Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Summary

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Abstract

Białka histonowe są bardzo obfite i zachowane wśród eukariontów i odgrywają dużą rolę w regulacji genów w wyniku struktur znanych jako modyfikacje potranslacyjne (PTM). Identyfikacja pozycji i charakteru każdego PTM lub wzorca PTM w odniesieniu do czynników zewnętrznych lub genetycznych pozwala na statystyczne skorelowanie tych informacji z reakcjami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja lub naprawa DNA. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustowy protokół analityczny do wykrywania histonów PTM w próbkach biologicznych. Zastosowanie komplementarnej chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) umożliwia separację i przypisanie PTM najbardziej istotnych biologicznie modyfikacji w jednej analizie. Opisane podejście wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w zakresie zależnej akwizycji danych (DDA) z wykorzystaniem równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana zderzeniem. Histonowe PTM są pewnie przypisywane na podstawie ich czasu przechowywania, mobilności i wzorca fragmentacji.

Introduction

W komórkach eukariotycznych DNA jest pakowane jako chromatyna w funkcjonalne jednostki zwane nukleosomami. Jednostki te składają się z oktamera czterech rdzeniowych histonów (po dwa H2A, H2B, H3 i H4)^1,2,3,4. Histony są jednymi z najliczniejszych i najbardziej konserwatywnych białek u eukariontów, które są w dużej mierze odpowiedzialne za regulację genów⁵. Modyfikacje potranslacyjne histonów (PTM) odgrywają dużą rolę w regulacji dynamiki chromatyny i sterują różnymi procesami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja i naprawa DNA⁶. PTM występują przede wszystkim na dostępnej powierzchni N-końcowych obszarów histonów, które są w kontakcie z DNA^3,7. Jednak modyfikacje ogona i rdzenia wpływają na strukturę chromatyny, zmieniając interakcje międzynukleosomowe i rekrutując określone białka^3,8.

Obecnym wyzwaniem podczas proteomiki opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) jest potencjalna koelucja analitów będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku analiz zależnych od danych (DDA) przekłada się to na potencjalną utratę kilku jonów prekursorowych podczas procesu akwizycji MS/MS⁹. Instrumenty do pomiaru czasu przelotu (ToF) rejestrują widma o bardzo wysokiej częstotliwości^9,10 (do kilkudziesięciu kHz)¹¹; to sprawia, że są one zdolne do szybkiego skanowania całkowitej ilości jonów prekursorowych w złożonej próbce (MS1), obiecując w ten sposób optymalną czułość i szybkość sekwencjonowania MS/MS (do 100 Hz)⁹ i czyniąc je idealnymi do analizy próbek biologicznych¹⁰. Niemniej jednak czułość dostępna przy tych wysokich szybkościach skanowania jest ograniczona przez szybkość MS/MS⁹. W celu złagodzenia tych ograniczeń zastosowano dodanie spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów (TIMS) w połączeniu z ortogonalnym kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (qToF). W TIMS wszystkie jony prekursorowe są akumulowane w tandemie i eluowane w funkcji ich ruchliwości, zamiast wybierać pojedyncze masy prekursorów za pomocą kwadrupola⁹. Równoległa akumulacja szeregowa (PASEF) pozwala na setki zdarzeń MS/MS na sekundę bez utraty czułości⁹.

Głównym celem tej pracy było pokazanie ostatnich osiągnięć DDA za pomocą równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana kolizją (CID). PTM histonów zostały pewnie przypisane na podstawie ich czasów retencji (RT), ruchliwości i wzorców fragmentacji.

Protocol

UWAGA: Próbki histonów zostały pobrane przy użyciu metody zaadaptowanej z Bhanu et al. (2020)¹².

