Method Article

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

DOI:

10.3791/65605

⸱

July 28th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest ciężką i potencjalnie śmiertelną chorobą jelit, która była trudna do zbadania ze względu na jej złożoną patogenezę, która pozostaje nie do końca poznana. Patofizjologia NEC obejmuje przerwanie ścisłych połączeń jelitowych, zwiększoną przepuszczalność bariery jelitowej, śmierć komórek nabłonka, dysbiozę mikrobiologiczną i rozregulowany stan zapalny. Tradycyjne narzędzia do badania NEC obejmują modele zwierzęce, linie komórkowe oraz organoidy jelitowe ludzi lub myszy. Chociaż badania z wykorzystaniem tych systemów modelowych poprawiły zrozumienie patofizjologii chorób, ich zdolność do podsumowania złożoności ludzkiego NEC jest ograniczona. Udoskonalony model NEC in vitro wykorzystujący technologię mikroprzepływową, nazwany NEC-on-a-chip. Model NEC-on-a-chip składa się z urządzenia mikroprzepływowego wysiewanego enteroidami jelitowymi pochodzącymi od wcześniaków, współhodowanymi z ludzkimi komórkami śródbłonka i mikrobiomem niemowlęcia z ciężkim NEC. Model ten jest cennym narzędziem do badań mechanistycznych nad patofizjologią NEC i nowym źródłem do testowania nowych leków na choroby jelit u noworodków. W niniejszym manuskrypcie zostanie zamieszczony szczegółowy opis modelu NEC-on-a-chip.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Martwicze zapalenie jelit (NEC) dotyka wcześniaków, z częstością do 10% u urodzonych o wadze < 1500 g1. Patofizjologia NEC jest złożona i obejmuje uszkodzenie nabłonka jelitowego, przerwanie ścisłych połączeń jelitowych, zwiększoną przepuszczalność bariery jelitowej, dysregulację immunologiczną i śmierć komórek nabłonka2,3. Nasza wiedza na temat mechanizmów związanych z patogenezą NEC pozostaje niekompletna i pomimo dziesięcioleci badań nadal nie ma skutecznych terapii celowanych.

Istotną przeszkodą dla rozwoju badań NEC jest ograniczona dostępność i mały rozmiar pierwotnej tkanki jelitowej wyizolowanej od ludzkich niemowląt. Tkanka jelitowa wycięta od niemowląt z NEC jest często martwicza i poważnie uszkodzona, co komplikuje badania nad mechanizmami poprzedzającymi wystąpienie choroby. Na przykład jelito cienkie niemowląt z NEC jest zalane komórkami odpornościowymi, obserwuje się również zmniejszoną liczbę jelitowych komórek macierzystych, zmniejszoną proliferację komórek nabłonka i zwiększoną apoptozę komórek nabłonka4,5,6,7. Prowadzi to do trudności w hodowli komórek nabłonka jelitowego z tych próbek oraz w izolowaniu RNA i białek, które mogą ulec degradacji w tym nieprzyjaznym środowisku zapalnym. Dodatkowo, ponieważ proces chorobowy jest już zaawansowany u niemowląt z chirurgicznym NEC, badania mechanistyczne nad czynnikami wywołującymi chorobę są niewykonalne. Ograniczenia te doprowadziły do polegania na modelach zwierzęcych w badaniach mechanistycznych NEC.

Modele zwierzęce NEC zostały stworzone dla myszy, szczurów, prosiąt, królików i pawianów5,8,9,11. Mocną stroną modeli zwierzęcych jest to, że choroba jelitowa podobna do NEC jest wywoływana przez czynniki związane z wystąpieniem NEC u ludzi, w tym mikrobiom dysbiotyczny, powtarzające się epizody niedotlenienia i brak karmienia mlekiem matki5,8,10,11. Ponadto reakcja zapalna i zmiany patologiczne obserwowane podczas eksperymentalnej NEC równolegle z chorobą człowieka5,9,12. Chociaż modele te naśladują wiele cech ludzkiego NEC, istnieją nieodłączne różnice między patofizjologią NEC u zwierząt i ludzi. Na przykład mysi model NEC jest indukowany u myszy urodzonych o czasie i chociaż ich rozwój jelitowy jest niekompletny, patofizjologia NEC jest z natury inna w tym kontekście klinicznym. Ekspresja genów w jesim jelicie po urodzeniu jest podobna do ekspresji przedzdolnego do życia płodu ludzkiego i nie jest zbliżona do ekspresji wcześniaka w wieku 22-24 tygodni ciąży do dnia 14 (P14)13. To myli mysi model NEC, ponieważ uszkodzenie jelit nie może być generalnie wywołane u myszy po P10. Ponadto szczepy wsobne myszy nie mają immunologicznego14 i różnorodności mikrobiologicznej ludzkich noworodków15, co służy jako kolejny czynnik zakłócający. W związku z tym zwiększone włączenie pierwotnych próbek pobranych od ludzi do badań NEC zwiększa znaczenie kliniczne badań w tej dziedzinie.

Badania nad mechanizmami NEC in vitro tradycyjnie wykorzystywały monotypowe linie komórkowe pochodzące z dorosłych komórek raka jelita, takie jak gruczolakorak jelita grubego (Caco2) i ludzki gruczolakorak jelita grubego (HT-29)16. Modele te są wygodne, ale mają ograniczone znaczenie fizjologiczne ze względu na ich wzrost z dorosłych komórek rakowych, niespolaryzowaną architekturę i zmiany fenotypowe związane z powtarzającymi się pasażami w hodowli. Enteroidy jelitowe są lepsze od tych modeli, ponieważ mogą być hodowane z krypt tkanki jelitowej, różnicowane na wszystkie podtypy nabłonka jelitowego i tworzą trójwymiarową (3D) strukturę podobną do kosmków17,18,19,20. Ostatnio enteroidy jelitowe zostały połączone z technologią mikroprzepływową w celu opracowania modelu jelita cienkiego na chipie i zapewnienia bardziej fizjologicznie odpowiedniego systemu modelowego in vitro21.

