Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ dla długiej lokalizacji niekodującego RNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka

DOI:

10.3791/65545

⸱

16 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA w celu lokalizacji lncRNA w ludzkich komórkach kostniakomięsaka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbadano ważne role długich niekodujących RNA (lncRNA) w raku, takie jak regulacja proliferacji, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), migracja, infiltracja i autofagia komórek nowotworowych. Wykrywanie lokalizacji lncRNA w komórkach może zapewnić wgląd w ich funkcje. Projektując specyficzną dla lncRNA sekwencję łańcucha antysensownego, a następnie znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi, można zastosować fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (FISH) do wykrywania lokalizacji komórkowej lncRNA. Wraz z rozwojem mikroskopii, techniki RNA FISH pozwalają obecnie nawet na wizualizację słabo eksprymowanych lncRNA. Ta metoda może nie tylko wykryć lokalizację samych lncRNA, ale także wykryć kolokalizację innych RNA, DNA lub białek za pomocą dwukolorowej lub wielokolorowej immunofluorescencji. W tym miejscu zamieściliśmy szczegółową eksperymentalną procedurę operacyjną i środki ostrożności RNA FISH przy użyciu lncRNA small nucleolar RNA host gen 6 (SNHG6) w ludzkich komórkach kostniakomięsaka (143B) jako przykład, aby zapewnić odniesienie dla badaczy, którzy chcą przeprowadzić eksperymenty RNA FISH, zwłaszcza lncRNA FISH.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze zrozumienie ludzkiego genomu znacznie się poszerzyło dzięki niedawnym postępom w technologii całego genomu. Około 93% ludzkiego genomu można transkrybować na RNA, ale tylko 2% RNA może zostać przetłumaczone na białka; pozostałe 98% RNA, które nie mają funkcji translacji białek, nazywa się niekodującymi RNA (ncRNA)1. Jako klasa niekodujących RNA (ncRNA), długie ncRNA (lncRNA), zawierające ponad 200 nukleotydów2, przyciągają coraz większą uwagę ze względu na ich udział w wielu fizjologicznych i patologicznych procesach komórek, takich jak różnicowanie, kontrola cyklu, apoptoza, migracja i inwazja3,4,5. LncRNA odgrywają swoją rolę poprzez różne mechanizmy, takie jak regulacja struktury chromatyny i ekspresji genów jądrowych, kontrolowanie procesu splicingu mRNA i modyfikacja potranskrypcyjna6. LncRNA regulują występowanie, rozwój i przerzuty nowotworów złośliwych zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym. Regulacja transkrypcji jest realizowana w jądrze poprzez wpływ na transkrypcję RNA poprzez wiązanie się ze strukturami chromosomalnymi, podczas gdy regulacja potranskrypcyjna jest realizowana w cytoplazmie poprzez kontrolowanie docelowych genów za pomocą endogennego konkurencyjnego mechanizmu RNA (ceRNA) 5, 7, 8. CeRNA ujawniło nowy mechanizm interakcji RNA, a mianowicie, że lncRNA mogą działać jak gąbka do adsorpcji miRNA i hamowania degradacji powiązanych genów docelowych za pośrednictwem miRNA9. Dlatego informacje dotyczące subkomórkowej lokalizacji lncRNA, niezależnie od tego, czy określony lncRNA znajduje się w cytoplazmie, czy w jądrze, są ważne, aby pomóc w identyfikacji ich funkcji biologicznych.

Obecnie lokalizacja lncRNA jest głównie wykrywana za pomocą dwóch metod, jedna to test izolacji frakcji jądra/cytoplazmy, a druga to test RNA FISH. W pierwszym przypadku RNA we frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej są ekstrahowane odpowiednio, a następnie amplifikacja PCR jest wykonywana za pomocą specyficznych starterów lncRNA w celu wykrycia stosunku lncRNA w cytoplazmie i jądrze. Zaletą tej metody jest efektywność czasowa, natomiast wadą jest to, że rzeczywista lokalizacja lncRNA nie jest bezpośrednio odzwierciedlona przez względną proporcję lncRNA w cytoplazmie i jądrze. RNA FISH może wykrywać lokalizację lncRNA w komórkach poprzez projektowanie specyficznych dla lncRNA sekwencji łańcuchów antysensownych, a następnie znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi10. Metody RNA FISH zostały ulepszone dzięki postępom w technikach sondowania i metodach wykrywania, w tym znakowanych fluoroforem zestawów wielu sond oligologicznych11, LNA probes12 i sondy rozgałęzionego DNA (bDNA)13. RNA FISH może nie tylko wykrywać lokalizację lncRNA, ale także wykrywać kolokalizację innych RNA, DNA lub białek za pomocą dwukolorowej lub wielokolorowej immunofluorescencji14.

