Artykuł metodologiczny

Analiza białek komórek gospodarza przy użyciu kulek wzbogacających w połączeniu z ograniczonym trawieniem

DOI:

10.3791/65544

⸱

19 stycznia 2024

 ,  , 
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z produktów leczniczych (DP) i wykrywania peptydów za pomocą kulek wzbogacających proteom. Metodę demonstruje się przy użyciu wyprodukowanej we własnym zakresie substancji leczniczej (DS) opartej na przeciwciałach monoklonalnych (mAb), która jest dobrze scharakteryzowanym materiałem referencyjnym do oceny i porównywania różnych metod pod względem wydajności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka komórek gospodarza (HCP) to zanieczyszczenia, które mogą niekorzystnie wpływać na białka terapeutyczne, nawet w małych ilościach. Aby ocenić potencjalne ryzyko związane z produktami leczniczymi, opracowano metody identyfikacji pracowników służby zdrowia o niskiej liczebności. Kluczowym podejściem do opracowania czułej metody wykrywania HCP jest wzbogacenie HCP przy jednoczesnym usunięciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) przed analizą, z wykorzystaniem chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS).

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące wzbogacania białek komórek gospodarza za pomocą dostępnych na rynku kulek wzbogacających proteom. Kulki te zawierają zróżnicowaną bibliotekę ligandów heksapeptydowych o specyficznym powinowactwie do różnych białek. Protokół obejmuje również ograniczone trawienie i późniejsze wykrywanie peptydów za pomocą nano LC-MS/MS. Dzięki zastosowaniu tych technik, HCP o niskiej liczebności mogą zostać wzbogacone ponad 7000-krotnie, co skutkuje imponującą granicą wykrywalności wynoszącą zaledwie 0,002 ppm. Co istotne, protokół ten umożliwia wykrycie 850 HCP z wysokim poziomem pewności przy użyciu mAb NIST. Co więcej, został zaprojektowany tak, aby był przyjazny dla użytkownika i zawiera demonstrację wideo, która pomaga w jego wdrożeniu. Postępując zgodnie z tymi krokami, naukowcy mogą skutecznie wzbogacać i wykrywać pracowników służby zdrowia, zwiększając czułość i dokładność oceny ryzyka dla produktów leczniczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka komórek gospodarza (HCP) to zanieczyszczenia, które są uwalniane z hodowli komórkowej organizmu gospodarza i współoczyszczane z przeciwciałem monoklonalnym (mAb)1,2,3,4. Śladowe ilości HCP mogą negatywnie wpływać na jakość produktu leczniczego5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, w związku z czym pożądana jest metoda analizy HCP do wykrywania HCP na poziomach od sub-ppm do ppm.

Metody ortogonalne mogą być stosowane do wykrywania HCP w małej obfitości. Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest zwykle stosowany do ilościowego oznaczania ogółu HCP, a także może wykrywać i oznaczać ilościowo poszczególnych HCP, jeśli dostępne są odpowiednie przeciwciała16. Jednak wytwarzanie przeciwciał specyficznych dla HCP jest czasochłonne i pracochłonne. W przeciwieństwie do tego, chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) może dostarczyć wyczerpujących informacji o poszczególnych HCP w produktach leczniczych mAb i jest szeroko stosowana do identyfikacji HCP4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.