Pierwsze urządzenia mikroprzepływowe typu organ-on-a-chip zostały wprowadzone na początku lat 200022,23,24. Pierwszym modelem narządu na chipie było ludzkie oddychanie płuc na chipie25. Następnie powstały liczne modele jednonarządowe, takie jak intestine21, liver26, kidneys27, bone marrow28, blood-brain barrier29 oraz heart30. Te modele narządów na chipie zostały wykorzystane do badania chorób ostrych, przewlekłych i rzadkich, w tym ostrego zespołu popromiennego, 31 przewlekła obturacyjna choroba płuc,32 i choroby neurodegeneracyjne33. Spolaryzowany charakter komórek na tych chipach i obecność dwóch przedziałów komórkowych oddzielonych porowatą błoną pozwala na modelowanie złożonych procesów fizjologicznych, takich jak perfuzja, gradienty stężeń chemicznych i chemotaksja komórek odpornościowych34,35. Te systemy mikroprzepływowe stanowią zatem nowe narzędzie do badania patofizjologii i mechanizmów chorób człowieka.

Model jelita cienkiego na chipie został opisany przez Kasendrę i in. w 2018 roku, którzy wykorzystali pediatryczne (w wieku 10-14 lat) próbki biopsji jelita cienkiego zróżnicowane na enteroidy i wyhodowane na urządzeniu mikroprzepływowym21. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, ciągły przepływ mediów oraz rozciąganie/relaksacja zostały również włączone do tego modelu. Obserwowali różnicowanie podtypów nabłonka jelitowego, tworzenie osi 3D przypominających kosmki, produkcję śluzu i wzorce ekspresji genów w jelicie cienkim21. Ten model mikroprzepływowy został zastosowany do chorób noworodków wraz z opracowaniem systemu NEC-on-a-chip, który obejmuje enteroidy jelitowe noworodków, komórki śródbłonka i mikrobiom noworodka z klasą NEC36. NEC-on-a-chip podsumowuje wiele krytycznych cech ludzkiego NEC, w tym ekspresję genów zapalnych, utratę wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych i zmniejszoną funkcję bariery jelitowej36. W związku z tym model ten ma wiele zastosowań w badaniach NEC, w tym w badaniach mechanistycznych i odkrywaniu leków. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół działania modelu NEC-on-a-chip

.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy pochodziły z próbek jelita cienkiego od wcześniaków (urodzonych w 22 do 36 tygodniu ciąży) uzyskanych podczas operacji NEC lub innych schorzeń jelitowych o etiologii niezapalnej. Pobieranie i przetwarzanie próbek zostało przeprowadzone po świadomej zgodzie i zatwierdzeniu przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis (numery protokołu IRB 201706182 i 201804040) oraz na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill (numer protokołu IRB 21-3134).

