RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera protokół do oznaczania ilościowego białek przy użyciu testu Bradforda i smartfona jako urządzenia analitycznego. Poziomy białka w próbkach można określić ilościowo za pomocą danych o kolorach uzyskanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

Streszczenie

Oznaczanie ilościowe białka jest podstawową procedurą w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych. Wśród kilku innych metod, test Bradforda jest jednym z najczęściej stosowanych. Ze względu na jego powszechność, ograniczenia i zalety testu Bradforda zostały wyczerpująco opisane, w tym kilka modyfikacji oryginalnej metody w celu poprawy jej wydajności. Jedną ze zmian w oryginalnej metodzie jest wykorzystanie aparatu w smartfonie jako instrumentu analitycznego. Wykorzystując trzy formy barwnika Coomassie Brilliant Blue, które występują w warunkach testu Bradforda, w artykule opisano, jak dokładnie określić ilościowo białko w próbkach przy użyciu danych o barwie wyekstrahowanych z pojedynczego obrazu mikropłytki. Po wykonaniu testu na mikropłytce, zdjęcie jest wykonywane za pomocą aparatu w smartfonie, a dane kolorów RGB są ekstrahowane z obrazu za pomocą bezpłatnej aplikacji do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Następnie stosunek intensywności koloru niebieskiego do zielonego (w skali RGB) próbek o nieznanych stężeniach białka jest wykorzystywany do obliczenia zawartości białka w oparciu o krzywą standardową. Nie obserwuje się znaczącej różnicy między wartościami obliczonymi przy użyciu danych kolorów RGB a tymi obliczonymi przy użyciu konwencjonalnych danych absorbancji.

Wprowadzenie

Niezależnie od dalszego zastosowania (np. ELISA, kinetyka enzymów, western blotting, oczyszczanie białek i spektrometria mas), kwantyfikacja białek jest kluczowa dla dokładnej analizy w laboratoriach nauk przyrodniczych. Oprócz ich wykorzystania jako odczytów wtórnych (tj. do obliczania względnych poziomów analitów na masę białka), poziomy białka w próbce mogą być również pożądanym wynikiem samym w sobie. Na przykład, można być zainteresowanym poziomem białka w zasobach żywności¹ lub w urine². Dostępnych jest wiele metod pomiaru stężenia białka w próbkach³, w tym bezpośrednie odczyty absorbancji UV⁴, chelatacja białkowo-miedziana^5,6, testy kolorymetryczne wiążące białko-barwnik⁷, oraz testy fluorescencyjne wiążące białko-barwnik⁸. O znaczeniu ilościowego oznaczania białek świadczy obecność dwóch prac opisujących metody pomiaru białek^5,7 w pierwszej trójce najczęściej cytowanej literatury^9,10. Pomimo faktu, że wielu autorów zaniedbuje swoje rzeczywiste cytowanie, cytując odniesienia inne niż pierwotne lub nie cytując niczego, oryginalne prace opisujące test białka Lowry'ego i test białka Bradforda mają po >200 000 cytowań każdy¹⁰.

Popularność testu Bradforda wynika z jego przystępnej ceny, prostoty, szybkości i czułości. Test opiera się na interakcji między białkami a barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G w warunkach kwaśnych. W warunkach testu (tj. niskie pH) barwnik występuje w trzech postaciach: czerwonej formie kationowej z λmax przy 470 nm; zielona forma neutralna z λmax przy 650 nm; oraz niebieska forma anionowa z λmax przy 590 nm^11,12 (Rysunek 1). Forma kationowa dominuje przy braku białek. Gdy białka oddziałują z barwnikiem, stabilizują niebieską formę anionową, powodując zauważalną zmianę koloru roztworu, z brązowawego na niebieski. Zwykle zmiana stężenia niebieskiej formy barwnika jest oznaczana ilościowo spektrofotometrycznie, której absorbancja przy 590-595 nm jest proporcjonalna do ilości białka w teście.

