Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65589

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

W tym artykule

Podsumowanie

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Streszczenie

Białka histonowe są bardzo obfite i zachowane wśród eukariontów i odgrywają dużą rolę w regulacji genów w wyniku struktur znanych jako modyfikacje potranslacyjne (PTM). Identyfikacja pozycji i charakteru każdego PTM lub wzorca PTM w odniesieniu do czynników zewnętrznych lub genetycznych pozwala na statystyczne skorelowanie tych informacji z reakcjami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja lub naprawa DNA. W niniejszej pracy opisano wysokoprzepustowy protokół analityczny do wykrywania histonów PTM w próbkach biologicznych. Zastosowanie komplementarnej chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) umożliwia separację i przypisanie PTM najbardziej istotnych biologicznie modyfikacji w jednej analizie. Opisane podejście wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w zakresie zależnej akwizycji danych (DDA) z wykorzystaniem równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana zderzeniem. Histonowe PTM są pewnie przypisywane na podstawie ich czasu przechowywania, mobilności i wzorca fragmentacji.

Wprowadzenie

W komórkach eukariotycznych DNA jest pakowane jako chromatyna w funkcjonalne jednostki zwane nukleosomami. Jednostki te składają się z oktamera czterech rdzeniowych histonów (po dwa H2A, H2B, H3 i H4)1,2,3,4. Histony są jednymi z najliczniejszych i najbardziej konserwatywnych białek u eukariontów, które są w dużej mierze odpowiedzialne za regulację genów5. Modyfikacje potranslacyjne histonów (PTM) odgrywają dużą rolę w regulacji dynamiki chromatyny i sterują różnymi procesami biologicznymi, takimi jak transkrypcja, replikacja i naprawa DNA6. PTM występują przede wszystkim na dostępnej powierzchni N-końcowych obszarów histonów, które są w kontakcie z DNA3,7. Jednak modyfikacje ogona i rdzenia wpływają na strukturę chromatyny, zmieniając interakcje międzynukleosomowe i rekrutując określone białka3,8.

Obecnym wyzwaniem podczas proteomiki opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) jest potencjalna koelucja analitów będących przedmiotem zainteresowania. W przypadku analiz zależnych od danych (DDA) przekłada się to na potencjalną utratę kilku jonów prekursorowych podczas procesu akwizycji MS/MS9. Instrumenty do pomiaru czasu przelotu (ToF) rejestrują widma o bardzo wysokiej częstotliwości9,10 (do kilkudziesięciu kHz)11; to sprawia, że są one zdolne do szybkiego skanowania całkowitej ilości jonów prekursorowych w złożonej próbce (MS1), obiecując w ten sposób optymalną czułość i szybkość sekwencjonowania MS/MS (do 100 Hz)9 i czyniąc je idealnymi do analizy próbek biologicznych10. Niemniej jednak czułość dostępna przy tych wysokich szybkościach skanowania jest ograniczona przez szybkość MS/MS9. W celu złagodzenia tych ograniczeń zastosowano dodanie spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów (TIMS) w połączeniu z ortogonalnym kwadrupolowym spektrometrem mas czasu przelotu (qToF). W TIMS wszystkie jony prekursorowe są akumulowane w tandemie i eluowane w funkcji ich ruchliwości, zamiast wybierać pojedyncze masy prekursorów za pomocą kwadrupola9. Równoległa akumulacja szeregowa (PASEF) pozwala na setki zdarzeń MS/MS na sekundę bez utraty czułości9.

Głównym celem tej pracy było pokazanie ostatnich osiągnięć DDA za pomocą równoległej akumulacji w pułapce mobilności, po której następuje sekwencyjna fragmentacja i dysocjacja wywołana kolizją (CID). PTM histonów zostały pewnie przypisane na podstawie ich czasów retencji (RT), ruchliwości i wzorców fragmentacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Próbki histonów zostały pobrane przy użyciu metody zaadaptowanej z Bhanu et al. (2020)12.