1. Izolacja i poszycie krypt z ludzkiego jelita cienkiego noworodka w celu ustalenia enteroidów

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotować wszystkie wymagane podłoża zgodnie z opisem w Tabeli 1. Upewnij się, że do przygotowania wszystkich pożywek stosowana jest technika aseptyczna. Przefiltruj media sterylizowane za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Mycie i mielenie tkanki jelitowej
    1. Umieść hydrożel matrycy hodowli komórkowej na lodzie do rozmrożenia. Pozyskaj ludzką tkankę jelitową z sali operacyjnej. Natychmiast umieść próbkę w 5 ml lodowatego środka do mycia tkanek w celu dezaktywacji endogennych proteaz.
    2. Przepłukać treść jelitową lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w przyciętą końcówkę pipety P1000. Przenieś tkankę jelitową do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 5 ml lodowatego D-PBS.
    3. Przetnij tkankę jelitową wzdłuż, aby odsłonić światło, i pokrój ją na małe kawałki za pomocą cienkich nożyczek. Przepłukać tkankę jelitową, delikatnie mieszając w D-PBS w naczyniu do hodowli tkankowej.
    4. Przenieś fragmenty tkanek do czystego naczynia o średnicy 35 mm. Zmiel tkankę cienkimi nożyczkami. Optymalny rozmiar to 0,5cm2 na sztukę. Tkanka jelitowa powinna przejść przez przyciętą końcówkę pipety o pojemności 1 ml.
  3. Dysocjacja tkanki jelitowej
    1. Dodaj 1 ml podgrzanej kolagenazy I do tkanki. Wymieszaj tkankę z kolagenazą, pipetując 10-15 razy i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Zamocuj rurkę poziomo na wytrząsarce ustawionej na 50 obr./min. Wstrząsaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Po inkubacji wyjąć probówki z wytrząsarki i ponownie zawiesić roztwór, pipetując 10-15 razy. Opcjonalnie: Usuń małą porcję, aby zweryfikować obecność pojedynczych krypt za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
  4. Izolacja krypt jelitowych
    1. Przefiltruj krypty przez sitko o średnicy 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Umyj sitko 9 ml lodowatego środka do mycia chusteczek. Przenieść filtrat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie usunąć supernatant. W probówce pozostanie około 200 μl pożywki. Zawiesić osad w 5 ml lodowatego środka do mycia tkanek.
    3. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 1 ml pożywki do mycia tkanek i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia krypt. Ostrożnie i całkowicie odessać supernatant tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą pipety. Umieść rurkę na lodzie.
  5. Posiewanie krypt jelitowych
    1. Zawiesić osad w hydrożelu matrycy do hodowli komórkowych (20 μl/dołek z 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej) za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety, aby uzyskać jednorodną zawiesinę krypt, podczas gdy probówka pozostaje na lodzie. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania. Trzymaj probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.
      UWAGA: Hydrożel matrycy do hodowli komórkowych polimeryzuje w temperaturach powyżej 8 °C. Krypty wyizolowane z kawałka tkanki jelitowej o długości 0,5 cm-1 cm są zwykle platerowane w 10 dołkach 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
    2. Zawiesinę hydrożelową macierzy krypty/hodowli komórkowej umieścić na wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Ogrzej płytkę, aby wspomóc krzepnięcie matrycy. Umieść zawieszenie na środku studni. Unikaj pęcherzyków podczas powlekania.
    3. Inkubować płytki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji matrycy. Niezbędne jest, aby hydrożel macierzy hodowli komórkowej w pełni polimeryzował przed dodaniem pożywki.
    4. Po polimeryzacji matrycy dodać 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki kondycjonowanej 50% L-WRN do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    5. Zmieniaj nośniki co 2 do 3 dni. Zastąp ciepłym 50% kondycjonowanym nośnikiem L-WRN. Przejazd co 7 do 10 dni. Enteroidy pasażowe, gdy są zlewające się w 50%-90% i wykazują tworzenie pąków.
      UWAGA: Nośnik może wymagać częstszej wymiany, jeśli zmieni kolor na żółty. Częstotliwość pasażu będzie zależeć od gęstości enteroidów i tempa wzrostu komórek konkretnego pacjenta. Enteroidy będą musiały zostać przejść, jeśli ich centra staną się ciemne.
  6. Pasażowanie enteroidów
    1. Delikatnie zassać pożywkę ze studzienek. Ostrożnie umyj studzienki 500 μl ciepłego D-PBS. Uważaj, aby nie naruszyć matrycy.
    2. Do każdej studzienki dodać 250 μl roztworu do odzyskiwania zimnych komórek. Zdrap dno każdej studzienki świeżą końcówką pipety, aby zakłócić hydrożel matrycy hodowli komórkowej. Inkubować płytkę na lodzie przez 30 minut.
    3. Dysocjację enteroidów należy przeprowadzić energicznym pipetowaniem (~25-50 razy pipetą P200) i dodać 500 μl pożywki do mycia tkanek.
    4. Przenieść zawiesinę enteroidową do probówki o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 5 ml zimnego podłoża do mycia tkanek. Delikatnie odpipetować, aby uzyskać jednorodny roztwór.
    5. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia enteroidów. Umieścić probówkę na lodzie i odessać supernatant tak dokładnie, jak to możliwe. W probówce pozostanie około 30-60 μl.
      UWAGA: Jeśli występują trudności z rozbijaniem enteroidów za pomocą pipetowania, można zastosować 0,25% trypsyny-EDTA lub odczynnik dysocjacji enzymatycznej, aby ułatwić ten proces.
    6. Zawiesić enteroidy w pozostałej objętości pożywki płuczącej za pomocą pipety P200. Podczas pipetowania należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    7. Dodać 20 μl hydrożelu matrycy do hodowli komórkowych na nowy dołek z 48-dołkowej płytki do zawiesiny enteroidowej. Podziel enteroidy 1:3, 1:4 lub 1:5, w zależności od ich gęstości.
    8. Dodaj zawiesinę do wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu zestalenia matrycy.
    9. Po polimeryzacji dodać 300 μl wstępnie podgrzanego 50% kondycjonowanego L-WRN podłoża do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Model jelita noworodkowego na chipie

UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące obchodzenia się z chipami mikroprzepływowymi i korzystania z tego sprzętu można znaleźć w protokole hodowli chipów w jelicie dwunastnicy producenta37.

