Praktyczne uwarunkowania dotyczące projektowania, wykonywania i interpretacji badań obejmujących próby zginania kości gryzoni w całości

Podsumowanie

Mechaniczne badanie kości gryzoni jest cenną metodą pozyskiwania informacji na temat podatności kości na złamania. Przy braku odpowiedniego zrozumienia praktycznego wyniki mogą być nadinterpretowane lub nieaktualne. Protokół ten posłuży jako przewodnik zapewniający, że testy mechaniczne są wykonywane dokładnie, aby zapewnić prawidłowe i funkcjonalne dane.

Streszczenie

Kruchość szkieletu prowadząca do złamań to amerykański kryzys zdrowia publicznego, skutkujący 1,5 miliona złamań rocznie i 18 miliardów dolarów bezpośrednich kosztów opieki. Zdolność do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby kości i odpowiedzi na leczenie jest nie tylko pożądana, ale i kluczowa. Mechaniczne badanie kości służy jako cenna technika pozwalająca zrozumieć i określić ilościowo podatność kości na złamania. Chociaż metoda ta wydaje się prosta do wykonania, można wyciągnąć niewłaściwe i niedokładne wnioski, jeśli użytkownik zignoruje nadrzędne założenia i kluczowe kroki. Zaobserwowano to w różnych dyscyplinach, ponieważ badania nadal są publikowane z niewłaściwym wykorzystaniem metod i nieprawidłową interpretacją wyników. Protokół ten posłuży jako podstawa do zasad związanych z testami mechanicznymi wraz z zastosowaniem tych technik - od rozważań nad wielkością próbki, poprzez pobieranie i przechowywanie tkanek, po analizę i interpretację danych. Dzięki temu można uzyskać cenne informacje na temat podatności kości na złamania, co pogłębi wiedzę zarówno dla badań akademickich, jak i rozwiązań klinicznych.

Wprowadzenie

Mechaniczne badanie kości jest podstawową metodą pozyskiwania funkcjonalnych informacji związanych z podatnością kości na złamania. W badaniach przedklinicznych można zastosować kilka metod testowania, ale zdecydowanie najczęstszą jest zginanie kości długich. Testy te są łatwe do wykonania i mogą być stosowane na kościach o różnej wielkości, od człowieka do myszy. Ponieważ myszy są jednymi z najczęściej badanych zwierząt w badaniach przedklinicznych, protokół ten skupi się na testach zginania wykonywanych na kości udowej i piszczelowej myszy.

Przed wykonaniem testów zginania, kości muszą być odpowiednio pobrane i przechowywane. Najczęstszymi metodami przechowywania tradycyjnie były zamrażanie kości w gazie nasączonej solą, zamrażanie w samej soli fizjologicznej lub odwadnianie kości w etanolu ¹. Wykazano, że kości przechowywane w etanolu mają zwiększoną sztywność i moduł sprężystości oraz zmniejszone parametry odkształcenia w porównaniu z tymi przechowywanymi w stanie zamrożonym¹. Nawet ponowne nawodnienie kości przed badaniem nie przywraca tych właściwości do normalnego poziomu ¹. Przechowywanie zanurzone w soli fizjologicznej może spowodować uszkodzenie kości, ponieważ ciśnienie jest wywierane w miarę rozszerzania się soli fizjologicznej. Ponadto konieczne byłoby całkowite rozmrożenie roztworu w celu usunięcia kości do skanowania metodą tomografii mikrokomputerowej (μCT). W związku z tym zamrażanie świeżo zebranych kości w gazie nasączonej solą stało się standardową metodą przechowywania i jest zalecane w całym tym protokole.

Ponieważ rozmiar i kształt kości wpływają na jej wytrzymałość, a wiele modeli chorób znacząco zmienia rozmiar i morfologię kości, stosuje się zasady inżynierii, aby znormalizować wpływ rozmiaru na uzyskanie właściwości, które szacują zachowanie tkanki². Podejście to wymaga geometrii przekroju poprzecznego miejsca uszkodzenia, która jest najczęściej uzyskiwana za pomocą μCT do tworzenia skanów kości przed badaniem. μCT jest szeroko stosowany ze względu na jego dostępność i wysoką rozdzielczość obrazu. Co więcej, wkład tkanek miękkich nie jest uwzględniony, a skanowanie nie wymaga chemicznego mocowania ani innych modyfikacji bone^3,4. We wszystkich formach tomografii komputerowej źródło promieniowania rentgenowskiego skupia się na obiekcie, podczas gdy detektor po drugiej stronie obiektu mierzy wynikową energię promieniowania rentgenowskiego. W ten sposób powstaje cień rentgenowski próbki, który można przekształcić w obraz^3,5. Skanowany obiekt jest obracany (lub źródło promieniowania rentgenowskiego i detektor są obracane wokół próbki), generując obrazy, które można zrekonstruować do trójwymiarowego zestawu danych reprezentującego obiekt⁵.