1. Przygotowanie próbki

1. Pobieranie hodowanych komórek
   1. Gdy komórki są w 80% zlewne, upewnij się, że są żywotne, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.
      UWAGA: Do tych eksperymentów użyto linii komórkowej HeLa S3, ale tę metodę można zastosować do dowolnych hodowanych komórek.
   2. Odessać pożywkę, a następnie nałożyć 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) na każdą płytkę.
   3. Zamieszać płytkę (płytki), aby wypłukać wszystkie pozostałe media, a następnie odessać PBS i nałożyć 5 ml 1x PBS.
   4. Delikatnie oddziel komórki od płytki, zeskrobując je jednorazowym podnośnikiem do komórek.
   5. Przenieść zawiesinę każdej komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
   6. Granulować komórki, odwirowując przy 800 x g przez 5 minut.
   7. Odessać PBS z osadu komórkowego.
   8. Przejdź do ekstrakcji histonów.
      UWAGA: Błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie, jeśli nie można go natychmiast przetworzyć. Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
2. Ekstrakcja histonów
   1. Oszacuj objętość każdej osadu komórkowego i oznacz łąkotkę trwałym markerem.
   2. Przygotować wystarczającą ilość buforu do izolacji jądrowej (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ i 250 mM sacharozy) dla wszystkich próbek. Alternatywnie, jeśli z czasem konieczne jest przetworzenie wielu próbek, należy sporządzić bufor luzem i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy lub podwielokrotność i zamrozić w temperaturze od -15 °C do -25 °C w nieskończoność, rozmrażając tylko ilość niezbędną do każdej ekstrakcji.
      UWAGA: Bufor powinien pozostać czysty podczas przechowywania. Jeśli w dowolnym momencie bufor stanie się mętny lub w inny sposób nietypowy, należy wyrzucić i przygotować nowy bufor.
   3. Przygotować 50-krotność objętości granulek komórkowych buforu do przemywania i dodać inhibitory w następujący sposób (około 10 ml buforu do przemywania na 2 próbki).
      1. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania należy zmieszać 10 ml NIB, 30 μl 200 mM chlorowodorku 4-(2-aminoetylo)benzenesulfonylu [AEBSF], 10 μl 1 M ditiotreitolu [DTT], 20 μl 5 μM mikrocystyny, 20 μL 5 M maślanu sodu.
   4. Usunąć 1/5 buforu do płukania, aby przygotować bufor do lizy (1/5 objętości z buforu do płukania, alternatywa 0,3% NP-40 lub NP-40).
      UWAGA: Nie używaj Triton-X 100 zamiast alternatywy NP-40 lub NP-40, ponieważ może być zbyt ścierny dla niektórych typów ogniw.
   5. Dokładnie przemyć osad komórkowy, zawieszając go w 5 kolumnach buforu do przemywania i odwirowując w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać ten etap dwukrotnie, zasysając i odrzucając supernatant między płukaniami.
   6. Upewnij się, że objętość osadu komórkowego jest nadal oznaczona trwałym markerem. Zawiesić ponownie w 10 objętościach buforu do lizy.
   7. Dokładnie wymieszaj pipetą każdą granulkę do ponownego zawieszenia, a następnie inkubuj przez 15 minut na lodzie.
   8. Po 15 minutach odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   9. Odessać i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Granulka powinna zmniejszyć się do ≤ ¹/₂ pierwotnego rozmiaru granulki (zgodnie z linią znacznika). Jeśli osad nie zmniejszył się wystarczająco, powtórz procedurę lizy i włącz delikatny etap homogenizacji za pomocą tłuczka w celu rozbicia komórek.
   10. Po zakończeniu lizy ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do płukania, a następnie odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant, a następnie powtórzyć etap płukania jeszcze raz, aby usunąć wszelkie ślady NP-40,
       UWAGA: W tym momencie osad składa się z chromatyny, która zawiera histony.
   11. Zawiesić osad w 5 objętościach (o pierwotnym rozmiarze osadu o oczku komórkowym) 0,4 N_H2SO4.
   12. Inkubować przez 2 godziny w chłodni lub lodówce za pomocą mieszadła.
   13. Po 2 godzinach odwirować próbkę(-i) o sile 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Nie należy wyrzucać supernatantu.
   14. Przenieść supernatant do nowych probówek i zwiększyć 100% kwas trichlorooctowy (TCA) do 1/3 objętości zawartości (końcowe stężenie TCA wyniesie około 20%).
   15. Delikatnie odwrócić probówkę i obserwować, że klarowny, bezbarwny roztwór zmienia kolor na biały i/lub mętny, co wskazuje na wytrącanie się białka.
       UWAGA: W przypadku roztworów o niskich stężeniach histonów wytrącanie białka może nie być od razu zauważalne, ale osad powinien być widoczny po całonocnej inkubacji.
   16. Inkubować bez zakłóceń przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 4 °C w celu całkowitego wytrącenia białek histonowych.
   17. Następnego dnia odwirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   18. Zassać supernatant, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety boków rurki. Na tym etapie histony są osadzane głównie w postaci filmu wokół boków rurki (rurek).
   19. Dodać 500 μl lodowatego acetonu + 0,1% HCl (kwaśnego acetonu) do każdej probówki za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie delikatnie odwrócić probówkę (probówki) kilka razy. Ułóż próbki w kolejności (1, 2, 3 itd.), ponieważ każdy błędny aceton może usunąć oznaczenia z probówek. Wirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie zdekantować supernatant.
   20. Powtórz ten etap płukania 500 μl lodowatego 100% acetonu, również za pomocą szklanej pipety Pasteura. Wirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie zdekantować supernatant.
   21. Pozostaw probówki otwarte do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż pozostały aceton wyparuje.
   22. Po wyschnięciu dodaj 100 μl wody klasy spektrometrii mas (MS) do każdej probówki. Użyj tej kropli do przetarcia wszystkich boków pojemnika, aby ponownie zawiesić całą folię histonową. W tym celu należy pipetować kroplę na bok probówki i obracać ją podczas pipetowania w górę i w dół lub dozując połowę 100 μl i mieszając ją dookoła za pomocą końcówki. Najlepiej sprawdza się połączenie obu metod. Histony są łatwo rozpuszczalne w wodzie i będą w roztworze.
   23. Po ponownym wymieszaniu wszystkich próbek, jeśli pozostały jakiekolwiek białe ciała stałe, należy przeprowadzić sonikację w kąpieli w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   24. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść klarowny roztwór do świeżych probówek. Wyrzuć wszelkie pozostałe nierozpuszczalne osady.
   25. Uruchom SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych, aby sprawdzić, czy ekstrakcja jest czysta.
       UWAGA: Żele mogą być uruchamiane przy użyciu dowolnego odpowiedniego stężenia poliakrylamidu, o ile jest on w stanie różnicować białka w zakresie 10-20 kDa. Patrz Tabela Materiałów dla żeli używanych w tym protokole.
   26. Wykonaj test stężenia białka (tj. Bradford lub BCA), aby określić całkowite stężenie białka.