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotować wszystkie wymagane podłoża zgodnie z opisem w Tabeli 2. Upewnij się, że stosowana jest technika aseptyczna. Przefiltruj media sterylizowane za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Dzień (-3): Rozmrażanie i rozszerzanie ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka jelitowego (HIMEC)
    1. Rozmrozić fiolkę z HIMEC i płytkę zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Pokryj kolbę o średnicy 25cm2 roztworem powlekającym na bazie żelatyny przez 2 minuty. Usuń nadmiar roztworu. Dodać HIMEC (około 0,5-1 x 106 komórek) zawieszone w 6 ml pożywki HIMEC do kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Zmieniaj pożywkę HIMEC co 48 godzin. Dodaj HIMEC do śródbłonka (dolnego) kanału chipa w ciągu 48-72 godzin od uzyskania 100% zlewania się.
  3. Dzień (-1): Aktywacja i powlekanie wiórów przed dodaniem enteroidów
    1. Rozpuść proszek odczynnika aktywującego chip 1 (CR-1) w celu uzyskania roztworu CR-1. Upewnij się, że proszek CR-1 i roztwór odczynnika aktywacyjnego do chipów 2 (CR-2) mają temperaturę pokojową na tym etapie.
      UWAGA: Proszek CR-1 i roztwór CR-1 przygotowane w poniższych krokach należy zawsze chronić przed światłem. Na potrzeby tych kroków światło w masce powinno być wyłączone.
      1. Umieść chip i nośnik chipów w kołysce na chipy, a następnie umieść je w naczyniu do hodowli tkankowych w kapturze do hodowli komórkowych. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać informacje na temat prawidłowej techniki umieszczania chipów w carrier37.
      2. Dodać 1 ml roztworu CR-2 do fiolki z proszkiem CR-1, a następnie bezpośrednio przenieść roztwór z fiolki z proszkiem CR-1 do probówki o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Nie mieszaj roztworu z pipetą. Celem jest uniknięcie tworzenia się pęcherzyków.
      3. Dodać kolejny 1 ml roztworu CR-2 do fiolki CR-1 i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powtórzyć tę czynność, w sumie 4 razy płukać i w sumie 4 ml CR-2 przepłukanego przez fiolkę CR-1. Dodać nakrętkę do fiolki i odwrócić do ostatniej płukanki, aby usunąć wszelkie pozostałości proszku.
      4. Dodać dodatkowe 6 ml CR-2 do 15 ml probówki zawierającej CR-1, aby uzyskać końcową objętość 10 ml (0,5 mg/ml). Wymieszaj ten roztwór pipetą, nie wprowadzając pęcherzyków. Upewnij się, że CR-1 jest całkowicie rozpuszczony przed przejściem do następnego kroku.
    2. Dodanie roztworu CR-1 do chip
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać wprowadzania bąbelków do kanałów podczas dodawania tych roztworów. Na tym etapie roztwór CR-1 powinien być chroniony przed światłem.
      1. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl dodaj 20 μl roztworu CR-1 do wlotu dolnego kanału, aż roztwór zacznie wychodzić z dolnego kanału. Dodać 50 μl roztworu CR-1 przez wlot górnego kanału, aż roztwór zacznie opuszczać wylot górnego kanału. Usunąć nadmiar roztworu CR-1 z powierzchni chipa przez delikatne zasysanie.
        UWAGA: Roztwory należy zawsze dodawać do dolnego kanału przed górnym kanałem. W przypadku zauważenia pęcherzyków powietrza, przepłukać oba kanały roztworem CR-1 i powtórzyć czynności opisane w pkt 2.3.2.1.
      2. Jeśli pokrywka naczynia do hodowli tkankowej zawierającego wióry jest na swoim miejscu, zdejmij ją na ten etap. Umieść frytki w świetle UV na 15 minut. Usuń CR-1 z górnego i dolnego kanału.
      3. Powtórz kroki od 2.3.2.1 do 2.3.2.2, aby uzyskać łącznie dwa etapy aktywacji UV. Po tym kroku chipy nie są już wrażliwe na światło.
      4. Usuń CR-1 z górnego i dolnego kanału. Przemyć oba kanały 100 μl roztworu CR-2. Usuń roztwór CR-2 z górnego i dolnego kanału.
      5. Umyj oba kanały 100 μl sterylnego D-PBS. Powtórz pranie 2x. Dodaj 100 μl D-PBS do obu kanałów. Usuń nadmiar z powierzchni wiórów, ale pozostaw kanały pełne.
    3. Pokryj kanały macierzą zewnątrzkomórkową.
      1. Rozmrozić fibronektynę, kolagen IV i hydrożel macierzy hodowli komórkowych na lodzie bezpośrednio przed tym etapem i trzymać te roztwory na lodzie przez pozostałą część tej sekcji.
      2. Przygotuj następujące roztwory macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) dla górnego i dolnego kanału chipa:
        Górny kanał: 100 μl 200 μg/ml kolagenu typu IV i 100 μg/ml hydrożelu matrycy do hodowli komórkowych w D-PBS na chip.
        Dolny kanał: 100 μl 200 μg/ml kolagenu typu IV i 30 μg/ml fibronektyny w D-PBS na chip.
      3. Całkowicie usuń D-PBS z górnego i dolnego kanału. Dodaj 50 μl ECM do dolnego wlotu kanału, aż na wylocie pojawi się kropla. Powtórz dla górnego kanału. Upewnij się, że używasz odpowiednich rozwiązań ECM dla każdego kanału i najpierw dodaj rozwiązanie do dolnego kanału.
      4. Dodaj D-PBS do zbiornika kołyski na chipsy i załóż pokrywkę na płytkę do hodowli tkankowej. Umieść wióry w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 2 na noc.
  4. Dzień (0): Siew chipsów z HIMEC i enteroidami
    1. Równoważenie próżni mediów
