W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).
Artykuł metodologiczny
Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Angiografia tomografii mikrokomputerowej (microCT) jest nieocenionym źródłem informacji dla badaczy. Nowe postępy w tej technologii pozwoliły na uzyskanie wysokiej jakości obrazów mikrokrążenia i są narzędziami o wysokiej wierności w dziedzinie transplantacji narządów. W tym modelu ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy, mikrotomografia komputerowa daje możliwość oceny zespolenia przeszczepu allogenicznego w czasie rzeczywistym i ma dodatkową zaletę w postaci braku konieczności poświęcania badanych zwierząt. Wybór kontrastu, a także ustawień akwizycji obrazu, tworzą obraz w wysokiej rozdzielczości, który dostarcza badaczom bezcennych informacji. Pozwala to na ocenę technicznych aspektów procedury, a także potencjalną ocenę różnych terapii w dłuższym okresie czasu. W tym protokole szczegółowo opisujemy model OLT u myszy w sposób krokowy, a na koniec opisujemy protokół mikrotomografii komputerowej, który może zapewnić wysokiej jakości obrazy, które pomagają naukowcom w dogłębnej analizie przeszczepu narządów litych. Udostępniamy przewodnik krok po kroku dotyczący przeszczepu wątroby u myszy, a także pokrótce omawiamy protokół oceny drożności przeszczepu za pomocą angiografii mikroCT.
Wprowadzenie
Transplantacja jest jedyną skuteczną terapią w końcowym stadium choroby wątroby. Niezaprzeczalnie korzyści z przeszczepu wątroby są doskonałe, z medianą przeżycia wynoszącą 11,6 roku w porównaniu z 3,1 roku na liście oczekujących1. Istnieją jednak istotne ograniczenia, które ograniczają szerokie zastosowanie transplantacji wątroby, a przede wszystkim brak odpowiednich, wysokiej jakości narządów od dawców. Poszerzenie puli narządów dawców będzie zatem wymagało innowacyjnych strategii, które pozwolą na stosowanie przeszczepów allogennych obecnie uznawanych za nieodpowiednie, zwiększając margines bezpieczeństwa przy przeszczepieniu. Dlatego, aby poprawić dostęp do przeszczepu wątroby, konieczne jest przeprowadzenie badań przedklinicznych na małych zwierzętach.
Szczególnie ważne dla badań transplantacyjnych są modele transplantacji in vivo. Ortotopowy przeszczep wątroby u myszy (OLT) istnieje od prawie 30 lat2 i ma kluczowe znaczenie dla badania wielu aspektów transplantacji, w tym charakterystyki odpowiedzi immunologicznej, uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, ostrego odrzucenia, efektów terapeutycznych nowych leków i długoterminowego przeżycia3,4,5,6,7. Wykorzystanie myszy do badania transplantacji jest niezbędne, ponieważ pozwala na wykorzystanie transgenicznych linii myszy do badania wpływu określonych szlaków molekularnych na wyniki przeszczepu. Ustalone protokoły przeszczepiania wątroby u myszy zostały dobrze opisane wcześniej8,9.
Istnieje wiele metod zespoleń dla żyły głównej dolnej i nadwątrobowej (IVC), żyły wrotnej (PV) i wspólnego przewodu żółciowego (CBD). Zazwyczaj opierają się one na zespoleniu ręki lub zmodyfikowanej technice mankietu naczyniowego, podobnej do przeszczepu płuc u myszy10,11,12. Ważnym krokiem w długoterminowym badaniu i przeżywalności myszy biorców, a także w opracowaniu trwałego programu przeszczepu wątroby u myszy, jest możliwość oceny tych krytycznych zespoleń. Metody obrazowania w celu oceny drożności przeszczepu allogenicznego wątroby często opierają się na ultrasonografii i tomografii komputerowej (CT) w warunkach klinicznych13,14. Tomografia komputerowa ma wyraźną przewagę nad ultrasonografią, ponieważ może oferować widoki całego brzucha, obejmując każde zespolenie, chociaż uzyskanie tych widoków za pomocą ultradźwięków może być szczególnie trudne u małych zwierząt. Poświęcono wiele badań i zasobów na opracowanie dokładnej mikrotomografii komputerowej w celu ulepszenia badań na zwierzętach i informacji, które możemy zebrać z tych modeli urazów i chorób15,16. Poniżej opisujemy protokół ortotopowego przeszczepu wątroby myszy (Ryc. 1) i pokrótce opisujemy protokół mikrotomografii komputerowej do oceny drożności przeszczepu allogenicznego i trwałości zespoleń.
Protokół
Samce myszy C57BL/6J (30 g masy ciała) były trzymane w warunkach wolnych od patogenów w Nationwide Children's Hospital Animal Facility. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w sposób humanitarny zgodnie z NIH i Przewodnikiem Krajowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (Protokół IACUC AR17-00045). Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, przyrządów i sprzętu użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Wstępne przygotowanie do operacji transplantacji
- Skonfiguruj urządzenia chirurgiczne.
- Skonfiguruj chirurgiczne urządzenia monitorujące (np. urządzenie do monitorowania tętna, pulsoksymetr, modułowy system monitorowania) i aparaty anestezjologiczne.