3. Derywatyzacja chemiczna (propionylacja) reszt lizyny
   1. Przenieś 20 μg histonów (oznaczonych za pomocą testu białka) do czystej probówki. Wysuszyć tę próbkę do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego, a następnie ponownie zawiesić przy użyciu 20 μl 100 mM wodorowęglanu amonu (NH₄CO₃ ) (~1 μg/μL roztworu). W razie potrzeby dostosuj pH do ~8 za pomocą wodorotlenku amonu.
      UWAGA: Nie używaj wodorotlenku amonu (NH₄OH) do ponownego zawieszania, tylko do regulacji pH, jeśli to konieczne. W przeciwnym razie białka ulegną denaturacji i wytrącą się.
      UWAGA: Aby sprawdzić pH przy minimalnym ubytku próbki, użyj końcówki pipety, aby zanurzyć w próbce i nanieść na pasek pH. Ta procedura testowa będzie przydatna na pozostałych etapach przygotowania próbki.
   2. Przygotować odczynnik do propionylacji, dodając bezwodnik propionowy do acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:3 (v/v) (tj. aby otrzymać 40 μl odczynnika, połączyć 10 μl bezwodnika propionowego z 30 μl ACN).
      UWAGA: Tradycyjnie, metanol lub izopropanol były używane do przygotowania odczynnika propionylacji. Ponieważ propionylacja jest reakcją tworzenia amidu, rozpuszczalnik nieprotonowy, taki jak acetonitryl, jest wymagany, aby zapobiec niepożądanym produktom ubocznym i reakcjom, takim jak ester metylu propionylu, który wynika ze stosowania metanolu. Przygotuj tylko tyle odczynnika propionylacyjnego na maksymalnie 4 próbki na raz, aby odczynnik pozostał świeży. Odczynnik należy zużyć w ciągu 1-2 minut od przygotowania. Gdy odczynnik usiądzie, bezwodnik propionowy będzie reagował z wilgocią otoczenia i zacznie tworzyć się kwas octowy, który może zmienić skuteczność odczynnika i zmienić pH roztworu histonu po dodaniu odczynnika.
   3. Dodać odczynnik propionylacji do każdej próbki w stosunku 1:4 (v/v) (tj. na 20 μl histonów dodać 5 μl odczynnika propionylacyjnego).
   4. Szybko dodaj 1:5 (v/v) NH₄OH (tj. dodaj 4 μL na 20 μL roztworu histonów), aby przywrócić pH roztworu do ~8. Jeśli pH jest nadal zbyt niskie, dodawaj jednorazowo 1-2 μl NH₄OH, aż do osiągnięcia pH 8. Zazwyczaj stosunek 1:5 (v/v) jest wystarczający.
   5. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut bez zakłóceń.
   6. Powtórzyć reakcję propionylacji dla nie więcej niż 3-4 próbek na partię odczynnika propionylacji, aby zapewnić minimalne tworzenie się kwasu.
   7. Powtórzyć kroki procedury propionylacji 1.3.2-1.3.5. Druga runda propionylacji zapewnia, że >95% dostępnych lizyn jest derywatyzowanych.
   8. Wysuszyć próbki do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego. Spowoduje to odparowanie wszelkich nieprzereagowanych odczynników propionylacji, produktów kwaśnych i amoniaku uwolnionego z NH₄OH. Jeśli próbki całkowicie wyschną, nie ma nic złego w tym, że nie dochodzi do znacznych strat próbki.
      UWAGA: Przed przechowywaniem wypier powietrze z butelki bezwodnika propionowego z argonem, aby zapobiec tworzeniu się kwasu octowego w wyniku kontaktu z wilgocią otoczenia pozostającą w butelce.
4. Trawienie proteolityczne z trypsyną
   1. Zawiesić histony w 100 mM NH₄HCO₃ do uzyskania objętości 20 μl, osiągając optymalne stężenie 1 μg/μL.
      UWAGA: Roztwory próbek o stężeniach niższych niż 1 μg/μL spowodują zmniejszenie wydajności trypsyny.
   2. Dodaj trypsynę do próbek histonów w stosunku 1:10 (wag./wag.) (tj. dodaj 2 μl 1 μg/μl roztworu trypsyny do 20 μg histonów).
   3. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin. Alternatywnie inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej.
   4. Przerwać trawienie przez zamrożenie w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h.
      UWAGA: Nie używaj kwasu do wygaszania reakcji trawienia, ponieważ spowoduje to niepożądany spadek pH na tym etapie zabiegu. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowa do dalszego postępowania (tymczasowy punkt zatrzymania).
5. Derywatyzacja chemiczna (propionylacja) N-końców peptydów
   1. Wysuszyć próbki do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego.
   2. Zawiesić próbki do 20 μl (1 μg/μl) przy użyciu 100 mM NH₄HCO₃.
   3. Powtórzyć propionylację jak poprzednio (krok 1.3).
      UWAGA: To normalne, że próbki schną dłużej na tym etapie ze względu na wyższy stosunek fazy wodnej do organicznej.
6. Odsalanie próbek za pomocą końcówek etapowych
   1. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki w 50 μl wody klasy MS + 0,1% TFA.
   2. Za pomocą rdzenia 11-G wydziurkować 5 krążków materiału C₁₈ z dysku do ekstrakcji do fazy stałej (przebić wszystkie 5 krążków przed przeniesieniem na końcówkę pipety). Włóż i upewnij się, że krążki są bezpiecznie i równomiernie zaklinowane na dnie końcówki do pipety o pojemności 200 μl (Rysunek 1).
      UWAGA: Użyj rdzenia 15-G w przypadku odsalania ponad 25 μg próbki przez pojedynczą końcówkę stopnia.
   3. Użyj adaptera wirówki, aby przytrzymać końcówki stage na miejscu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1.5 ml lub 2 ml.
      UWAGA: Dla poniższych etapów wirowania należy stosować powolne (400-500 x g) obroty w temperaturze 4 °C, jednorazowo przez 1-2 minuty; rozpuszczalniki zwykle przechodzą przez żywicę w czasie krótszym niż 1 minuta, w zależności od tego, jak ciasno materiał C₁₈ jest upakowany w końcówkach.
   4. Wypłucz żywicę, odwirowując 50 μl 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C₁₈ i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
      UWAGA: Ładowanie roztworów na końcówki stage za pomocą końcówek do pipet z żelem może być łatwiejsze. Po aktywacji materiału C₁₈ ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia żywicy na czas procedury odsalania.
   5. Zrównoważyć materiał dysku z 80 μl wody klasy MS + 0,1% TFA przez odwirowanie.
   6. Zakwasić próbkę do pH 4 lub niższego przy użyciu lodowatego kwasu octowego. Sprawdź pH za pomocą pasków pH, jak poprzednio, aby zminimalizować utratę próbki.
   7. Załadować całą próbkę na krążek żywicy przez powolne wirowanie.
   8. Przepłukać próbkę 80 μl wody klasy MS + 0,1% TFA przez odwirowanie.
   9. Eluować próbkę do czystej probówki o pojemności 1,5 ml, przepłukując 70 μl 75% acetonitrylu i 0,5% kwasu octowego przez powolne wirowanie. Można zastosować dodatkowy czas wirowania, aby zapewnić wymycie pełnej objętości próbki z końcówki stolika. Nie ma nic złego w tym, że żywica wyschnie po dodatkowym czasie wirowania, ponieważ nie jest już potrzebna po elucji próbki.
   10. Całkowicie wysuszyć każdą próbkę w koncentratorze próżniowym.
       UWAGA: Próbka(i) może być przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do kontynuowania (tymczasowy punkt zatrzymania).
   11. Do analizy LC-MS/MS należy rozpuścić próbki w objętości rozpuszczalnika A (0,1% kwasu mrówkowego) z protokołu chromatografii cieczowej (LC), który daje końcowe stężenie 0,4 μg/μL (tj. rozpuścić 20 μg histonów w 50 μl rozpuszczalnika A).

