnej do monitorowania temperatury ciała myszy
Klucz imbusowy (1,5 mm)Do regulacji dociskowych M3
Klucz imbusowy (2,5 mm)Dostosuj napięcie metalowego klipsa na ucho
Wkładka
do obrazowania przyżyciowegoIsofluraneMed-Vet InternationalHPA030782-100uLznieczulenia dla myszy
(lub taśma klejąca)VWR10127-458Alternatywa dla metalowego klipsa na ucho do unieruchomienia ucha do szkiełka nakrywkowego
Metaloweużywane jako klips na ucho
Mysz: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/JLaboratorium JacksonaRRID: IMSR_JAX:034459Specyficzny dla fibrroblastu promotor napędzający indukowaną doksycykliną ekspresję rtTA
Mysz: K14-H2BPAmCherryDzięki uprzejmości dr Valentiny Greco z UniwersytetuEtykietuje jądra komórek nabłonka naskórka za pomocą mCherry; określane w tekście jako "K14-H2B-mCherry"
Mysz: pTRE-H2B-GFP: STOCK
Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J		Laboratorium JacksonaRRID: IMSR_JAX:005104  Znakuje jądra fibroblastów za pomocą GFP w połączeniu z Pdgfra-rtTA i indukowane doksycykliną
Uniwersalna folia uszczelniającaGladEnhance mouse warmth
OptixcareVWRMSPP-078932779Smar do oczu
ustalające x 3 (M3; 6 mm)ThorlabsSS3M6Nasadka do modułu płyty grzewczej
Silikonowy olejekNakładany na 40x silikon obiektyw
Płyta grzewcza dla małych zwierzątPhysitempHP-4MDostarcza ciepło do zwierzęcia
Elektroniczny waporyzator Somnoflow o niskim przepływieKent ScientificSF-01do znieczulenia myszy
FlinnScientificAP1095Uszczelki krążka nakrywkowego do włożenia
Veet 
Poduszka grzewcza z cyrkulacją wodyStryker MedicalTP700do obrazowania po ożywieniu myszy
Wacik z bawełnianą końcówką Nikon Taśma do etykietowania zapięcie Yale immersyjny Smar próżniowy depilacji

Bibliografia

  1. Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
  2. Nal Chen,, et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196(2022).
  3. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
  4. Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Multidimensional imaging of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).
  5. Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
  6. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  7. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  8. Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
  9. Pal Arndt,, et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).
  10. Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
  11. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
  12. Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).
  13. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  14. Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).
  15. Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
  16. Ral Li,, et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
  17. Tal Tumbar,, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  18. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).
  19. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie żywych komórekśledzenie komórek skórywkładka wydrukowana w technologii 3Dobrazowanie ucha myszyfluorescencyjny timelapsekomórki naskórkafibroblasty skóry właściwej
Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.