Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu myszy z przetoką ustno-nosową

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65578

⸱

8 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Head and Neck Oncology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 3State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Eastern Clinic, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 4State Key Laboratory of Oral Diseases and National Clinical Research Center for Oral Diseases and Department of Oral Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia krok po kroku procedurę tworzenia modelu myszy z przetoką ustno-nosową. Przetoka ustno-nosowa została utworzona przez zastosowanie podgrzanej kauteryzacji okulistycznej w celu uszkodzenia środkowej części podniebienia twardego, co spowodowało powstanie otworu między jamą ustną a nosową.

Streszczenie

To badanie przedstawia metodę wykorzystującą podgrzewaną kauteryzację okulistyczną do opracowania realnego modelu do badania przetok ustnych. Myszy C57BL/6 wykorzystano do ustalenia modelu przetoki ustnej nosowej (ONF). Aby stworzyć ONF, myszy zostały znieczulone, unieruchomione, a ich twarde podniebienia zostały odsłonięte. Podczas zabiegu chirurgicznego za pomocą kauteryzacji okulistycznej wywołano uszkodzenie błony śluzowej o wymiarach 2,0 x 1,5 mm pełnej grubości w linii środkowej podniebienia twardego. Kluczowe było kontrolowanie wielkości ONF i minimalizowanie krwawienia, aby zapewnić sukces eksperymentu. Weryfikacja skuteczności modelu ONF została przeprowadzona w 7. dobie po operacji, obejmując zarówno ocenę anatomiczną, jak i funkcjonalną. Obecność przegrody nosowej w obrębie jamy ustnej oraz odpływ sterylnej wody z nozdrzy po wstrzyknięciu do jamy ustnej potwierdziły pomyślne ustalenie modelu ONF. Model wykazał praktyczną i udaną przetokę ustno-nosową, charakteryzującą się niską śmiertelnością, znacznymi zmianami masy ciała i minimalną zmiennością wielkości ONF. Przyszłe badania mogą rozważyć przyjęcie tej metodologii w celu wyjaśnienia mechanizmów gojenia się ran podniebienia i zbadania nowych metod leczenia przetok ustno-nosowych.

Wprowadzenie

Przetoka ustna (ONF), nieprawidłowy otwór między jamą ustną a nosową, klinicznie objawia się jako defekt w obszarze strukturalnym od wyrostka zębodołowego do języczka, który często występuje jako powikłanie po naprawie rozszczepu podniebienia1. Pacjenci z ONF doświadczają refluksu pokarmowego, zaburzeń artykulacji i upośledzenia funkcji gardła, co znacząco wpływa na jakość ich życia2,3,4. Częstość pooperacyjnych ONF waha się od 2,4% do 55% ze względu na takie czynniki, jak szerokość rozszczepu, typ Veau i metoda chirurgiczna5,6,7,8. Ponadto wskaźnik nawrotów po naprawie ONF jest wysoki i wynosi od 0% do 43%9.

Kilka nowatorskich metod leczenia okazało się ostatnio obiecujących w dziedzinie ONF, w tym różne materiały, leki i nowatorskie techniki10,11,12,13,14,15,16,17. Dokładna ocena efektów terapeutycznych jest niezbędna, ponieważ stanowi podstawę do wyboru i dalszego rozwoju terapii ONF. Jednak uzyskanie w krótkim okresie prawidłowej oceny efektów terapeutycznych innych niż chirurgiczne jest trudne, ponieważ charakterystyka ONF różni się u różnych pacjentów. W związku z tym konieczne jest ustalenie modelu choroby ONF w celu zweryfikowania skuteczności tych metod leczenia.

Przez kilka dziesięcioleci badacze tworzyli model przetoki ustno-nosowej (ONF) u różnych gatunków zwierząt, w tym szczurów18,19, prosięta20,21, minipigs22 oraz psy23, ponieważ gatunki te posiadają pokaźne podniebienie twarde nadające się do manipulacji chirurgicznej. Jednak myszy mają sekwencję genetyczną i cały genom podobny do ludzkiego, co czyni je ważnym modelem do badań i opracowywania nowych leków24,25,26. Co więcej, myszy oferują niewielką zmienność między partiami, co czyni je korzystnym wyborem do ustanowienia modelu ONF12,13,27.