Rysunek 1: Widma absorpcyjne Coomassie brylantowo niebieskie G w warunkach testu Bradforda. Trzy główne szczyty są oznaczone strzałkami wskazującymi λmax czerwonej (470 nm), zielonej (650 nm) i niebieskiej (590 nm) formy barwnika. Widma rejestrowano przy braku białka (linia żółta) oraz w obecności 3 μg (linia szara) i 10 μg (linia niebieska) albuminy surowicy bydlęcej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Powszechne stosowanie testu Bradforda doprowadziło do zidentyfikowania kilku ograniczeń (np. zmienne reakcje na różne białka¹¹, oraz interferencja ze strony lipidów¹³ i detergenty⁷) oraz opracowanie modyfikacji poprawiających jego wydajność (np. dodanie detergentów^14,15, alkalizacja^14,16 i użycie współczynnika absorbancji¹⁷). Oprócz modyfikacji samego testu, opisano również użycie alternatywnych urządzeń, takich jak smartfony lub aparaty fotograficzne, do przechwytywania sygnałów analitycznych^18,19,20. Rzeczywiście, rozwój metod wykorzystujących smartfony jako przenośne analizatory chemiczne jest aktywnym obszarem badań. Motywacja do korzystania ze smartfonów wynika z przystępności cenowej, przenośności, łatwości obsługi i powszechnej dostępności tych urządzeń.

Ten artykuł przedstawia protokół do oznaczania ilościowego białek za pomocą testu RGBradford²⁰, który wykorzystuje smartfon jako urządzenie analityczne. W przeciwieństwie do oryginalnej publikacji RGBradford²⁰, tutaj wprowadzono procedurę, która usprawnia proces ekstrakcji kolorów. Polega ona na wykorzystaniu ogólnodostępnego oprogramowania do automatycznego wyodrębniania informacji o kolorze z każdego dołka obrazu mikropłytki, co pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu i wysiłku. Jest to alternatywa dla poprzedniej metody ręcznego pozyskiwania danych o kolorach z każdej studni jeden po drugim za pomocą aplikacji do edycji grafiki²⁰. Ostatecznie poziomy białka w próbkach można określić ilościowo za pomocą danych o kolorach wyodrębnionych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

Protokół

1. Przygotowanie odczynnika do oznaczania białek Bradforda

1. Rozpuścić 100 mg Coomassie Brilliant Blue G w 50 ml 95% (w/v) etanolu. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia Coomassie Brilliant Blue G.
   UWAGA: Etanol jest łatwopalny i powoduje podrażnienie oczu. Unikaj płomieni i używaj okularów.
2. Do poprzedniego roztworu ostrożnie dodać 100 ml 85% (w/v) kwasu fosforowego.
   UWAGA: Kwas fosforowy działa żrąco na metale i powoduje korozję skóry, poważne uszkodzenie oczu i ostrą toksyczność doustną. Nosić rękawice i okulary.
3. Powoli dodawać roztwór zawierający Coomassie Brilliant Blue G, etanol i kwas fosforowy do 600 ml wody dejonizowanej.
4. Rozcieńczyć roztwór do końcowej objętości 1 000 ml. Skaluj w górę lub w dół w zależności od liczby próbek do analizy. Zgodnie z opisem w oryginalnej metodzie⁷, końcowe stężenia w działającym odczynniku Bradford powinny wynosić 0,01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (w/v) etanolu i 8,5% (w/v) kwasu fosforowego.
5. Usuń wszelki nierozpuszczalny materiał filtrujący przez bibułę filtracyjną (papier Whatman #1 lub odpowiednik).
6. Odczynnik jest stabilny przez kilka tygodni, gdy jest przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) i chroniony przed światłem. W razie potrzeby przefiltrować, ponieważ z czasem mogą tworzyć się osady.
   UWAGA: Alternatywnie, gotowe do rozcieńczenia i użycia odczynniki Bradford są dostępne w handlu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania odczynnika i przejdź do następnego kroku.