Rozdzielczość skanowania, czyli jak blisko siebie mogą znajdować się dwa obiekty i nadal być rozdzielone indywidualnie, jest kontrolowana przez zmianę nominalnego rozmiaru woksela lub rozmiaru piksela w wynikowym obrazie. Ogólnie przyjmuje się, że obiekty muszą być co najmniej dwa razy większe od pojedynczego woksela, aby mogły zostać zidentyfikowane³, ale wyższy współczynnik pozwoli na poprawę precyzji. Co więcej, większe woksele są bardziej podatne na częściowe efekty objętościowe: gdy pojedynczy woksel zawiera tkanki o różnej gęstości, przypisuje się mu średnią tych gęstości, a nie gęstość właściwą pojedynczej tkanki, co może prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania obszarów tkanek i gęstości mineralnej³. Chociaż te problemy można złagodzić, wybierając mniejsze rozmiary wokseli, użycie wyższej rozdzielczości nie gwarantuje eliminacji częściowych efektów głośności i może wymagać dłuższego czasu skanowania³. Podczas skanowania kości ex vivo ogólnie zaleca się rozmiar woksela 6-10 μm, aby dokładnie ocenić architekturę beleczkową kości myszy. Większy rozmiar woksela wynoszący 10-17 μm może być użyty dla kości korowej, chociaż należy użyć najmniejszego rozsądnego rozmiaru woksela. Protokół ten wykorzystuje rozmiar woksela 10 μm, który jest wystarczająco mały, aby rozróżnić kluczowe właściwości beleczkowania i zminimalizować efekty częściowej objętości bez długiego czasu skanowania.

Ustawienia filtra energii rentgenowskiej i energii również muszą być starannie dobrane, ponieważ wysoka gęstość mineralna i grubość tkanki kostnej znacznie tłumi i zmienia transmitowane widmo energii promieniowania rentgenowskiego. Powszechnie zakłada się, że ponieważ emitowane widmo promieniowania rentgenowskiego jest równoważne widmu, które opuszcza obiekt⁶, użycie niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego na gęstych obiektach, takich jak kości, może prowadzić do artefaktu znanego jako utwardzanie wiązki⁷. Podczas skanowania próbek kości zaleca się wyższe napięcie 50-70 kVp, aby zmniejszyć częstość występowania tych artefaktów⁵. Ponadto wstawienie aluminiowego lub miedzianego filtra energii tworzy bardziej skoncentrowaną wiązkę energii, co jeszcze bardziej minimalizuje artefakty^4,7. W całym tym protokole zostanie zastosowany filtr aluminiowy o grubości 0,5 mm.

Na koniec, krok obrotu skanowania i długość obrotu (np. 180°-360°) razem kontrolują liczbę przechwytywanych obrazów, co określa ilość szumu w końcowym skanowaniu⁴. Uśrednienie wielu klatek w każdym kroku może zredukować szum, ale może wydłużyć czas skanowania⁴. Ten protokół wykorzystuje krok obrotu wynoszący 0,7 stopnia i uśrednianie klatek wynoszące 2.

Ostatnia uwaga na temat skanowania: fantomy kalibracji hydroksyapatytu powinny być skanowane przy użyciu tych samych ustawień skanowania, co kości eksperymentalne, aby umożliwić konwersję współczynników tłumienia na gęstość mineralną w g/cm3⁵. W protokole tym wykorzystuje się fantomy o stężeniu 0,25 g/^cm3 i hydroksyapatytu o stężeniu 0,75 g/^cm3, chociaż dostępne są różne fantomy. Należy pamiętać, że niektóre systemy skanujące używają wewnętrznych fantomów w ramach codziennej kalibracji systemu.

Po zakończeniu skanowania, rzuty kątowe są rekonstruowane w przekrojowe obrazy obiektu, zazwyczaj przy użyciu dołączonego oprogramowania producenta. Niezależnie od zastosowanego systemu, ważne jest, aby upewnić się, że cała kość jest uchwycona w rekonstrukcji i że progi są odpowiednio ustawione, aby umożliwić rozpoznanie kości i niekości. Po rekonstrukcji bardzo ważne jest, aby obrócić wszystkie skany w trzech wymiarach, tak aby kości były zorientowane spójnie i prawidłowo wyrównane z osią poprzeczną, ponownie przy użyciu oprogramowania producenta.

Po obróceniu, obszary zainteresowania (ROI) do analizy mogą być wybrane w zależności od tego, czy pożądane są właściwości kory, beleczkowanie czy geometria złamania dla normalizacji mechanicznej. W przypadku tych ostatnich ROI należy wybrać po przeprowadzeniu testów, mierząc odległość od miejsca złamania do jednego końca kości i używając rozmiaru woksela do określenia odpowiedniej lokalizacji przekroju w pliku skanowania. Wybrany obszar powinien mieć co najmniej 100 μm długości, z punktem pęknięcia w przybliżonym środku ROI, aby zapewnić odpowiednie oszacowanie⁴.

Po wybraniu ROI, do normalizacji mechanicznej (do obliczenia naprężenia zginającego i odkształcenia) potrzebne są dwie właściwości: maksymalna odległość od neutralnej osi gięcia do powierzchni, na której inicjowane jest uszkodzenie (zakłada się, że jest to powierzchnia obciążona napięciem, określona przez układ testowy) oraz obszar momentu bezwładności wokół osi neutralnej (również zależny od konfiguracji testowej). Ten protokół zaleca użycie niestandardowego kodu do określenia tych wartości. Aby uzyskać dostęp do kodu, skontaktuj się bezpośrednio z autorem korespondencyjnym lub odwiedź stronę internetową laboratorium pod adresem https://bbml.et.iupui.edu/, aby uzyskać więcej informacji.

