RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera protokół do oznaczania ilościowego białek przy użyciu testu Bradforda i smartfona jako urządzenia analitycznego. Poziomy białka w próbkach można określić ilościowo za pomocą danych o kolorach uzyskanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

Streszczenie

Oznaczanie ilościowe białka jest podstawową procedurą w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych. Wśród kilku innych metod, test Bradforda jest jednym z najczęściej stosowanych. Ze względu na jego powszechność, ograniczenia i zalety testu Bradforda zostały wyczerpująco opisane, w tym kilka modyfikacji oryginalnej metody w celu poprawy jej wydajności. Jedną ze zmian w oryginalnej metodzie jest wykorzystanie aparatu w smartfonie jako instrumentu analitycznego. Wykorzystując trzy formy barwnika Coomassie Brilliant Blue, które występują w warunkach testu Bradforda, w artykule opisano, jak dokładnie określić ilościowo białko w próbkach przy użyciu danych o barwie wyekstrahowanych z pojedynczego obrazu mikropłytki. Po wykonaniu testu na mikropłytce, zdjęcie jest wykonywane za pomocą aparatu w smartfonie, a dane kolorów RGB są ekstrahowane z obrazu za pomocą bezpłatnej aplikacji do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Następnie stosunek intensywności koloru niebieskiego do zielonego (w skali RGB) próbek o nieznanych stężeniach białka jest wykorzystywany do obliczenia zawartości białka w oparciu o krzywą standardową. Nie obserwuje się znaczącej różnicy między wartościami obliczonymi przy użyciu danych kolorów RGB a tymi obliczonymi przy użyciu konwencjonalnych danych absorbancji.

Wprowadzenie

Niezależnie od zastosowania w dalszych etapach analizy (np. ELISA, kinetyka enzymatyczna, western blotting, oczyszczanie białek oraz spektrometria mas), oznaczanie ilości białka jest kluczowe dla zapewnienia dokładności analiz w laboratoriach nauk biologicznych. Poza wykorzystaniem w charakterze wtórnych odczytów (tj. do obliczenia względnych poziomów analitów w przeliczeniu na masę białka), poziom białka w próbce może być również samym pożądanym wynikiem analizy. Przykładem może być badanie zawartości białka w zasobach żywności.¹ lub w moczu²Dostępnych jest wiele metod pomiaru stężenia białek w próbkach.³, w tym bezpośrednie pomiary absorbancji w UV⁴, chelatowanie białek przez miedź^5,6, kolorymetryczne testy wiązania białka z barwnikiem⁷, oraz fluorescencyjne testy wiązania białko-barwnik⁸Znaczenie oznaczania ilości białek potwierdza obecność dwóch publikacji opisujących metody pomiaru białek.^5,7 wśród trzech najczęściej cytowanych publikacji^9,10Mimo że wielu autorów pomija właściwe cytowanie, powołując się na źródła wtórne lub nie podając żadnych odniesień, oryginalne prace opisujące metodę Lowry’ego oraz metodę Bradforda do oznaczania białek >po 200 000 cytowań każde¹⁰.

Popularność metody Bradforda wynika z jej przystępności cenowej, prostoty, szybkości i czułości. Metoda ta opiera się na oddziaływaniu białek z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G w warunkach kwasowych. W warunkach przeprowadzania analizy (tzn. przy niskim pH) barwnik występuje w trzech formach: czerwonej formie kationowej z λmax przy 470 nm; zielonej formie neutralnej z λmax przy 650 nm oraz niebieskiej formie anionowej z λmax przy 590 nm^11,12 (Rycina 1). W nieobecności białek dominuje forma kationowa. W wyniku oddziaływania białek z barwnikiem stabilizowana jest niebieska forma anionowa, co powoduje wyraźną zmianę barwy roztworu z brązowawej na niebieską. Zazwyczaj zmianę stężenia niebieskiej formy barwnika określa się spektrofotometrycznie; jej absorbancja przy 590-595 nm jest proporcjonalna do ilości białka w badanej próbce.