1. Przygotowanie próbki

  1. Pobieranie hodowanych komórek
    1. Gdy komórki są w 80% zlewne, upewnij się, że są żywotne, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.
      UWAGA: Do tych eksperymentów użyto linii komórkowej HeLa S3, ale tę metodę można zastosować do dowolnych hodowanych komórek.
    2. Odessać pożywkę, a następnie nałożyć 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) na każdą płytkę.
    3. Zamieszać płytkę (płytki), aby wypłukać wszystkie pozostałe media, a następnie odessać PBS i nałożyć 5 ml 1x PBS.
    4. Delikatnie oddziel komórki od płytki, zeskrobując je jednorazowym podnośnikiem do komórek.
    5. Przenieść zawiesinę każdej komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    6. Granulować komórki, odwirowując przy 800 x g przez 5 minut.
    7. Odessać PBS z osadu komórkowego.
    8. Przejdź do ekstrakcji histonów.
      UWAGA: Błyskawicznie zamroź osad komórkowy w ciekłym azocie, jeśli nie można go natychmiast przetworzyć. Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kontynuowania.
  2. Ekstrakcja histonów
    1. Oszacuj objętość każdej osadu komórkowego i oznacz łąkotkę trwałym markerem.
    2. Przygotować wystarczającą ilość buforu do izolacji jądrowej (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 i 250 mM sacharozy) dla wszystkich próbek. Alternatywnie, jeśli z czasem konieczne jest przetworzenie wielu próbek, należy sporządzić bufor luzem i przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 6 miesięcy lub podwielokrotność i zamrozić w temperaturze od -15 °C do -25 °C w nieskończoność, rozmrażając tylko ilość niezbędną do każdej ekstrakcji.
      UWAGA: Bufor powinien pozostać czysty podczas przechowywania. Jeśli w dowolnym momencie bufor stanie się mętny lub w inny sposób nietypowy, należy wyrzucić i przygotować nowy bufor.
    3. Przygotować 50-krotność objętości granulek komórkowych buforu do przemywania i dodać inhibitory w następujący sposób (około 10 ml buforu do przemywania na 2 próbki).
      1. Aby przygotować 10 ml buforu do przemywania należy zmieszać 10 ml NIB, 30 μl 200 mM chlorowodorku 4-(2-aminoetylo)benzenesulfonylu [AEBSF], 10 μl 1 M ditiotreitolu [DTT], 20 μl 5 μM mikrocystyny, 20 μL 5 M maślanu sodu.
    4. Usunąć 1/5 buforu do płukania, aby przygotować bufor do lizy (1/5 objętości z buforu do płukania, alternatywa 0,3% NP-40 lub NP-40).
      UWAGA: Nie używaj Triton-X 100 zamiast alternatywy NP-40 lub NP-40, ponieważ może być zbyt ścierny dla niektórych typów ogniw.
    5. Dokładnie przemyć osad komórkowy, zawieszając go w 5 kolumnach buforu do przemywania i odwirowując w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać ten etap dwukrotnie, zasysając i odrzucając supernatant między płukaniami.
    6. Upewnij się, że objętość osadu komórkowego jest nadal oznaczona trwałym markerem. Zawiesić ponownie w 10 objętościach buforu do lizy.
    7. Dokładnie wymieszaj pipetą każdą granulkę do ponownego zawieszenia, a następnie inkubuj przez 15 minut na lodzie.
    8. Po 15 minutach odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Odessać i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Granulka powinna zmniejszyć się do ≤ 1/2 pierwotnego rozmiaru granulki (zgodnie z linią znacznika). Jeśli osad nie zmniejszył się wystarczająco, powtórz procedurę lizy i włącz delikatny etap homogenizacji za pomocą tłuczka w celu rozbicia komórek.
    10. Po zakończeniu lizy ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do płukania, a następnie odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant, a następnie powtórzyć etap płukania jeszcze raz, aby usunąć wszelkie ślady NP-40,
      UWAGA: W tym momencie osad składa się z chromatyny, która zawiera histony.
    11. Zawiesić osad w 5 objętościach (o pierwotnym rozmiarze osadu o oczku komórkowym) 0,4 NH2SO4.
    12. Inkubować przez 2 godziny w chłodni lub lodówce za pomocą mieszadła.
    13. Po 2 godzinach odwirować próbkę(-i) o sile 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Nie należy wyrzucać supernatantu.
    14. Przenieść supernatant do nowych probówek i zwiększyć 100% kwas trichlorooctowy (TCA) do 1/3 objętości zawartości (końcowe stężenie TCA wyniesie około 20%).
    15. Delikatnie odwrócić probówkę i obserwować, że klarowny, bezbarwny roztwór zmienia kolor na biały i/lub mętny, co wskazuje na wytrącanie się białka.
      UWAGA: W przypadku roztworów o niskich stężeniach histonów wytrącanie białka może nie być od razu zauważalne, ale osad powinien być widoczny po całonocnej inkubacji.