2. Przygotowanie wzorcowych roztworów białkowych

1. Przygotować roztwór podstawowy (patrz krok 2.4) wyizolowanego białka, który ma być użyty jako wzorzec. Niedrogim i powszechnie stosowanym białkiem jest albumina surowicy bydlęcej (BSA). Inne opcje to albumina jaja kurzego i gamma globulina bydlęca.
2. Jeżeli znana jest absorpcja molowa białka użytego jako wzorzec, sprawdzić stężenie roztworu podstawowego w spektrofotometrze.
3. W przypadku BSA powszechnie stosowanym wzorem jest BSA (mg/ml) = (A280/6,6) × 10, gdzie A280 to absorbancja przy 280 nm przy długości drogi 1 cm odczytana w stosunku do odpowiedniej próby ślepej (tj. ε₂₈₀^1% = 6,6)7. Na przykład 0,8 mg/ml BSA ma absorbancję 0,528 przy 280 nm.
4. Aby wygenerować krzywą wzorcową, należy przygotować kilka rozcieńczeń BSA w zakresie 0,025 mg/ml i 1,0 mg/ml. Spowoduje to 0,25-10 μg BSA na studzienkę po dodaniu próbki o objętości 10 μl na studzienkę.
   UWAGA: Wzorcowe roztwory białek powinny być przygotowywane w pożywce o tym samym składzie (stężeniu końcowym) co pożywka użyta do przygotowania próbek.

3. Test

1. Rozcieńczyć próbki, aby uzyskać stężenie białka w standardowym zakresie krzywej 0,025-1,0 mg/ml. Mieć kilka (co najmniej 3) rozcieńczeń próbki w zakresie.
   UWAGA: Próbki można rozcieńczać solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub dowolną inną kompozycją pożywki/buforu zgodną z odczynnikiem Bradforda. Końcowe stężenie składników pożywki nie powinno różnić się między wzorcem a próbkami.
2. Dodać 10 μl każdego wzorcowego roztworu białka do trzech dołków (tj. w trzech powtórzeniach) 96-dołkowej mikropłytki. Dla punktu 0 (zerowego) białka dodać 10 μl buforu/pożywki użytej do przygotowania roztworów wzorcowych i rozcieńczeń próbki.
3. Do innego zestawu studzienek dodać 10 μl każdej próbki rozcieńczonej do trzech dołków (tj. w trzech dowartościach) tej samej 96-dołkowej mikropłytki. Jednym ze sposobów jest dodanie różnych objętości próbki i uzupełnienie pożywką do 10 μl na studzienkę (np. 0,5 μl, 1 μl, 2 μl, 4 μl i 8 μl próbki plus 9,5 μl, 9 μl, 8 μl, 6 μl, i 2 μl pożywki).
4. Dodać 250 μl odczynnika do oznaczania białek Bradforda do wszystkich studzienek. Typowy układ mikropłytki jest pokazany w Rysunek 2. W tym przykładzie zestaw ślepych studzienek zawierających 260 μl (ostateczna objętość na studzienkę) wody został dołączony, aby służyć jako ślepa próba w czytniku mikropłytek (krok 4.5). Jest to wymagane tylko wtedy, gdy gromadzone są również dane dotyczące absorbancji.
   UWAGA: Za każdym razem, gdy wykonywany jest test, należy przygotować krzywą wzorcową na tej samej mikropłytce próbek. Innymi słowy, jeśli liczba próbek wymaga kolejnej płytki, przygotuj kolejną krzywą wzorcową na drugiej płytce i tak dalej.
5. Zapisz wyniki (sekcja 4) w ciągu 5-15 minut.