Po zakończeniu skanowania μCT można rozpocząć testy mechaniczne. Próby zginania mogą być wykonywane w konfiguracji czteropunktowej lub trzypunktowej. Preferowane są czteropunktowe testy zginania, ponieważ eliminują naprężenia ścinające w kości między punktami obciążenia, co pozwala na wystąpienie czystego zginania w tym obszarze³. Kość następnie pęknie z powodu naprężenia, tworząc uszkodzenie, które jest bardziej reprezentatywne dla prawdziwych właściwości zginania bone³. Kość musi być jednak obciążona w taki sposób, aby dostarczyć takie samo obciążenie w obu punktach obciążenia (można to ułatwić za pomocą obrotowej głowicy ładującej). W testach zginania trzypunktowego występuje duża zmiana naprężenia ścinającego w miejscu, w którym punkt obciążenia styka się z kością, co powoduje, że kość pęka w tym miejscu z powodu ścinania, a nie rozciągania³. Normy ASTM zalecają, aby materiały poddawane zginaniu miały stosunek długości do szerokości 16:1, co oznacza, że długość przęsła podparcia powinna być 16 razy większa niż szerokość kości, aby zminimalizować wpływ ścinania^8,9. Jest to często niemożliwe do osiągnięcia podczas badania małych kości gryzoni, więc rozpiętość obciążenia jest po prostu tak duża, jak to możliwe, ale z jak najmniejszą zmianą kształtu przekroju poprzecznego. Co więcej, podczas wykonywania zgięcia czteropunktowego, stosunek długości dolnego i górnego przęsła powinien wynosić ~3:1⁸, co zwykle można osiągnąć w kości piszczelowej, ale jest to trudne w krótszej kości udowej. Ponadto cieńsze ściany kory udowej sprawiają, że są one podatne na deformację pierścieniową, która zmienia kształt przekroju kości podczas badania (można to uwydatnić w testach czteropunktowych, ponieważ do wywołania tego samego momentu zginającego potrzebna jest większa siła w porównaniu ze zginaniem trzypunktowym). Dlatego zginanie trzypunktowe będzie stosowane w przypadku kości udowej myszy, podczas gdy zginanie czteropunktowe będzie stosowane w przypadku kości piszczelowych w całym tym protokole.

Na koniec, ważne jest, aby odpowiednio zasilić badanie do analizy statystycznej. Ogólnym zaleceniem dla badań mechanicznych jest posiadanie próbki o wielkości 10-12 kości na grupę doświadczalną, aby móc wykryć różnice, ponieważ niektóre właściwości mechaniczne, zwłaszcza parametry po plonowaniu, mogą być bardzo zmienne. W niektórych przypadkach może to oznaczać rozpoczęcie od większej wielkości próby zwierzęcej, biorąc pod uwagę wyczerpanie, które może wystąpić podczas badania. Analiza wielkości próby przy użyciu istniejących danych powinna zostać zakończona przed przystąpieniem do badania.

Istnieją liczne ograniczenia i założenia, ale testy zginania mogą dostarczyć dość dokładne wyniki, zwłaszcza gdy interesujące są względne różnice między grupami. Właściwości te, wraz z analizą architektury beleczkowej i morfologii kory mózgowej, mogą zapewnić lepszy wgląd w stany chorobowe i schematy leczenia. Jeśli zachowamy ostrożność w tych aspektach eksperymentu, które są pod naszą kontrolą (np. zbieranie, przechowywanie, skanowanie i testowanie), możemy mieć pewność, że uzyskano dokładne wyniki.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole, które dotyczyły zwierząt, zostały zatwierdzone przez Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) przed procedurą. Zwierzęta opisane w procedurze zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie CO_{2 ,}a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako wtórny sposób eutanazji.