2. Interfejs oprogramowania TIMS

1. Wybierz kartę Instrument i przełącz się na Obsługa (sprawdź, czy nazwa instrumentu jest podświetlona na zielono) (Rysunek 2).
2. Sprawdź parametry TIMS (Rysunek 2).
3. Sprawdź ustawienia MS (początek skanowania, koniec skanowania, polaryzacja jonów, tryb skanowania) (Rysunek 2).
4. Sprawdź ustawienia TIMS (tryb, początek mobilności, koniec mobilności, czas narastania, czas akumulacji, cykl pracy, szybkość narastania, szybkość MS, uśrednianie MS i autokalibracja) (Rysunek 2).
5. Przejdź do zakładki Źródło i aktywuj opcję strzykawki (Hamilton 500 μL) tylko dla kroku kalibracji TuneMix (Rysunek 3)¹³.
6. Przejdź do zakładki Kalibracja, kliknij m/z, wybierz Tryb kalibracji i wybierz tryb (ogólnie Enhanced Q), powiększenie (+0,01%) STD Dev (0,24) i kliknij Kalibruj; gdy zostanie osiągnięty wynik 100%, zaakceptuj (Rysunek 4).
7. Przejdź do zakładki mobilności i powtórz proces kalibracji (ogólnie tryb liniowy), zakres wykrywania (+5%), szerokość (0,1 Da), STD Dev (0,1855), a następnie kliknij kalibruj; gdy uzyskasz wynik ≥ 98,5%, zaakceptuj (Rysunek 5).
8. Przejdź do metody i wybierz metodę, która ma być używana; w tym przykładzie wybrano Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (Rysunek 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

1. Stosować typowe warunki pracy nESI: napięcie kapilarne 4500 V, przesunięcie płyty końcowej 800 V, ciśnienie nebulizatora 3,0 bar, suchy gaz 10,0 l/min, sucha grzałka 200 °C i natężenie przepływu wtrysku 50 μl/min.
2. Użyj typowych ustawień MS: energia zderzenia 6 eV, RF kolizji 1200 Vpp, czas transferu 75 μs, magazynowanie impulsów wstępnych 5 μs.
3. Określić przepływ gazu dryftującego na podstawie różnicy ciśnień z leja wejściowego P1 i leja wyjściowego P2. W komórce TIMS zachodzi równoległa akumulacja szeregowa (PASEF), w której wszystkie jony prekursorowe gromadzą się jednocześnie, a nie pojedynczo. Jony prekursorowe są następnie uwalniane w wąskich pikach jonowych w porównaniu z normalnie znacznie szerszymi pikami (około 50 razy krótszymi), zwiększając stosunek sygnału do szumu, jednocześnie oddzielając peptydy koeluujące za pomocą mobility¹⁴.
4. Opracowanie metody LC-TIMS-TOF MS/MS do analizy proteolitycznych peptydów histonowych. Połącz wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) wyposażony w kolumnę C₁₈ (300 A, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) z komercyjnym instrumentem TIMS-TOF MS z opatentowaną technologią PASEF.
   UWAGA: Ten rozmiar kolumny został określony w celu zapewnienia dobrej separacji zarówno przy wysokim, jak i niskim pH dla mieszanin peptydowych, na podstawie wcześniej opublikowanych prac^15,16,17.
   1. Ustawić objętość iniekcji na 20 μl (8 μg) próbki i natężenie przepływu 0,4 ml/min.
   2. Przeprowadź 60-minutowy, nieliniowy gradient LC, używając wody z 0,1% kwasem mrówkowym (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym (rozpuszczalnik B). Ustaw gradient: 10% B na 2,7 min, następnie na 20% B w 5,3 min, 28% B w 4 min, 35% B w kolejne 18 min, na 40% B w 13 min i 100% B w kolejne 2 min. Po utrzymaniu 100% B przez 5 minut, zmniejsz stężenie do 10% B w ciągu 5 minut i przytrzymaj przez ostatnie 5 minut.
5. Sprawdzić elucję próbki z HPLC do TIMS-TOF poprzez jonizację nano-elektronrozpylania (nESI) w trybie jonizacji dodatniej.