- Jeśli to możliwe, włącz chirurgiczną płytę rozgrzewającą do 42 °C.
- Upewnij się, że urządzenia do wentylacji i znieczulenia są włączone w celu ogrzania parownika izofluranu. Napełnij zbiornik anestezjologiczny 30 ml ciekłego izofluranu i upewnij się, że respirator jest podłączony do tlenu.
UWAGA: W tym protokole nie intubujemy zwierzęcia; Do natleniania używaj tylko stożka nosowego.
- Zapisz masę ciała myszy biorcy i dawcy.
- Włącz mikroskop chirurgiczny o dużej mocy i dostosuj wysokość i ostrość do preferencji chirurga. Upewnij się, że pozostałe urządzenia chirurgiczne są włączone (np. urządzenie do elektrokoagulacji).
- Przygotuj i rozłóż narzędzia chirurgiczne, a także opaski chirurgiczne z nylonu 10-0 (Rysunek 2).
UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne były sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Dodatkowo, różne konfiguracje narzędzi chirurgicznych mogą być równie skuteczne. - Przygotuj mankiety na stenty do żyły wrotnej (PV) i wspólnego przewodu żółciowego (CBD) (Rysunek 3). Umieść angiocewnik, a także PE10, na sterylnej powierzchni pod mikroskopem o dużej mocy. Za pomocą ostrza chirurgicznego #11 przeciąć angiocewnik, aby utworzyć mankiet o długości 1,5 mm z zakładką około 0,75 mm w górnej części korpusu mankietu; przyciąć rurkę polietylenową (PE10) na długość 2,5 mm. Mankiety i stent należy przechowywać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do czasu, aż będą gotowe do użycia.
UWAGA: Ten model przeszczepu wykorzystuje angiocewnik o pojemności 20 G do wykonania mankietów do rekonstrukcji PV, a także rurkę polietylenową 10 (PE10) do rekonstrukcji CBD. Wszystkie inne zespolenia są szyte ręcznie. - Przygotuj rozwiązania. Przygotuj wstrzyknięcie heparyny, które zostanie dostarczone w 100 j. w 0,5 ml roztworu histydyny-tryptofanu-ketoglutaranu (HTK). Sól fizjologiczną, sól fizjologiczną, PBS i roztwór konserwujący HTK należy przechowywać na lodzie.
2. Pozyskiwanie myszy-dawców
- Wywołać znieczulenie u myszy dawcy, umieszczając ją w komorze inhalacyjnej izofluranu. Upewnij się, że stężenie izofluranu wynosi około 2,5% przy przepływie tlenu 2 ml/min. Odczekaj 5 minut, aż rozwinie się chirurgiczna płaszczyzna znieczulenia. Aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia, uszczypnij mysz u nogi, aby wywołać reakcję; Brak reakcji wskazuje, że został spełniony właściwy poziom znieczulenia.
- Ogol brzuch myszy za pomocą elektronicznych maszynek do strzyżenia i umieść mysz w pozycji leżącej na desce grzewczej. Oczyść brzuch jodonem powidonu, a następnie 70% etanolem. Umieść maść okulistyczną pod oczami myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
- Umieść mysz pod mikroskopem o dużej mocy i utrzymuj mysz w znieczuleniu za pomocą inhalacji izofluranu o stężeniu 2% i przepływie tlenu 2 ml/min.
- Wykonaj laparotomię w linii środkowej nożyczkami (preferencja chirurga) od wyrostka mieczykowatego do spojenia łonowego. Następnie wykonaj dodatkowe nacięcie poprzeczne, aby stworzyć "krzyżowy" wzór niższy od żeber. Za pomocą kleszczy hemostatycznych na komary cofnij wyrostek mieczykowaty, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję zawartości brzusznej.
UWAGA: Kleszcze można zabezpieczyć w zależności od preferencji chirurga. - Wypatroszyć jelita i umieścić je po lewej stronie jamy brzusznej w mokrej gąbce z gazy. Zmobilizuj wątrobę, usuwając wszystkie przyczepy więzadłowe.
- Odsłonić właściwą tętnicę wątrobową (pHA). Zeszkieletuj naczynie za pomocą kleszczy krzywych i podwiązuj je nylonowym szwem 10-0.
- Rozetnij CBD na całej długości, stosując kombinację ostrego i rozwarstwienia. Wykonaj duktotomię (wystarczająco dużą, aby zmieścił się stent CBD) jak najbliżej górnej granicy trzustki, aby uzyskać odpowiednią długość do wykorzystania w przyszłości (~1 cm od dolnej granicy wątroby). Włóż stent przewodu żółciowego do CBD za pomocą cienkich kleszczyków i zabezpiecz go nylonowym szwem 10-0. Zwiąż dystalny aspekt CBD za pomocą nylonowego szwu 10-0 (Rysunek 4).
- Cofnij prawy płat wątroby w kierunku mieczyka mieczykowatego za pomocą mokrej gąbki z gazy i odsłoń IVC. Zmobilizuj IVC podwątrobowe (IHIVC) z dala od przestrzeni zaotrzewnowej i kauteryzuj prawą żyłę nadnerczy za pomocą ręcznego urządzenia do kauteryzacji (patrz tabela materiałów).