1. Zbieranie, przechowywanie i rozmrażanie kości

1. Zbiór i przechowywanie
   1. Umieść mysz brzuszną stroną do góry. Użyj skalpela (lub żyletki lub nożyczek), aby wykonać nacięcie w przybliżonym miejscu połączenia kości udowej i miednicy po jednej stronie.
   2. Kontynuuj początkowe nacięcie grzbietowo, aż staw biodrowy zostanie zlokalizowany; poszukaj głowy kości udowej, która wygląda jak mała biała kula przymocowana do miednicy.
   3. Naciskać krawędzią skalpela na bliższą krawędź głowy kości udowej, aż głowa kości udowej wyskoczy z panewki. Wyciąć dodatkową tkankę, aby uwolnić tylną kończynę od pozostałej części tuszy.
   4. Po odizolowaniu kończyny tylnej oddziel kość piszczelową i kość udową, wywołując zgięcie w stawie kolanowym. Przesuń skalpel w kierunku przyśrodkowo-bocznym na przedniej powierzchni kolana, aby przeciąć przylegającą tkankę, w tym więzadła między kośćmi.
   5. Jeśli to nie rozdzieli kości, wyprostuj staw kolanowy, aby umożliwić dostęp do tylnej powierzchni. Uważaj, aby nie przeciąć kości lub nie zeskrobać chrząstki stawowej.
   6. Po oddzieleniu kości udowej i piszczelowej usuń tylną część stopy z kości piszczelowej, zginając staw i wykonując przyśrodkowo-boczny ruch piłowania na tylnej powierzchni stawu. W razie potrzeby przedłuż staw, aby odsłonić przednią powierzchnię. Uważaj, aby nie przeciąć kości.
   7. Po odizolowaniu oczyść kości ze wszystkich przylegających tkanek miękkich. Jeśli wykonujesz czteropunktowe próby zginania kości piszczelowej, usuń również kość strzałkową. Kość strzałkowa jest połączona więzadłami na bliższym końcu, ale jest zrośnięta z piszczelem w pobliżu dystalnego końca kości. Użyj ostrych nożyczek w pobliżu punktu połączenia, aby oddzielić kość strzałkową.
   8. Oddzielnie odizolowane i oczyszczone kości zawinąć w gazę nasączoną solą fizjologiczną i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zrób to natychmiast po zbiorach.
   9. Powtórzyć kroki od 1.1.1 do 1.1.8 dla drugiej strony tuszy.
      UWAGA: Jeśli występuje opór podczas próby rozdzielenia kości w krokach 1.1.4-1.1.6, najlepiej jest powtórzyć kroki, zamiast próbować rozsunąć kości. Silne ruchy mogą prowadzić do uszkodzenia lub złamania kości.
2. Rozmrażanie
   UWAGA: Liczba cykli zamrażania i rozmrażania, którym poddawana jest kość, powinna być zminimalizowana, ponieważ nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania mogą niekorzystnie wpływać na właściwości mechaniczne kości. Częściowe rozmrożenie do skanowania μCT można uzyskać, pozostawiając kość w temperaturze pokojowej na 5-10 minut. Całkowicie rozmrozić kość tylko podczas wykonywania prób zginania, jak opisano poniżej.
   1. Preferowana nocna rozmrażówka
      1. Przenieś kości z przechowywania w temperaturze -20 °C do 1-4 °C w chłodni lub lodówce. Upewnij się, że kości pozostają tam przez 8-12 godzin, aby całkowicie się rozmrozić przed badaniem.
   2. Szybkie rozmrażanie
      1. Ustawić temperaturę kąpieli na około 37 °C. Gdy osiągniesz tę temperaturę, dodaj kości do kąpieli.
      2. Pozostaw kości w kąpieli na około 1 godzinę.

2. Skanowanie μCT

1. Owiń kości parafilmem przed skanowaniem, aby utrzymać nawodnienie. Trzymaj wszystkie inne kości na lodzie w oczekiwaniu na skanowanie.
2. Po owinięciu w parafilm umieść kość w uchwycie, aby połączyć się ze skanerem. Upewnij się, że wszystkie zeskanowane kości są wyrównane w tej samej orientacji, ponieważ spójne wyrównanie uprości obracanie w dalszej części analizy.
3. Dostosuj ustawienia skanowania do zastosowania skanowania. W przypadku kości myszy zalecane są następujące ogólne ustawienia skanowania: rozdzielczość/rozmiar woksela: 10 μm; Rozmiar piksela: średni, 2000 x 1048; filtr: aluminium 0,5 mm; krok obrotu: 0,7; Uśrednianie klatek: 2,
   UWAGA: Ustawienia te mogą się różnić w zależności od systemu używanego do skanowania, a w razie potrzeby należy zapoznać się z instrukcją producenta i obsługi.
4. Gdy źródło promieniowania rentgenowskiego jest włączone, wykonaj płaską korekcję pola, aby zminimalizować artefakty. Aby to zrobić, najpierw upewnij się, że komora jest pusta i wyłącz płaskie pole.
5. Zmierz średnią intensywność pola i dostosuj ją do 60%. Gdy osiągnie 60%, zaktualizuj płaskie pole i włącz je ponownie.
6. Upewnij się, że średnia intensywność wynosi teraz (86-88%).
   UWAGA: Ten proces może się różnić w zależności od używanego systemu μCT. Przed przystąpieniem do procesu zapoznaj się z instrukcją obsługi.
7. Po pomyślnym wykonaniu korekcji płaskiego pola umieść uchwyt w komorze. Upewnij się, że próbki są wyśrodkowane i wypoziomowane przed umieszczeniem cokołu w komorze.
8. Po zabezpieczeniu cokołu zamknij komorę, upewnij się, że cała kość zostanie uchwycona na skanie (może być konieczny widok zwiadowczy) i rozpocznij skanowanie.
9. Po skanowaniu ponownie przechowywać kości w gazie nasączonej solą fizjologiczną w temperaturze -20 °C.