4. Analiza danych

1. Zidentyfikuj sekwencje peptydowe i miejsca modyfikacji.
   1. Przygotuj teoretyczną listę peptydów za pomocą ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] w narzędziu MS-digest.
      1. Przeprowadzić teoretyczny przegląd, biorąc pod uwagę warunki trawienia (użyty enzym), rodzaje poszukiwanych PTM (np. mono-, di- lub trimetylacja), zakres wielkości poszukiwanych peptydów, a także zakres wykrywania masy i potencjalną liczbę pominiętych rozszczepień.
2. Ręcznie przeanalizuj uzyskane dane w oparciu o teoretyczne peptydy (Rysunek 6)¹².
   1. Poszukuje się mas w kilku stanach naładowania (+1 do +4) dla każdego teoretycznego peptydu.
   2. Po wstępnej identyfikacji każdego m/z wybierz pik i potwierdź MS/MS, korzystając z teoretycznej listy jonów fragmentacyjnych opartej na sekwencji peptydowej, w tym PTM.
      UWAGA: Jeśli ruchliwość zidentyfikowanego peptydu była znana wcześniej, jest to również potwierdzone.
3. Oblicz względną obfitość różnych PTM i podaj każdą modyfikację jako procent określonej sekwencji peptydów.
   1. Względną liczebność każdego wykrytego PTM oblicza się za pomocą następującego równania:
      Obfitość względna = Powierzchnia PTM/Całkowita powierzchnia niezmodyfikowanych i PTM dla danego peptydu

Results

Oddolny proteomiczny przepływ pracy (Rysunek 7) zazwyczaj obejmuje następujące czynności: ekstrakcję docelowego białka (białek) z surowej próbki, następnie ilościowe określenie stężenia białka (białek), a następnie frakcjonowanie, zwykle za pomocą elektroforezy żelowej lub chromatografii cieczowej. Po frakcjonowaniu białka są trawione za pomocą enzymu proteolitycznego (często trypsyny), a na koniec analiza spektrometryczna mas otrzymanych peptydów i identyfikacja białek przy użyciu ustalonej bazy danych¹⁸. Informacje o sekwencji pochodzą z jonów prekursorowych we wskazanym zakresie od masy do ładunku (m/z), które są poddawane dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID), tworząc wzorce fragmentacji, które należy zidentyfikować i zsekwencjonować za pomocą bazy danych¹⁹ (Rysunek 8).

Dla tej pracy, głównym celem było opracowanie i zastosowanie metody LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA zgodnie z krokami opisanymi wcześniej w sekcji protokołu. Określenie pozycyjności modyfikacji potranslacyjnych na peptydach izomerycznych i izobarycznych stanowiło szczególne wyzwanie w zakresie identyfikacji i interpretacji widma. W tym badaniu jako próbki użyto rekombinowanych wzorców histonów ludzkich i komórek HeLa S3.

Analiza ludzkich standardów histonów metodą PTM histonów za pomocą ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS dała peptydy średniej i dużej wielkości (o długości 3-30 aminokwasów), które zawierały aż 5 ładunków na peptyd. Procedura propionylacji okazała się skuteczna w wytwarzaniu dłuższych, bardziej informacyjnych peptydów niż te zwykle wytwarzane przez trawienie tryptyczne. Po analizie danych zidentyfikowano peptydy w różnie zmodyfikowanych stanach. Zaletą metody opartej na TIMS jest rozróżnienie niektórych pozycyjnych peptydów izomerycznych przenoszących te same PTM. Na przykład dwa gatunki izomeryczne mogą nakładać się na siebie pod względem czasu retencji i m/z; jednak te dwa sygnały mogą być rozdzielone w domenie mobilności (Rysunek 9).

Odpowiednie widma fragmentacji dla peptydów pokazanych w Rysunek 9 zostały opisane przez oprogramowanie do analizy proteomicznej przy użyciu odpowiednich plików FAPSA. W Rysunek 9A, niezmodyfikowany peptyd jest widziany z trzema grupami propionylowymi (+56,03) (na N-końcu, lizyna 18 i lizyna 23). W klasie Rysunek 9B, peptyd jest obserwowany z grupą acetylową (+42.02) na lizynie 18 i dwiema grupami propionylowymi (jedną na N-końcu i jedną na lizynie 23). Wreszcie, w Rysunek 9C peptyd jest widoczny z acetylacją obserwowaną na lizynie 23 i dwóch grupach propionylowych (na N-końcu i lizynie 18). Jak opublikowano wcześniej, przewaga PASEF może być wykorzystana do zwiększenia szybkości i czułości sekwencjonowania poprzez wielokrotne celowanie w tę samą funkcję⁹. Dzięki temu użytkownik może uzyskać więcej informacji strukturalnych z próbek biologicznych. W tym przypadku odnosi się to do rodzaju i położenia PTM występujących na każdym histonie.