W tej pracy dołączyliśmy jako przykład szczegółowy protokół wykrywania lokalizacji wewnątrzkomórkowej genu gospodarza lncRNA małego jąderkowego RNA 6 (SNHG6) w komórkach kostniakomięsaka (143B) przez RNA FISH. SNHG6 to lncRNA nukleotydu 600-730 w swojej dojrzałej postaci splicingowej i zidentyfikowany jako nowy onkogen w różnych nowotworach u ludzi, w tym raku jelita grubego, raku żołądka, raku jasnokomórkowym jajnika, kostniakomięsaku i raku wątrobowokomórkowego15,16,17,18. Badania potwierdziły udział SNHG6 w zachowaniach biologicznych komórek nowotworowych, takich jak proliferacja, EMT i autofagia, oraz wykazały cytoplazmatyczną lokalizację SNHG6 w miejscu, w którym może wpływać na geny docelowe poprzez wiązanie (gąbczaste) miRNAs15,16,17. Ten szczegółowy protokół wykrywania wewnątrzkomórkowej lokalizacji SNHG6 przez RNA FISH jest przedstawiony w niniejszym dokumencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów używanych w tym protokole. Rysunek 1 pokazuje ogólny protokół dla RNA FISH; Tabela 1 zawiera skład wszystkich roztworów, a tabela 2 zawiera sekwencje starterów stosowane w tym protokole.

1. Przygotowanie sondy

  1. Zidentyfikuj i uzyskaj sekwencję FASTA docelowego lncRNA będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład z GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Postępując zgodnie ze wskazówkami na stronie internetowej, zaprojektuj sondy ISH online19 i zapoznaj się z sugestiami algorytmu projektowego, aby wyświetlić listę sond, które należy zamówić z etykietą Cy3.
  2. Inkubować bufor do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez 2 godziny wcześniej.
  3. Rozpuścić sondę o 4 gęstościach optycznych (OD) w 160 μl ddH2O nasączony dietylowęglanem (DEPC) w stężeniu 1 mg/ml z dala od światła.
    UWAGA: Gęstość optyczna (OD) reprezentuje jednostkę miary DNA i RNA. Zwykle 1 jednostka OD = 33 μg/ml DNA.
  4. Przygotuj 200 μl mieszaniny sondy dla każdej studzienki (1,2 μl-10 μl sondy, 70 μl buforu hybrydyzacyjnego, uzupełnij objętość ddH2O poddanych działaniu DEPC do 200 μl) i ustaw serię 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml i 6 μg/mL.
    UWAGA: Stężenie sondy musi być wcześniej zbadane eksperymentalnie. Wysokie stężenie w sondzie doprowadzi do niespecyficznego wiązania lncRNA, podczas gdy niskie stężenie w sondzie doprowadzi do niewrażliwego lub nieudanego wykrycia lncRNA.
  5. Denaturacja mieszanki sondy w temperaturze 73 °C przez 5 minut
    UWAGA: Jeśli sonda DNA znakowana Cy3 jest dwuniciowa, denaturuj sondę do jednoniciowego DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie szybko schładzaj przez 2 minuty na lodzie.

2. Przygotowanie komórek

  1. Wysiewać 50 000 komórek 143B na basenie na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowych i inkubować je przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2) w DMEM.
    UWAGA: Konkretna liczba komórek zasianych w tym miejscu różni się w zależności od wielkości komórki, co jest odpowiednie dla komórek zasianych, aby osiągnąć konfluencję 50% po inkubacji przez 24 godziny. Szkiełka nakrywkowe ze sterylnego szkła są okrągłe, aby pasowały do płytki 12-dołkowej.
  2. Usunąć pożywkę i płukać przez 2 x 5 minut 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    UWAGA: Przygotuj 1x PBS z ddH2O. PBS bez leczenia DEPC nie może być używany, ponieważ zawiera RNazę. Wykonaj wszystkie poniższe kroki w warunkach wolnych od RNaz.
  3. Usuń 1x PBS i dodaj 200 μl 100% etanolu do każdej studzienki, aby utrwalić przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć etanol, dodać 200 μl 0,1% Triton X-100 (w 1x PBS) do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Czas musi być ściśle kontrolowany za pomocą przepuszczalności Triton X-100 i nie może być zbyt długi.
  5. Usunąć 0,1% Triton X-100 i umyć 2 x 5 min 1x PBS.
    UWAGA: Jeśli protokół musi zostać wstrzymany w tym miejscu, należy zastąpić PBS 70% etanolem (rozcieńczenie 100% etanolu z ddH2O bez RNaz) i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  6. Usunąć 1x PBS, dodać 200 μl 2x buforu cytrynianu soli sodowej (SSC) (rozcieńczenie 20x SSC z ddH2O, wolnym od RNaz) do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Usuń 2x bufor SSC, dodaj 200 μl 70% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić 70% etanol, dodać 200 μl 85% etanolu (rozcieńczenie 100% etanolu z wolnym od RNaz ddH2O) do każdego dołka i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Wyrzuć 85% etanol, dodaj 200 μl 100% etanolu do każdej studzienki i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  10. Wchłonąć i wyrzucić 100% etanol; pozostawić studzienki do wyschnięcia.

3. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

  1. Dodać 200 μl mieszaniny sondy (denaturowanej jak w kroku 1.5) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (16-18 godzin).
    UWAGA: Istnieje silna dodatnia korelacja między temperaturą hybrydyzacji a stężeniem sondy; Dlatego, aby zoptymalizować tło, należy zmniejszyć zarówno temperaturę hybrydyzacji, jak i stężenie sondy.
  2. Następnego dnia należy pobrać próbki o temperaturze 37 °C i wyrzucić mieszaninę sondy. Dodać 200 μl 0,4x SSC/0,3% buforu Tween-20 do każdej studzienki (podgrzanej do 65 °C) i myć przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń 0,4x bufor SSC/0,3% Tween-20, dodaj 200 μl 2x buforu SSC/0,1% Tween-20 do każdej studzienki i myj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń 2x bufor SSC/0,1% Tween-20, dodaj 200 μl roztworu barwiącego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) (1 μg/ml) i barwić przez 20 minut z dala od światła.
  5. Wyrzuć roztwór barwnika DAPI i myj 1x PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 50 μl podłoża mocującego zawierającego gumę na szkiełko podstawowe i umieścić szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku w celu zamocowania.
    UWAGA: Pamiętaj, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku stroną z komórką do dołu.
  7. Obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Użyj mikroskopu fluorescencyjnego lub laserowego mikroskopu konfokalnego; Ten ostatni zapewnia wyższą czułość i klarowność obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano reprezentatywne obrazy SNHG6 FISH w ludzkich komórkach kostniakomięsaka (Rysunek 2). Kontrola ujemna jest traktowana ujemną sondą Ctrl; Kontrola pozytywna jest traktowana za pomocą sondy U6 20. Sonda SNHG6 i sonda U6 są oznaczone Cy3, który emituje czerwoną fluorescencję. DAPI to barwnik, który barwi DNA, który emituje niebieską fluorescencję. Wynik ten pokazuje, że SNHG6 jest głównie zlokalizowany w cytoplazmie, a informacje te mogą stanowić ważny kierunek dla dalszyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół RNA FISH może nie tylko wykrywać lokalizację lncRNA w komórkach, ale także wykrywać kolokalizację innych RNA, DNA lub białek w komórkach, co można również wykorzystać do wykrywania lokalizacji lncRNA w tkankach osadzonych w parafinie. Jednak konkretny protokół w takich przypadkach jest inny, ponieważ tkanki zatopione w parafinie muszą zostać odparafinowane21. Ta eksperymentalna procedura może być stosowana na płytkach 48- lub 96-dołkowych, ale płytki 384-dołkowe są zbyt małe, aby możn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty z (1) Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2020YFE0201600); (2) Narodowa Fundacja Nauk o Przyrodzie (81973877 i 82174408); (3) Szanghajskie Centrum Innowacji Współpracy w zakresie Transformacji Przemysłowej Przygotowania TCM Szpitala; (4) Projekty badawcze w ramach budżetu Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (2021LK047).

    

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny licznik komórekShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Liczenie komórek
Płytka do hodowli komórkowych-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513,corningUmieść szkiełka nakrywkowe w talerzu
  Linia komórkowa (143B)Bank komórek Chińskiej Akademii NaukCRL-8303linia komórkowa raka kostniakomięsaka
Probówka wirówkowa (15 mL, 50 ml)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningWirówka komórek
Szkiełka nakrywkoweShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026Komórki są wysiewane na szkiełkach nakrywkowych
Cy3 etykieta Sonda DNA SNHG6Shanghai GenePharma Co., LtdA10005Wykryj lokalizację SNHG6
Pożywka DMEMShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Pożywka do hodowli komórkowych
Inkubatordo suchej kąpieliHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.DKT200-2 Inkubacja w różnych wysokich temperaturach
Etanol 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218odwodnienie
Mikroskop fluorescencyjnyShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 wyposażony w kamerę Olympus U-TV0.5XC-3 (SN: 5J01719),obserwacji i pozycjonowania
Olympus Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051Próbki inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Medium montażoweSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełka
wytrząsarkowegoHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.TS-8S Próbkado mycia
SzkiełkoShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105Szkiełka nakrywkowe umieszcza się na szkiełku
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198Membrana przepuszczalna i membrana jądrowa
  Trypsyna (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, Gibcoleczenie komórek trypsyną
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560detergent
inkubator do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82(2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA FISHd ugie niekoduj ce RNAlokalizacja lncRNAdetekcja SNHG6hybrydyzacja fluorescencyjnalokalizacja cytoplazmatycznabarwienie DAPIznakowanie sondyhodowla kom rkowa

Powiązane artykuły