3. rekonstrukcja μCT

1. Wybierz zwrot z inwestycji, który uchwyci całą kość podczas rekonstrukcji. Aby to zrobić, wyświetl największy przekrój poprzeczny kości i zwymiaruj ROI na podstawie tego przekroju.
2. Ustaw progi oprogramowania, aby umożliwić prawidłowe rozpoznanie kości w porównaniu z kością. W tym celu należy użyć histogramu, w którym dolne ograniczenie jest ustawione na 0, a górne ograniczenie jest ustawione na końcu danych histogramu szczytu.
3. Dostosuj dodatkowe ustawienia, w tym redukcję artefaktów pierścienia i wzmocnienie wiązki odpowiednio do 5 i 20%. Sprawdź, czy kompensacja niewspółosiowości mieści się w zakresie od -7 do 7. Wartości te mogą się różnić w zależności od oprogramowania. Upewnij się, że zostały one zweryfikowane z instrukcją obsługi i instrukcjami producenta przed rozpoczęciem rekonstrukcji.
   UWAGA: Artefakty można zminimalizować podczas rekonstrukcji, korzystając z poprawek dotyczących hartowania belki, artefaktów pierścieniowych i kompensacji niewspółosiowości. Kompensacja niewspółosiowości może działać jako wskaźnik jakości skanowania, a jeśli wykracza poza zakres określony przez producenta, skanowanie należy powtórzyć. Jednak ustawienia rekonstrukcji będą zależne od oprogramowania i należy zapoznać się z instrukcją obsługi.

4. rotacja μCT

UWAGA: Po zrekonstruowaniu, skany muszą być obracane, aby ustalić stałą orientację na wszystkich kościach i zapewnić, że przekroje poprzeczne powstałej kości są prowadzone normalnie do osi podłużnej z jak najmniejszym kątem przesunięcia. Należy to zrobić za pomocą wybranego przez użytkownika oprogramowania.

1. Rotacja kości udowej
   1. Obróć kość udową tak, aby wszystkie kości miały tę samą orientację wzdłużną. Na przykład ustaw wszystkie kości tak, aby proksymalny koniec kości znajdował się u góry skanu.
   2. Obróć kość tak, aby orientacja przekroju poprzecznego wszystkich kości była taka sama. Na przykład obróć kości tak, aby przednia strona zawsze znajdowała się po prawej stronie skanów.
   3. Po wprowadzeniu tych regulacji wyprostuj skanowanie, aby zapewnić zachowanie symetrii względem osi środkowej.
   4. Zapisz obrócony zestaw danych.
2. Rotacja Tibii
   1. Powtórz kroki 4.1.1-4.1.4 dla kości piszczelowej.