Analiza modyfikacji potranslacyjnej może być również przedstawiona wizualnie jako wykres pokrycia sekwencji, jak widać na Rysunek 10. W Rysunek 10A, wzorzec histonu H3, który został propionylowany przed trawieniem, prezentuje dłuższe peptydy, niż wynikałoby to w innym przypadku, oznaczone niebieskimi liniami. Histony wyekstrahowane z komórek HeLa S3 zostały przetworzone w ten sam sposób, jak to jest reprezentowane przez Rysunek 10B. Wskazano kilka PTM, w tym wiele różnych wzorców w tych samych pozycjach aminokwasów. Należy się tego spodziewać po próbkach biologicznych. Warto zauważyć, że kilka szarych linii w Rysunek 10B oznacza peptydy, które zostały zidentyfikowane niejednoznacznie z powodu braku MS² wynikającego z niskiej intensywności.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie i produkcja końcówek stolika. (A-G) Przewodnik krok po kroku na temat produkcji końcówki z tarczą krzemionkową C18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przetwarzanie danych: 20210804 Propionylowane standardowe histony Mix_QC peptyd. Przed przystąpieniem do przetwarzania danych należy przygotować teoretyczną listę możliwych stanów ładunku i ich fragmentacji (1550.9013; 775.9543; 517.6386; itd.), aby wyodrębnić te wartości z chromatogramu pików bazowych (BPC + All MS). Po wyekstrahowaniu każdego peptydu upewnij się, że wygląda on tak, jak na liście analiz pokazanej na rysunku. Jako przykład wybrano szczyt 775.9543. Po prawej stronie rysunku pokazano trzy wykresy: pierwszy odpowiada chromatogramowi (wykres intensywności w funkcji czasu), drugi mobilogramowi, a trzeci widmu mas z uwzględnieniem fragmentacji PASEF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: kroki 1-4 protokołu timsControl. Na rysunku przedstawiono pierwsze cztery kroki procedury timsControl. W lewym górnym rogu kliknij przycisk Instrument, aby włączyć lub wyłączyć połączenie między instrumentem a oprogramowaniem. Przed wykonaniem jakiegokolwiek zadania należy upewnić się, że oprogramowanie jest w trybie pracy. Na koniec sprawdź, czy parametry TIMS są poprawne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Parametry źródłowe. W tym przypadku strzykawka Hamilton 500 μL została użyta tylko do TuneMix. Sprawdź, czy pozostałe parametry są nadal poprawne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Kalibracja masy do ładunku (m/z). Wybierz Kalibruj, aż zostanie uzyskany wynik 100% w lewym dolnym panelu Tryb kalibracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Kalibracja mobilności. Wybierz Kalibruj, aż zostanie uzyskany wynik co najmniej 98.5% w trybie kalibracji w lewym dolnym panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Typowy przepływ pracy proteomiki od dołu do góry. Procedury oddolne krok po kroku, od przygotowania próbki do identyfikacji⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Czas retencji, wzór izotopowy i profile mobilności H3 18-26. (A) niezmodyfikowany propionylowany, (B) peptyd K23Ac propionylowany w pozostałych dwóch pozycjach, oraz (C) K18Ac propionylowany w pozostałych dwóch pozycjach. Zwróć uwagę na zalety separacji mobilności w przypadku izomerów strukturalnych pokazanych na panelach B i C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Przykład sekwencjonowania peptydów fragmentacyjnych MS/MS przy użyciu PASEF. Widma fragmentów uzyskano z oprogramowania do analizy proteomicznej peptydu H3 o pozycjach aminokwasów 18-26. (A) niemodyfikowany propionylowany, (B) peptyd K23Ac propionylowany w pozostałych dwóch pozycjach i (C) K18Ac propionylowany w pozostałych dwóch pozycjach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Przykład wizualnego podsumowania analizy PTM histonów. Wyniki obserwowanych peptydów i PTM z (A) wzorca H3 i (B) H3 z komórek HeLa S3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Charakterystyka MS/MS peptydu standardowego i HeLa S3 LC-TIMS-ToF. Lista docelowych i obserwowanych peptydów, w tym właściwości eksperymentalne (tj. czas retencji, m/z, 1/K_o i obszary pików LC). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

Histony to podstawowe białka, które regulują strukturę chromatyny poprzez interakcję z DNA w postaci oktamerów składających się z czterech histonów rdzeniowych (po dwa z H2A, H2B, H3 i H4)²⁰. Histony zawierają liczne reszty lizyny i argininy, które są łatwo modyfikowane, co prowadzi do rozległych PTM, które zmieniają chemię chromatyny, wpływając na funkcję histonów lub wiążąc się z innymi białkami komórkowymi²¹. PTM mogą wywoływać reakcje biologiczne poprzez pracę w tandemie, przy czym określone grupy PTM zostały zgłoszone w kilku chorobach, w szczególności w kilku typach raka²².

Kiedy uszkodzenie DNA zostanie rozpoznane na poziomie komórkowym, natychmiast następuje działanie złożonej kaskady sygnalizacyjnej, w której zaznaczane są zmiany, a następnie następuje koordynacja progresji cyklu komórkowego i aktywacja wymaganych szlaków naprawczych. Ponadto uszkodzenie DNA indukuje różne modyfikacje, takie jak addukty acetylowe i metylowe, które ułatwiają rekrutację białek²³. Ogromna różnorodność PTM, które są zaangażowane w uszkodzenia DNA, prowadzi do pytania, w jaki sposób te mechanizmy molekularne regulują swoje współistnienie i jakie jest funkcjonalne znaczenie obrony integralności genomu za pomocą niezwykle złożonej zintegrowanej sieci. Na przykład trimetylacja histonu H3 (H3K9me3) lizyny 9 została powiązana z różnymi patologiami w różnych chorobach²⁴. Z takich powodów konieczne jest opracowanie instrumentalnych metodologii analitycznych, które pozwolą na pełną charakterystykę tych modyfikacji na poziomie komórkowym²³.

Analiza ekstrakcji histonów HeLa S3 przy użyciu oprogramowania do ręcznej analizy danych i oprogramowania do analizy proteomicznej ujawniła PTM, w tym acetylację (+42,01 Da), metylo-propionylację (+70,04 Da), dimetylację (+28,03 Da) i trimetylację (+42,05) dla kilku białek histonowych. Ponadto metoda MS/MS oparta na projekcie PASEF była w stanie zróżnicować niektóre pozycyjne peptydy izomeryczne przenoszące te same PTM.

We wstępie opisano pokrótce zalety sprzężenia LC-TIMS-ToF MS/MS w badaniu PTM w celu pokazania najnowszych osiągnięć DDA wykorzystujących równoległą akumulację w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana zderzeniem. Główną ideą jest ustanowienie metodologii, która pozwoli na rozdzielczość sygnałów pochodzących z różnych peptydów, a do tej pory klasyczne techniki nie były w stanie tego rozwiązać. Proces derywatyzacji przy użyciu bezwodnika propionowego zapobiega rozszczepianiu C-końców lizyny przez trypsynę, generując dłuższe, bardziej informacyjne peptydy. Peptydy o tym samym m/z i czasie retencji były w stanie zidentyfikować na podstawie ich wzorców fragmentacji, ale zaobserwowano również, że niektóre z tych gatunków można oddzielić w domenie mobilności za pomocą tej metody LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS.