Jednak szczegółowe kroki tworzenia ONF nie zostały opisane, a stabilność rozmiaru ONF nie została wzięta pod uwagę. Dodatkowo, weryfikacja powstawania ONF opierała się wyłącznie na obserwacji28, bez zapewnienia bezpośredniej komunikacji między jamą ustną a nosową. Nie wykazano tego za pomocą innych środków, takich jak utrata masy ciała myszy z powodu trudności w jedzeniu spowodowanych przez ONF. Ponadto nie uwzględniono normalnej zmienności wielkości rany, co ma kluczowe znaczenie dla badań nad lekami lub materiałami, które wspomagają lub hamują gojenie się ran. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustanowienia stabilnego i zwalidowanego modelu ONF.

Celem tego badania było opracowanie praktycznego modelu ONF, który rozwiązuje wyżej wymienione problemy, z nadzieją, że ten protokół posłuży jako podstawa do przyszłych badań nad mechanizmami gojenia się ran podniebienia i nowymi metodami leczenia ONF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii, Uniwersytetu Syczuańskiego. Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6 (samice).

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Zbierz niezbędne narzędzia chirurgiczne do zabiegu: kiełkownik, kauteryzację okulistyczną, nożyczki mikrochirurgiczne, pęsety mikrochirurgiczne, strzykawki i igły (26 g x 0,63 cala) (Rysunek 1A,B) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Przed zabiegiem chirurgicznym należy autoklawować narzędzia chirurgiczne, w tym kauteryzację okulistyczną, pęsetę mikrochirurgiczną i nożyczki mikrochirurgiczne, w temperaturze 102,9 kPa (1,05 kg/cm2) i temperaturze 121 °C przez 20 min.
  2. Zbierz potrzebne materiały chirurgiczne: obłożenia chirurgiczne, rękawiczki lateksowe, sterylną bawełnę, sterylne prześcieradła, sterylną folię metalową, płytę piankową jako platformę chirurgiczną, gumki (które można uzyskać, rozdzierając medyczną rękawicę lateksową) i taśmę (Rysunek 1C) (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Do każdej myszy należy używać osobnego zestawu materiałów, w tym strzykawek i sterylnych arkuszy do użytku w polu operacyjnym.
  3. Oczyść obszar operacyjny i aparaturę (źródło światła, płytę piankową i urządzenie do utrzymywania temperatury, patrz Tabela materiałów) za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Przykryj gałki i uchwyty narzędzi, które mogą być wymagane podczas zabiegu, sterylną folią metalową.
  4. W asepcie otwórz poszczególne narzędzia i ostrożnie umieść je w obszarze operacyjnym. Aktywuj kiełkownik (patrz Tabela materiałów) i światła do użycia podczas zabiegu. Umieścić kauteryzację okulistyczną w kiełkowniku i podgrzewać ją do 250 °C przez 20 minut.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Wykonaj unieruchomienie myszy i otwórz jamę ustną, wykonując poniższe czynności.
    1. Wybierz suczkę myszy C57BL/6J o wadze 20-25 g i w wieku 8-12 tygodni. Trzymaj mysz przez 7 dni przed wykonaniem jakichkolwiek zabiegów.