5. Procedura testów mechanicznych

1. preparat
   1. Przed przystąpieniem do badań mechanicznych należy upewnić się, że uzyskano i zrekonstruowano skan μCT o rozdzielczości 6-10 μm, aby sprawdzić, czy uzyskano wysokiej jakości skan dla każdej próbki w celu obliczenia geometrii przekroju poprzecznego w miejscu złamania (sekcje 2-3).
   2. Po uzyskaniu i zweryfikowaniu skanów rozmrozić wszystkie kości przed badaniem (sekcja 1) . Przetestuj wszystkie kości z jednego eksperymentu tego samego dnia i losowo zlosuj kolejność testów, aby zminimalizować stronniczość użytkowników i zmienność systemu między próbkami i grupami eksperymentalnymi. Upewnij się, że kości pozostają nawodnione przez cały proces testowania.
2. Konfiguracja aparatury
   1. Zlokalizuj ogniwo obciążnikowe o odpowiedniej czułości i nośności dla próbki. Weź pod uwagę oczekiwany zakres uszkodzeń próbki i wybierz czujnik wagowy o około 50% większej nośności, jednocześnie maksymalizując czułość (np. czujnik wagowy 10 lbf o pojemności 45 N dla kości myszy w zakresie awarii 0-25 N).
   2. Zlokalizuj mocowania przęsła obciążenia i podparcia.
   3. Zamontuj ogniwo obciążnikowe i osprzęt, jak pokazano na Rysunek 1, przykręcając ogniwo obciążnikowe do górnego lub dolnego wspornika testera, uchwyt ładujący od góry do ogniwa obciążnikowego, a dolny uchwyt do dolnego wspornika testera. Zapewnij bezpieczne dopasowanie.
      UWAGA: Mocowanie ogniwa obciążnikowego do górnego uchwytu jest ogólnie zalecane podczas wykonywania testów zginania, aby uniknąć kontaktu płynu z ogniwem obciążnikowym, ale w razie potrzeby można użyć dolnego uchwytu.
   4. Po zainstalowaniu ogniwa obciążnikowego i osprzętu wybierz długość przęsła podpory i upewnij się, że pozostaje ona stała dla wszystkich badanych próbek. Aby wybrać rozpiętość podpory, najpierw zlokalizuj najkrótszą kość w zestawie próbek.
   5. Ustaw kość między urządzeniami, jak pokazano na Rysunek 2.
   6. Aby uzyskać trzypunktowe zgięcie kości udowej, postępuj zgodnie z Rysunek 2A. Upewnij się, że przednia powierzchnia kości przylega do przęsła podparcia, a obszar rozpiętości znajduje się w trzonie próbki. Unikaj włączania trzeciego krętarza na bliższym końcu i punkcie przejścia, w którym kość rozszerza się do przynasady i kłykci na dystalnym końcu.
   7. W przypadku gięcia czteropunktowego upewnij się, że przęsła podpory i obciążenia są wyrównane i wyśrodkowane względem siebie. Postępuj zgodnie z Rysunek 2B, aby załadować kość do urządzeń.
      1. Ustaw długości podpór i przęseł obciążenia tak, aby były zgodne ze stosunkiem 3:1⁸ (np. rozpiętość podpory 9 mm i rozpiętość obciążenia 3 mm).
      2. W przypadku kości piszczelowej obciążyć przyśrodkową powierzchnię kości o przęsło podparcia jednym podparciem na połączeniu piszczelowo-strzałkowym. Drugie podparcie zostanie prawdopodobnie umieszczone tuż za grzebieniem piszczelowym. Upewnij się, że rozpiętość obciążenia, wyśrodkowana w rozpiętości podpory, zawiera jednolity obszar kości.
   8. Zmierz odległość rozpiętości podpory w przypadku gięcia trzypunktowego oraz odległości obciążenia i rozpiętości podpory w przypadku gięcia 4-punktowego i zapisz te odległości. Upewnij się, że wartość ta jest rejestrowana od środka punktów obciążenia zarówno dla pomiarów rozpiętości obciążenia, jak i podpory.
   9. Umieść kość z powrotem w soli fizjologicznej lub nawodnij za pomocą bolusa soli fizjologicznej.
      UWAGA: Przy wyborze punktów dla rozpiętości obciążenia zaleca się stosowanie punktów kołowych (promień 0,75 mm jest wystarczający, ponieważ rozkłada obciążenie, a jednocześnie styka się z kością na stycznej koła). Podczas gdy teoria zaleca, aby krawędź noża reprezentowała obciążenie punktowe, spowoduje to zmiażdżenie kości w miejscu przyłożenia obciążenia, co prowadzi do przeszacowania odkształcenia i niedoszacowania modułu.
   10. Upewnij się, że wszystkie części oprawy są szczelne i nie mają żadnych ruchów.
3. Konfiguracja oprogramowania
   1. Upewnij się, że tester jest prawidłowo podłączony do komputera za pośrednictwem skrzynki modułu, kanałów ogniw obciążnikowych i wszelkich innych wymagań zgodnie z instrukcją obsługi systemu.
   2. W oprogramowaniu powiązanym z testerem mechanicznym utwórz profil próby zginania z rampą, której szybkość przemieszczania jest wystarczająco niska, aby nie wywoływać efektów lepkosprężystych (często stosuje się 0,025 mm/s) w celu obciążenia kości do uszkodzenia.
   3. Minimalna częstotliwość próbkowania wynosząca 25 Hz jest również zalecana podczas tworzenia profilu testowego, chociaż preferowana jest wyższa częstotliwość próbkowania.
   4. Utwórz jeden folder na grupę badawczą i zapisz każdy test jako osobny plik w tym folderze.
4. Ładowanie i testowanie próbek
   1. Wybierz prawidłowo rozmrożoną kość (patrz krok 1.2). Zmierz i zapisz jego pełną długość za pomocą suwmiarki.
   2. Załaduj próbkę na osprzęt, jak pokazano na Rysunek 2A, jeśli testujesz kość udową w zginaniu trzypunktowym i Rysunek 2B, jeśli testujesz piszczel w czteropunktowym zginaniu.
   3. Zmień nazwę pliku, aby odzwierciedlić testowaną próbkę.
   4. Wyzeruj obciążenie (nie przemieszczenie). Włącz napęd systemu; Upewnij się, że nie jest w sterowaniu obciążeniem lub przemieszczeniem.
   5. Zachowując ostrożność, należy zastosować minimalne napięcie wstępne do kości, aby zabezpieczyć jej pozycję i zapobiec toczeniu się kości, ale upewnić się, że nie zagraża to próbce. Dążyć do napięcia wstępnego około 0,25 N. Przed kontynuowaniem upewnij się, że pożądana orientacja kości jest zachowana.
   6. Uwodnić próbkę, obficie oblewając ją solą fizjologiczną.
   7. Rozpocznij próbę zginania, wybierając Start lub Uruchom w oprogramowaniu. KRYTYCZNE: Uważnie obserwuj próbkę przez cały test i zanotuj testy, w których wystąpiły jakiekolwiek problemy (np. toczenie, ślizganie się).
      UWAGA: Te problemy mogą zagrozić danym, a notatki dotyczące tych testów będą pomocne podczas analizy.
   8. Obserwuj, czy kość zaczyna się łamać (po stronie rozciągania). Większość testów będzie kontynuowana, dopóki nie wystąpi awaria. W tym momencie test zakończy się z powodu zaprogramowanych limitów. Jeśli wystąpi awaria, ale tester nadal się przemieszcza, ręcznie przerwij test, aby zapobiec uszkodzeniu czujnika wagowego.
   9. Po zakończeniu badania zmierz długość od dystalnego końca do punktu przerwania za pomocą suwmiarki i zapisz ją.
   10. Powtórzyć kroki 5.4.1 – 5.4.9 dla każdej próbki.