Opracowano kilka metod wykrywania HCP z LC-MS/MS, w tym ograniczone trawienie20, filtracja17, delecjonacja białka A21, immunoprecypitacja (IP) i wzbogacenie ProteoMiner (PM)18. Większość metod ma na celu zmniejszenie ilości mAb i wzbogacenie HCP przed analizą LC-MS/MS, zmniejszając w ten sposób zakres dynamiki między peptydami mAb a peptydami HCP. Protokół ten przedstawia metodę proteomicznego wzbogacania próbek, która łączy technologię ProteoMiner i ograniczone trawienie (PMLD)28. Zasada wzbogacania ProteoMiner polega na wykorzystaniu dostępnych na rynku kulek wzbogacających proteom zawierających zróżnicowaną bibliotekę kombinatorycznych ligandów peptydowych. Ligandy te specyficznie wiążą się z białkami na produktach przeciwciała-leki, umożliwiając usunięcie nadmiaru cząsteczek przy jednoczesnej koncentracji białek komórek gospodarza (HCP) o niskiej liczebności na odpowiednich ligandach powinowactwa. Z drugiej strony zasada ograniczonego trawienia polega na stosowaniu niskiego stężenia trypsyny. Stężenie to jest wystarczające do trawienia HCP o niskiej liczebności, ale niewystarczające do trawienia wszystkich produktów leczniczych opartych na przeciwciałach. Takie podejście umożliwia odzyskanie i wzbogacenie strawionych peptydów HCP z roztworu.

W porównaniu do metod filtracji, technika PMLD nie jest ograniczona rozmiarem wykrytych HCPs17. Metody delecji białka A są specyficzne dla wykrywania HCP związanych z przeciwciałami21, podczas gdy immunoprecypitacja jest ograniczona do predefiniowanych HCP z określonej linii komórkowej (takiej jak linia komórkowa jajnika chomika chińskiego), w której wygenerowano przeciwciało anty-HCP4. Natomiast PMLD może być stosowany do wykrywania HCP z dowolnych modułów leków i białek komórek gospodarza współoczyszczonych z produktami leczniczymi z różnych linii komórkowych. Dodatkowo PMLD wykazuje lepszą czułość w porównaniu z wymienionymi metodami17,18,20,21,24.

To podejście może zwiększyć stężenie HCP 7000-krotnie i obniżyć granicę wykrywalności do 0,002 ppm28. Konfiguracja eksperymentalna jest zilustrowana w Rysunek 1.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skróty użyte w protokole są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Przygotowanie roztworów i

UWAGA: Szczegóły handlowe wszystkich odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotować 0,1 M roztwór Tris-HCl, pH 8,0, dodając 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 do 9 ml wody dejonizowanej w szklanej fiolce i dobrze wymieszać przez wirowanie. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  2. Przygotować 24 mM deoksycholanu sodu (SDC), rozpuszczając 10 mg SDC w 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Przygotować 24 mM lauroilosarkozynianu sodu (SLS), rozpuszczając 7 mg SLS w 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Przygotować bufor elucyjny, mieszając 24 mM SDC i 24 mM SLS w stosunku 1:1 (v/v).
  5. Przygotuj 50 ng/μl roztworu trypsyny, dodając 400 μl wody dejonizowanej do 20 μg trypsyny.
  6. Przygotować 25 mg/ml ditiotreitolu (DTT), dodając 308 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, do 7,7 mg DTT.
  7. Przygotować 0,25 M jodoacetamidu (IAM), dodając 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl o pH 8,0 do 56 mg IAM.
  8. Przygotuj 10% TFA, dodając 1 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) do 9 ml wody dejonizowanej. Wiruj przez 4 s i rozkręć w dół. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  9. Przygotuj bufor A, dodając 1 ml 10% TFA do 99 ml wody dejonizowanej.
  10. Przygotuj bufor B, dodając 1 ml 10% TFA i 49 ml wody dejonizowanej do 50 ml acetonitrylu (ACN).
  11. Przygotować 10 mM buforu histydyny, dodając 37 mg L-histydyny i 54,8 mg monochlorowodorku L-histydyny jednowodnej do 50 ml wody.