    2. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie Zoletil50 (80 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) (patrz tabela materiałów). Nałóż maść okulistyczną na oko myszy. Poczekaj, aż nie będzie odpowiedzi na uszczypnięcie palca.
      UWAGA: Mysz jest gotowa do zabiegu, gdy nie jest w stanie samodzielnie się obrócić.
    3. Przymocuj mysz do piankowej tablicy wyłożonej sterylnymi prześcieradłami. Użyj taśmy, aby przywiązać mysz do platformy chirurgicznej w pozycji leżącej na plecach (Rysunek 2A).
    4. Otwórz jamę ustną myszy. Umieść dwie igły (26 g x 0,63 cala) przed płaszczyzną ucha oczodołu i dwie kolejne za nią. Umieść gumkę wokół igieł i skrzyżuj siekacze, aby usta były otwarte. Użyj pęsety mikrochirurgicznej, aby podeprzeć kąciki ust (Ryc. 2B).
      UWAGA: Upewnij się, że twarde podniebienie jest wyraźnie odsłonięte. Zamocuj język pod gumką, aby zapobiec zasłanianiu pola widzenia i poparzeniom podczas kolejnych eksperymentów.
  2. Utwórz przetokę ustno-nosową (ONF) na podniebieniu twardym (Ryc. 3A-F).
    1. Pobrać kauteryzację okulistyczną, która była podgrzewana do 250 °C przez 20 minut. Umieść końcówkę kauteryzacyjną w odległości 1 mm od przecięcia linii środkowej podniebienia i linii pierwszego przedtrzonowca, tworząc pełnowymiarowe uszkodzenie błony śluzowej podniebienia twardego w linii środkowej.
      UWAGA: Unikaj poparzenia języka myszy.
    2. Po kilku sekundach usuń kauteryzację okulistyczną, gdy błona śluzowa wokół końcówki kauterium zmieni kolor na biały.
    3. Umieścić kauteryzację okulistyczną w kiełkowniku i kontynuować podgrzewanie do temperatury 250 °C przez 10 minut. Powtórz poprzedni krok, aby powiększyć ranę wokół krawędzi, aż osiągnie długość 2,0 mm i szerokość 1,5 mm.
      UWAGA: Każde przedłużenie powinno podążać za krawędzią ostatniego urazu. Użyj suwmiarki z noniuszem, aby zmierzyć długość i szerokość urazu. Uraz powinien obejmować 10% podniebienia.
    4. Użyj nożyczek mikrochirurgicznych, aby usunąć nadmiar zdenaturowanej tkanki miękkiej wokół rany. Używaj sterylnej bawełny, aby zatamować krwawienie i zapobiec uduszeniu wziewnemu myszy. Zmierz ranę, aby upewnić się, że tworzy uraz błony śluzowej twardego podniebienia o pełnej grubości o wymiarach 2,0 x 1,5 mm w linii środkowej.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Meloksykam należy podawać myszy w czasie wybudzenia pooperacyjnego, w dawce 5 mg/kg/d przez 3 dni, podskórnie29.
  2. Umieść mysz na urządzeniu do utrzymywania temperatury, aż całkowicie odzyska przytomność.
    UWAGA: Upewnij się, że mysz jest ustawiona w sposób ułatwiający oddychanie. Obracaj myszy co 10-15 minut, aby zapobiec gromadzeniu się krwi lub zapadaniu się płatów płuc. Gdy mysz się rozgrzeje, włóż ją z powrotem do klatki. Na dnie klatki należy zapewnić sterylną galaretkę i napromieniowaną paszę, aby myszy mogły je spożywać.

4. Weryfikacja powstania przetoki ustno-nosowej

UWAGA: Powodzenie stworzenia przetoki ustno-nosowej (ONF) jest oceniane w 7 dniu po zabiegu chirurgicznym.