- Wyciąć prawą tętnicę nerkową i żyłę i podwiązać odpowiednio nylonem 7-0 i 10-0. Przeciąć prawą żyłę nerkową i tętnicę oraz pozostałe przyczepy więzadłowe. Na koniec usuń prawą nerkę.
UWAGA: Ma to na celu uzyskanie lepszej ekspozycji podczas ostatecznego cięcia IHIVC. - Wstrzyknąć 0,5 ml zimnego HTK ze 100 j. roztworem heparyny przez PV za pomocą igły 30 G. Odczekaj 1 minutę, aż heparyna zacznie się systematycznie rozprowadzać. Przeciąć żyłę wrotną tuż nad żyłą śledzionową i żyłą krezkową górną.
- Powoli wstrzyknąć zimny roztwór konserwujący HTK z heparyną do IHIVC za pomocą igły 30 G w celu perfuzji wątroby dawcy. Przestań wstrzykiwać roztwór, gdy płyn pochodzący z PV jest czysty. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy umieścić mikrozacisk na IHIVC tuż nad prawą żyłą nerkową i przeciąć go nieco niżej od zacisku. Po zakończeniu tego kroku wyłącz respirator i odstaw izofluran, ponieważ zwierzę zostało właśnie poddane eutanazji.
- Przeciąć CBD dystalnie do stentu, który został wcześniej umieszczony w kroku 2.7. Dodatkowo zidentyfikuj przewód torbielowaty i podwiąż przewód za pomocą szwu nylonowego 10-0. Następnie chwyć kopułę pęcherzyka żółciowego parą kleszczy i wypreparuj z dołu pęcherzyka żółciowego, stosując kombinację ostrego i cięcia. Gdy pęcherzyk żółciowy zostanie odpowiednio zmobilizowany, za pomocą nożyczek sprężynowych zakończ cholecystektomię, przecinając przewód torbielowaty powyżej wcześniej założonego szwu.
- Cofnij wątrobę dolnie, aby odsłonić nadwątrobowy IVC (SHIVC). Wyciąć SHIVC zwracając szczególną uwagę, aby uzyskać odpowiednią długość do zespolenia u biorcy.
- Wypreparować dodatkowe przyczepy więzadłowe do wątroby i dostarczyć wątrobę dawcy ex vivo, a następnie umieścić narząd w pojemniku z zimną solą fizjologiczną.
3. Przygotowanie alloprzeszczepu wątroby na tylnym stole
- Umieść lód w izolowanym pojemniku i umieść szalkę Petriego na warstwie lodu. Napełnij szalkę Petriego zimną solą fizjologiczną. Umieść alloprzeszczep wątroby w naczyniu tak, aby powierzchnia trzewna była odsłonięta.
- Umieść PV przez wcześniej wybrany mankiet i przetnij żyłę tak, aby wewnętrzna powierzchnia śródbłonka była odsłonięta. Zabezpiecz mankiet nylonowym szwem 10-0. Upewnij się, że szew leży w rowkach mankietu, aby uzyskać najlepsze wyniki (Rysunek 5).
- Dostosuj alloprzeszczep wątroby, aby odsłonić SHIVC i umieść dwa 8-0 Nylonowe szwy rozporowe odpowiednio na godzinie 3' i 9 do ewentualnego zespolenia u zwierzęcia biorcy. Ponownie wyreguluj alloprzeszczep wątroby, aby odsłonić IHIVC i umieść dwa 8-0 Nylonowe szwy rozporowe odpowiednio na godzinie 3' i 9 do ewentualnego zespolenia u zwierzęcia biorcy.
4. Operacja odbiorcy
UWAGA: Ponieważ jest to operacja sterylna, używaj rękawiczek i odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej oraz podawaj antybiotyki. Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. jako znieczulenie przedoperacyjne w czasie zabiegu.
- Odsłonić pHA jak w przypadku operacji dawcy; zamiast wcześniej opisanego nacięcia brzucha należy zastosować tylko laparotomię w linii środkowej.
- Zmobilizuj wątrobę i przetnij wszystkie przyczepy więzadłowe. Dodatkowo podwiązać lewe naczynia przeponowe i okołoprzełykowe nylonowym szwem 10-0.
- Cofnij wątrobę niżej i wypreparuj SHIVC z zaotrzewnowej. Następnie cofnij wątrobę wyżej i wypreparuj IHIVC z zaotrzewnowej. W razie potrzeby kauteryzować małe żyły mostkowe i żyły lędźwiowe, stosując tę samą technikę, jak opisano wcześniej.
- Kauteryzuj prawą żyłę nadnerczy za pomocą ręcznego kauteryzacji i odsłoń wnękę wątroby. Podwiązywać pHA za pomocą nylonowego szwu 10-0. Następnie należy rozciąć CBD na płasko z PV i podwiązać CBD szwem 7-0 w pobliżu rozwidlenia CBD, aby uzyskać odpowiednią długość zespolenia CBD.