2. Przygotowanie roztworów przeciwciał monoklonalnych (mAb)

  1. W przypadku produktów leczniczych o stężeniach powyżej 50 mg/ml należy rozcieńczyć 15 mg przeciwciała monoklonalnego (mAb) (patrz tabela materiałów) wodą dejonizowaną w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, uzyskując całkowitą objętość 300 μl i końcowe pH ~6. W razie potrzeby dostosuj pH za pomocą kwasu octowego lub Tris-HCl.
  2. W przypadku produktów leczniczych o stężeniach poniżej 50 mg/ml należy przeprowadzić wymianę buforu zgodnie z krokami od 2.2.1 do 2.2.5.
    1. Przenieść 20 mg każdej próbki do 10-odśrodkowego urządzenia filtrującego (patrz tabela materiałów) i odwirować przy 14 000 x g przez 25 minut (w temperaturze pokojowej, RT), aż pozostanie około 100 μl objętości.
    2. Dodać 350 μl 10 mM histydyny (patrz tabela materiałów), buforu o pH 6,0 do filtra, wirować i wirować przy 14 000 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
    3. Odwrócić filtr i umieścić go w probówce do pobierania próbek, a następnie odwirować próbki o sile 1000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby odzyskać całą objętość w probówce zbiorczej. Umyj filtr 200 μl 10 mM buforu histydyny i pipetuj w górę iw dół, aby odzyskać pozostałe próbki białka. Przenieś cały roztwór do tej samej probówki zbiorczej, odwiruj i odwiruj.
    4. Zmierz stężenie próbki za pomocą NanoDrop. Dostosować stężenie każdej próbki białka do 50 mg/ml, dodając bufor histydyny przed inkubacją z kulkami wzbogacającymi.
    5. Przenieść 300 μl próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.

3. Przygotowanie koralików wzbogacających proteom

  1. Zdejmij górną i dolną nasadkę z każdej kolumny wirowej uzyskanej z dostępnego w handlu zestawu do wzbogacania białek (patrz Tabela materiałów). Nie wyrzucaj nakrętek, ponieważ będą one używane później.
  2. Weź kolumnę wirową i umieść ją w probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml bez nakrętki. Odwirować zestaw w temperaturze pokojowej i 1,000 x g przez 30-60 s w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania roztworu do przechowywania. Wyrzuć materiał zebrany na tym etapie.
  3. Dodać 200 μl buforu do dostępnych w handlu kulek wzbogacających (patrz tabela materiałów) i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół. Umieść kolumnę wirową w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wiruj przy 1,000 x g przez 30-60 s w temperaturze pokojowej w celu usunięcia buforu. Wyrzuć zebrany materiał.
    UWAGA: Bufor do płukania znajduje się w dostępnym w handlu zestawie do wzbogacania białek.
  4. Powtórz kroki 3.3 dwa razy.
  5. Załóż dolną nakrętkę i dodaj 200 μl wody, a następnie załóż górną nakrętkę.