Aby lepiej to zrozumieć, rysunek 8 przedstawia trzy główne cechy dowolnej cząsteczki, umożliwiając w ten sposób identyfikację związku, niezależnie od tego, czy są to nienaruszone białka, lipidy czy peptydy (w tym przypadku histon H3 18-26), by wymienić tylko kilka przykładów. Cechy te obejmują czas retencji (min) związku w kolumnie chromatograficznej, stosunek masy do ładunku (m/z) każdego związku oraz ruchliwość (1/K_o), jaką wykazują te związki podczas interakcji z gazem dryfującym. Na rysunku 8A pokazano, że niezmodyfikowany peptyd H3 18-26 ma RT 28,15 min i że prezentuje dwa pasma w swoim spektrum ruchliwości, co wskazuje, że ma co najmniej dwie konformacje, wynik, który podejrzewa się, że jest wynikiem dwóch lizyn (18 i 23), które zostały propionylowane zgodnie z wcześniej opisanym protokołem. Poniższe widma (Rysunek 8B,C) pokazują ten sam peptyd (H3 18-26), ale zmieniający położenie grupy acetylacyjnej (42.02) między B, K18Ac i C, K23Ac. Te dwa izomery (K18Ac i K23Ac) zostały zidentyfikowane za pomocą mobilogramu, ponieważ mają różne rozkłady przestrzenne, co skutkuje różnymi interakcjami z gazem w komórce TIMS. Znaczenie tej metody polega na możliwości zidentyfikowania i bardziej szczegółowego zbadania różnych PTM, które zostały powiązane z różnymi chorobami, na przykład poprzez uszkodzenie DNA.

W przypadku gdy dane dotyczące fragmentacji są nieliczne, identyfikacja modyfikacji w określonej pozostałości jest trudna, ponieważ dwie lub więcej różnych modyfikacji może wystąpić jednocześnie w tych samych pozostałościach (lub w pobliżu) tych samych pozostałości i może być rozumiana jako pojedyncza modyfikacja²⁵. Problem ten można rozwiązać, upewniając się, że niezmodyfikowany peptyd został zidentyfikowany, zwłaszcza przy użyciu wzorca do potwierdzenia lub zaprzeczenia obecności pojedynczej modyfikacji, a nie wielu modyfikacji (Tabela 1).

Aby uniknąć nadmiernego zanieczyszczenia lub ekstrakcji zanieczyszczonych histonów, ważne jest, aby przed użyciem sprawdzić jakość odczynników. Na przykład, jeśli roztwór buforowy NIB jest przechowywany i używany luzem, należy upewnić się, że roztwór jest klarowny i nie wykazuje zmętnienia lub nieprawidłowej prezentacji. Zmętnienie może być wynikiem rozwoju bakterii, które zanieczyściłyby próbki i mogłyby doprowadzić do powstania mieszaniny histonów i białek bakteryjnych. Ponadto zaleca się przygotowanie świeżych krzywych kalibracyjnych do testów, takich jak test BCA lub test Bradforda stosowany do oznaczania stężenia białka, zapewniając, że białko użyte do krzywej kalibracyjnej nie jest wygasłe lub zdegradowane.

Metodę tę można rozszerzyć na inne typy komórek lub organizmów, na przykład komary. W przypadku organizmów całych lub częściowych wybór odpowiedniej liczby organizmów jest szczególnie ważny, aby zapewnić, że końcowe stężenie histonów jest odpowiednie do analizy.

Ponadto, jako ogólną wskazówkę dotyczącą konserwacji spektrometru masowego, przód powinien być okresowo czyszczony, aby zapobiec gromadzeniu się osadów na przyrządzie i zanieczyszczeniu między cyklami. To czyszczenie powinno obejmować kurtynę, kryzę i kwadrupol, w zależności od potrzeb.

Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku stosowania LC należy wziąć pod uwagę przygotowywanie co tydzień świeżej fazy ruchomej przy użyciu rozpuszczalników klasy MS. Dobrą praktyką jest przechowywanie dedykowanych pipet i naczyń szklanych do mobilnego przygotowywania faz oraz czyszczenie przewodów LC za każdym razem, gdy do systemu wprowadzane są nowe roztwory. Kolumny ochronne i separacyjne należy zwykle wymieniać odpowiednio co 100-200 iniekcji i 500-1500 iniekcji²⁶. Należy pamiętać o wstrzyknięciu ślepych prób przed i po uruchomieniu partii próbek. Jeżeli w danej partii znajduje się duża liczba próbek, można również rozważyć przeprowadzenie ślepej próby w różnych odstępach czasu w partii.

Protokół zapewnia oparty na PASEF przepływ pracy DDA do wykrywania histonów PTM i różnicowania gatunków izobarycznych i izomerycznych na podstawie ruchliwości jonów.

Protokół ten wymaga intensywnego przygotowania próbki i należy wziąć pod uwagę całkowity czas przygotowania próbki eksperymentalnej. Protokół przygotowania próbki trwa średnio 2-3 dni robocze. Ponadto różnice między laboratoriami i wersjami urządzeń mogą wpływać na ogólną czułość analizy.

Bardzo niewiele programów do analizy danych proteomicznych zostało uznanych za odpowiednie do wykorzystania w analizie histonów metodami oddolnymi bez ręcznej regulacji lub korekty 27,28,29. Wyniki powinny być (przynajmniej na początku) potwierdzone za pomocą ręcznej analizy, która również jest czasochłonna. Jeśli używane jest oprogramowanie analityczne, powinno ono mieć możliwość adnotacji MS/MS, które na ogół są łatwe do potwierdzenia lub odrzucenia.