Rycina 1: Widma absorpcyjne Coomassie brilliant blue G w warunkach testu Bradforda. Trzy główne piki są oznaczone strzałkami wskazującymi λmax dla formy czerwonej (470 nm), zielonej (650 nm) i niebieskiej (590 nm) barwnika. Widma zarejestrowano w nieobecności białka (linia żółta) oraz w obecności 3 µg (linia szara) i 10 µg (linia niebieska) albuminy surowicy bydlęcej. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Powszechne zastosowanie metody Bradforda doprowadziło do zidentyfikowania kilku ograniczeń (np. zmiennych odpowiedzi dla różnych białek¹¹ oraz interferencji lipidów¹³ i detergentów⁷) oraz opracowania modyfikacji mających na celu poprawę jej wydajności (np. dodanie detergentów^14,15, alkalinizację^14,16 oraz wykorzystanie stosunku absorbancji¹⁷). Oprócz modyfikacji samego testu opisano również stosowanie alternatywnych urządzeń, takich jak smartfony lub aparaty fotograficzne, do rejestracji sygnałów analitycznych^18,19,20. Rzeczywiście, rozwój metod wykorzystujących smartfony jako przenośne analizatory chemiczne stał się aktywnym obszarem badań. Motywacją do stosowania smartfonów jest przystępność cenowa, przenośność, łatwość obsługi oraz powszechna dostępność tych urządzeń.

Niniejsza praca przedstawia protokół ilościowego oznaczania białek z wykorzystaniem testu RGBradford²⁰, w którym smartfon służy jako urządzenie analityczne. W przeciwieństwie do oryginalnej publikacji dotyczącej metody RGBradford²⁰, wprowadzono tutaj procedurę usprawniającą proces ekstrakcji koloru. Polega ona na wykorzystaniu bezpłatnej aplikacji programistycznej do automatycznego wyodrębniania informacji o kolorze z każdego dołka zdjęcia mikropłytki, co pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu i wysiłku. Stanowi to alternatywę dla poprzedniej metody ręcznego pozyskiwania danych o kolorze z każdego dołka pojedynczo za pomocą aplikacji edytora graficznego²⁰. W rezultacie poziom białek w próbkach może być określony ilościowo na podstawie danych o kolorze wyekstrahowanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

Protokół

1. Przygotowanie odczynnika do oznaczenia białek metodą Bradforda

1. Rozpuścić 100 mg Coomassie Brilliant Blue G w 50 mL 95% (w/v) etanolu. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia Coomassie Brilliant Blue G.
   OSTROŻNIE: Etanol jest łatwopalny i powoduje podrażnienie oczu. Unikać kontaktu z otwartym ogniem i używać okularów ochronnych.
2. Do poprzedniego roztworu ostrożnie dodać 100 mL 85% (w/v) kwasu fosforowego.
   OSTROŻNIE: Kwas fosforowy jest żrący dla metali i powoduje oparzenia skóry, poważne uszkodzenia oczu oraz ostrą toksyczność przy połknięciu. Należy stosować rękawice i okulary ochronne.
3. Powoli dodać roztwór zawierający Coomassie Brilliant Blue G, etanol i kwas fosforowy do 600 mL wody dejonizowanej.
4. Dopełnić roztwór do objętości końcowej 1 000 mL. Zmienić skalę przygotowania w zależności od liczby próbek do analizy. Zgodnie z opisem w oryginalnej metodzie⁷, stężenia końcowe w roboczym odczynniku Bradforda powinny wynosić: 0,01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (w/v) etanolu i 8,5% (w/v) kwasu fosforowego.
5. Usunąć nierozpuszczone cząstki poprzez filtrowanie przy użyciu papieru filtracyjnego (papier Whatman nr 1 lub odpowiednik).
6. Odczynnik jest stabilny przez kilka tygodni przy przechowywaniu w temperaturze pokojowej (RT) i ochronie przed światłem. Filtrować w razie potrzeby, ponieważ z czasem mogą tworzyć się osady.
   UWAGA: Alternatywnie dostępne są komercyjne odczynniki Bradforda gotowe do rozcieńczenia i użycia. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania odczynnika i przejść do następnego kroku.