Rysunek 2: Typowy układ płytki dla testu białka Bradforda. Ślepa próba odnosi się do trzech studzienek zawierających 260 μl wody, która ma być użyta jako ślepa próba w czytniku mikropłytek. Choroby przenoszone drogą płciową odnoszą się do standardów białkowych. S1-S6 to sześć różnych próbek. SX_1-SX_4 to cztery różne rozcieńczenia próbki dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zapisywanie wyników

1. W dobrze oświetlonym pomieszczeniu jedną ręką trzymaj mikropłytkę równolegle do ławki na jednolitym białym tle (np. arkuszu papieru). Upewnij się, że wyrównanie jest dokładne, umieszczając poziomicę na talerzu.
2. Drugą ręką trzymaj smartfon równolegle (niektóre aplikacje aparatu z pożytkiem wskazują nachylenie urządzenia) do ławki i mikropłytki i zrób jedno lub kilka zdjęć całej mikropłytki (Rysunek 3). W urządzeniach z systemem iOS włącz wskaźnik poziomu kamery w ustawieniach aparatu, włączając opcję Siatka. Na urządzeniach z systemem Android włącz wskaźnik poziomu kamery w ustawieniach aparatu, włączając opcję Podpowiedzi dotyczące kadrowania.
3. Nie jest wymagany żaden specjalny aparat oświetleniowy, ale należy uważać, aby uniknąć cieni i odbić. Na przykład unikaj cieniowania płyty lub tła za pomocą smartfona i unikaj cieniowania tła za pomocą mikropłytki. Małe odbicia na krawędziach obszaru studni nie stanowią problemu; Dane o kolorach można uzyskać z bardzo małego obszaru w środku każdej studni.
4. Krótko sprawdź obraz pod kątem jednolitości tła, cieni i odbić. Spójrz także na kąt studni; Środek każdej studni powinien być bezpośrednio widoczny (tj. Nie za ścianami studni).
5. Jeśli pożądane jest porównanie odczytów absorbancji mikropłytki z danymi dotyczącymi koloru obrazu, odczytaj mikropłytkę przy 590 nm i 450 nm w czytniku mikropłytek²¹.

Rysunek 3: Przechwytywanie wyników testu białka Bradforda. W dobrze oświetlonym pomieszczeniu mikropłytkę umieszcza się jedną ręką równolegle do ławki na jednolitym tle. Drugą ręką smartfon trzyma się równolegle do ławki i mikropłytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Automatyczne wyodrębnianie danych kolorów

1. Pobierz ImageJ i ReadPlate²², wtyczka ImageJ jest dostępna pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (jest to plik .txt).
2. Otwórz ImageJ, kliknij Wtyczki > Zainstaluj i wybierz plik pobrany w kroku 6.1.
3. Ustaw parametry pomiaru, klikając Analizuj > Ustaw pomiary i zaznacz następujące opcje: Obszar; Odchylenie standardowe; Min. i maksymalna wartość szarości; Średnia wartość szarości; Modalna wartość szarości. W dolnej części okna ustaw Przekierowanie na: Brak i Miejsca dziesiętne (0-9): 3.
4. Przejdź do File > Open (Plik Otwórz i wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w kroku 4.
5. Przejdź do Wtyczki > ReadPlate. Przeczytaj instrukcje, a następnie kliknij przycisk OK.
6. Wybierz liczbę studzienek: 96.
7. Korzystając z narzędzia do zaznaczania prostokątnego ładowanego automatycznie przez wtyczkę, utwórz prostokąt zaczynający się w środku studni A1 i kończący się w środku studni H12. Następnie kliknij przycisk OK.
8. Wybierz kanał niebieski i kliknij przycisk OK.
9. Potwierdź domyślne parametry, klikając OK.
10. Sprawdź, czy oprogramowanie wyznaczyło obszar wewnątrz każdej studzienki i czy wybrane obszary nie zakrywają obszarów z nietypowymi cieniami lub odbiciami. Kliknij przycisk OK.
11. Zapisz wyniki i powtórz kroki 5.8-5.10 dla kanału zielonego.
12. Oblicz stosunek niebieskiego do zielonego, korzystając z trybu dla każdego koloru.
    UWAGA: Obliczenia można wykonać ręcznie lub za pomocą oprogramowania o preferencjach czytnika, takiego jak R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.