  1. Przygotuj niezbędne materiały chirurgiczne: gumkę, taśmę, strzykawki, obłożenia chirurgiczne, rękawiczki lateksowe, sterylne prześcieradła, sterylną folię metalową i płytę piankową.
  2. Nosić obłożenia chirurgiczne i sterylne rękawice, aby utrzymać warunki aseptyki. Zdezynfekuj płytę piankową, źródło światła i urządzenie do utrzymywania temperatury alkoholem.
  3. Wywołać znieczulenie ogólne przez dootrzewnowe wstrzyknięcie Zoletilu50 (80 mg/kg). Poczekaj, aż nie będzie reakcji na uszczypnięcie palca. Użyj tej samej metody, która została opisana w krokach 2.1.3 i 2.1.4, aby unieruchomić mysz i odsłonić twarde podniebienie.
  4. Przeprowadź anatomiczną weryfikację strukturalną, upewniając się, że przegroda jest nadal widoczna w miejscu rany, co wskazuje na pomyślne utworzenie ONF (Rysunek 4A, B).
  5. Przeprowadź weryfikację funkcjonalną: zamknij jamę ustną myszy i wstrzyknij sterylną wodę do jej jamy ustnej za pomocą sterylnej strzykawki. Pomyślne utworzenie ONF jest potwierdzone, gdy płyn wypływa z nozdrzy myszy.
  6. Umieść mysz na urządzeniu do utrzymywania temperatury (37 °C), aż całkowicie odzyska przytomność. Obracaj myszy co 10-15 minut, aby zapobiec gromadzeniu się krwi lub zapadaniu się płatów płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu oceny wykonalności i stabilności tej metody eksperymentalnej, tę samą procedurę przeprowadzono na dziesięciu myszach, a następnie dokonano obserwacji dotyczących śmiertelności, zmian w wielkości rany, masy ciała oraz analizy histologicznej. Myszy uśmiercono w 7. dniu.

Procedura ta charakteryzowała się niskim wskaźnikiem śmiertelności. Kluczowymi instrumentami wykorzystanymi w tym eksperymencie były kauteryzator okulistyczny oraz germinator, przedstawione na Ryc. 1A<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naukowcy badali różne materiały, leki i nowatorskie techniki leczenia ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Wraz z postępem w procedurach chirurgicznych zmniejszyła się częstość występowania i nawroty ONF. Jednak ze względu na unikalną charakterystykę choroby, liczb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Badawczo-Rozwojowy, Zachodniochiński Szpital Stomatologii, Uniwersytet Sichuan (RD-02-202107), Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Sichuan (2022NSFSC0743) oraz grant Sichuan Postdoctoral Science Foundation (TB2022005) dla H. Huanga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikroskopiielektronowej kiełków 66118-20Sprzęt do ogrzewania i dezynfekcji
Rękawice lateksoweAllmedlub podobne
ŚwiatłaOlympusA1813
MeloxicamMedChemExpressHY-B0261zgniecione; 5 mg/kg
Narzędzia mikrochirurgiczne (nożyczki i pęseta)Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.M-Y-0087Instrument chirurgiczny
Okulistyczne kauteryzacjeSuqian Wenchong Medical Equipment Co.1.00234E + 13Instrument chirurgiczny
Sterylna bawełna,Yancheng Begu Technology Co.lub podobne
Sterylna folia metalowaBiosharplub podobne
Sterylne arkusze3MXH003801129lub podobne
Serwety chirurgiczneYancheng Begu Technology Co.lub podobne
strzykawkiYancheng Begu Technology Co.S-015301lub podobny
TaśmaBkmamlablub podobne
urządzenie do utrzymywania temperaturyAparatura Harvarda LE-13-2104
Zoletil50Virbac80 mg/kg
Nauka o