4. Wzbogacanie białek

  1. Pipetować w górę i w dół zawiesiny (od kroku 3.5) i przenieść 40 μl gnojowicy do próbki przygotowanej w kroku 2. Inkubować i obracać probówkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Za pomocą igły 16 G należy wykonać końcówkę z frytką (patrz tabela materiałów), aby uzyskać odpowiedni rozmiar frytki, a następnie włożyć ją do końcówki końcówki o pojemności 200 μl.
  3. Przenieś próbkę z koralikami na końcówkę przygotowaną w kroku 4.2. Odwirować końcówkę z probówką do mikrowirówek o pojemności 2 ml o pojemności 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia roztworu.
  4. Przemyć kulki, dodając 200 μl buforu płuczącego do końcówki i odwirować końcówkę za pomocą probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml o stężeniu 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia roztworu myjącego. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  5. Umyj kulki, dodając 200 μl wody do końcówki i odwiruj końcówkę za pomocą probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml o sile 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu usunięcia wody.
  6. Eluować białka z kulek, dodając 10 μl buforu elucyjnego (krok 1.4) do końcówki i odpipetować zawiesinę dziesięć razy do końcówki, aby upewnić się, że kulki są nasączone buforem elucyjnym.
  7. Odwirować końcówkę za pomocą nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml o sile 200 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej w celu zebrania eluentu. Powtórzyć kroki 4.6-4.7 dwa razy i połączyć całą elucję w jednej probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  8. Dodać 1,5 μl roztworu trypsyny (krok 1.5) do eluentu do nocnego trawienia w temperaturze 28 °C. Dodać 1,5 μl 25 mg/ml DTT (krok 1.6) i podgrzewać próbkę w temperaturze 90 °C przez 20 min.
  9. Dodaj 1,5 μl 0,25 M IAM (krok 1.7) i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut. Dodaj 3,5 μl 10% TFA (krok 1.8), wiruj przez 2 minuty i upewnij się, że pH wynosi ~2-3.
  10. Wirować przy 14 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia SDC i SLS. Zebrać supernatant do odsalania.
  11. Wykonaj odsalanie, wykonując poniższe czynności.
    1. Dodać 50 μl buforu B (krok 1.10) do końcówki odsalania GC (patrz Tabela materiałów). Odwirować końcówkę z uchwytem o stężeniu 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć zebrany materiał.
    2. Dodaj 50 μl buforu A (krok 1.9) do końcówki. Odwirować końcówkę z uchwytem o stężeniu 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć zebrany materiał.
    3. Dodaj zakwaszoną próbkę do końcówki. Odwirować końcówkę z uchwytem o pojemności 500 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Zebrany materiał należy wyrzucić.
    4. Umyj końcówkę, dodając do niej 50 μl buforu A. Odwirować końcówkę z uchwytem o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć zebrany materiał. Powtórz raz.
    5. Eluować peptyd z końcówki, dodając 50 μl buforu B do końcówki odsalającej GC. Odwirować końcówkę z nową probówką o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać materiał. Powtórz krok raz i połącz eluent.
    6. Wysuszyć eluent za pomocą koncentratora próżniowego (patrz Tabela materiałów).
  12. Zawiesić wysuszony eluent w 30 μl 0,1% roztworu kwasu mrówkowego (FA).
  13. Zmierzyć promieniowanie UV mieszanin peptydów przy długości fali 214 nm za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów). Stężenie mieszanin peptydowych powinno wynosić od 0,1 do 0,5 mg/ml.
  14. Przenieść 10 μl każdej strawionej próbki do fiolki z próbką LC, a następnie wstrzyknąć 1 μg każdej strawionej próbki do nano LC-MS/MS (patrz tabela materiałów). Wykonaj analizę zgodnie z krokiem 5. Resztę strawionych próbek należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

5. Analiza Nano LC-MS/MS

  1. Wstrzyknąć mieszaninę peptydów do systemu nano-LC sprzężonego ze spektrometrem masowym. Załadować mieszaniny peptydów (~1 μg) do kolumny pułapki C18 o gradiencie podanym w tabeli 1A w celu odsalania, a następnie do kolumny analitycznej C18 w temperaturze 40 °C w celu separacji.
    UWAGA: Ruchomy bufor fazy A składał się z 0,1% FA w ultraczystej wodzie, a mobilny bufor fazy B składał się z 0,1% FA w 80% ACN.
  2. Oddzielić peptydy i wymyć z gradientem podanym w tabeli 1B przy natężeniu przepływu 250 nL/min.
    UWAGA: Spektrometr masowy pracował w trybie zależnym od danych (DDA) z czasem cyklu 3 s. Jony uległy fragmentacji poprzez dysocjację kolizyjną o wyższej energii (HCD) ze znormalizowaną energią zderzenia wynoszącą 30% dla każdego pełnego skanu MS. Skany zostały wykonane w rozdzielczości 60 000, z celem automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 3e6, maksymalnym czasem wstrzykiwania 20 ms i zakresem m/z 380-1600. Zdarzenia MS/MS przeprowadzono z rozdzielczością 15 000, z celem AGC 1e5, maksymalnym czasem wstrzyknięcia 60 ms i zakresem m/z 200-2000. Czas trwania wykluczenia został ustawiony na 45 s. Właściwości źródła jonów podano w tabeli 1C, a konkretne parametry spektrometrii mas można znaleźć w tabeli 2A-F.