      1. Dodać wymaganą objętość pożywki HIMEC i pożywki do rozprężania chipów, aby zakończyć eksperyment, do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Równoważyć pożywkę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej przez co najmniej 1 godzinę.
      2. Podłączyć urządzenie do filtracji próżniowej do probówek o pojemności 50 ml zawierających podgrzane media. Probówki powinny być zorientowane w taki sposób, aby wstępnie podgrzane podłoże znajdowało się na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Podciśnienie -70 kPa lub wyższe przez 10 s.
      3. Odwróć rurki tak, aby media przepływały przez filtr. Kontynuuj odkurzanie przez 5 minut. Po zakończeniu filtracji próżniowej należy wyjąć urządzenie do filtracji próżniowej i umieścić probówki o pojemności 50 ml zawierające pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Mycie frytek
      1. Przemyć kanał śródbłonka, przepłukując go 100 μl podgrzanego podłoża HIMEC.
        Przemyć kanał nabłonkowy, przepłukując go 100 μl podgrzanego podłoża do rozprowadzania wiórów. Usuń wszelkie media, które rozprzestrzeniły się na powierzchnię wiórów.
      2. Powtórz krok prania. Media powinny pozostać w kanałach, a także w portach wlotowych i wylotowych po tych płukaniach. Załóż pokrywkę naczynia hodowlanego zawierającego wióry i wróć do inkubatora, aż będzie gotowe do użycia.
    3. Zbieranie HIMEC
      1. Odessać pożywkę z kolby o średnicy 25cm2 zawierającej HIMEC. Delikatnie umyj monowarstwę za pomocą D-PBS. Dodać 2 ml podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i delikatnie spłukać monowarstwę.
      2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut. Zneutralizować trypsynę za pomocą 10 ml pożywki HIMEC. Ponownie zawiesić komórki w pożywce i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
      3. Wirować w komórkach 150 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl pożywki HIMEC.
      4. Usuń 10 μl komórek i umieść probówkę na lodzie. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Pożądane stężenie HIMEC wynosi 6 x 106 do 8 x 106 komórek/ml.
    4. Wysiewanie HIMEC na chipie
      1. Wyjmij chip z inkubatora i umieść go w okapie. Zassać wszelkie media, które mogły wycieknąć na powierzchnię chipa.
      2. Przepłukać kanał nabłonkowy (górny) chipa 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża do rozprężania wiórów. Przepłukać śródbłonek (dolny) kanał chipa 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża HIMEC.
      3. Delikatnie zawiesić HIMEC w celu uzyskania jednorodnego rozprowadzenia. Całkowicie usuń pożywkę z kanału śródbłonka (dolnego). Dodaj 10 μl HIMEC (~36 000 komórek/chip) do kanału śródbłonka (dolnego).
        UWAGA: Jeśli trudno jest wypełnić kanał HIMEC bez tworzenia się pęcherzyków przy użyciu 10 μl HIMEC, zwiększ objętość dodawanych komórek. Powinna to być taka sama liczba komórek na chip.
      4. Dodaj dodatkowe organoidowe pożywki wzrostowe do kanału nabłonkowego (górnego), jeśli nie jest pełny. Sprawdź gęstość wysiewu HIMEC. Jeśli nie są równomiernie rozprowadzone i nie pokrywają 80%-90% powierzchni wiórów, przepłucz kanał i powtórz siew.
      5. Odwróć chip do kołyski na chipsy w naczyniu do hodowli komórkowych. Dodaj D-PBS do zbiornika w kołysce na wióry. Załóż pokrywkę na naczynie do hodowli komórkowej i umieść je w inkubatorze.
      6. Pozostaw chip odwrócony w temperaturze 37 °C na 2-3 godziny, aby umożliwić HIMEC przymocowanie się do membrany chipa. Po zakończeniu inkubacji przywróć podstawkę na wióry do pozycji pionowej.
      7. Delikatnie przemyć kanał śródbłonka (dolny) 100 μl ciepłej pożywki HIMEC. Pozostaw multimedia w kanale. Delikatnie przemyć kanał nabłonkowy (górny) 100 μl organoidalnej pożywki wzrostowej. Pozostaw multimedia w kanale.
      8. Włóż wióry do inkubatora w temperaturze 37 °C, wykonując kolejne kroki.
    5. Zbiór enteroidów i siew na chip
      UWAGA: Chipsy są wysiewane enteroidami, które zostały podzielone 10-14 dni wcześniej, są w 50%-75% zlewające się oraz w pasażu 7 i 20. Zobacz Rysunek 2 dla wyglądu enteroidów w dniu 0. Czas potrzebny do przygotowania enteroidów do wysiewu będzie zależał od tempa wzrostu komórek konkretnego pacjenta.
      1. Delikatnie zassać pożywkę ze studzienek. Ostrożnie umyć studzienki zawierające hydrożel z matrycą do hodowli komórkowych za pomocą 500 μl ciepłego D-PBS. Uważaj, aby nie naruszyć hydrożelu macierzy hodowli komórkowych.
      2. Do każdej studzienki dodać 250 μl roztworu do odzyskiwania zimnych komórek. Zdrap dno każdej studzienki świeżą końcówką pipety, aby rozbić hydrożel macierzy hodowli komórkowych. Dodaj zawartość studzienek do zimnej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
      3. Inkubować probówkę na lodzie przez 45 minut i odwracać probówkę co 3-5 minut. Na tym etapie należy przygotować pożywkę do dysocjacji enteroidów. Umieścić tę pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, gdy pozostało 10 minut na etapie inkubacji.
      4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia enteroidów. Usunąć supernatant.