    16. Inkubować bez zakłóceń przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 4 °C w celu całkowitego wytrącenia białek histonowych.
    17. Następnego dnia odwirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    18. Zassać supernatant, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety boków rurki. Na tym etapie histony są osadzane głównie w postaci filmu wokół boków rurki (rurek).
    19. Dodać 500 μl lodowatego acetonu + 0,1% HCl (kwaśnego acetonu) do każdej probówki za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie delikatnie odwrócić probówkę (probówki) kilka razy. Ułóż próbki w kolejności (1, 2, 3 itd.), ponieważ każdy błędny aceton może usunąć oznaczenia z probówek. Wirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie zdekantować supernatant.
    20. Powtórz ten etap płukania 500 μl lodowatego 100% acetonu, również za pomocą szklanej pipety Pasteura. Wirować przy 3400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie zdekantować supernatant.
    21. Pozostaw probówki otwarte do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż pozostały aceton wyparuje.
    22. Po wyschnięciu dodaj 100 μl wody klasy spektrometrii mas (MS) do każdej probówki. Użyj tej kropli do przetarcia wszystkich boków pojemnika, aby ponownie zawiesić całą folię histonową. W tym celu należy pipetować kroplę na bok probówki i obracać ją podczas pipetowania w górę i w dół lub dozując połowę 100 μl i mieszając ją dookoła za pomocą końcówki. Najlepiej sprawdza się połączenie obu metod. Histony są łatwo rozpuszczalne w wodzie i będą w roztworze.
    23. Po ponownym wymieszaniu wszystkich próbek, jeśli pozostały jakiekolwiek białe ciała stałe, należy przeprowadzić sonikację w kąpieli w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    24. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść klarowny roztwór do świeżych probówek. Wyrzuć wszelkie pozostałe nierozpuszczalne osady.
    25. Uruchom SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych, aby sprawdzić, czy ekstrakcja jest czysta.
      UWAGA: Żele mogą być uruchamiane przy użyciu dowolnego odpowiedniego stężenia poliakrylamidu, o ile jest on w stanie różnicować białka w zakresie 10-20 kDa. Patrz Tabela Materiałów dla żeli używanych w tym protokole.
    26. Wykonaj test stężenia białka (tj. Bradford lub BCA), aby określić całkowite stężenie białka.
  3. Derywatyzacja chemiczna (propionylacja) reszt lizyny
    1. Przenieś 20 μg histonów (oznaczonych za pomocą testu białka) do czystej probówki. Wysuszyć tę próbkę do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego, a następnie ponownie zawiesić przy użyciu 20 μl 100 mM wodorowęglanu amonu (NH4CO3 ) (~1 μg/μL roztworu). W razie potrzeby dostosuj pH do ~8 za pomocą wodorotlenku amonu.
      UWAGA: Nie używaj wodorotlenku amonu (NH4OH) do ponownego zawieszania, tylko do regulacji pH, jeśli to konieczne. W przeciwnym razie białka ulegną denaturacji i wytrącą się.
      UWAGA: Aby sprawdzić pH przy minimalnym ubytku próbki, użyj końcówki pipety, aby zanurzyć w próbce i nanieść na pasek pH. Ta procedura testowa będzie przydatna na pozostałych etapach przygotowania próbki.
    2. Przygotować odczynnik do propionylacji, dodając bezwodnik propionowy do acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:3 (v/v) (tj. aby otrzymać 40 μl odczynnika, połączyć 10 μl bezwodnika propionowego z 30 μl ACN).
      UWAGA: Tradycyjnie, metanol lub izopropanol były używane do przygotowania odczynnika propionylacji. Ponieważ propionylacja jest reakcją tworzenia amidu, rozpuszczalnik nieprotonowy, taki jak acetonitryl, jest wymagany, aby zapobiec niepożądanym produktom ubocznym i reakcjom, takim jak ester metylu propionylu, który wynika ze stosowania metanolu. Przygotuj tylko tyle odczynnika propionylacyjnego na maksymalnie 4 próbki na raz, aby odczynnik pozostał świeży. Odczynnik należy zużyć w ciągu 1-2 minut od przygotowania. Gdy odczynnik usiądzie, bezwodnik propionowy będzie reagował z wilgocią otoczenia i zacznie tworzyć się kwas octowy, który może zmienić skuteczność odczynnika i zmienić pH roztworu histonu po dodaniu odczynnika.
    3. Dodać odczynnik propionylacji do każdej próbki w stosunku 1:4 (v/v) (tj. na 20 μl histonów dodać 5 μl odczynnika propionylacyjnego).
    4. Szybko dodaj 1:5 (v/v) NH4OH (tj. dodaj 4 μL na 20 μL roztworu histonów), aby przywrócić pH roztworu do ~8. Jeśli pH jest nadal zbyt niskie, dodawaj jednorazowo 1-2 μl NH4OH, aż do osiągnięcia pH 8. Zazwyczaj stosunek 1:5 (v/v) jest wystarczający.
    5. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut bez zakłóceń.