6. Analiza danych

  1. Przeszukaj surowe pliki spektrometrii mas NISTmAb w bazie danych UniProt mus+musculus29. Dodatkowo wyszukaj surowe pliki spektrometrii mas mAb DS z dodatkiem rekombinowanego białka w bazie danych UniProt Cricetulus Griseus30.
    UWAGA: Wyszukiwania te zostały przeprowadzone w oprogramowaniu Proteome Discoverer (patrz Spis materiałów) przy użyciu wyszukiwarek Sequest HT i Mascot. Wykorzystywane bazy danych były wolne od zbędnych wpisów.
  2. W przypadku wyszukiwania spektrometrii mas należy zastosować tolerancję masy 10 ppm i ustawić tolerancję masy fragmentu na 0,02 Da.
    UWAGA: Kryteria wyszukiwania obejmowały statyczną karbamidometylację reszt cysteiny (+57,0214 Da) i zmienną modyfikację utleniania (+15,9949 Da) na resztach metioniny. Dodatkowo zastosowano zmienną modyfikację deaminacji (+0,984 Da).
  3. Przeszukaj bazę danych za pomocą trawienia trypsyny, pozwalając na maksymalnie dwa pominięte rozszczepienia. Ustaw współczynniki fałszywych wykryć zarówno dla białek, jak i peptydów na 0,01,
    UWAGA: Aby pozytywnie zidentyfikować białka komórek gospodarza (HCP), zastosowano minimalne wymaganie co najmniej dwóch unikalnych peptydów. Tabela 3 zawiera reprezentatywne podsumowanie zidentyfikowanych HCP związanych z mAb NIST analizowanych przez oprogramowanie Proteome Discoverer.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawiał proces przygotowania próbki, określany jako wzbogacanie białek w połączeniu z ograniczonym trawieniem (PMLD), do analizy białek komórek gospodarza (HCP) w próbce przeciwciała monoklonalnego (mAb). Rysunek 1 ilustruje procedurę PMLD krok po kroku. Naukowcy porównali wyniki analizy HCP przy użyciu bezpośredniego trawienia (pokazanego w górnym panelu Rysunek 2) i PMLD (pokazanego w dolnym panelu Rysunek 2). Profile chromatogramu jonów całkowitych (TIC) wykazały, że PMLD znacząco zmniejszył lub wyeliminował główne peptydy mAb, umożliwiając jednocześnie obserwację niektórych peptydów HCP porównywalnych z peptydami mAb. Podano szczegółowe parametry dla analiz nano LC (tabela 1) i MS/MS (tabela 2). Ponadto w tabeli 3 przedstawiono podsumowanie zidentyfikowanych HCP związanych z mAb NIST, w tym informacje takie jak numer dostępu, nazwa HCP, gatunek, procent pokrycia, PSM, unikalne peptydy, masa cząsteczkowa, oczekiwany punkt izoelektryczny (pI), wynik maskotki, wynik Sequest HT oraz liczba peptydów zidentyfikowanych przez Mascot i Sequest HT.

figure-results-1
Rysunek 1: Proces przygotowania próbki wzbogacania białka w połączeniu z ograniczonym trawieniem (PMLD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Profil całkowitego chromatogramu jonowego (TIC) do analizy HCP mAb NIST. Górny panel: Profil TIC do analizy HCP mAb NIST przy użyciu bezpośredniego trawienia. Dolny panel: Profil TIC do analizy mAb NIST przez HCP przy użyciu PMLD. Z profilu TIC jasno wynika, że w porównaniu z trawieniem bezpośrednim, większość głównych peptydów mAb została zmniejszona lub wyeliminowana po PMLD, podczas gdy niektóre peptydy należące do HCP można zaobserwować i są one porównywalne z peptydami mAb. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Parametry dla nano LC. (A) Gradient pompy obciążeniowej. (B) Gradient pompy NC. (C) Właściwości źródła jonów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Parametry dla MS/MS. (A) Właściwości pełnego skanowania. (B) Właściwości MIPS. (C) Właściwości intensywności. (D) Właściwości stanu ładowania. (E) Wykluczenie dynamiczne. (F) Właściwości skanowania MS2 zależne od danych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Reprezentatywna tabela podsumowująca zidentyfikowanych HCP związanych z mAb NIST analizowana przez oprogramowanie Proteome Discoverer. Tabela zawiera takie informacje, jak numer dostępu, nazwa HCP, gatunek, procent pokrycia, liczba dopasowań widma peptydów (PSM), liczba unikalnych peptydów, masa cząsteczkowa, oczekiwany punkt izoelektryczny (pI), wynik maskotki, wynik Sequest HT oraz liczba peptydów zidentyfikowanych przez Mascot i Sequest HT. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Lista używanych skrótów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieją dwie wersje dostępnych na rynku kulek wzbogacających białka: jedna o mniejszej pojemności, a druga o większej pojemności (patrz Tabela materiałów). Obie wersje koralików wzbogacających zawierają w opakowaniu dziesięć preparatów. Z instrukcji producenta wynika, że każdy preparat z zestawu o małej pojemności może być wykorzystany do wzbogacenia 10 mg białka ogółem. Jednakże, aby zapewnić optymalną wydajność wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z DS, każdy preparat jest dobry dla pięciu próbek DS. Dlatego każdy zestaw może być używany do wzbogacania HCP z pięćdziesięciu próbek. Dla każdego preparatu z zestawu o dużej pojemności dobrze nadaje się do wzbogacenia HCP z dwudziestu pięciu próbek DS, co pozwala na wykrycie HCP z łącznie dwustu pięćdziesięciu próbek.

Krok 3.1 odradza wyrzucanie górnych lub dolnych zaślepek, ponieważ będą one ponownie używane w całym protokole. Jeśli koraliki osiądą w górnej nasadce, wymień je po wyjęciu dolnego korka i odwirowaniu, trzymając górną nasadkę na kolumnie. Aby wykorzystać dolną nasadkę jako zatyczkę, odwróć ją i bezpiecznie umieść na dole kolumny wirującej.

Krytycznym krokiem w procedurze jest krok 4.1, w którym zawiesina perełki osadza się na dnie rury. Dlatego tak ważne jest utrzymanie ciągłego pipetowania w górę i w dół podczas przenoszenia zawiesiny do próbek przeciwciał monoklonalnych (mAb). Kolejnym krytycznym krokiem jest krok 4.6, w którym konieczne jest dziesięciokrotne pipetowanie gnojowicy w końcówce, podczas gdy kulki są nasycone buforem elucyjnym. Czas wirowania w krokach 4.3-4.5, 4.7 i 4.10 może się różnić w zależności od ilości nagromadzonych białek komórek gospodarza (HCP). Dlatego ważne jest, aby sprawdzić i upewnić się, że płyny w końcówce zostały prawidłowo odwirowane przed przejściem do następnego kroku. Ponownie, zaczynając od początkowej ilości 15 mg produktu leczniczego, można wymyć około 30 μg przeciwciała i wzbogaconych białek komórek gospodarza (HCP). Aby osiągnąć stosunek białka do enzymu 400:1 dla ograniczonego trawienia, dodano 75 ng trypsyny. W przypadku użycia mniejszej ilości materiału wejściowego konieczne jest zmierzenie stężenia eluowanej próbki białka. Ten pomiar pomaga dostosować odpowiednią ilość trypsyny, którą należy dodać. Krok 4.9 pokazuje biały osad po dodaniu 10% TFA. Aby zapobiec wszelkim zakłóceniom sygnału MS ze strony środków powierzchniowo czynnych, ważne jest, aby sprawdzić pH po dodaniu kwasu trifluorooctowego (TFA), aby zapewnić całkowite usunięcie detergentu z supernatantu.

Po wysuszeniu i ponownym zawieszeniu eluentu w wodzie konieczne jest wykonanie pomiaru UV mieszaniny peptydów. Pomiar ten ma kluczowe znaczenie, ponieważ ilość peptydów załadowanych do kolumny może wpływać na wykrywanie za pomocą MS. Po ocenie stwierdzono, że około 1 μg mieszaniny peptydów wykazywało najlepszą skuteczność w SM. W związku z tym ta optymalna ilość musi zostać wstrzyknięta do nano LC-MS/MS w celu dalszej analizy.

Podejście PMLD oferuje kilka korzyści w przygotowaniu próbek, w tym wystarczającą redukcję DS przeciwciał monoklonalnych (mAb) przy jednoczesnym zachowaniu większości białek komórek gospodarza (HCP) o niskiej liczebności. W przeciwieństwie do immunoprecypitacji (IP), technika ta nie opiera się na przeciwciałach anty-HCP, eliminując w ten sposób stronniczość związaną z predefiniowanymi przeciwciałami oraz skracając pracę i czas wymagany do wytworzenia przeciwciał anty-HCP. Ponadto, w przeciwieństwie do metod filtracji opartych na odcięciu masy cząsteczkowej17, PMLD wzbogaca pracowników służby zdrowia niezależnie od ich wielkości. Może być stosowany do wzbogacania HCP z różnych modułów leków, takich jak przeciwciała, białka fuzyjne, ScFv i inne, co czyni go wszechstronnym podejściem w porównaniu z metodami delecji białka A21.

Oprócz tych zalet, PMLD wykazuje niższą granicę wykrywalności i umożliwia wykrycie większej liczby HCP z NISTmAb, powszechnie scharakteryzowanego wzorca referencyjnego, w porównaniu z innymi metodami. Warto jednak zauważyć, że PMLD wymaga sprzętu domowej roboty, co ogranicza jego zastosowanie do automatyzacji. Aby zwiększyć jego użyteczność, możliwa jest wymiana niektórych urządzeń, takich jak końcówka na frytę, na dostępne na rynku alternatywy. Dodatkowo, przeprowadzanie odsalania na płytkach 96-dołkowych może umożliwić wyższą przepustowość przy użyciu tego podejścia. Zbadanie automatyzacji lub półautomatyzacji w przyszłych eksperymentach może być logicznym kolejnym krokiem w kierunku rozszerzenia szerszego zastosowania PMLD.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16 G, Metalowa igła piasty, 2 cale, styl punktowy 3Hamilton91016
Acclaim Kolumna pułapki PepMap 100 C18 (20 cm i razy 0,075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrylFisher-ScientificA955
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0,5 Filtr odśrodkowyKolumna analityczna Millipore SigmaUFC5010
C18 (0,075 mm i razy 1,7 μ m i razy; 30 cm, 100 & Aring ;)HEB07503001718ICoAnn Technologies
5424Eppendorf5405000646
Ditiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit do kartridży SPE, 9,5 mm, 3 mL, 100/opkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc   7820-11201
Własne stężenie mAbRegeneron200 mg / ml
Jodoacetamid (30 x 9,3 mg)Thermo FisherA39271
IzopropanolFisher-Scientific149320025
L-histydynaSigma AldrichH6034
Monochlorowodorek L-histydyny monohydratSigma Aldrich53370
MetanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Białko LoBind w tubce 0,5 mlEppendorf (VWR)22431064
Białko LoBind w tubce 2,0 mlEppendorf (VWR)22431102
Odkrywca proteomu Oprogramowanie 2.4Thermo Scientific
Zestaw do wzbogacania białek ProteoMiner o dużej pojemnościBio-Rad1633007
Zestaw do wzbogacania białek ProteoMiner o małej pojemnościBio-Rad1633006
Deoksycholan sodu (SDC)Sigma AldrichD6750
Lauroilosarkozynian sodu (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Kwas trifluorooctowy (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsyna (zmodyfikowana klasa sekwencjonowania)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Rewolwer rurowy RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8,0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa Optima LC/MS Fisher-ScientificLS118-4 
Wirówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811(2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128(2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972(2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka kom rek gospodarzakuleczki do wzbogacania bia ekprzeciwcia o monoklonalneanaliza LC MStechnologia ProteoMinernano LC MS MSdetekcja peptyd wusuwanie bia ekzanieczyszczenia produktu leczniczego

Powiązane artykuły