- Użyj mikrozacisku do zaciśnięcia podwątrobowego IVC i tymczasowo podwiązaj PV za pomocą szwu 7-0. Rozpocznij fazę bezwątrobową. Przerwać inhalację izofluranu.
UWAGA: Po zaciśnięciu żyły wrotnej i IVC, powrót żylny wątroby jest całkowicie zablokowany w fazie zniedokrwienia. Wziewny środek znieczulający izofluran jest metabolizowany przez wątrobę; W ten sposób jego wdychanie zostaje chwilowo zatrzymane, ponieważ nagromadzenie może prowadzić do zapaści krążeniowo-oddechowej. - Przez PV natywnej wątroby wstrzyknij 0,5 ml soli fizjologicznej heparyny za pomocą igły 30 G, aby przepłukać narząd.
- Umieść zaciski mikronaczyniowe na SHIVC i IHIVC tak proksymalnie i dystalnie, jak to możliwe, aby pozostawić odpowiednią długość do zespolenia. Przeciąć natywne SHIVC, IHIVC, PV (w pobliżu poprzednio założonego szwu) i wszelkie pozostałe przyczepy więzadłowe do natywnej wątroby biorcy i dostarczyć natywną wątrobę ex vivo.
UWAGA: Zacisk IHIVC powinien znajdować się powyżej prawej żyły nerkowej. - Umieść alloprzeszczep wątroby dawcy w jamie brzusznej i cofnij wnękę alloprzeszczepu dawcy, aby odsłonić PV. Przepłukać zarówno dawcę, jak i natywną PV 0,5 ml soli fizjologicznej heparyny za pomocą igły 30 G, aby odpowietrzyć naczynia, aby uniknąć zatoru powietrznego. Następnie należy wprowadzić wcześniej wykonany mankiet PV dawcy do światła PV wątroby biorcy i w razie potrzeby założyć szwy podtrzymujące, które wspomagają zespolenie (szew 8-0). Zabezpiecz zespolenie szwem 7-0 (Ryc. 6).
- Obróć deskę o 180°. Wykonaj ręcznie szyte zespolenie z nylonowym szwem 10-0 z dawcą i natywnym SHIVC. Po zakończeniu zespolenia tylnej ściany przepłukać 0,5 ml soli fizjologicznej z heparyny, aby odpowietrzeć, aby uniknąć zatoru powietrznego. Całkowite zespolenie ściany górnej (Rysunek 7).
- Najpierw usuń szew podwiązany PV, a następnie usuń zaciski naczyniowe z SHIVC, aby rozpocząć reperfuzję. Zakończyć fazę bezwątrobową i wznowić inhalację izofluranu. Wykonać ręczne zespolenie z nylonowym szwem 10-0, w taki sam sposób, jak w przypadku zespolenia SHIVC, w celu rekonstrukcji IHIVC. Po zakończeniu rekonstrukcji usuń mikrozacisk z natywnego i dawcy IHIVC, aby ponownie spalić (Rysunek 8).
- Wykonaj zespolenie CBD poprzez wykonanie duktotomii na biorcy CBD w pobliżu wcześniej założonego szwu. Wprowadzić stent do CBD dawcy do światła CBD biorcy i zabezpieczyć zespolenie szwem 10-0 (Ryc. 9).
- Przepłukać jamę brzuszną 1 ml soli fizjologicznej; sprawdzić hemostazę i kauteryzować pozostałe naczynia krwionośne. Zamknij nacięcie brzucha w dwóch warstwach za pomocą szwu 6-0.
- Umieścić zwierzę w ciepłym inkubatorze (42 °C) w celu rekonwalescencji i nie pozostawiać zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska przytomności i wystarczającej aktywności. Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,1 mg/kg mc. po zabiegu chirurgicznym i kontynuować podawanie co 8 do 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu. Dodatkowo należy podawać karprofen (0,2 ml rozpuszczony w 400 ml wody) przez butelkę z wodą zwierzęcia biorcy przez okres do 7 dni po zabiegu. Obserwuj zwierzę biorcy przez 4-5 godzin, a gdy w pełni wyzdrowieje, zwróć je do miejsca utrzymania, ponieważ teraz można bezpiecznie przebywać z innymi zwierzętami.
UWAGA: Leki przeciwbólowe i antybiotyki mogą być podawane zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt.
5. Obrazowanie angiografii mikrotomografii komputerowej myszy
- Po obserwacji myszy przez z góry określony interwał badania, przygotuj mysz do oceny drożności przeszczepu allogenicznego za pomocą angiografii mikroCT.
- Upewnij się, że urządzenia do wentylacji i znieczulenia są włączone w celu ogrzania parownika izofluranu. Napełnij zbiornik anestezjologiczny 30 ml ciekłego izofluranu i upewnij się, że respirator jest podłączony do tlenu. Włącz skaner mikrotomografu komputerowego i upewnij się, że całe oprogramowanie działa prawidłowo.
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji w systemie skanera mikrotomografii komputerowej.
- Na monitorze aparatu microCT kliknij przycisk Initialize (Zainicjuj system) i wybierz tryb CT scan mode (Tryb skanowania CT).