6. Ekstrakcja danych kolorów - ręcznie

1. Pobierz Inkscape, darmowy edytor graficzny o otwartym kodzie źródłowym.
   UWAGA: Każde oprogramowanie z narzędziem do próbnika kolorów (zwykle przedstawianym jako zakraplacz) może być używane do identyfikacji koloru i wyodrębniania danych RGB.
2. Otwórz Inkscape, przejdź do Plik > Otwórz. Wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w kroku 4.
3. Wybierz narzędzie Zaznaczanie i przekształcanie obiektów (S), które jest przedstawione jako strzałka w lewym górnym rogu, a następnie kliknij obraz. Obramowanie linią przerywaną wskaże wybór.
4. Wybierz narzędzie Wybierz kolory z obrazu (D), które jest przedstawione jako zakraplacz do oczu po lewej stronie.
5. Kliknij na środku studni. Kolor na dolnym panelu ("Wypełnienie:") zmieni się odpowiednio. Kliknij kolor, a po prawej stronie pojawi się zakładka Wypełnienie i obrys.
6. Zmień menu rozwijane Kolor płaski na RGB. Zapisz wartości pokazane dla kanałów niebieskiego i zielonego dla każdej studzienki.
7. Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego, korzystając z zarejestrowanych wartości.
   UWAGA: Obliczenia można wykonać ręcznie lub za pomocą oprogramowania o preferencjach czytnika, takiego jak R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.

7. Budowanie krzywych standardowych i ekstrapolacja niewiadomych

1. Wykreślić średni stosunek intensywności koloru zielonego do niebieskiego w funkcji stężenia wzorca białka.
   UWAGA: Wykreśl dane ręcznie lub za pomocą oprogramowania w preferencjach czytnika, takiego jak R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.
2. Obliczyć średni stosunek intensywności koloru zielonego do niebieskiego dla każdej próbki i rozcieńczenia.
3. Sprawdzić, czy sygnał uzyskany dla próbki mieści się w zakresie liniowym wzorca białka.
4. Zignoruj wszystkie wartości poniżej lub powyżej minimalnych lub maksymalnych wartości krzywej standardowej.
5. Użyj równania liniowego opisującego krzywą standardową, aby ekstrapolować ilość białka w próbce. Obliczone wartości należy odpowiednio pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.

Wyniki

Rysunek 4 to zdjęcie mikropłytki, z której pobrano dane o kolorach i zarejestrowano absorbancję przy 450 nm i 590 nm. Dane kolorów RGB zgłoszone tutaj jako reprezentatywne zostały uzyskane automatycznie, jak opisano w sekcji 5. Typowym wzorcem danych kolorów jest wzrost wartości koloru niebieskiego oraz spadek wartości koloru czerwonego i zielonego (Rysunek 5). Zauważ, że pomimo wyraźnego odbicia we wszystkich studzienkach i nieidealnie wyrównanej mikropłytki (

Dyskusja

W tym artykule opisano RGBradford, metodę, która wykorzystuje kamerę smartfona do rejestrowania danych z testu białka Bradforda, wyodrębniania danych o kolorze i dokładnego ilościowego określania poziomów białka w próbkach biologicznych, jak pierwotnie opisano niedawno^. Jedną z różnic w stosunku do oryginalnej metody RGBradford jest to, że tutaj zastosowano procedurę automatycznego uzyskiwania danych o kolorach za pomocą wtyczki ImageJ²² . Główną nowością metody RGBradford ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowe płaskie płytki do mikromiareczkowania z polistyrenu	Jet Biofil, Guangzhou, Chiny	TCP011096	Wystarczy dowolna mikropłytka z płaskim dnem kompatybilna z odczytem optycznym.
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Alkohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Można zastąpić innym smartfonem wyposażonym w aparat
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric kwas	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	Nie dotyczy
S22 Ultra	Samsung	Nie dotyczy
SpectraMax 384 Plus. Czytnik mikropłytek.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Będzie działał każdy czytnik mikropłytek zdolny do odczytu przy 450 nm i 590 nm. Jest to opcjonalne. Metoda ta została stworzona, aby wyeliminować potrzebę korzystania z czytnika mikropłytek.