      5. Dodać 2 ml enteroidalnej pożywki dysocjacyjnej na zebraną płytkę do osadu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 60 s do 120 s. Podczas inkubacji delikatnie obracać probówkę. Inkubować wystarczająco długo, aby uzyskać rozdrobnione enteroidy, ale bez dysocjacji do zawiesiny pojedynczej komórki.
      6. Po inkubacji dodać 10 ml zimnego płynu do mycia tkanek do każdej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia enteroidów. Całkowicie odessać supernatant.
      7. Zawiesić granulat w 200 μl pożywki do rozprężania wiórów. Dysocjację enteroidów należy przeprowadzić przez energiczne pipetowanie (~25-50 razy pipetą P200).
      8. Połącz komórki w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Delikatnie odpipetować, aby uzyskać jednorodny roztwór. Celem jest zasianie chipa z rozdrobnionymi enteroidami w małych skupiskach po 10-30 komórek.
      9. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia. Umieścić pozostałą zawiesinę komórkową na lodzie. Dostosuj objętość nośnika do rozszerzania chipów, aby uzyskać stężenie 6 x 106 komórek/ml.
        UWAGA: Może być konieczne odwirowanie enteroidów i ponowne ich zawieszenie w mniejszej objętości pożywki w celu uzyskania wymaganej gęstości.
      10. Umieść chipy mikroprzepływowe w masce i zasysaj media z kanału nabłonkowego (górnego) chipa. Załaduj górny kanał chipa 30 μl zawieszonych ogniw (~ 180 000 ogniw/chip). Zapewnić pełne i równomierne pokrycie kanału nabłonkowego chipa w celu utworzenia monowarstwy. Jeśli to nie zostanie osiągnięte, przepłucz enteroidy przez chip i ponownie wysiew.
        UWAGA: W przypadku trudności z uzyskaniem jednolitej zawiesiny podczas ładowania wielu wiórów, enteroidy można rozdzielić na 40 μl podwielokrotności w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zminimalizuje to zmienność liczby enteroidów i wielkości fragmentów w miarę postępu ładowania.
      11. Włóż chipsy do kołyski na chipsy w naczyniu do hodowli komórkowych (jeśli zostały usunięte). Dodaj D-PBS do zbiornika w kołysce na wióry. Załóż pokrywkę na naczynie do hodowli komórkowej i umieść frytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  5. Dzień (1): Przygotowanie strąków i wprowadzenie flow do frytek
    1. Umieść chipsy w kapturze do hodowli tkankowej. Delikatnie przepłukać kanał nabłonkowy dwukrotnie 100 μl pożywki do rozprężania wiórów. Delikatnie przepłukać kanał śródbłonka dwukrotnie 100 μl pożywki HIMEC. Usuń nadmiar nośnika z powierzchni wióra.
    2. Zalej strąki i reguluj zgodnie z protokołem producenta37. Dodać 2 ml odpowiedniej pożywki do zbiorników wlotowych. Dodać 300 μl odpowiedniej pożywki do zbiorników wylotowych. Natężenie przepływu wyniesie 30 μL/h. Rozciąganie nie zostanie jeszcze rozpoczęte.
  6. Dzień (2): Monitorowanie rozwoju monowarstw i zmieniających się mediów
    1. Wstrzymaj moduł hodowli i umieść strąki w masce.
    2. Sprawdź chipsy i strąki pod kątem pęcherzyków. Zbadaj monowarstwę nabłonka za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Rejestruj obrazy w spójnych lokalizacjach na chipie, aby monitorować postępy. Wyobraź sobie chipsy, gdy pozostają w strąkach.
    3. Usuń pożywkę ze zbiorników wlotowych górnego kanału i zastąp ją 2 ml pożywki do różnicowania chipów. Dodaj 1 ml pożywki HIMEC do zbiornika wlotowego dolnego kanału. Pozostaw wystarczającą ilość mediów w zbiornikach wlotowych, aby upewnić się, że dno zbiornika pozostaje pokryte cienką warstwą mediów.
    4. Umieść strąki z powrotem w module hodowlanym i wznowij przepływ przy 30 μl/h.
  7. Dzień (3): Monitorowanie rozwoju monowarstwy, inicjowanie rozciągania i dodawanie nośnika
    1. Powtórz kroki 2.6.1.1 i 2.6.1.2. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania chipów do zbiornika wlotowego górnego kanału i dodać 1 ml pożywki HIMEC do zbiornika wlotowego dolnego kanału.
      UWAGA: Wyjmij media ze zbiorników wylotowych obu kanałów, gdy zaczną osiągać 50-75% pojemności.
    2. Zwróć strąki do modułu hodowli. Wznowić przepływ przy 30 μl/h i rozpocząć rozciąganie przy 2% odkształceniu i częstotliwości 0,2 Hz.
  8. Dzień (4): Monitorowanie rozwoju monowarstwy, zwiększanie rozciągliwości i dodawanie pożywek
    1. Powtórz kroki 2.6.1.1 i 2.6.1.2. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania chipów do zbiornika wlotowego górnego kanału i dodać 1 ml pożywki HIMEC do zbiornika wlotowego dolnego kanału.
      UWAGA: Wyjmij media ze zbiorników wylotowych obu kanałów, gdy zaczną osiągać 50-75% pojemności.
    2. Zwróć strąki do modułu hodowli. Uruchom ponownie przepływ przy 30 μl/h i zwiększ rozciągliwość do 10% obciążenia i częstotliwości 0,2 Hz.
  9. Dzień (5) do dnia (7): Monitorowanie rozwoju monowarstw i dodawanie pożywek
    1. Powtórz kroki 2.6.1.1 i 2.6.1.2. Dodać 1 ml pożywki do różnicowania chipów do zbiornika wlotowego górnego kanału i dodać 1 ml pożywki HIMEC do zbiornika wlotowego dolnego kanału.
    2. Zwróć zasobniki do modułu kultury, a następnie uruchom ponownie przepływ i rozciąganie. Po wizualizacji osi przypominających kosmki przejdź do modelu NEC-on-a-chip.

3. Model NEC-on-a-chip

  1. Hodowla bakterii jelitowych
    UWAGA: Ten krok wymaga wstępnie miareczkowanego zamrożonego zapasu bakterii jelitowych od pacjenta z NEC, który jest przygotowany przed rozpoczęciem tego protokołu. Do tych eksperymentów wykorzystano wcześniej opisaną zawiesinę polimikrobiologicznych bakterii jelitowych od jednego pacjenta z ciężkim chirurgicznym NEC38.
    1. Przygotuj 50% zapas glicerolu bakterii jelitowych i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
    2. Rozmrozić podwielokrotność bakterii jelitowych i zaszczepić 10 μl w 3 ml pożywki Luria-Bertani (LB). Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min przez noc.
    3. Tego samego dnia delikatnie przemyj kanały 100 μl wstępnie podgrzanej, wolnej od antybiotyków pożywki do różnicowania chipów (górny kanał) lub 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki HIMEC wolnej od antybiotyków (dolny kanał). Całkowicie zassać pożywkę i powtórzyć spłukiwanie, w sumie 3 prania.
    4. Po zaessaniu trzeciego prania wymień media w kanałach i pozostaw na miejscu.
    5. Przepłukać zbiorniki wlotowe górnego i dolnego kanału sterylnym D-PBS, a następnie napełnić 3 ml odpowiedniego podłoża bez antybiotyków. Zalać strąki i regulować jak w ppkt 2.5.2.
    6. Zwróć chip do modułu hodowli i ponownie zainicjuj rozciąganie i przepływ.
    7. Następnego ranka weź 1 ml nocnej kultury bakteryjnej i zaszczep ją w 25 ml świeżej pożywki LB.
    8. Umieść tę nową kulturę z powrotem w wytrząsarce o temperaturze 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,6 ± 0,02 mierzone za pomocą kuwety o średnicy 1 cm. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną do 7 x 108 jednostek tworzących kolonie/ml w pożywce do ekspandowania chipów bez antybiotyków.
    9. Zapisz podwielokrotność tej kultury, aby potwierdzić stężenie inokulum39. Może być konieczne dostosowanie stężenia bakterii w zależności od odpowiedzi nabłonka.
    10. Usuń pożywkę z kanału nabłonkowego (górnego). Dodać 30 μl kultury bakteryjnej rozcieńczonej w pożywce do rozprężania chipów bez antybiotyków do górnego kanału chipa. Bądź bardzo ostrożny, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego kanału HIMEC (śródbłonka) bakteriami. Usuń wszelkie dodatkowe nośniki z powierzchni chipa.
    11. Pozostaw wióry w warunkach statycznych przez 30 minut, aby ułatwić przyleganie bakterii do wierzchołkowej strony nabłonka noworodka. Po inkubacji przepłukać górny kanał 100 μl pożywki ekspansującej bez antybiotyków, aby usunąć nieprzyłączone bakterie. Zwróć wióry do modułu hodowli i ponownie zainicjuj rozciąganie i przepływ.
    12. Co 24 godziny wyjmuj saszetki z modułu hodowlanego i powoli przepłukuj 100 μl pożywki do rozprężania chipów bez antybiotyków przez kanał nabłonkowy. Pomoże to w zapobieganiu przerostowi bakterii.

4. Test przepuszczalności jelit

UWAGA: To można wykonać na dowolnym etapie protokołu. Jeśli zostanie zainicjowany podczas wysiewu wiórów, test przepuszczalności jelit może być użyty do seryjnej oceny konfluencji jednowarstwowej. Jeśli test ten zostanie zainicjowany po dodaniu bakterii jelitowych, może być wykorzystany do określenia wpływu bakterii jelitowych na integralność jednowarstwowej warstwy nabłonka jelitowego.

  1. Usuń pożywkę ze zbiornika wlotowego kanału nabłonkowego (górnego). Dodać odpowiednią pożywkę zawierającą barwnik przepuszczalności (50 μg/ml) do zbiornika wlotowego. W modelu NEC-on-a-chip należy używać pożywek do różnicowania chipów bez antybiotyków.
  2. Ścieki należy zbierać z kanałów nabłonkowych i śródbłonkowych co 24 godziny. Określić ilościowo stężenie barwnika przepuszczalności za pomocą czytnika mikropłytek zgodnie z Lanik et al.36.

5. Immunohistochemia

  1. Delikatnie umyj dolny i górny kanał chipa 200 μl D-PBS. Całkowicie zassać D-PBS z kanałów.
  2. Napraw komórki, przepłukując oba kanały 4% paraformaldehydem, pozostawiając roztwór w kanałach. Odessać nadmiar z powierzchni wióra. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Przemyć oba kanały 200 μl D-PBS. Pozostaw D-PBS w dolnym kanale i całkowicie usuń z górnego kanału.
  4. Przepuszczalność warstwy nabłonkowej poprzez przepłukanie górnego kanału 100 μl 0,1% roztworu detergentu, pozostawiając roztwór w kanałach. Odessać nadmiar z powierzchni wióra i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  5. Przemyć oba kanały 200 μl D-PBS. Pozostaw D-PBS w dolnym kanale i całkowicie usuń z górnego kanału.
  6. Dodaj 10% osiej surowicy (lub odpowiedni środek blokujący) do górnego kanału przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć oba kanały 200 μl D-PBS. Pozostaw D-PBS w dolnym kanale i całkowicie usuń z górnego kanału.
  7. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 5% surowicy osła i dodać do górnego kanału chipa (przeciwciała i stężenia wcześniej testowane są dostępne w Lanik et al.36). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Umyj oba kanały 3x 200 μl D-PBS. Pozostaw D-PBS w dolnym kanale i całkowicie usuń z górnego kanału.
  9. Rozcieńczone przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie rozcieńczone w stosunku 1:200 w 5% surowicy osła w D-PBS i Hoechst 33342 lub DAPI (barwienia jądrowe). Dodaj przeciwciała wtórne do górnego kanału chipa. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chronić przed światłem.
  10. Umyj oba kanały 3x 200 μl D-PBS. Pozostaw kanały wypełnione D-PBS po ostatnim praniu. Umieść chip w naczyniu do obrazowania z D-PBS w celu uzyskania obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    UWAGA: Utrwalone wióry, barwione lub niebarwione, można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia w PBS. Upewnij się, że kanały nie wyschną w tym okresie.

6. Izolacja RNA, przygotowanie cDNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

  1. Delikatnie umyj dolny i górny kanał chipa 200 μl D-PBS. Całkowicie zassać D-PBS z kanałów.
  2. Ekstrahuj całkowite RNA z komórek za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Aby wyizolować RNA tylko z nabłonka, podawaj tylko przez górny kanał.
  3. Określ ilościowo stężenie RNA za pomocą spektrofotometru nanoobjętościowego. Odwrotna transkrypcja 1 μg całkowitego RNA. Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym. Startery używane wcześniej w tym modelu są dostępne w Lanik et al. 36.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy zostały zasiane na urządzeniu mikroprzepływowym (Rysunek 1) i wyhodowane zgodnie z powyższym opisem. Wzrost enteroidów w hydrożelu macierzy macierzy hodowli komórkowej przed wysiewem, a następnie późniejsza ekspansja monowarstwy komórek nabłonka jelitowego po wysiewie urządzenia monitorowano za pomocą mikroskopii jasnego pola (Rysunek 2). Utworzyła się zlewająca się monowarstwa komórek nabłonka jelitowego, która następnie rozwinęła się w dojrzałą strukturę przypominającą ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten system NEC-on-a-chip jest nowym, potężnym narzędziem, które można wykorzystać do modelowania patofizjologii NEC. Platforma ta zapewnia złożone mikrośrodowisko, które bardziej przypomina środowisko jelitowe in vivo niż poprzednie modele, dzięki włączeniu systemu kohodowli z ciągłym przepływem światła i rozciąganiem. Warunki te sprzyjają rozwojowi architektury 3D przypominającej kosmki wyłożonej wysoce spolaryzowanym nabłonkiem składającym się z dojrzałych podtypów nabłonka i ścisłych połączeń (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym manuskryptem.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt był wspierany przez R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) i R01HD105301 (MG) z National Institutes of Health, Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) dzięki hojnemu wsparciu darczyńców dla University of North Carolina w Chapel Hill, oraz Wydział Pediatrii Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I człowiekSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, bez surowicy (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
Wielomodowy czytnik mikropłytek BioTek Synergy 2Agilent  7131000
Kuwety z metakrylanu marki (PMMA), półmikroBrandTech759085D
Rozwiązanie do odzyskiwania komórekCorning354270
CFX Opus Systemy PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad12011319
Podstawka do chipówEmulacjanie dotyczy
Chip-S1 Rozciągliwy chipemulacyjnyNie dotyczy
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC,  48 dołków Corning3548
Kolagen z ludzkiego łożyskaSigma-AldrichC5533
Kolagenaza, typ I, proszekGibco17018029
Kompletne podłoże dla ludzkich komórek śródbłonka z zestawem Cell BiologicsH-1168
Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu, 15 mlFisher Scientific05-539-12
Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu, 50 mlFisher Scientific05-539-8
Prowadnice komory do liczenia komórek CountessInvitrogen C10283
Hrabina II automatyczny licznik komórekInvitrogen 
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionowy, Lizyna FixableInvitrogen  D7132Barwnik przepuszczalności 
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Jednorazowe jednostki filtrujące PES, membrana 0,2um aPESFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
Serum osłaSigma-AldrichD9663
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - wysoki poziom glukozySigma-AldrichD5796
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0,5 M,  pH 8,0Corning46-034-CI
Odczynnik aktywacji powierzchniowej ER-1Emulujodczynnik aktywacji chipaER-1
Odczynnik aktywacji powierzchniowej ER-2 Emulujodczynnik aktywacyjny chipaER-2
Fibronektyna Białko ludzkie, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand  Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką, 100 mmFisher ScientificFB0875713
Roztwór do powlekania na bazie żelatyny Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
Gentamycyna Gibco15750060
HEPES, Płynny roztwór 1M (238,3 mg/ ml)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, Trójchlorowodorek, Trójwodzian InvitrogenH3570
Kolagen ludzki typu ISigma-AldrichCC050
Ludzkie pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita cienkiegoCell BiologicsH-6054
Mikroskop odwróconyFisher Scientific03-000-013
Kąpiele wodne Isotemp ogólnego przeznaczenia DeluxeFisher ScientificFSGPD10
L-glutamina Gibco25030-081
Bulion Luria (LB) agar, MillerSupelcoL3027
L-WRN Cells American Type Culture CollectionCRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, bez LDEV Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Suplement (100x)Gibco17502048
N-acetylo-L-cysteinaSigma-Aldrich1009005
LAMPA UV NAILSTARNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC  Spektrofotometr UV-Vis o mikroobjętościThermo Scientific840-274200
NikotynamidSigma-Aldrich72340
Moduł koncentratora Orb-HM1Emulacjanie dotyczy
paraformaldehyduThermoFisher047392.9L
Penicylina-Streptomycyna Gibco15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Pipeta wielofunkcyjna Gibco10010023
Pipet-Lite L8-200XLS+Rainin17013805
Końcówki do pipet TR LTS 1000µ Przenośny moduł LS768A/8Rainin17014966
Podemulujenie dotyczy
najwyższej jakości płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (inaktywowanej termicznie) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect Zestaw do odwrotnej transkrypcji QIAGEN205313
Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Kwadratowe naczynie do testów biologicznych z uchwytami, nie poddane obróbce TC Corning431111
SsoAdvanced Uniwersalny SYBR  Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Sterylna probówka wirówkowa Górny filtrMilliporeSE1M179M6
Sterylne sitka komórkowe, 70umFisher Scientific22-363-548
Sterylne strzykawki, 10 mlFisher Scientific14-955-453
Proste, cienkie, ostre nożyczki z ostrym końcemMiltex  InstrumentyMH5-300
Thermo Scientific Wirówka Sorvall X4R Pro-MDThermo Scientific75016052
Triton  X-100 Sigma-AldrichT8787Detergent
TRIzol Odczynnik Invitrogen15596026odczynnik do ekstrakcji RNA
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% (w/v) w PBS, pH 7,5 ± 0,5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej Gibco12604013Odczynnik dysocjacji enzymatycznej
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4174
VIOS 160i Inkubator CO2, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 Moduł hodowliEmulacjaN/A
AMQAX1000 1 2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951(2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871(2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516(2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069(2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223(2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980(2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318(2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496(2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430(2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Necrotizing EnterocolitisMicrofluidic ModelNeonatal EnteroidsDysbiotic MicrobiomeIntestinal OrganoidsEndothelial CellsGut Barrier PermeabilityEpithelial Cell DeathMicrofluidic ChipTight Junction Disruption

Related Articles