Bibliografia

  1. Alonso, V., et al. Three-layered repair with a collagen membrane and a mucosal rotational flap reinforced with fibrine for palatal fistula closure in children. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 127, 109679(2019).
  2. Garg, R., Shah, S., Uppal, S., Mittal, R. K. A statistical analysis of incidence, etiology, and management of palatal fistula. National Journal of Maxillofacial Surgery. 10 (1), 43-46 (2019).
  3. Mahajan, R. K., Kaur, A., Singh, S. M., Kumar, P. A retrospective analysis of incidence and management of palatal fistula. Indian Journal of Plastic Surgery. 51 (3), 298-305 (2018).
  4. Huang, H., et al. Validation of the Chinese Velopharyngeal Insufficiency Effects on Life Outcomes Instrument. Laryngoscope. 129 (11), E395-E401 (2019).
  5. Sakran, K. A., et al. Evaluation of Postoperative Outcomes in Two Cleft Palate Repair Techniques without Relaxing Incisions. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2023).
  6. Sakran, K. A., et al. Evaluation of late cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. Journal of Stomatology, Oral and Maxillofacial Surgery. 124 (4), 101403(2023).
  7. Sakran, K. A., et al. The Sommerlad-Furlow modified palatoplasty technique: postoperative complications and implicating factors. Laryngoscope. 133 (4), 822-829 (2023).
  8. Sakran, K. A., et al. Early cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. , (2022).
  9. Chen, J., Yang, R., Shi, B., Xu, Y., Huang, H. Obturator manufacturing for oronasal fistula after cleft palate repair: a review from handicraft to the application of digital techniques. Journal of Functional Biomaterials. 13 (4), 251(2022).
  10. Yussif, N., Wagih, R., Selim, K. Propylene mesh versus acrylic resin stent for palatal wound protection following free gingival graft harvesting: a short-term pilot randomized clinical trial. BMC Oral Health. 21 (1), 208(2021).
  11. Miron, R. J., et al. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (1), 83-99 (2017).
  12. Ballestas, S. A., et al. Improving hard palate wound healing using immune modulatory autotherapies. Acta Biomaterialia. 91, 209-219 (2019).
  13. Ferreira, C. L., et al. Electrical stimulation enhances early palatal wound healing in mice. Archives of Oral Biology. 122, 105028(2021).
  14. Lindley, L. E., Stojadinovic, O., Pastar, I., Tomic-Canic, M. Biology and Biomarkers for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 18s-28s (2016).
  15. Xu, Y., et al. Rapid Additive Manufacturing of a Superlight Obturator for Large Oronasal Fistula in Pediatric Patient. Laryngoscope. 133 (6), 1507-1512 (2022).
  16. Leenstra, T. S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. The healing process of palatal tissues after palatal surgery with and without implantation of membranes: an experimental study in dogs. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 9 (5), 249-255 (1998).
  17. In de Braekt, M. M., van Alphen, F. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. Wound healing and wound contraction after palatal surgery and implantation of poly-(L-lactic) acid membranes in beagle dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 50 (4), 359-365 (1992).
  18. Suragimath, G., Krishnaprasad, K. R., Moogla, S., Sridhara, S. U., Raju, S. Effect of carbonated drink on excisional palatal wound healing: A study on Wistar rats. Indian Journal of Dental Research. 21 (3), 330-333 (2010).
  19. Zhu, T., Park, H. C., Son, K. M., Yang, H. -C. Effects of dimethyloxalylglycine on wound healing of palatal mucosa in a rat model. BMC Oral Health. 15 (1), 60(2015).
  20. Kirschner, R. E., et al. Repair of oronasal fistulae with acellular dermal matrices. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 1431-1440 (2006).
  21. Rohleder, N. H., et al. Repair of oronasal fistulae by interposition of multilayered amniotic membrane allograft. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 172-181 (2013).
  22. Kesting, M. R., et al. Repair of oronasal fistulas with human amniotic membrane in minipigs. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 131-135 (2010).
  23. Ayvazyan, A., et al. Collagen-gelatin scaffold impregnated with bFGF accelerates palatal wound healing of palatal mucosa in dogs. Journal of Surgical Research. 171 (2), e247-e257 (2011).
  24. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  25. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
  26. Shan, L., Flavell, R. A., Herndler-Brandstetter, D. Development of humanized mouse models for studying human NK cells in health and disease. Methods in Molecular Biology. 2463, 53-66 (2022).
  27. Keswani, S. G., et al. Role of salivary vascular endothelial growth factor (VEGF) in palatal mucosal wound healing. Wound Repair and Regeneration. 21 (4), 554-562 (2013).
  28. Amanso, A. M., et al. Local delivery of FTY720 induces neutrophil activation through chemokine signaling in an oronasal fistula model. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (2), 160-174 (2021).
  29. Antiorio, A. T. F. B., et al. Administration of meloxicam to improve the welfare of mice in research: a systematic review (2000 - 2020). Veterinary Research Communications. 46 (1), 1-8 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Uraz podniebienia twardegokauteryzacja okulistycznagojenie rany podniebieniauszkodzenie błony śluzowejmyszy C57BL/6analiza histologicznaodpowiedź zapalnatechnika chirurgiczna
Opracowanie modelu myszy z przetoką ustno-nosową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.