    6. Powtórzyć reakcję propionylacji dla nie więcej niż 3-4 próbek na partię odczynnika propionylacji, aby zapewnić minimalne tworzenie się kwasu.
    7. Powtórzyć kroki procedury propionylacji 1.3.2-1.3.5. Druga runda propionylacji zapewnia, że >95% dostępnych lizyn jest derywatyzowanych.
    8. Wysuszyć próbki do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego. Spowoduje to odparowanie wszelkich nieprzereagowanych odczynników propionylacji, produktów kwaśnych i amoniaku uwolnionego z NH4OH. Jeśli próbki całkowicie wyschną, nie ma nic złego w tym, że nie dochodzi do znacznych strat próbki.
      UWAGA: Przed przechowywaniem wypier powietrze z butelki bezwodnika propionowego z argonem, aby zapobiec tworzeniu się kwasu octowego w wyniku kontaktu z wilgocią otoczenia pozostającą w butelce.
  4. Trawienie proteolityczne z trypsyną
    1. Zawiesić histony w 100 mM NH4HCO3 do uzyskania objętości 20 μl, osiągając optymalne stężenie 1 μg/μL.
      UWAGA: Roztwory próbek o stężeniach niższych niż 1 μg/μL spowodują zmniejszenie wydajności trypsyny.
    2. Dodaj trypsynę do próbek histonów w stosunku 1:10 (wag./wag.) (tj. dodaj 2 μl 1 μg/μl roztworu trypsyny do 20 μg histonów).
    3. Reakcje inkubować w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin. Alternatywnie inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze pokojowej.
    4. Przerwać trawienie przez zamrożenie w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h.
      UWAGA: Nie używaj kwasu do wygaszania reakcji trawienia, ponieważ spowoduje to niepożądany spadek pH na tym etapie zabiegu. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowa do dalszego postępowania (tymczasowy punkt zatrzymania).
  5. Derywatyzacja chemiczna (propionylacja) N-końców peptydów
    1. Wysuszyć próbki do <5 μl za pomocą koncentratora próżniowego.
    2. Zawiesić próbki do 20 μl (1 μg/μl) przy użyciu 100 mM NH4HCO3.
    3. Powtórzyć propionylację jak poprzednio (krok 1.3).
      UWAGA: To normalne, że próbki schną dłużej na tym etapie ze względu na wyższy stosunek fazy wodnej do organicznej.
  6. Odsalanie próbek za pomocą końcówek etapowych
    1. Zawiesić lub rozcieńczyć próbki w 50 μl wody klasy MS + 0,1% TFA.
    2. Za pomocą rdzenia 11-G wydziurkować 5 krążków materiału C18 z dysku do ekstrakcji do fazy stałej (przebić wszystkie 5 krążków przed przeniesieniem na końcówkę pipety). Włóż i upewnij się, że krążki są bezpiecznie i równomiernie zaklinowane na dnie końcówki do pipety o pojemności 200 μl (Rysunek 1).
      UWAGA: Użyj rdzenia 15-G w przypadku odsalania ponad 25 μg próbki przez pojedynczą końcówkę stopnia.
    3. Użyj adaptera wirówki, aby przytrzymać końcówki stage na miejscu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1.5 ml lub 2 ml.
      UWAGA: Dla poniższych etapów wirowania należy stosować powolne (400-500 x g) obroty w temperaturze 4 °C, jednorazowo przez 1-2 minuty; rozpuszczalniki zwykle przechodzą przez żywicę w czasie krótszym niż 1 minuta, w zależności od tego, jak ciasno materiał C18 jest upakowany w końcówkach.
    4. Wypłucz żywicę, odwirowując 50 μl 100% acetonitrylu, aby aktywować materiał C18 i usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
      UWAGA: Ładowanie roztworów na końcówki stage za pomocą końcówek do pipet z żelem może być łatwiejsze. Po aktywacji materiału C18 ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia żywicy na czas procedury odsalania.
    5. Zrównoważyć materiał dysku z 80 μl wody klasy MS + 0,1% TFA przez odwirowanie.
    6. Zakwasić próbkę do pH 4 lub niższego przy użyciu lodowatego kwasu octowego. Sprawdź pH za pomocą pasków pH, jak poprzednio, aby zminimalizować utratę próbki.
    7. Załadować całą próbkę na krążek żywicy przez powolne wirowanie.
    8. Przepłukać próbkę 80 μl wody klasy MS + 0,1% TFA przez odwirowanie.
    9. Eluować próbkę do czystej probówki o pojemności 1,5 ml, przepłukując 70 μl 75% acetonitrylu i 0,5% kwasu octowego przez powolne wirowanie. Można zastosować dodatkowy czas wirowania, aby zapewnić wymycie pełnej objętości próbki z końcówki stolika. Nie ma nic złego w tym, że żywica wyschnie po dodatkowym czasie wirowania, ponieważ nie jest już potrzebna po elucji próbki.
    10. Całkowicie wysuszyć każdą próbkę w koncentratorze próżniowym.
      UWAGA: Próbka(i) może być przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do kontynuowania (tymczasowy punkt zatrzymania).
    11. Do analizy LC-MS/MS należy rozpuścić próbki w objętości rozpuszczalnika A (0,1% kwasu mrówkowego) z protokołu chromatografii cieczowej (LC), który daje końcowe stężenie 0,4 μg/μL (tj. rozpuścić 20 μg histonów w 50 μl rozpuszczalnika A).

2. Interfejs oprogramowania TIMS

  1. Wybierz kartę Instrument i przełącz się na Obsługa (sprawdź, czy nazwa instrumentu jest podświetlona na zielono) (Rysunek 2).
  2. Sprawdź parametry TIMS (Rysunek 2).
  3. Sprawdź ustawienia MS (początek skanowania, koniec skanowania, polaryzacja jonów, tryb skanowania) (Rysunek 2).
  4. Sprawdź ustawienia TIMS (tryb, początek mobilności, koniec mobilności, czas narastania, czas akumulacji, cykl pracy, szybkość narastania, szybkość MS, uśrednianie MS i autokalibracja) (Rysunek 2).
  5. Przejdź do zakładki Źródło i aktywuj opcję strzykawki (Hamilton 500 μL) tylko dla kroku kalibracji TuneMix (Rysunek 3)13.
  6. Przejdź do zakładki Kalibracja, kliknij m/z, wybierz Tryb kalibracji i wybierz tryb (ogólnie Enhanced Q), powiększenie (+0,01%) STD Dev (0,24) i kliknij Kalibruj; gdy zostanie osiągnięty wynik 100%, zaakceptuj (Rysunek 4).
  7. Przejdź do zakładki mobilności i powtórz proces kalibracji (ogólnie tryb liniowy), zakres wykrywania (+5%), szerokość (0,1 Da), STD Dev (0,1855), a następnie kliknij kalibruj; gdy uzyskasz wynik ≥ 98,5%, zaakceptuj (Rysunek 5).
  8. Przejdź do metody i wybierz metodę, która ma być używana; w tym przykładzie wybrano Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl (Rysunek 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

  1. Stosować typowe warunki pracy nESI: napięcie kapilarne 4500 V, przesunięcie płyty końcowej 800 V, ciśnienie nebulizatora 3,0 bar, suchy gaz 10,0 l/min, sucha grzałka 200 °C i natężenie przepływu wtrysku 50 μl/min.
  2. Użyj typowych ustawień MS: energia zderzenia 6 eV, RF kolizji 1200 Vpp, czas transferu 75 μs, magazynowanie impulsów wstępnych 5 μs.
  3. Określić przepływ gazu dryftującego na podstawie różnicy ciśnień z leja wejściowego P1 i leja wyjściowego P2. W komórce TIMS zachodzi równoległa akumulacja szeregowa (PASEF), w której wszystkie jony prekursorowe gromadzą się jednocześnie, a nie pojedynczo. Jony prekursorowe są następnie uwalniane w wąskich pikach jonowych w porównaniu z normalnie znacznie szerszymi pikami (około 50 razy krótszymi), zwiększając stosunek sygnału do szumu, jednocześnie oddzielając peptydy koeluujące za pomocą mobility14.
  4. Opracowanie metody LC-TIMS-TOF MS/MS do analizy proteolitycznych peptydów histonowych. Połącz wysokosprawny chromatograf cieczowy (HPLC) wyposażony w kolumnę C18 (300 A, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) z komercyjnym instrumentem TIMS-TOF MS z opatentowaną technologią PASEF.
    UWAGA: Ten rozmiar kolumny został określony w celu zapewnienia dobrej separacji zarówno przy wysokim, jak i niskim pH dla mieszanin peptydowych, na podstawie wcześniej opublikowanych prac15,16,17.
    1. Ustawić objętość iniekcji na 20 μl (8 μg) próbki i natężenie przepływu 0,4 ml/min.
    2. Przeprowadź 60-minutowy, nieliniowy gradient LC, używając wody z 0,1% kwasem mrówkowym (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym (rozpuszczalnik B). Ustaw gradient: 10% B na 2,7 min, następnie na 20% B w 5,3 min, 28% B w 4 min, 35% B w kolejne 18 min, na 40% B w 13 min i 100% B w kolejne 2 min. Po utrzymaniu 100% B przez 5 minut, zmniejsz stężenie do 10% B w ciągu 5 minut i przytrzymaj przez ostatnie 5 minut.
  5. Sprawdzić elucję próbki z HPLC do TIMS-TOF poprzez jonizację nano-elektronrozpylania (nESI) w trybie jonizacji dodatniej.

4. Analiza danych

  1. Zidentyfikuj sekwencje peptydowe i miejsca modyfikacji.
    1. Przygotuj teoretyczną listę peptydów za pomocą ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] w narzędziu MS-digest.
      1. Przeprowadzić teoretyczny przegląd, biorąc pod uwagę warunki trawienia (użyty enzym), rodzaje poszukiwanych PTM (np. mono-, di- lub trimetylacja), zakres wielkości poszukiwanych peptydów, a także zakres wykrywania masy i potencjalną liczbę pominiętych rozszczepień.
  2. Ręcznie przeanalizuj uzyskane dane w oparciu o teoretyczne peptydy (Rysunek 6)12.
    1. Poszukuje się mas w kilku stanach naładowania (+1 do +4) dla każdego teoretycznego peptydu.
    2. Po wstępnej identyfikacji każdego m/z wybierz pik i potwierdź MS/MS, korzystając z teoretycznej listy jonów fragmentacyjnych opartej na sekwencji peptydowej, w tym PTM.
      UWAGA: Jeśli ruchliwość zidentyfikowanego peptydu była znana wcześniej, jest to również potwierdzone.
  3. Oblicz względną obfitość różnych PTM i podaj każdą modyfikację jako procent określonej sekwencji peptydów.
    1. Względną liczebność każdego wykrytego PTM oblicza się za pomocą następującego równania:
      Obfitość względna = Powierzchnia PTM/Całkowita powierzchnia niezmodyfikowanych i PTM dla danego peptydu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przepływ pracy w proteomice oddolnej (Rycina 7) zazwyczaj obejmuje następujące etapy: ekstrakcję białka lub białek docelowych z surowej próbki, następnie oznaczanie stężenia białek, a następnie frakcjonowanie, zazwyczaj za pomocą elektroforezy w żelu lub chromatografii cieczowej. Po frakcjonowaniu białka są trawione za pomocą enzymu proteolitycznego (często trypsyny), a na koniec przeprowadza się analizę spektrometrią mas powstałych peptydów oraz identyfikację białek z wykorzystaniem uznanej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Histony to podstawowe białka, które regulują strukturę chromatyny poprzez interakcję z DNA w postaci oktamerów składających się z czterech histonów rdzeniowych (po dwa z H2A, H2B, H3 i H4)20. Histony zawierają liczne reszty lizyny i argininy, które są łatwo modyfikowane, co prowadzi do rozległych PTM, które zmieniają chemię chromatyny, wpływając na funkcję histonów lub wiążąc się z innymi białkami komórkowymi21. PTM mogą wywoływać reakcje biologiczne poprzez pracę w tandemi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Melvin A. Park i Matthew Willetts są pracownikami firmy Bruker Daltonics Inc., producenta przyrządu timsTOF.