Warto również wspomnieć, że niemożliwe jest rozdzielenie izomerów za pomocą spektrometrii mas, chyba że wstawi się ogniwo TIMS i nie zastosuje się wartości ruchliwości; na przykład pozycje modyfikacji histonów można określić za pomocą wzorców fragmentacji (PASEF).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010023	Końcówki
do pipet	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μ L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatkowymi
1,5 ml Probówki do mikrowirówek	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	Używaj tych probówek do prostego i bezpiecznego przetwarzania próbek o objętości do 1,5 ml
10 µ L Końcówki do pipet	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex, 10 μ L, niesterylny, niefiltrowany, z koszem
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Roztwór detergentu Surfact-Amps
10x Dulbecco' s PBS bez Ca2+/Mg2+	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL Probówki stożkowe	Corning	352196	Falcon Stożkowe probówki wirówkowe
200 &mikro; L Żelowe końcówki do pipet	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand  Końcówki do ładowania żelu, 1– 200 μ L
200 i mikro; L Końcówki do pipet	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μ L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatymi
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610737	Wstępnie zmieszany bufor do próbek białkowych SDS-PAGE
50 mL Probówki stożkowe	Corning	352070	Falcon
96-dołkowa płaska płyta dolna	Thermo Fisher Scientific	12565501
96-dołkowa, V-Bottom 600 μ L	Axygen	P-DW-500-C-S
Aceton	Sigma Aldrich	179124	odczynnik ACS, ≥ 99,5%
Acetonitryl (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC, Fisher Chemical
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa LC/MS	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	Chlorowodorek AEBSF, 98%
Wodorowęglan amonu, NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra, ≥ 99,5% (T)
Roztwór wodorotlenku amonu, NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	Spełnia specyfikacje ACS, spełnia specyfikacje odczynników do testowania Monografie USP / NF GR ACS
Argon (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 Kolumna HPLC	Wody	186003625	XBridge Peptyd BEH C18 Kolumna, 300 & Aring;, 5 & mikro; m, 4.6 mm X 250 mm, 1K– 15K
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma Aldrich	A7906 Frakcja	szoku cieplnego, pH 7, ≥ 98%
Chlorek wapnia, CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	Bezwodny, proszek, ≥ 97%
Bufor dysocjacji komórek	Thermo Fisher Scientific	13151014
Ceramiczny wafel punktacji	Restek	20116
Kompas DataAnalysis 6.0	Kompas Bruker Datonics
HyStar 6.2	Kompas daltoniczny Bruker
	Bruker Daltonics
timsControl 4.1	Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad	1610436
Deep Well, 96-dołkowa mikropłytka, 2,0 ml	Thermo Fisher Scientific	89237526
Jednorazowe podnośniki komórkowe	Thermo Fisher Scientific	08100240	Podnośniki komórkowe Fisherbrand; Jednorazowe podnośniki szybko usuwają warstwy komórek
Jednorazowe tłuczki do pelletu	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand  tłuczki do peletów; Zawiesić granulki białka i DNA lub zmielić tkanki miękkie w probówkach do mikrowirówek
Ditiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
Kwas mrówkowy (FA)	Sigma Aldrich	695076	odczynnik ACS, ≥ 96%
Kapilara z topionej krzemionki 75 μ m ID x 363 μ m OD(	Molex (Polymicro)	TSP075375
Lodowaty kwas octowy	Thermo Fisher Scientific	A38S	Kwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS),
pipety Pasteura ze szkła	Fisher Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
Wysokowydajny chromatograf cieczowy	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Kwas solny, HCl	Sigma Aldrich	258148	odczynnik ACS, 37%
Hypercarb 30-40 μ m Węgiel 150– 300 i Aring;	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Wkład Hypersep	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS Wzorzec kalibracji, do ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
Chlorek magnezu, MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Bezwodny, ≥ 98%
Metanol, do HPLC	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima do HPLC, Fisher Chemical
Adaptery probówek do mikrowirówek	GL Sciences	501021514
Microcystin	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences  Fiolka na próbkę Microcystin-LA
MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm	LEAP PAL Części	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Model naukowy	: ND3300
Azot (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
Paski wskaźnika pH, Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	Model: Hydrion
Chlorek potasu, odczynnik KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS, 99,0%– 100,5%
ciśnieniowa komórka iniekcyjna	Next Advance	model: PC77
Bezwodnik propionowy	Sigma Aldrich	8.00608	Do syntezy
Wirówka z chłodzeniem (700– 18 000 x g)	NuAire, model: Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE Żele	Bio-Rad	4569035	Dowolna prefabrykowany żel poliakrylamidowy kD, 8,6 cm i razy; 6,7 cm (W &czas; L), do stosowania z komórkami do elektroforezy Mini-PROTEAN
Maślan sodu	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
chlorek sodu, odczynnik ACS NaCl	Sigma Aldrich	S9888	≥ 99.0%
Dysk SPE, C18	VWR	76333-134	Empore Dysk SPE, C18, CDS Analityczny, 90 mm x 0.5 mm, 12 i mikro; m
Pompa próżniowa SpeedVac+ i wirnik płytowy	Model Savant	: SC210A
		1.07651	odpowiedni do mikrobiologii
Kwas siarkowy, H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99,999%
Spektrometr masowy TIMS-ToF	Bruker Daltonics		Tims tof ms
Roztwór kwasu trichlorooctowego, TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1  N
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Nadaje się do HPLC, ≥ 99,0%
Triversa Nanomate	Advion	model: TR263
Proteaza trypsynowa, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057
Rotator rurowy	Thermo Fisher Scientific	88881001
Mieszalnik Vortex	Thermo Fisher Scientific	88880017
Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS Grade	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific