Praktyczne uwarunkowania dotyczące projektowania, wykonywania i interpretacji badań obejmujących próby zginania kości gryzoni w całości

Podsumowanie

Mechaniczne badanie kości gryzoni jest cenną metodą pozyskiwania informacji na temat podatności kości na złamania. Przy braku odpowiedniego zrozumienia praktycznego wyniki mogą być nadinterpretowane lub nieaktualne. Protokół ten posłuży jako przewodnik zapewniający, że testy mechaniczne są wykonywane dokładnie, aby zapewnić prawidłowe i funkcjonalne dane.

Streszczenie

Kruchość szkieletu prowadząca do złamań to amerykański kryzys zdrowia publicznego, skutkujący 1,5 miliona złamań rocznie i 18 miliardów dolarów bezpośrednich kosztów opieki. Zdolność do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby kości i odpowiedzi na leczenie jest nie tylko pożądana, ale i kluczowa. Mechaniczne badanie kości służy jako cenna technika pozwalająca zrozumieć i określić ilościowo podatność kości na złamania. Chociaż metoda ta wydaje się prosta do wykonania, można wyciągnąć niewłaściwe i niedokładne wnioski, jeśli użytkownik zignoruje nadrzędne założenia i kluczowe kroki. Zaobserwowano to w różnych dyscyplinach, ponieważ badania nadal są publikowane z niewłaściwym wykorzystaniem metod i nieprawidłową interpretacją wyników. Protokół ten posłuży jako podstawa do zasad związanych z testami mechanicznymi wraz z zastosowaniem tych technik - od rozważań nad wielkością próbki, poprzez pobieranie i przechowywanie tkanek, po analizę i interpretację danych. Dzięki temu można uzyskać cenne informacje na temat podatności kości na złamania, co pogłębi wiedzę zarówno dla badań akademickich, jak i rozwiązań klinicznych.

Wprowadzenie

Mechaniczne badanie kości jest podstawową metodą pozyskiwania funkcjonalnych informacji związanych z podatnością kości na złamania. W badaniach przedklinicznych można zastosować kilka metod testowania, ale zdecydowanie najczęstszą jest zginanie kości długich. Testy te są łatwe do wykonania i mogą być stosowane na kościach o różnej wielkości, od człowieka do myszy. Ponieważ myszy są jednymi z najczęściej badanych zwierząt w badaniach przedklinicznych, protokół ten skupi się na testach zginania wykonywanych na kości udowej i piszczelowej myszy.

Przed wykonaniem testów zginania, kości muszą być odpowiednio pobrane i przechowywane. Najczęstszymi metodami przechowywania tradycyjnie były zamrażanie kości w gazie nasączonej solą, zamrażanie w samej soli fizjologicznej lub odwadnianie kości w etanolu ¹. Wykazano, że kości przechowywane w etanolu mają zwiększoną sztywność i moduł sprężystości oraz zmniejszone parametry odkształcenia w porównaniu z tymi przechowywanymi w stanie zamrożonym¹. Nawet ponowne nawodnienie kości przed badaniem nie przywraca tych właściwości do normalnego poziomu ¹. Przechowywanie zanurzone w soli fizjologicznej może spowodować uszkodzenie kości, ponieważ ciśnienie jest wywierane w miarę rozszerzania się soli fizjologicznej. Ponadto konieczne byłoby całkowite rozmrożenie roztworu w celu usunięcia kości do skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej (μCT). W związku z tym zamrażanie świeżo zebranych kości w gazie nasączonej solą stało się standardową metodą przechowywania i jest zalecane w całym tym protokole.

Ponieważ rozmiar i kształt kości wpływają na jej wytrzymałość, a wiele modeli chorób znacząco zmienia rozmiar i morfologię kości, stosuje się zasady inżynierii, aby znormalizować wpływ rozmiaru na uzyskanie właściwości, które szacują zachowanie tkanki². Podejście to wymaga geometrii przekroju poprzecznego miejsca uszkodzenia, która jest najczęściej uzyskiwana za pomocą μCT do tworzenia skanów kości przed badaniem. μCT jest szeroko stosowany ze względu na jego dostępność i wysoką rozdzielczość obrazu. Co więcej, wkład tkanek miękkich nie jest uwzględniony, a skanowanie nie wymaga chemicznego mocowania ani innych modyfikacji bone^3,4. We wszystkich formach tomografii komputerowej źródło promieniowania rentgenowskiego skupia się na obiekcie, podczas gdy detektor po drugiej stronie obiektu mierzy wynikową energię promieniowania rentgenowskiego. W ten sposób powstaje cień rentgenowski próbki, który można przekształcić w obraz^3,5. Skanowany obiekt jest obracany (lub źródło promieniowania rentgenowskiego i detektor są obracane wokół próbki), generując obrazy, które można zrekonstruować do trójwymiarowego zestawu danych reprezentującego obiekt⁵.

Rozdzielczość skanowania, czyli jak blisko siebie mogą znajdować się dwa obiekty i nadal być rozdzielone indywidualnie, jest kontrolowana przez zmianę nominalnego rozmiaru woksela lub rozmiaru piksela w wynikowym obrazie. Ogólnie przyjmuje się, że obiekty muszą być co najmniej dwa razy większe od pojedynczego woksela, aby mogły zostać zidentyfikowane³, ale wyższy współczynnik pozwoli na poprawę precyzji. Co więcej, większe woksele są bardziej podatne na częściowe efekty objętościowe: gdy pojedynczy woksel zawiera tkanki o różnej gęstości, przypisuje się mu średnią tych gęstości, a nie gęstość właściwą pojedynczej tkanki, co może prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania obszarów tkanek i gęstości mineralnej³. Chociaż te problemy można złagodzić, wybierając mniejsze rozmiary wokseli, użycie wyższej rozdzielczości nie gwarantuje eliminacji częściowych efektów głośności i może wymagać dłuższego czasu skanowania³. Podczas skanowania kości ex vivo ogólnie zaleca się rozmiar woksela 6-10 μm, aby dokładnie ocenić architekturę beleczkową kości myszy. Większy rozmiar woksela wynoszący 10-17 μm może być użyty dla kości korowej, chociaż należy użyć najmniejszego rozsądnego rozmiaru woksela. Protokół ten wykorzystuje rozmiar woksela 10 μm, który jest wystarczająco mały, aby rozróżnić kluczowe właściwości beleczkowania i zminimalizować efekty częściowej objętości bez długiego czasu skanowania.

Ustawienia filtra energii rentgenowskiej i energii również muszą być starannie dobrane, ponieważ wysoka gęstość mineralna i grubość tkanki kostnej znacznie tłumi i zmienia transmitowane widmo energii promieniowania rentgenowskiego. Powszechnie zakłada się, że ponieważ emitowane widmo promieniowania rentgenowskiego jest równoważne widmu, które opuszcza obiekt⁶, użycie niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego na gęstych obiektach, takich jak kości, może prowadzić do artefaktu znanego jako utwardzanie wiązki⁷. Podczas skanowania próbek kości zaleca się wyższe napięcie 50-70 kVp, aby zmniejszyć częstość występowania tych artefaktów⁵. Ponadto wstawienie aluminiowego lub miedzianego filtra energii tworzy bardziej skoncentrowaną wiązkę energii, co jeszcze bardziej minimalizuje artefakty^4,7. W całym tym protokole zostanie zastosowany filtr aluminiowy o grubości 0,5 mm.

Na koniec, krok obrotu skanowania i długość obrotu (np. 180°-360°) razem kontrolują liczbę przechwytywanych obrazów, co określa ilość szumu w końcowym skanowaniu⁴. Uśrednienie wielu klatek w każdym kroku może zredukować szum, ale może wydłużyć czas skanowania⁴. Ten protokół wykorzystuje krok obrotu wynoszący 0,7 stopnia i uśrednianie klatek wynoszące 2.

Ostatnia uwaga na temat skanowania: fantomy kalibracji hydroksyapatytu powinny być skanowane przy użyciu tych samych ustawień skanowania, co kości eksperymentalne, aby umożliwić konwersję współczynników tłumienia na gęstość mineralną w g/cm3⁵. W protokole tym wykorzystuje się fantomy o stężeniu 0,25 g/^cm3 i hydroksyapatytu o stężeniu 0,75 g/^cm3, chociaż dostępne są różne fantomy. Należy pamiętać, że niektóre systemy skanujące używają wewnętrznych fantomów w ramach codziennej kalibracji systemu.

Po zakończeniu skanowania, rzuty kątowe są rekonstruowane w przekrojowe obrazy obiektu, zazwyczaj przy użyciu dołączonego oprogramowania producenta. Niezależnie od zastosowanego systemu, ważne jest, aby upewnić się, że cała kość jest uchwycona w rekonstrukcji i że progi są odpowiednio ustawione, aby umożliwić rozpoznanie kości i niekości. Po rekonstrukcji bardzo ważne jest, aby obrócić wszystkie skany w trzech wymiarach, tak aby kości były zorientowane spójnie i prawidłowo wyrównane z osią poprzeczną, ponownie przy użyciu oprogramowania producenta.

Po obróceniu, obszary zainteresowania (ROI) do analizy mogą być wybrane w zależności od tego, czy pożądane są właściwości kory, beleczkowanie czy geometria złamania dla normalizacji mechanicznej. W przypadku tych ostatnich ROI należy wybrać po przeprowadzeniu testów, mierząc odległość od miejsca złamania do jednego końca kości i używając rozmiaru woksela do określenia odpowiedniej lokalizacji przekroju w pliku skanowania. Wybrany obszar powinien mieć co najmniej 100 μm długości, z punktem pęknięcia w przybliżonym środku ROI, aby zapewnić odpowiednie oszacowanie⁴.

Po wybraniu ROI, do normalizacji mechanicznej (do obliczenia naprężenia zginającego i odkształcenia) potrzebne są dwie właściwości: maksymalna odległość od neutralnej osi gięcia do powierzchni, na której inicjowane jest uszkodzenie (zakłada się, że jest to powierzchnia obciążona napięciem, określona przez układ testowy) oraz obszar momentu bezwładności wokół osi neutralnej (również zależny od konfiguracji testowej). Ten protokół zaleca użycie niestandardowego kodu do określenia tych wartości. Aby uzyskać dostęp do kodu, skontaktuj się bezpośrednio z autorem korespondencyjnym lub odwiedź stronę internetową laboratorium pod adresem https://bbml.et.iupui.edu/, aby uzyskać więcej informacji.

Po zakończeniu skanowania μCT można rozpocząć testy mechaniczne. Próby zginania mogą być wykonywane w konfiguracji czteropunktowej lub trzypunktowej. Preferowane są czteropunktowe testy zginania, ponieważ eliminują naprężenia ścinające w kości między punktami obciążenia, co pozwala na wystąpienie czystego zginania w tym obszarze³. Kość następnie pęknie z powodu naprężenia, tworząc uszkodzenie, które jest bardziej reprezentatywne dla prawdziwych właściwości zginania bone³. Kość musi być jednak obciążona w taki sposób, aby dostarczyć takie samo obciążenie w obu punktach obciążenia (można to ułatwić za pomocą obrotowej głowicy ładującej). W testach zginania trzypunktowego występuje duża zmiana naprężenia ścinającego w miejscu, w którym punkt obciążenia styka się z kością, co powoduje, że kość pęka w tym miejscu z powodu ścinania, a nie rozciągania³. Normy ASTM zalecają, aby materiały poddawane zginaniu miały stosunek długości do szerokości 16:1, co oznacza, że długość przęsła podparcia powinna być 16 razy większa niż szerokość kości, aby zminimalizować wpływ ścinania^8,9. Jest to często niemożliwe do osiągnięcia podczas badania małych kości gryzoni, więc rozpiętość obciążenia jest po prostu tak duża, jak to możliwe, ale z jak najmniejszą zmianą kształtu przekroju poprzecznego. Co więcej, podczas wykonywania zgięcia czteropunktowego, stosunek długości dolnego i górnego przęsła powinien wynosić ~3:1⁸, co zwykle można osiągnąć w kości piszczelowej, ale jest to trudne w krótszej kości udowej. Ponadto cieńsze ściany kory udowej sprawiają, że są one podatne na deformację pierścieniową, która zmienia kształt przekroju kości podczas badania (można to uwydatnić w testach czteropunktowych, ponieważ do wywołania tego samego momentu zginającego potrzebna jest większa siła w porównaniu ze zginaniem trzypunktowym). Dlatego zginanie trzypunktowe będzie stosowane w przypadku kości udowej myszy, podczas gdy zginanie czteropunktowe będzie stosowane w przypadku kości piszczelowych w całym tym protokole.

Na koniec, ważne jest, aby odpowiednio zasilić badanie do analizy statystycznej. Ogólnym zaleceniem dla badań mechanicznych jest posiadanie próbki o wielkości 10-12 kości na grupę doświadczalną, aby móc wykryć różnice, ponieważ niektóre właściwości mechaniczne, zwłaszcza parametry po plonowaniu, mogą być bardzo zmienne. W niektórych przypadkach może to oznaczać rozpoczęcie od większej wielkości próby zwierzęcej, biorąc pod uwagę wyczerpanie, które może wystąpić podczas badania. Analiza wielkości próby przy użyciu istniejących danych powinna zostać zakończona przed przystąpieniem do badania.

Istnieją liczne ograniczenia i założenia, ale testy zginania mogą dostarczyć dość dokładne wyniki, zwłaszcza gdy interesujące są względne różnice między grupami. Właściwości te, wraz z analizą architektury beleczkowej i morfologii kory mózgowej, mogą zapewnić lepszy wgląd w stany chorobowe i schematy leczenia. Jeśli zachowamy ostrożność w tych aspektach eksperymentu, które są pod naszą kontrolą (np. zbieranie, przechowywanie, skanowanie i testowanie), możemy mieć pewność, że uzyskano dokładne wyniki.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersyteckiej Szkoły Nauk Uniwersytetu w Indianie przed rozpoczęciem prac. Zwierzęta opisane w procedurze zostały poddane eutanazji poprzez inhalację CO₂, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych jako pomocniczej metody eutanazji.

1. Pobieranie, przechowywanie i rozmrażanie kości

1. Pobieranie i przechowywanie
   1. Umieść mysz stroną brzuszną do góry. Używając skalpela (lub żyletki bądź nożyczek), wykonaj nacięcie w przybliżonym miejscu połączenia kości udowej i miednicy po jednej stronie.
   2. Kontynuuj początkowe nacięcie w kierunku grzbietowym, aż do zlokalizowania stawu biodrowego; szukaj głowy kości udowej, która wygląda jak mała biała sfera przytwierdzona do miednicy.
   3. Przyłóż nacisk krawędzią skalpela do proksymalnej krawędzi głowy kości udowej, aż głowa kości udowej wyskoczy z panewki. Wycięcie dodatkowej tkanki, aby oddzielić kończynę tylną od reszty truchła.
   4. Po odizolowaniu kończyny tylnej oddziel piszczel i kość udową, wymuszając zgięcie w stawie kolanowym. Poruszaj skalpelem w kierunku przyśrodkowo-bocznym na powierzchni przedniej kolana, aby przeciąć wszelkie przylegające tkanki, w tym więzadła między kośćmi.
   5. Jeśli nie spowodowało to oddzielenia kości, wyprostuj staw kolanowy, aby uzyskać dostęp do powierzchni tylnej. Należy uważać, aby nie przeciąć kości ani nie zarysować chrząstki stawowej.
   6. Po oddzieleniu kości udowej i piszczeli usuń tylną stopę z piszczeli, zginając staw i wykonując ruchy piłujące w kierunku przyśrodkowo-bocznym na tylnej powierzchni stawu. W razie potrzeby wyprostuj staw, aby odsłonić powierzchnię przednią. Należy uważać, aby nie przeciąć kości.
   7. Po odizolowaniu oczyść kości z całej przylegającej tkanki miękkiej. Jeśli wykonujesz testy zginania czteropunktowego na piszczeli, usuń również strzałkę. Strzałka jest połączona więzadłami na końcu proksymalnym, ale zrośnięta z piszczelą w pobliżu końca dystalnego kości. Użyj ostrych nożyczek w pobliżu miejsca połączenia, aby oddzielić strzałkę.
   8. Odizolowane i oczyszczone kości owiń osobno w gazę nasączoną solą fizjologiczną i przechowuj w temperaturze -20 °C. Należy to zrobić niezwłocznie po pobraniu.
   9. Powtórz kroki od 1.1.1 do 1.1.8 dla drugiej strony truchła.
      UWAGA: Jeśli podczas próby oddzielenia kości w krokach 1.1.4-1.1.6 występuje opór, najlepiej powtórzyć te kroki, zamiast próbować rozrywać kości siłą. Gwałtowne ruchy mogą prowadzić do uszkodzenia lub złamania kości.
2. Rozmrażanie
   UWAGA: Liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, którym poddawana jest kość, należy zminimalizować, ponieważ nadmierna liczba takich cykli może niekorzystnie wpłynąć na właściwości mechaniczne kości. Częściowe rozmrożenie do skanowania µCT można osiągnąć, pozostawiając kość w temperaturze pokojowej przez 5-10 min. Kość należy rozmrozić całkowicie tylko podczas wykonywania testów zginania, zgodnie z opisem poniżej.
   1. Preferowane rozmrażanie przez noc
      1. Przenieś kości z przechowywania w -20 °C do temperatury 1-4°C w chłodni lub lodówce. Upewnij się, że kości pozostaną tam przez 8-12 h, aby całkowicie rozmrozić się przed badaniem.
   2. Szybkie rozmrażanie
      1. Ustaw temperaturę kąpieli na około 37 °C. Po osiągnięciu tej temperatury włóż kości do kąpieli.
      2. Pozostaw kości w kąpieli przez około 1 h.

2. Skanowanie µCT

1. Przed skanowaniem owiń kości folią parafilm, aby zapobiec ich wysychaniu. Pozostałe kości przechowuj w lodzie do czasu skanowania.
2. Po owinięciu folią parafilm umieść kość w uchwycie dopasowanym do skanera. Upewnij się, że wszystkie skanowane kości są ustawione w tej samej orientacji, ponieważ spójne ustawienie ułatwi późniejszą rotację podczas analizy.
3. Dostosuj ustawienia skanowania do celu badania. Dla kości myszy zaleca się następujące ogólne ustawienia skanowania: rozdzielczość/wielkość woksela: 10 µm; rozmiar piksela: medium, 2000 x 1048; filtr: 0,5 mm aluminium; krok rotacji: 0,7; uśrednianie klatek: 2.
   UWAGA: Ustawienia te mogą się różnić w zależności od używanego systemu skanowania; w razie potrzeby należy zapoznać się z instrukcją producenta oraz instrukcją obsługi.
4. Po włączeniu źródła promieni rentgenowskich wykonaj korekcję pola płaskiego (flat field correction), aby zminimalizować artefakty. W tym celu najpierw upewnij się, że komora jest pusta, i wyłącz korekcję pola płaskiego.
5. Zmierz średnią intensywność pola i dostosuj ją do poziomu 60%. Po osiągnięciu 60% zaktualizuj pole płaskie i ponownie je włącz.
6. Upewnij się, że średnia intensywność wynosi obecnie (86-88%).
   UWAGA: Proces ten może się różnić w zależności od używanego systemu µCT. Przed przystąpieniem do procedury zapoznaj się z instrukcją obsługi.
7. Po pomyślnym przeprowadzeniu korekcji pola płaskiego umieść uchwyt w komorze. Przed umieszczeniem podstawy w komorze upewnij się, że próbki są wycentrowane i wypoziomowane.
8. Po zabezpieczeniu podstawy zamknij komorę, upewnij się, że cała kość zostanie ujęta w skanowaniu (może być konieczne wykonanie skanu wstępnego/scout view), a następnie rozpocznij skanowanie.
9. Po zakończeniu skanowania ponownie przechowuj kości w gazie nasączonym solą fizjologiczną w temperaturze -20 °C.

3. Rekonstrukcja µCT

1. Wybierz ROI, który obejmie całą kość w rekonstrukcji. Aby to zrobić, wyświetl największy przekrój poprzeczny kości i dostosuj rozmiar ROI na podstawie tego przekroju.
2. Ustaw progowanie w oprogramowaniu, aby umożliwić prawidłowe odróżnienie tkanki kostnej od niekostnej. W tym celu użyj histogramu, w którym dolne ograniczenie zostanie ustawione na 0, a górne ograniczenie na koniec szczytu danych histogramu.
3. Dostosuj dodatkowe ustawienia, w tym redukcję artefaktów pierścieniowych oraz utwardzanie wiązki, odpowiednio do 5 i 20%. Sprawdź, czy kompensacja przesunięcia mieści się w zakresie od -7 do 7. Wartości te mogą się różnić w zależności od oprogramowania. Przed rozpoczęciem rekonstrukcji należy zweryfikować je z instrukcją obsługi i wytycznymi producenta.
   UWAGA: Artefakty można zminimalizować podczas rekonstrukcji, stosując korekcje utwardzania wiązki, artefaktów pierścieniowych oraz kompensację przesunięcia. Kompensacja przesunięcia może służyć jako wskaźnik jakości skanowania; jeśli wykracza ona poza zakres określony przez producenta, skanowanie należy powtórzyć. Należy jednak pamiętać, że ustawienia rekonstrukcji zależą od oprogramowania i należy zapoznać się z instrukcją obsługi.

4. Rotacja w µCT

UWAGA: Po rekonstrukcji skany należy obrócić, aby ustanowić spójną orientację dla wszystkich kości oraz zapewnić, że przekroje poprzeczne otrzymanej kości zostaną wykonane prostopadle do osi podłużnej z jak najmniejszym kątem odchylenia. Należy to wykonać za pomocą wybranego przez użytkownika oprogramowania.

1. Rotacja kości udowej
   1. Obróć kość udową tak, aby wszystkie kości miały tę samą orientację podłużną. Na przykład ustaw wszystkie kości tak, aby koniec proksymalny znajdował się u góry skanu.
   2. Obróć kość tak, aby orientacja przekroju poprzecznego wszystkich kości była taka sama. Na przykład obróć kości tak, aby strona przednia zawsze znajdowała się po prawej stronie skanów.
   3. Po wprowadzeniu tych korekt wyprostuj skan, aby zapewnić zachowanie symetrii względem osi centralnej.
   4. Zapisz obrócony zestaw danych.
2. Rotacja kości piszczelowej
   1. Powtórz kroki 4.1.1-4.1.4 dla kości piszczelowej.

5. Procedura badań mechanicznych

1. Przygotowanie
   1. Przed badaniami mechanicznymi należy upewnić się, że wykonano i zrekonstruowano skan µCT o rozdzielczości 6-10 µm, aby zweryfikować poprawność obrazowania każdej próbki w celu obliczenia geometrii przekroju poprzecznego w miejscu złamania (sekcje 2-3).
   2. Po uzyskaniu i weryfikacji skanów należy rozmrozić wszystkie kości przed badaniem (sekcja 1). Wszystkie kości z jednego eksperymentu należy badać tego samego dnia, randomizując kolejność testów w celu zminimalizowania błędu operatora i zmienności systemowej między próbkami i grupami eksperymentalnymi. Należy dopilnować, aby kości pozostały nawodnione przez cały proces badania.
2. Konfiguracja aparatury
   1. Należy dobrać ogniwo tensometryczne o odpowiedniej czułości i zakresie pomiarowym dla danej próbki. Biorąc pod uwagę przewidywany zakres obciążenia krytycznego dla próbki, należy wybrać ogniwo o wydajności o około 50% większej, maksymalizując jednocześnie czułość (np. ogniwo 10 lbf o udźwigu 45 N dla kości mysiej w zakresie pękania 0-25 N).
   2. Należy przygotować uchwyty do obciążania i podpory rozpiętości.
   3. Zainstaluj ogniwo tensometryczne i uchwyty zgodnie z Rysunkiem 1, przykręcając ogniwo do górnego lub dolnego wspornika testera, górny uchwyt obciążający do ogniwa, a dolny uchwyt do dolnego wspornika testera. Należy zapewnić stabilne mocowanie.
      UWAGA: Przy badaniach zginania zazwyczaj zaleca się mocowanie ogniwa tensometrycznego do górnego uchwytu, aby uniknąć kontaktu cieczy z ogniwem, choć w razie potrzeby można użyć wspornika dolnego.
   4. Po zainstalowaniu ogniwa i uchwytów należy wybrać długość rozpiętości podpór i upewnić się, że pozostaje ona stała dla wszystkich badanych próbek. Aby dobrać odległość rozpiętości podpór, najpierw należy zlokalizować najkrótszą kość w zestawie próbek.
   5. Ustaw kość pomiędzy uchwytami, jak pokazano na Rysunku 2.
   6. W przypadku zginania trójpunktowego kości udowej należy postępować zgodnie z Rysunkiem 2A. Należy upewnić się, że powierzchnia przednia kości przylega do rozpiętości podpór, a obszar rozpiętości znajduje się w obrębie diafizy próbki. Należy unikać obejmowania trzeciego trochanteru na końcu proksymalnym oraz punktu przejścia, w którym kość rozszerza się w metafizę i kłykcie na końcu dystalnym.
   7. W przypadku zginania czteropunktowego należy upewnić się, że rozpiętości podpór i obciążenia są wyrównane i wycentrowane względem siebie. Postępuj zgodnie z Rysunkiem 2B, aby umieścić kość w uchwytach.
      1. Ustaw długości rozpiętości podpór i obciążenia w stosunku 3:1⁸ (np. rozpiętość podpór 9 mm i rozpiętość obciążenia 3 mm).
      2. W przypadku kości piszczelowej należy oprzeć powierzchnię przyśrodkową kości o rozpiętość podpór, umieszczając jedną podporę w miejscu połączenia piszczeli i strzałki. Druga podpora zostanie prawdopodobnie umieszczona tuż za grzebieniem piszczeli. Należy upewnić się, że rozpiętość obciążenia, wycentrowana w obrębie rozpiętości podpór, obejmuje jednorodny odcinek kości.
   8. Zmierz odległość rozpiętości podpór w przypadku zginania trójpunktowego oraz odległości rozpiętości obciążenia i podpór w przypadku zginania czteropunktowego i zanotuj te wartości. Należy upewnić się, że wartość ta jest mierzona od środków punktów obciążenia zarówno dla pomiarów rozpiętości obciążenia, jak i podpór.
   9. Umieść kość z powrotem w soli fizjologicznej lub nawodnij ją dawką soli fizjologicznej.
      UWAGA: Przy wyborze punktów dla rozpiętości obciążenia zaleca się stosowanie punktów okrągłych (promień 0,75 mm jest wystarczający, ponieważ rozkłada obciążenie, jednocześnie stykając się z kością w stycznej okręgu). Choć teoria sugeruje użycie ostrza w celu reprezentacji obciążenia punktowego, spowodowałoby to zmiażdżenie kości w punkcie przyłożenia siły, co prowadzi do zawyżania odkształcenia i zaniżania modułu.
   10. Upewnij się, że wszystkie części uchwytu są dokręcone i nieruchome.
3. Konfiguracja oprogramowania
   1. Upewnij się, że tester jest prawidłowo podłączony do komputera za pomocą modułu, kanałów ogniwa tensometrycznego i wszelkich innych elementów wymaganych zgodnie z instrukcją systemu.
   2. W oprogramowaniu przypisanym do testera mechanicznego utwórz profil badania zginania z rampą o prędkości przemieszczenia na tyle niskiej, aby nie wywołać efektów lepkosprężystych (0,025 mm/s jest często stosowane), aby obciążyć kość do momentu pęknięcia.
   3. Podczas tworzenia profilu badania zaleca się również minimalną częstotliwość próbkowania na poziomie 25 Hz, choć preferowana jest wyższa częstotliwość.
   4. Utwórz osobny folder dla każdej grupy badawczej i zapisuj każdy test jako oddzielny plik w tym folderze.
4. Obciążanie i badanie próbek
   1. Wybierz prawidłowo rozmrożoną kość (patrz krok 1.2). Zmierz jej całkowitą długość za pomocą suwmiarki i zanotuj wynik.
   2. Umieść próbkę w uchwytach zgodnie z Rysunkiem 2A w przypadku badania kości udowej w zginaniu trójpunktowym oraz zgodnie z Rysunkiem 2B w przypadku badania kości piszczelowej w zginaniu czteropunktowym.
   3. Zmień nazwę pliku tak, aby odzwierciedlała badaną próbkę.
   4. Wyzeruj obciążenie (nie przemieszczenie). Włącz napęd systemu; upewnij się, że nie znajduje się on w trybie kontroli obciążenia lub przemieszczenia.
   5. Zachowując ostrożność, przyłóż do kości minimalne obciążenie wstępne, aby ustabilizować jej pozycję i zapobiec toczeniu, dbając jednocześnie, by nie uszkodzić próbki. Dąż do obciążenia wstępnego wynoszącego około 0,25 N. Przed kontynuacją upewnij się, że zachowano pożądaną orientację kości.
   6. Nawodnij próbkę, obficie polewając ją solą fizjologiczną.
   7. Rozpocznij badanie zginania, wybierając Start lub Run w oprogramowaniu. KRYTYCZNE: Uważnie obserwuj próbkę przez cały czas trwania badania i zaznacz testy, podczas których wystąpiły jakiekolwiek problemy (np. toczenie, poślizg).
      UWAGA: Problemy te mogą wpłynąć na dane, a notatki na ich temat będą pomocne podczas analizy.
   8. Obserwuj moment rozpoczęcia pękania kości (po stronie rozciąganej). Większość testów będzie trwać do momentu całkowitego złamania. W tym punkcie test zostanie przerwany przez zaprogramowane limity. Jeśli nastąpi pęknięcie, ale tester nadal przemieszcza się, zatrzymaj test ręcznie, aby zapobiec uszkodzeniu ogniwa tensometrycznego.
   9. Po zakończeniu badania zmierz za pomocą suwmiarki długość od końca dystalnego do miejsca pęknięcia i zanotuj ją.
   10. Powtórz kroki 5.4.1 – 5.4.9 dla każdej próbki.

Rysunek 1: Konfiguracja testera mechanicznego. (A) Próba zginania trójpunktowego i (B) próba zginania czteropunktowego. Ogniwo obciążnika zaznaczono na żółto, przyrządy do obciążania na niebiesko, a podpory na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Orientacja kości pomiędzy uchwytami. (A) Prawidłowa orientacja kości udowej w uchwytach do obciążania zginaniem trójpunktowym, pokazująca (od góry do dołu) widoki z boku przyśrodkowego, przedniego i tylnego kości udowej przy prawidłowym ustawieniu. Uchwyty obciążające są zaznaczone na pomarańczowo, a uchwyty wsporcze na niebiesko. Dolne rozpiętości należy dostosować tak, aby objęły jak największą część najprostszego odcinka diafizy, a górny uchwyt powinien znajdować się w centrum między tymi rozpiętościami. (B) Prawidłowa orientacja kości piszczelowej do zginania czteropunktowego, pokazująca (od góry do dołu) widoki z boku przedniego, bocznego i przyśrodkowego kości piszczelowej. Kość należy obciążyć tak, aby powierzchnia przyśrodkowa stykała się z dolnym uchwytem, a powierzchnia boczna z górnym uchwytem. Połączenie kości piszczelowej i strzałkowej powinno znajdować się tuż poza rozpiętością obciążenia. Rozpiętości należy dostosować tak, aby w jak najlepszym stopniu zachować stosunek rozpiętości obciążenia do rozpiętości wsparcia wynoszący 1:3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Wybór ROI

1. Po zarejestrowaniu długości pęknięć, wczytaj obrócone obrazy do wybranego oprogramowania. Po wczytaniu obrazów zlokalizuj i zanotuj górny oraz dolny przekrój kości.
2. Oblicz różnicę między górnym a dolnym przekrojem. Pomnóż tę wartość przez rozmiar woksela skanowania, aby określić całkowitą długość kości w mikrometrach.
3. Aby zlokalizować miejsce złamania w skanie CT, podziel zarejestrowaną długość pęknięcia (w mikrometrach) przez rozmiar woksela, aby otrzymać liczbę przekrojów µCT od końca dystalnego skanu do punktu pęknięcia.
4. Wybierz ROI wycentrowaną w tym miejscu. Najpierw ustal całkowitą pożądaną długość ROI (co najmniej 100 µm). Oblicz liczbę przekrojów odpowiadającą tej długości, dzieląc długość w mikrometrach przez rozmiar woksela, aby określić całkowitą liczbę przekrojów w ROI.
5. Aby wyznaczyć dolną granicę ROI, podziel całkowitą liczbę przekrojów ROI przez 2 i odejmij tę wartość od wcześniej obliczonej lokalizacji pęknięcia wyznaczonej w kroku 6.4.
6. Dodaj całkowitą długość ROI w przekrojach do wcześniej obliczonej wartości, aby otrzymać górną granicę ROI.
7. Wybierz odpowiedni obszar ROI na podstawie obliczonych granic i zapisz go.

7. Normalizacja danych siły i przemieszczenia

UWAGA: Tester mechaniczny generuje jedynie punkty z współrzędnymi x i y (przemieszczenie, siła). Punkty te można przekształcić w naprężenie i odkształcenie, korzystając z równań naprężenia i odkształcenia przy zginaniu Eulera-Bernoulliego, jednak wymaga to właściwości geometrycznych uzyskanych ze skanów µCT. Kwantyfikację tych właściwości można przeprowadzić przy użyciu preferowanego przez użytkownika oprogramowania. My preferujemy własny kod, który zapewnia pełną kontrolę nad wszystkimi danymi wejściowymi, obliczeniami i wynikami. Jak wspomniano wcześniej, w celu uzyskania dostępu do kodu należy skontaktować się bezpośrednio z autorem korespondencyjnym lub odwiedzić stronę internetową laboratorium pod adresem https://bbml.et.iupui.edu/ w celu uzyskania dalszych informacji. Poniżej omówiono równania naprężenia i odkształcenia, a także niezbędne właściwości geometryczne, które muszą zostać uzyskane ze skanów µCT w celu ich obliczenia.

1. Równania normalizacji dla zginania trójpodporowego
   1. Równanie służące do obliczania naprężenia w zginaniu trójpodporowym przedstawiono poniżej w Równaniu 1. W równaniu tym „F” oznacza siłę, a „L” długość rozstawu podpór. Wartości siły są rejestrowane przez tester mechaniczny podczas badania. Przed rozpoczęciem testów należy zapisać długość rozstawu podpór. „c” i „I” to właściwości geometryczne, które zostaną obliczone na podstawie skanów µCT (sekcja 7.3).
           (1)
   2. Równanie do obliczania odkształcenia przedstawiono poniżej w Równaniu 2; „c” i „L” reprezentują te same właściwości zarówno dla obliczeń naprężenia, jak i odkształcenia. „d” oznacza wartości przemieszczenia rejestrowane przez tester mechaniczny podczas badań.
           (2)
2. Równania normalizacji dla zginania czteropodporowego
   1. Równanie na naprężenie w zginaniu czteropodporowym przedstawiono poniżej w Równaniu 3. „F” i „I” pozostają tymi samymi zmiennymi, które omówiono w kroku 7.1.1. Oblicz „a” na podstawie pomiarów rozstawu podpór i rozstawu obciążenia przed rozpoczęciem testów. W przypadku zastosowania zalecanego stosunku 3:1 rozstawu podpór do rozstawu obciążenia dla zginania czteropodporowego, wartość „a” będzie wynosić jedną trzecią długości rozstawu podpór.
           (3)
   2. Równanie na odkształcenie w zginaniu czteropodporowym przedstawiono poniżej w Równaniu 4. „c” i „a” oznaczają te same właściwości zarówno dla obliczeń naprężenia, jak i odkształcenia. „d” oznacza wartości przemieszczenia rejestrowane przez tester mechaniczny podczas badań.
           (4)
3. Obliczanie właściwości geometrycznych ze skanów µCT
   1. Zmienna „c” reprezentuje odległość od osi obojętnej do powierzchni kości, która została poddana rozciąganiu. W związku z tym należy wyznaczyć środek ciężkości każdego przekroju poprzecznego w skanach µCT, ponieważ oś obojętna przechodzi przez środek ciężkości.
      1. W przypadku zastosowania orientacji badania kości udowej w zginaniu trójpodporowym opisanej w kroku 5.2.6, należy zmierzyć „c” względem powierzchni przedniej.
      2. W przypadku zastosowania orientacji badania kości piszczelowej opisanej w kroku 5.2.7, należy zmierzyć „c” względem powierzchni przyśrodkowej kości.
   2. Zmienna „I” reprezentuje moment bezwładności pola powierzchni względem osi zginania (osi przyśrodkowej-bocznej dla kości udowej; osi przedniej-tylnej dla kości piszczelowej). Wartość tę należy obliczyć za pomocą Równania 5. W równaniu tym „dA” to powierzchnia każdego piksela zarejestrowanego w skanie µCT, a y to obliczona odległość każdego piksela od osi obojętnej.
           (5)

8. Badane właściwości mechaniczne

1. Przed obliczeniem właściwości mechanicznych należy wygenerować krzywą siła-przemieszczenie oraz krzywą naprężenie-odkształcenie (idealne krzywe przedstawiono poniżej na Rysunku 3, wraz z istotnymi właściwościami).
   UWAGA: Badania próbek biologicznych nie zawsze dają krzywe wyglądające jak te zidealizowane przykłady, jednak pozostają one użytecznym punktem odniesienia.
2. Przed analizą należy zbadać te krzywe, aby wykryć błędy w pomiarach, takie jak toczenie się lub ślizganie kości. Błędy te zazwyczaj powodują wybrzuszenia lub obszary płaskie w początkowej linearnej części krzywej. Na tym etapie należy usunąć nadmiarowe dane, w tym wszelkie dane, które mogły zostać zebrane przed kontaktem urządzenia badawczego z kością lub dane po wystąpieniu zniszczenia.
3. Po upewnieniu się na podstawie wykreślonych krzywych, że badanie było prawidłowe, należy rozpocząć analizę istotnych właściwości.
   1. Sztywność i moduł sprężystości
      1. Sztywność należy obliczyć, korzystając wyłącznie z obszaru sprężystego krzywej siła-przemieszczenie. Nachylenie krzywej w tym obszarze stanowi sztywność.
      2. Moduł sprężystości należy obliczyć, korzystając z nachylenia wyłącznie sprężystej części krzywej naprężenie-odkształcenie.
   2. Punkt plastyczności
      UWAGA: Istnieją dwa punkty plastyczności: jeden na krzywej siła-przemieszczenie i jeden na krzywej naprężenie-odkształcenie. Wartości (x,y) dla tego punktu z krzywej siła-przemieszczenie określa się jako przemieszczenie do plastyczności i siłę plastyczności, natomiast z krzywej naprężenie-odkształcenie jako odkształcenie do plastyczności i naprężenie plastyczności. Punkty te reprezentują koniec obszaru sprężystego krzywej i można je wyznaczyć w następujący sposób:
      1. Metoda krzywej naprężenie-odkształcenie: Należy wyznaczyć linię przesuniętą od punktu (0,0) o odkształcenie 0,2% (2 000 mikroodkształceń), ale o tym samym nachyleniu co moduł sprężystości. Linię tę nanosi się na wykres naprężenie-odkształcenie; miejsce, w którym linia ta przecina krzywą naprężenie-odkształcenie, definiuje się jako punkt plastyczności. Należy użyć tych współrzędnych naprężenia i odkształcenia plastyczności, aby znaleźć analogiczne wartości siły i przemieszczenia; wartości te będą reprezentować siłę plastyczności i przemieszczenie do plastyczności.
      2. Metoda sekancyjna: Należy obliczyć sztywność z krzywej siła-przemieszczenie, a następnie zmniejszyć sztywność o wybrany procent (5-10%). Należy wykreślić linię zaczynającą się w punkcie (0,0) o nachyleniu odpowiadającym tej zredukowanej sztywności i doprowadzić do jej przecięcia z krzywą siła-przemieszczenie. Punkt przecięcia będzie miał współrzędne (przemieszczenie do plastyczności, siła plastyczności).
         UWAGA: Metodę sekancyjną można stosować do wyznaczenia punktu plastyczności bez danych o naprężeniu-odkształceniu.
   3. Siła maksymalna i naprężenie maksymalne
      1. Siłę maksymalną i naprężenie maksymalne oblicza się poprzez znalezienie wartości maksymalnej w odpowiednich zestawach danych.
   4. Właściwości przemieszczenia i odkształcenia
      1. Wartości przemieszczenia do plastyczności i odkształcenia do plastyczności reprezentują przemieszczenie lub odkształcenie w punkcie plastyczności. Aby je wyznaczyć, należy zlokalizować plastyczność zgodnie z opisem w kroku 8.3.2.
      2. Wartości całkowitego przemieszczenia i całkowitego odkształcenia reprezentują całkowite przemieszczenie lub całkowite odkształcenie, jakiego próbka uległa podczas badania, i odpowiadają one punktowi zniszczenia.
      3. Przemieszczenie poplastyczne i odkształcenie poplastyczne: Przemieszczenie poplastyczne jest często raportowane i można je obliczyć, odejmując przemieszczenie do plastyczności od przemieszczenia całkowitego. Odkształcenie poplastyczne oblicza się poprzez odjęcie odkształcenia do plastyczności od odkształcenia całkowitego, jednak należy raportować je z ostrożnością, ponieważ odkształcenie jest pierwotnie wyprowadzane przy założeniu, że materiał jest liniowo sprężysty (przed plastycznością). Sprawia to, że pomiar poplastyczny może być niewiarygodny.
   5. Właściwości energetyczne
      1. Energię oblicza się jako pole powierzchni pod krzywą siła-przemieszczenie lub krzywą naprężenie-odkształcenie.
      2. Pole powierzchni pod krzywą siła-przemieszczenie określa się jako pracę. Pole obliczone pod częścią krzywej przed punktem plastyczności, czyli w obszarze sprężystym, określa się jako pracę sprężystą lub energię sprężystą. Pole obliczone pod krzywą za punktem plastyczności, czyli w obszarze plastycznym, określa się jako pracę poplastyczną lub plastyczną, bądź energię utraconą.
      3. Obliczone całkowite pole pod krzywą naprężenie-odkształcenie określa się jako udarność lub moduł udarności, natomiast pole obliczone pod krzywą naprężenie-odkształcenie do punktu plastyczności określa się jako sprężystość. Udarność poplastyczna, podobnie jak odkształcenie poplastyczne, często nie jest raportowana ze względu na założenia równań odkształcenia, które nie mają zastosowania do tej właściwości.

Rycina 3: Krzywe siła-przemieszczenie oraz naprężenie-odkształcenie. (A) Idealna krzywa siła-przemieszczenie; (B) idealna krzywa naprężenie-odkształcenie z linią wyznaczoną metodą przesunięcia 0,2% użytą do obliczenia granicy plastyczności zaznaczoną na czerwono (należy zauważyć, że linia ta ma takie samo nachylenie jak obszar sprężysty krzywej). Kluczowe właściwości, które można uzyskać z krzywej siła-przemieszczenie, obejmują siłę plastyczności, siłę maksymalną, przemieszczenie do granicy plastyczności, całkowite przemieszczenie oraz pracę. Właściwości na poziomie tkanki, które można uzyskać z krzywej naprężenie-odkształcenie, obejmują naprężenie plastyczności, naprężenie maksymalne, odkształcenie do granicy plastyczności, całkowite odkształcenie, sprężystość oraz udarność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Po zakończeniu badania tomografii komputerowej (CT) większość wadliwych skanów można wykryć na etapie rekonstrukcji. Często skany słabej jakości charakteryzują się wysoką kompensacją niedopasowania, co jest wyraźnym wskaźnikiem błędu podczas skanowania. Błędy mogą jednak wystąpić również na innych etapach, co może prowadzić do uzyskania nieprawidłowych danych. Błędy te można często zauważyć podczas analizy poszczególnych obliczonych właściwości architektonicznych. Jeśli wartości znacznie odbiegają od zakresu pozostałych ...

Dyskusja

W całym procesie skanowania i testowania zdarzają się momenty, w których rozwiązywanie problemów i optymalizacja są odpowiednie. Pierwszy z nich występuje podczas skanowania kości za pomocą μCT. Podczas gdy wiele systemów jest dostarczanych z uchwytem, w którym można trzymać i skanować jeden obiekt, niestandardowe uchwyty mogą być produkowane w celu skanowania wielu kości w tym samym czasie. Skanowanie wielu kości może być doskonałym punktem do optymalizacji, ale należy zachować ostrożność podczas całego procesu skanowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CTAn	Bruker	NA	Oprogramowanie do analizy skanów CT DataViewer
	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Platforma kodowania używana do analizy danych
Oprogramowanie do rekonstrukcji skanów CT	NRecon	Bruker
NA SKYSCAN 1272-100 kV z detektorem CCD 16 MP, w tym oprogramowanie 3D Suite i nbsp;	Micro Photonics Inc	SKY-016814	System Micro-CT, który może nieniszcząco wizualizować do 209 mPs w każdym wirtualnym przekroju obiektu