Podziękowania

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr. HRD-1547798 i nr grantu HRD-2111661. Granty NSF zostały przyznane Florida International University w ramach programu Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Jest to wkład numer 1672 z Institute of Environment, wybitnego programu na Florida International University. Dodatkowego wsparcia udzielił Narodowy Instytut Zdrowia w ramach Grantu nr Piłsudskiego. R21AI135469 Francisco Fernandez-i Grant No. R01HD106051 Benjaminowi A. Garcii, a także przez National Science Foundation w ramach grantu nr CHE-2127882 do Benjamina A. Garcii. Autorzy chcieliby podziękować za początkowe wsparcie dr Mario Gomeza Hernandeza podczas początkowego rozwoju metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 stopni Celsjusza; C Zamrażarka
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023Końcówki
do pipetThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μ L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatkowymi
1,5 ml Probówki do mikrowirówekThermo Fisher Scientific14-282-300Używaj tych probówek do prostego i bezpiecznego przetwarzania próbek o objętości do 1,5 ml
10 µ L Końcówki do pipetThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μ L, niesterylny, niefiltrowany, z koszem
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Roztwór detergentu Surfact-Amps
10x Dulbecco' s PBS bez Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL Probówki stożkoweCorning352196Falcon Stożkowe probówki wirówkowe
200 &mikro; L Żelowe końcówki do pipetThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand  Końcówki do ładowania żelu, 1– 200 μ L
200 i mikro; L Końcówki do pipetThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μ L, niesterylne, niefiltrowane, z końcówkami zębatymi
2x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610737Wstępnie zmieszany bufor do próbek białkowych SDS-PAGE
50 mL Probówki stożkoweCorning352070Falcon
96-dołkowa płaska płyta dolnaThermo Fisher Scientific12565501
96-dołkowa, V-Bottom 600 μ LAxygenP-DW-500-C-S
AcetonSigma Aldrich179124odczynnik ACS, ≥ 99,5%
Acetonitryl (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemical
Acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), klasa LC/MSThermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500Chlorowodorek AEBSF, 98%
Wodorowęglan amonu, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥ 99,5% (T)
Roztwór wodorotlenku amonu, NH4OHSigma AldrichAX1303Spełnia specyfikacje ACS, spełnia specyfikacje odczynników do testowania Monografie USP / NF GR ACS
Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 Kolumna HPLCWody186003625XBridge Peptyd BEH C18 Kolumna, 300 & Aring;, 5 & mikro; m, 4.6 mm X 250 mm, 1K– 15K
albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA7906 Frakcjaszoku cieplnego, pH 7, ≥ 98%
Chlorek wapnia, CaCl2Sigma AldrichC4901Bezwodny, proszek, ≥ 97%
Bufor dysocjacji komórekThermo Fisher Scientific13151014
Ceramiczny wafel punktacjiRestek20116
Kompas DataAnalysis 6.0Kompas Bruker Datonics
HyStar 6.2Kompas daltoniczny Bruker
Bruker Daltonics
timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-dołkowa mikropłytka, 2,0 mlThermo Fisher Scientific89237526
Jednorazowe podnośniki komórkoweThermo Fisher Scientific  08100240Podnośniki komórkowe Fisherbrand; Jednorazowe podnośniki szybko usuwają warstwy komórek
Jednorazowe tłuczki do pelletuThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand  tłuczki do peletów; Zawiesić granulki białka i DNA lub zmielić tkanki miękkie w probówkach do mikrowirówek
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Kwas mrówkowy (FA)Sigma Aldrich695076odczynnik ACS, ≥ 96%
Kapilara z topionej krzemionki 75 μ m ID x 363 μ m OD(Molex (Polymicro)TSP075375
Lodowaty kwas octowyThermo Fisher ScientificA38SKwas octowy, lodowaty (certyfikowany ACS),
pipety Pasteura ze szkłaFisher Sigma AldrichBR747725-1000EA
Wysokowydajny chromatograf cieczowy  ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Kwas solny, HClSigma Aldrich258148odczynnik ACS, 37%
Hypercarb 30-40 μ m Węgiel 150– 300 i Aring;Thermo Fisher Scientific60106-402
Wkład HypersepThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Wzorzec kalibracji, do ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Chlorek magnezu, MgCl2Sigma AldrichM8266Bezwodny, ≥ 98%
Metanol, do HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima do HPLC, Fisher Chemical   
Adaptery probówek do mikrowirówekGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences  Fiolka na próbkę Microcystin-LA
MS, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL CzęściLAP.11190933
NanodropThermo Fisher Model naukowy: ND3300
Azot (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
Paski wskaźnika pH, InstachekMicro Essential LabJR-113Model: Hydrion
Chlorek potasu, odczynnik KClSigma AldrichP3911ACS, 99,0%– 100,5%
ciśnieniowa komórka iniekcyjnaNext Advance  model: PC77
Bezwodnik propionowySigma Aldrich8.00608Do syntezy
Wirówka z chłodzeniem (700– 18 000 x g)NuAire, model: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE ŻeleBio-Rad4569035Dowolna prefabrykowany żel poliakrylamidowy kD, 8,6 cm i razy; 6,7 cm (W &czas; L), do stosowania z komórkami do elektroforezy Mini-PROTEAN
Maślan soduThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
chlorek sodu, odczynnik ACS NaClSigma AldrichS9888≥ 99.0%
Dysk SPE, C18VWR76333-134Empore Dysk SPE, C18, CDS Analityczny, 90 mm x 0.5 mm, 12 i mikro; m
Pompa próżniowa SpeedVac+ i wirnik płytowyModel Savant: SC210A
1.07651odpowiedni do mikrobiologii
Kwas siarkowy, H2SO4 Sigma Aldrich33974199,999%
Spektrometr masowy TIMS-ToFBruker DaltonicsTims tof ms
Roztwór kwasu trichlorooctowego, TCASigma AldrichT06996.1  N
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma Aldrich302031Nadaje się do HPLC, ≥ 99,0%
Triversa NanomateAdvionmodel: TR263
Proteaza trypsynowa, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
Rotator rurowyThermo Fisher Scientific88881001
Mieszalnik VortexThermo Fisher Scientific88880017
Woda z 0,1% kwasem mrówkowym (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 
pochodzenia zwierzęcego 1 ml IzotopWzór Kompas daltoniczny chemicznego , Milipor sacharozy Model

Bibliografia

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245(2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756(2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138(2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619(2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60(2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Modyfikacje potranslacyjnerozdział izomerów peptydowychnanoelektrosprayowa jonizacjaProtein Prospectordysocjacja indukowana zderzeniemanaliza wariancji epigenetycznej
Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.