2. Przygotowanie roztworów standardowych białek

1. Przygotować roztwór zapasowy (patrz krok 2.4) wyizolowanego białka, które będzie służyć jako standard. Przystępnym i powszechnie stosowanym białkiem jest albumina surowicy bydlęcej (BSA). Innymi opcjami są owalbumina oraz gamma globulina bydlęca.
2. Jeśli znany jest współczynnik absorpcji molowej białka użytego jako standard, należy sprawdzić stężenie roztworu zapasowego za pomocą spektrofotometru.
3. W przypadku BSA powszechnie stosowany wzór to BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10, gdzie A280 to absorbancja przy 280 nm dla drogi optycznej 1 cm, zmierzona względem odpowiedniej próbki ślepej (tj. ε₂₈₀^1% = 6.6)⁷. Na przykład BSA o stężeniu 0,8 mg/mL wykazuje absorbancję 0,528 przy 280 nm.
4. Aby wyznaczyć krzywą wzorcową, należy przygotować kilka rozcieńczeń BSA w zakresie od 0,025 mg/mL do 1,0 mg/mL. Po dodaniu objętości próbki wynoszącej 10 µL na dołek, pozwoli to uzyskać od 0,25 do 10 µg BSA na dołek.
   UWAGA: Roztwory standardowe białek powinny być przygotowane w medium o takim samym składzie (stężeniu końcowym) co medium użyte do przygotowania próbek.

3. Analiza

1. Rozcieńczyć próbki tak, aby uzyskać stężenie białka w zakresie krzywej wzorcowej od 0,025-1,0 mg/mL. Należy przygotować kilka (co najmniej 3) rozcieńczeń próbek w tym zakresie.
   UWAGA: Próbki można rozcieńczać solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS) lub jakimkolwiek innym składnikiem medium/buforu kompatybilnym z odczynnikiem Bradforda. Końcowe stężenie składników medium nie powinno się różnić pomiędzy wzorcami a próbkami.
2. Do trzech studzienek (tj. w trzech powtórzeniach) płytki mikrotytryjnej 96-dołkowej dodać 10 µL każdego roztworu wzorca białka. Dla punktu zero (bez białka) dodać 10 µL buforu/medium użytego do przygotowania roztworów wzorcowych i rozcieńczeń próbek.
3. Do innego zestawu studzienek tej samej płytki mikrotytryjnej 96-dołkowej dodać 10 µL każdego rozcieńczenia próbki do trzech studzienek (tj. w trzech powtórzeniach). Jednym ze sposobów jest dodanie różnych objętości próbki i uzupełnienie ich medium do objętości 10 µL na studzienkę (np. 0,5 µL, 1 µL, 2 µL, 4 µL i 8 µL próbki oraz odpowiednio 9,5 µL, 9 µL, 8 µL, 6 µL i 2 µL medium).
4. Do wszystkich studzienek dodać 250 µL odczynnika do oznaczania białka metodą Bradforda. Typowy układ płytki mikrotytryjnej przedstawiono na Rysunku 2. W tym przykładzie dołączono zestaw pustych studzienek zawierających 260 µL (objętość końcowa na studzienkę) wody, aby służyły jako ślepa próba w czytniku płytek (krok 4.5). Jest to wymagane tylko w przypadku, gdy będą zbierane dane o absorbancji.
   UWAGA: Przy każdym wykonywaniu testu należy przygotować krzywą wzorcową na tej samej płytce, co próbki. Innymi słowy, jeśli liczba próbek wymaga użycia kolejnej płytki, należy przygotować kolejną krzywą wzorcową na drugiej płytce i tak dalej.
5. Odczytać wyniki (sekcja 4) w czasie od 5-15 min.

Rysunek 2: Typowy układ płytki dla oznaczania białek metodą Bradforda. Próbka ślepa (Blank) odnosi się do trzech studzienek zawierających 260 µL wody, służących jako tło w czytniku mikropłytek. STD odnosi się do standardów białek. S1-S6 to sześć różnych próbek. SX_1-SX_4 to cztery różne rozcieńczenia dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Rejestrowanie wyników

1. W dobrze oświetlonym pomieszczeniu, jedną ręką trzymaj mikropłytkę równolegle do blatu na jednolitym białym tle (np. arkuszu papieru). Aby zapewnić dokładne wyrównanie, umieść poziomicę na płytce.
2. Drugą ręką trzymaj smartfon równolegle (niektóre aplikacje aparatów użytecznie wskazują nachylenie urządzenia) do blatu i mikropłytki, a następnie wykonaj jedno lub kilka zdjęć całej mikropłytki (Rysunek 3). W urządzeniach z systemem iOS włącz w ustawieniach aparatu wskaźnik poziomu, aktywując opcję Siatka. W urządzeniach z systemem Android włącz w ustawieniach aparatu wskaźnik poziomu, aktywując opcję Wskazówki kadrowania.
3. Nie jest wymagana specjalna aparatura oświetleniowa, jednak należy zadbać o uniknięcie cieni i odbić. Na przykład unikaj zasłaniania płytki lub tła smartfonem oraz zasłaniania tła mikropłytką. Małe odblaski na krawędziach obszaru studzienek nie stanowią problemu; dane o kolorze mogą być pobierane z bardzo małego obszaru w centrum każdej studzienki.
4. Krótko sprawdź zdjęcie pod kątem jednolitości tła, cieni i odbić. Zwróć również uwagę na kąt widzenia studzienek; centrum każdej studzienki powinno być bezpośrednio widoczne (tzn. nie powinno znajdować się za ściankami studzienki).
5. Jeśli planowane jest porównanie odczytów absorbancji mikropłytki z danymi kolorystycznymi ze zdjęć, odczytaj wartości dla mikropłytki przy 590 nm i 450 nm w czytniku mikropłytek²¹.

Rysunek 3: Rejestrowanie wyników analizy białek metodą Bradforda. W dobrze oświetlonym pomieszczeniu mikropłytka zostaje ustawiona równolegle do blatu na jednolitym tle przy pomocy jednej ręki. Drugą ręką trzymamy smartfon równolegle do blatu i mikropłytki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

5. Automatyczna ekstrakcja danych kolorymetrycznych

1. Pobierz program ImageJ oraz wtyczkę ReadPlate²², dostępną pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (jest to plik .txt).
2. Otwórz program ImageJ, kliknij Plugins > Install i wybierz plik pobrany w kroku 6.1.
3. Ustaw parametry pomiarowe, klikając Analyze > Set Measurements i zaznaczając następujące opcje: Area; Standard deviation; Min & max gray value; Mean gray value; Modal gray value. Na dole okna ustaw Redirect to: None oraz Decimal places (0-9): 3.
4. Przejdź do File > Open i wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w kroku 4.
5. Przejdź do Plugins > ReadPlate. Zapoznaj się z instrukcjami, a następnie kliknij OK.
6. Wybierz liczbę studni: 96.
7. Używając narzędzia Rectangular selection, które zostanie automatycznie wczytane przez wtyczkę, wyznacz prostokąt zaczynający się w centrum studni A1 i kończący w centrum studni H12. Następnie kliknij OK.
8. Wybierz kanał Blue i kliknij OK.
9. Zatwierdź domyślne parametry, klikając OK.
10. Sprawdź, czy oprogramowanie wyznaczyło obszar wewnątrz każdej studni oraz czy zaznaczone obszary nie pokrywają miejsc z nienaturalnymi cieniami lub odblaskami. Kliknij OK.
11. Zapisz wyniki i powtórz kroki 5.8–5.10 dla kanału zielonego.
12. Oblicz stosunek sygnału niebieskiego do zielonego, wykorzystując wartość modalną dla każdego koloru.
    UWAGA: Obliczenia można wykonać ręcznie lub przy użyciu preferowanego oprogramowania, np. R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.

6. RęczneB ekstrakcja danych o kolorze

1. Pobierz program Inkscape, bezpłatny edytor grafiki o otwartym kodzie źródłowym.
   UWAGA: Do identyfikacji koloru i wyodrębnienia danych RGB można użyć dowolnego oprogramowania z narzędziem wyboru koloru (zazwyczaj przedstawionym jako pipeta).
2. Uruchom program Inkscape, przejdź do Plik > Otwórz. Wybierz zdjęcie mikropłytki wykonane w Kroku 4.
3. Wybierz narzędzie Zaznacz i przekształć obiekty (S), przedstawione jako strzałka w górnym lewym rogu, a następnie kliknij zdjęcie. Zaznaczenie zostanie wskazane przez przerywaną linię obramowania.
4. Wybierz narzędzie Próbnik kolorów obrazu (D), przedstawione jako pipeta po lewej stronie.
5. Kliknij w centrum studzienki. Kolor w dolnym panelu („Wypełnienie:”) zmieni się odpowiednio. Kliknij kolor, aby po prawej stronie pojawiła się karta Wypełnienie i kontur.
6. Zmień rozwijane menu Kolor jednolity na RGB. Zapisz wartości wyświetlane dla kanałów niebieskiego i zielonego dla każdej studzienki.
7. Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego, korzystając z zapisanych wartości.
   ​UWAGA: Obliczeń można dokonać ręcznie lub za pomocą preferowanego oprogramowania do analizy danych, takiego jak R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.

7. Tworzenie krzywych wzorcowych i ekstrapolacja nieznanych wartości

1. Nanieś na wykres średni stosunek intensywności zielonej do niebieskiej w funkcji stężenia standardu białka.
   UWAGA: Wykres należy sporządzić ręcznie lub za pomocą preferowanego oprogramowania, np. R, Microsoft Excel lub GraphPad Prism.
2. Oblicz średni stosunek intensywności zielonej do niebieskiej dla każdej próbki i każdego rozcieńczenia.
3. Sprawdź, czy sygnał uzyskany dla próbki mieści się w zakresie liniowym standardu białka.
4. Zignoruj wszelkie wartości poniżej lub powyżej wartości minimalnej lub maksymalnej krzywej wzorcowej.
5. Wykorzystaj równanie liniowe opisujące krzywą wzorcową, aby ekstrapolować ilość białka w próbce. Obliczone wartości pomnóż odpowiednio przez czynnik rozcieńczenia.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia zdjęcie mikropłytki, z której wyekstrahowano dane o kolorze oraz zarejestrowano absorbancję przy 450 nm i 590 nm. Przedstawione tutaj reprezentatywne dane kolorystyczne RGB uzyskano automatycznie, zgodnie z opisem w sekcji 5. Typowy wzorzec danych kolorystycznych to wzrost wartości niebieskiej oraz spadek wartości czerwonej i zielonej (Rysunek 5). Należy zauważyć, że mimo wyraźnych odbić we wszystkich dołkach oraz niedoskonałego wyrównania ...

Dyskusja

W tym artykule opisano RGBradford, metodę, która wykorzystuje kamerę smartfona do rejestrowania danych z testu białka Bradforda, wyodrębniania danych o kolorze i dokładnego ilościowego określania poziomów białka w próbkach biologicznych, jak pierwotnie opisano niedawno^. Jedną z różnic w stosunku do oryginalnej metody RGBradford jest to, że tutaj zastosowano procedurę automatycznego uzyskiwania danych o kolorach za pomocą wtyczki ImageJ²² . Główną nowością metody RGBradford ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-dołkowe płaskie płytki do mikromiareczkowania z polistyrenu	Jet Biofil, Guangzhou, Chiny	TCP011096	Wystarczy dowolna mikropłytka z płaskim dnem kompatybilna z odczytem optycznym.
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Alkohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Można zastąpić innym smartfonem wyposażonym w aparat
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric kwas	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	Nie dotyczy
S22 Ultra	Samsung	Nie dotyczy
SpectraMax 384 Plus. Czytnik mikropłytek.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Będzie działał każdy czytnik mikropłytek zdolny do odczytu przy 450 nm i 590 nm. Jest to opcjonalne. Metoda ta została stworzona, aby wyeliminować potrzebę korzystania z czytnika mikropłytek.

etylowy