- Wysuń łóżko, przymocuj łoże myszy i zablokuj je.
- Włączyć płytę grzewczą do temperatury 42 °C dla klatki rekuperalnej.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 100 μl środka kontrastowego CT. Założyć igłę o rozmiarze 30 do przyszłego dożylnego podawania kontrastu. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
- Umieść mysz w systemie unieruchamiania żył ogonowych. Gdy mysz znajdzie się całkowicie w systemie ograniczającym, zamknij bramę systemu, pozwól, aby ogon opadł pionowo i ostrożnie przetrzyj go roztworem alkoholu (70% etanolu).
UWAGA: Sukces w kaniulacji żyły ogonowej można zwiększyć, ogrzewając ogon zwierzęcia, trzymając go w dłoni w rękawiczce przez kilka minut. - Chwycić ogon w kierunku dystalnym i umieścić dwa palce (wskazujący i środkowy) wokół ogona proksymalnie do planowanego miejsca wstrzyknięcia. Umieścić dystalną część ogona (poniżej miejsca wstrzyknięcia) między kciukiem a palcem serdecznym.
- Obiema parami palców lekko docisnąć i wprowadzić igłę do żyły na niewielką głębokość, upewniając się, że strzykawka i igła są równoległe do ogonka. Zwalniając nacisk palca wskazującego na proksymalny ogon, dożylnie podaj środek kontrastowy CT. Należy unikać zasysania strzykawką, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się żyły.
UWAGA: Podczas wstrzyknięcia nie powinien być odczuwany żaden opór, jeśli igła jest prawidłowo umieszczona w żyle. Jeśli występuje opór, należy wyjąć igłę i ponownie umieścić ją powyżej pierwotnego miejsca wstrzyknięcia. Jeśli kaniulacja żyły nie powiedzie się nawet po dwóch próbach, wymień igłę. - Po udanym wstrzyknięciu kontrastu i usunięciu igły, należy delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia za pomocą sterylnej gazy, aby zatamować krwawienie.
- Przenieś mysz do komory inhalacyjnej izofluranu i ustaw stężenie na 2,5% przy przepływie tlenu 2 ml/min i odczekaj 3-4 min. Po ustaleniu płaszczyzny znieczulenia szybko przenieś mysz na łóżko skanera mikrotomografii komputerowej i połóż ją w pozycji leżącej na stole skanera (Rysunek 10).
- Zakryj oczy zwierzęcia odpowiednią ilością maści okulistycznej. Umieść stożek nosowy odpowiednio nad zwierzęciem i upewnij się, że powietrze i izofluran prawidłowo przepływają przez stożek nosowy. Użyj tych samych parametrów znieczulenia, które opisano wcześniej (krok 5.12). Nasmaruj i włóż sondę temperatury w odbycie, aby stale monitorować temperaturę ciała zwierzęcia podczas obrazowania.
- Umieść respirator w kontakcie z myszą.
- Użyj taśmy, aby przymocować podkładkę EKG do lewej, prawej przedniej i lewej tylnej kończyny. Użyj żelu do ultradźwięków, aby poprawić sygnał między podkładką EKG a skórą.
- Sprawdź EKG i sygnał oddechowy w oprogramowaniu komputerowym, aby upewnić się, że na monitorze widoczne są prawidłowe zespoły QRS. Aby to zrobić, sprawdź Logic Lead w zakładce Source Set Up (Konfiguracja źródła) i wybierz odprowadzenie, które zapewnia najwyraźniejszą krzywą EKG.
UWAGA: Przewody logiczne odpowiadają trzem elektrodom EKG, które są podłączone do prawej, lewej klatki piersiowej i dolnej części nogi. Każdy odprowadzenie reprezentuje krzywą EKG. - Ustaw wzmocnienie dla odpowiedniej wysokości sygnału, zwykle 4 lub 8 jest dobre. Wybierz podwójne bramkowanie. Na karcie Display Set Up (Ustawienia wyświetlacza) dostosuj ustawienia wyświetlania, aby uzyskać wyraźny widok sygnału: zaznacz pola obok opcji EKG i RESP i ustaw każde z nich na 500. Na karcie Konfiguracja wyzwalacza upewnij się, że zaznaczone są opcje Kanał A, Kanał B i DualTrig.
- Upewnij się, że ustawione są również następujące parametry: Próg: gdy sygnał spadnie poniżej tej wartości; ustaw wartość na 2,500; Histereza: upewnij się, że sygnał przekracza histerezę, aby utworzyć programowy punkt wyzwalania, w którym rozpoczyna się nowy cykl wyzwalania; ustaw wartość na 300; Opóźnienie: poczekaj na wysłanie wyzwalacza; ustaw wartość na 100; Wstrzymanie: w tym okresie nie można wygenerować żadnego sygnału, ustaw wartość na 200.
- Upewnij się, że próg EKG znajduje się poniżej wartości histerezy i powyżej wartości szczytowej segmentu sT na ekranie wyświetlacza.
- Przesuń zwierzę do skanera i naciśnij Aktualizuj obraz. Uzyskaj zdjęcie rentgenowskie zwierzęcia, aby wybrać odpowiednie pole widzenia i pokrycie skanu anatomicznego dla kolejnego obrazu mikrotomografii komputerowej.
- Wykonaj akwizycję obrazu angiografii mikrotomografii komputerowej przy użyciu następujących parametrów: Powiększenia: Ultraostrość, Kąt skanowania: Pełny skan (360), Energia: Pojedyncza, Tryb skanowania: Bramkowany, Ustawienia: Domyślne (pełny obrót o 360°, domyślne ustawienia lampy rentgenowskiej 0,33 mA i 55 kV, 0,750 stopnia na krok, 1 projekcja na krok, 1 x 1 binning i czas ekspozycji 40 ms; podwójne bramkowanie oznacza bramkowanie serca i oddechu) (Rysunek 11).
- Po zakończeniu skanowania przenieś zwierzę do wstępnie ogrzanej klatki rekonwalescencji. Gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje, przenieś je z powrotem do klatki podstawowej.
- Rekonstrukcja obrazów mikrotomografii komputerowej za pomocą oprogramowania systemowego. Po przesłaniu obrazu ustaw niebieskie paski tak, aby znajdowały się okrakiem na anatomicznym obszarze zainteresowania; Wyświetl podgląd plasterka, aby zmniejszyć objętość i jak najbardziej ograniczyć ją do myszy (ten etap pomaga zmniejszyć rozmiar zrekonstruowanego obrazu).
- Włącz kontur głośności zainteresowania, aby zoptymalizować granicę obrazu. Wybierz rozmiar woksela 40 μm, filtr projekcyjny Hanna i filtr objętościowy Gaussa (80 μm). Przejdź do pozycji Zaawansowane | Bramkowanie oparte na obrazie i dostosuj okna wyzwalania i fazę odpowiednio do 0,5 i 0,6, wybierz 10 faz dla bramkowania serca, a następnie naciśnij przycisk rekonstrukcji głośności.
Wyniki
W przypadku badaczy, którzy nie są chirurgami, nie znają anatomii lub nie czują się pewnie w interpretacji wyników radiologicznych, właściwa analiza obrazu powinna być przeprowadzona przez personel z odpowiednim przeszkoleniem. Powodzenie OLT u myszy zostało zaprezentowane w powyższym protokole. Ponadto, aby poprawić parametry badania i uzyskać informację zwrotną w czasie rzeczywistym o sukcesie przeszczepu, a także wyeliminować konieczność przeprowadzania nekropsji, można zastosować angiografię mikroCT w celu uzyskania dokładnych i wyraźnych obrazów. Reprezentatywne obrazy zamieszczono w niniejszym opracowaniu (Rysunek 11). Reprezentatywne obrazy nieudanej anastomozy in vivo przedstawiono na Rysunku 12.
Osoby znające anatomię i układ naczyniowy wątroby mogą dostrzec drożne anastomozy żylne żyły głównej dolnej (IVC). W niektórych przypadkach można również zwizualizować żyłę wrotna, co w tym modelu jest ułatwione dzięki zastosowaniu mankietu na żyłę wrotną. Obserwacja otwartych anastomoz świadczy o sukcesie technicznym operacji. Dodatkowo rekonstrukcja 3D tych obrazów może dostarczyć badaczom dodatkowych informacji oraz bardziej szczegółowego obrazu anatomii naczyniowej. Przy zastosowaniu powyższego modelu śmiertelność w kohorcie myszy poddanych OLT wynosi ~40-45%.
Rysunek 1: Przegląd ortotopowego przeszczepienia wątroby. (A) Rysunek przedstawiający cztery różne zespolenia: i) zespolenie żyły głównej dolnej powyżej wątroby, ii) zespolenie żyły głównej dolnej poniżej wątroby, iii) zespolenie żyły wrotnej, iv) zespolenie wspólnego przewodu żółciowego. Każda strzałka wskazuje względne miejsce nacięcia naczynia lub przewodu – żyła główna dolna powyżej wątroby (krok protokołu 2.13), żyła główna dolna poniżej wątroby (krok protokołu 2.11), żyła wrotna (krok protokołu 2.10) oraz wspólny przewód żółciowy (krok protokołu 2.7). (B) Schemat zespoleń in vivo. Pasek skali = 2 mm. Skrót: IVC = żyła główna dolna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Narzędzia chirurgiczne stosowane w operacjach. (A) precyzyjna pęseta 45°, (B-E) pęsety precyzyjne, (F) zakrzywiony needle holder/pęseta, (G) pęseta prosta, (H) aplikator zacisków naczyniowych, (I) kleszczyki hemostatyczne, (J) needle holder, (K) urządzenie do elektrokoagulacji, (L) ostrze nr 11, (M) retraktor brzuszny, (N,O) mikronozyczki, (P) nożyczki precyzyjne, (Q) nożyczki chirurgiczne, (R,S) zaciski Yasargila, (T) zacisk typu bulldog do żył, (U) mikrozacisk naczyniowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Mankiet żyły wrotnej i stent przewodu żółciowego. Obraz ex vivo stentów i mankietów przed użyciem. Pasek skali = 3,5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Figura 4: Stentowanie wspólnego przewodu żółciowego podczas operacji dawcy. (A) Wprowadzanie stentu do wspólnego przewodu żółciowego. (B) Stent przewodu żółciowego zabezpieczony wewnątrz przewodu. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 5: Zakładanie mankietu żyły wrotnej podczas przygotowania allograftu wątroby na stole operacyjnym. (A) Przewlekanie żyły wrotnej przez mankiet żylny. (B) Wywinięta żyła na mankiecie. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Anastomoza żyły wrotnej podczas operacji biorcy. (A) Wprowadzanie mankietu żylnego do żyły wrotnej biorcy. (B) Anastomoza żyły wrotnej zabezpieczona szwem. Pasek skali = 2 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Anastomoza nadwątrobna IVC podczas operacji biorcy. (A) Ściana tylna anastomozy jest kompletna. (B) Zakończona anastomoza SHIVC. Pasek skali = 2 mm. Skróty: IVC = żyła główna dolna; SHIVC = nadwątrobna IVC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Anastomoza IVC podwątrobowa podczas operacji biorcy. (A) Ściana tylna anastomozy jest kompletna. (B) Zakończona anastomoza IHIVC. Pasek skali = 2 mm. Skróty: IVC = żyła główna dolna; IHIVC = IVC podwątrobowa. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 9: Anastomoza wspólnego przewodu żółciowego podczas operacji biorcy. (A) Umieszczanie stentu przewodu żółciowego wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego biorcy. (B) Zabezpieczenie anastomozy przewodu żółciowego. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 10: Przygotowanie zwierzęcia do mikroangiografii microCT u myszy. (A) Iniekcja do ogonowej żyły myszy w celu podania kontrastu. (B) Mysz przesuwana przez urządzenie microCT. Skrót: microCT = mikrotomografia komputerowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 11: Reprezentatywne obrazy przedstawiające mikroangiografię CT w celu oceny drożności allograftu. (A,B) Kontrast jest widoczny w całej IVC, co świadczy o drożności anastomos w odcinku nad- i podwątrobowym. (C) Kontrast w żyle wrotnej, ponownie potwierdzający drożność. (D) Rekonstrukcja 3D naczyń krwionośnych. Skróty: microCT = mikrotomografia komputerowa; IVC = żyła główna dolna; PV = żyła wrotna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 12: Reprezentatywne obrazy przedstawiające nieudane anastomozy in vivo. (A) Nieudana anastomoza żyły wrotnej z powodu zniekształcenia żyły, co skutkowało brakiem przepływu krwi. (B) Nieudana anastomoza nadwątrobowego odcinka żyły głównej dolnej (sIVC) z powodu nadmiernego krwawienia. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
OLT u gryzoni został dobrze opisany w literaturze 2,8. Aby wykonać tę wymagającą technicznie procedurę, często wymagane jest kilka lat mikrochirurgii (lub chirurgii w ogóle), ponieważ wymaga to solidnego zrozumienia anatomii i umiejętności technicznych. Opracowując ten model, napotkaliśmy kilka problemów technicznych związanych z zespoleniami. Szczególnie w przypadku zespolenia PV często trudno jest ustabilizować żyłę do zespolenia. Odkryliśmy, że założenie jednego lub dwóch szwów (preferencja chirurga) pomaga w ułatwieniu zakładania mankietów. Należy zauważyć, że założenie większej liczby szwów podtrzymujących wydłuża czas operacji.
Dodatkowo SHIVC znajduje się głęboko w jamie brzusznej i trudno jest założyć na niego zacisk, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję. Odkryliśmy, że jeśli mysz jest zrelaksowana w swojej powściągliwości tak bardzo, jak to możliwe, zwiększy to elastyczność żyły. Ostatecznie to od chirurga będzie zależało, czy wraz z praktyką określi właściwe umiejscowienie. Co więcej, w przypadku zespolenia CBD, przewód jest ponownie bardzo delikatny. Założenie szwów podtrzymujących w celu ustabilizowania przewodu może być trudne, a być może umieszczenie go na małym kawałku gazy pomoże w jego stabilizacji. Wreszcie, ponieważ wszystkie małe ssaki są wyjątkowo delikatne pod względem czasu znieczulenia, ważne jest, aby wykonać operację tak szybko, jak to możliwe. Idealne czasy operacji są następujące: 1) operacja dawcy, 45-60 min; 2) przygotowanie tylnego stołu, 15 min; 3) obsługa odbiornika, 60-80 min. Praktyka pomoże w zmniejszeniu marnotrawstwa ruchu.
Wraz z postępem modeli zwierzęcych rozwinęła się również zdolność do oceny skuteczności interwencji badawczych. Mikrotomografia komputerowa została po raz pierwszy wykorzystana do prowadzenia badań nad układem naczyniowym u szczurów pod koniec lat 90. Istnieje wiele wyzwań związanych z wykonywaniem dokładnych i przejrzystych badań angiografii mikrotomografii komputerowej u gryzoni. Jednak większość wyzwań wynika z krótkich cykli serca i oddychania tych ssaków. Można temu zaradzić poprzez zastosowanie krótkich ekspozycji w celu ograniczenia artefaktów ruchu, a także wyższych współczynników fluencji fotonów18. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdziliśmy, że zastosowanie bramkowania serca, a także dostosowanie stężeń izofluranu w celu zmniejszenia częstości oddechów, dało najwyraźniejsze obrazy. Odkryliśmy również, że zastosowanie specyficznego dla gryzoni czasu kontrastu dla określonych faz: fazy tętniczej wątroby, fazy wrotno-żylnej i fazy opóźnionej również poprawiło wizualizację19. Zastosowanie kontrastu ExiTron nano 12000 ma kilka zalet i może poprawić ogólną jakość obrazu. Oferuje najsilniejsze wzmocnienie kontrastu w wątrobie20 i krwi21. Kolejną zaletą jest to, że kontrast jest obecny w wątrobie do 120 godzin po pierwszym wstrzyknięciu, co może zmniejszyć związane z tym działanie toksyczne na wątrobę, ponieważ potrzeba mniej kontrastu, jeśli wymagane są wielokrotne skany20.
Ponadto, ponieważ skany są wykonywane z myszą uspokojoną izofluranem, wzmocnienie kontrastu nie zmienia się wraz z tą zmianą fizjologii20. Dzięki zastosowaniu tych technik obrazowania i kontrastu ExiTron możliwa jest wyraźna ocena udanych zespoleń w OLT. Mikrotomografia komputerowa pozwala na nieinwazyjną ocenę alloprzeszczepów in vivo przez dłuższy czas. Protokół ten zmniejsza liczbę zwierząt, które muszą zostać uśmiercone w celu oceny zespoleń naczyniowych i daje możliwość studiowania terapii przez kilka tygodni i ich wpływu na układ naczyniowy.
Ograniczenia
Należy zauważyć, że chociaż przeprowadzono wiele zmian w modelu OLT w celu udoskonalenia jego techniki, wizualizacja zespoleń za pomocą mikrotomografii komputerowej jest nadal procesem w toku. Co więcej, mysi OLT oferuje unikalny wgląd w medycynę transplantacyjną. Nie jest to jednak model obejmujący, ponieważ trudno jest utrzymać te myszy przy życiu dłużej niż 1 tydzień. Należy również wykorzystać dodatkowe modele przeszczepów w celu dalszego uzasadnienia eksperymentów przedklinicznych.
Wnioski
W ciągu ostatniej dekady nastąpił gwałtowny postęp w dziedzinie mikrotomografii komputerowej, dostarczając naukowcom nieocenionych nowych narzędzi w dziedzinie modeli zwierzęcych i transplantacji. W przyszłości bardziej szczegółowe obrazowanie 3D zapewni dalszy wgląd w badania i odkrycia.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
SMB jest wspierane przez grant Narodowego Instytutu Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek (NIDDK) R01DK1234750. BAW jest wspierany przez National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, grant R01HL143000.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 szew jedwabny | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 szew nylonowy | AD Chirurgiczny | S-N618R13 | |
| 7-0 | AD Chirurgiczny | S-N718SP13 | |
| 8-0 | AD Chirurgiczny | XXS-N807T6 | |
| 10-0 szew nylonowy | AD Chirurgiczny | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Igła | Med Igły | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloksacyna) Tabletki antybakteryjne | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Materiały medyczne i chirurgiczne | BM-DEL1 | |
| Zacisk do żył Bulldog 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J myszy | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Mikro preparujące nożyczki sprężynowe | Sklep chirurgiczny Roboz | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Drobne kleszcze | Precyzyjne narzędzia naukowe | 11254-20 | |
| Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Kleszcze - kątowe 45° | Narzędzia do nauki | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT środek kontrastowy |
| Kleszcze | Narzędzia do nauki pięknej | 11027-12 | |
| Hemostat Halsted-Mosquito | Roboz Chirurgiczny | RS-7112 | |
| heparyna | Fresnius Lab, Jezioro Zuryskie, IL | C504701 | |
| histydyna-trypotofan-ketoglutaran | Apteka uniwersytecka | NA | |
| Izolowany pojemnik | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamina | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Narzędzia do nauki o nagodzeniu | 18055-05 | |
| Mysz Sonda temperatury doodbytnicy | WPI Inc | UCHWYT NA | |
| proste | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Rurki | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Maść okulistyczna | Dechra | NA | |
| sól fizjologiczna | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Nożyczki | Narzędzia do nauki | 14090-11 | |
| Ograniczenie małych myszy – 1" średnica wewnętrzna | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite System znieczulenia małych zwierząt | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Mikroskop chirurgiczny | Leica | M500-N z OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | Oprogramowanie do tomografii komputerowej |
| Vannas-Tubingen Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| ksylazyna | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Zacisk Yasagil | Aesculap | FT351T | |
| Zacisk Yasagil | Aesculap | FT261T | |
| Aplikator zaciskowy Yasagil | Aesculap | FT484T |
Bibliografia
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465(2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006(2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584(2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628(2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309(2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445(2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025(2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174(2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
Przedruki i uprawnienia