Rysunek 1: Konfiguracja testera mechanicznego. (A) Trzypunktowe i (B) czteropunktowe próby zginania. Ogniwo obciążnikowe jest pokazane na żółto, osprzęt załadowczy jest pokazany na niebiesko, a osprzęt wsporczy jest pokazany na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Orientacja kości między elementami. (A) Właściwa orientacja kości udowej w trzypunktowym zginaniu urządzeń obciążających, pokazujących (od góry do dołu) widoki od środkowej, przedniej i tylnej strony kości udowej przy prawidłowym ustawieniu. Osprzęt załadowczy jest pokazany na pomarańczowo, a osprzęt podporowy jest pokazany na niebiesko. Dolne przęsła powinny być wyregulowane tak, aby obejmowały jak najwięcej najprostszej części trzonu, a górne mocowanie powinno być wyśrodkowane między tymi przęsłami. (B) Właściwa orientacja kości piszczelowej do czteropunktowego zgięcia pokazująca (od góry do dołu) widoki z przedniej, bocznej i przyśrodkowej strony kości piszczelowej. Kość powinna być obciążona tak, aby powierzchnia przyśrodkowa stykała się z dolnym uchwytem, a powierzchnia boczna stykała się z górnym mocowaniem. Połączenie piszczelowo-strzałkowe powinno być umieszczone tuż poza rozpiętością obciążenia. Przęsła powinny być dostosowane tak, aby jak najlepiej spełniały stosunek rozpiętości obciążenia do podpory wynoszący 1:3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Wybór ROI

1. Po zarejestrowaniu długości przerw załaduj obrócone obrazy do wybranego przez użytkownika oprogramowania. Po załadowaniu obróconych obrazów zlokalizuj i zapisz górne i dolne plasterki kości.
2. Oblicz różnicę między górnymi i dolnymi plasterkami. Pomnóż tę wartość przez rozmiar woksela skanującego, aby określić całkowitą długość kości w mikrometrach.
3. Aby zlokalizować miejsce złamania w tomografii komputerowej, podziel zarejestrowaną długość złamania (w mikrometrach) przez rozmiar woksela, aby uzyskać liczbę wycinków μCT od dystalnego końca skanu do punktu złamania.
4. Wybierz ROI, wyśrodkowany w tej lokalizacji. Najpierw ustaw całkowitą żądaną długość ROI (co najmniej 100 μm). Znajdź liczbę wycinków reprezentowanych przez tę długość, dzieląc długość w mikrometrach przez rozmiar woksela, aby określić całkowitą liczbę wycinków w ROI.
5. Aby uzyskać dolną granicę ROI, podziel całkowitą liczbę wycinków ROI przez 2 i odejmij tę wartość od wcześniej obliczonej lokalizacji przerwy znalezionej w kroku 6.4.
6. Dodaj całkowitą długość ROI w wycinkach do wcześniej obliczonej wartości, aby uzyskać górną granicę ROI.
7. Wybierz odpowiedni zwrot z inwestycji na podstawie obliczonych granic i zapisz go.

7. Normalizacja danych o sile i przemieszczeniu

UWAGA: Tester mechaniczny wygeneruje tylko punkty o współrzędnych x i y (przemieszczenie, siła). Punkty te można przekształcić w naprężenie i odkształcenie za pomocą równań naprężenia zginającego i odkształcenia Eulera-Bernoulliego, ale wymagają one właściwości geometrycznych uzyskanych ze skanów μCT. Kwantyfikacja tych właściwości może być przeprowadzona za pomocą preferowanego przez użytkownika oprogramowania. Preferujemy niestandardowy kod, który daje pełną kontrolę nad wszystkimi danymi wejściowymi, obliczeniami i wyjściami. Jak wspomniano wcześniej, aby uzyskać dostęp do kodu, skontaktuj się bezpośrednio z autorem korespondencyjnym lub odwiedź stronę internetową laboratorium pod adresem https://bbml.et.iupui.edu/, aby uzyskać więcej informacji. Równania naprężeń i odkształceń, a także niezbędne właściwości geometryczne, które należy uzyskać ze skanów μCT, aby je obliczyć, omówiono poniżej.

1. Równania normalizacji zginania trzypunktowego
   1. Równanie używane do obliczania naprężenia przy zginaniu trzypunktowym pokazano poniżej w równaniu 1. W tym równaniu "F" oznacza siłę, a "L" oznacza długość rozpiętości podpory. Wartości siły są rejestrowane przez tester mechaniczny podczas badania. Upewnij się, że długość rozpiętości podpory została zarejestrowana przed testowaniem. "c" i "I" to właściwości geometryczne, które zostaną obliczone za pomocą skanów μCT (sekcja 7.3).
      (1)
   2. Równanie do obliczania odkształcenia pokazano poniżej w równaniu 2; "c" i "L" reprezentują te same właściwości zarówno dla obliczeń naprężeń, jak i odkształceń. "d" oznacza wartości przemieszczenia zarejestrowane przez tester mechaniczny podczas testów.
      (2)
2. Równania normalizacji zginania czteropunktowego
   1. Równanie naprężenia przy zginaniu czteropunktowym pokazano poniżej w równaniu 3. "F" i "I" pozostają tymi samymi zmiennymi omówionymi w kroku 7.1.1. Obliczyć "a" na podstawie pomiarów rozpiętości podpory i obciążenia przed badaniem. Jeśli zastosujesz się do zalecanego stosunku 3:1 dla rozpiętości podpory do obciążenia dla gięcia czteropunktowego, "a" będzie równa jednej trzeciej długości rozpiętości podpory.
      (3)
   2. Równanie odkształcenia przy zginaniu czteropunktowym pokazano poniżej w równaniu 4. "c" i "a" oznaczają te same właściwości zarówno dla obliczeń naprężeń, jak i odkształceń. "d" oznacza wartości przemieszczenia zarejestrowane przez tester mechaniczny podczas testów.
      (4)
3. Obliczanie właściwości geometrycznych na podstawie skanów μCT
   1. Zmienna "c" reprezentuje odległość od osi neutralnej do powierzchni kości, która została obciążona napięciem. W związku z tym określ środek ciężkości każdego przekroju poprzecznego w skanach μCT, ponieważ oś neutralna przechodzi przez środek ciężkości.
      1. W przypadku podążania za orientacją badawczą kości udowej w zgięciu trzypunktowym opisanym w kroku 5.2.6, zmierzyć "c" w odniesieniu do powierzchni przedniej.
      2. Jeśli postępujesz zgodnie z orientacją testową kości piszczelowej opisaną w kroku 5.2.7, zmierz "c" w odniesieniu do przyśrodkowej powierzchni kości.
   2. Zmienna "I" reprezentuje obszar momentu bezwładności wokół osi zgięcia (oś przyśrodkowo-boczna dla kości udowej; oś przednio-tylna dla kości piszczelowej). Oblicz tę wartość, korzystając z równania 5. W tym równaniu "dA" to obszar każdego piksela uchwycony w skanowaniu μCT, podczas gdy y to obliczona odległość każdego piksela od osi neutralnej.
      (5)

8. Interesujące właściwości testów mechanicznych

1. Przed obliczeniem jakichkolwiek właściwości mechanicznych wygeneruj krzywą siła-przemieszczenie i krzywą naprężenie-odkształcenie (idealne krzywe pokazane poniżej w Rysunek 3, wraz ze znaczącymi właściwościami).
   UWAGA: Testowanie próbek biologicznych nie zawsze generuje krzywe, które wyglądają jak te wyidealizowane przykłady, ale pozostają one użytecznym przewodnikiem.
2. Zbadaj te krzywe przed analizą, aby wykryć błędy w testowaniu, takie jak toczenie się lub ślizganie się kości. Błędy te zazwyczaj powodują wypukłości lub płaskie obszary w początkowej liniowej części krzywej. W tym momencie usuń nadmiarowe dane, w tym wszelkie dane, które mogły zostać zebrane przed skontaktowaniem się testera z kością lub dane po awarii.
3. Po upewnieniu się, że test jakości został przeprowadzony na podstawie wykreślonych krzywych, rozpocznij analizę istotnych właściwości.
   1. Sztywność i moduł sprężystości
      1. Oblicz sztywność, używając tylko obszaru sprężystego krzywej siła-przemieszczenie. Nachylenie krzywej w tym obszarze to sztywność.
      2. Obliczyć moduł sprężystości, używając nachylenia tylko części sprężystej krzywej naprężenie-odkształcenie.
   2. Granica plastyczności
      UWAGA: Istnieją dwie granice plastyczności, jedna na krzywej siła-przemieszczenie, a druga na krzywej naprężenie-odkształcenie. Wartości (x,y) dla tego punktu z krzywej siła-przemieszczenie są znane jako przemieszczenie do plastyczności i siły plastyczności, podczas gdy te z krzywej naprężenie-odkształcenie są znane jako odkształcenie do plastyczności i granica plastyczności. Punkty te reprezentują koniec sprężystego obszaru krzywej i można je znaleźć w sposób opisany poniżej.
      1. Metoda krzywej naprężenie-odkształcenie: Oblicz przesunięcie linii od (0,0) o 0,2% odkształcenia (2 000 mikroodkształceń), ale o takim samym nachyleniu jak moduł sprężystości. Narysuj tę linię na wykresie naprężenie-odkształcenie; Pozycja, w której linia ta przecina krzywą naprężenie-odkształcenie, jest zdefiniowana jako granica plastyczności. Użyj tej współrzędnej granicy plastyczności i odkształcenia, aby znaleźć analogiczne wartości siły i przemieszczenia; Wartości te będą reprezentować siłę plastyczności i przemieszczenie do wartości plastyczności.
      2. Metoda sieczna: Oblicz sztywność na podstawie krzywej siła-przemieszczenie i zmniejsz sztywność o wybrany procent (5-10%). Wykreślić linię rozpoczynającą się od (0,0) o nachyleniu tej zmniejszonej sztywności i pozwolić jej przeciąć się z krzywą siła-przemieszczenie. Punkt przecięcia będzie miał współrzędne (przemieszczenie do ustąpienia, siła plastyczności).
         UWAGA: Metoda siecznej może być użyta do znalezienia granicy plastyczności bez danych naprężenie-odkształcenie.
   3. Najwyższa siła i najwyższy stres
      1. Oblicz siłę maksymalną i naprężenie graniczne, znajdując maksymalną wartość w odpowiednich zestawach danych.
   4. Właściwości przemieszczenia i odkształcenia
      1. Przemieszczenie do granicy plastyczności i odkształcenia do granicy plastyczności reprezentujące przemieszczenie lub odkształcenie do granicy plastyczności. Aby je znaleźć, zlokalizuj plon zgodnie z opisem w kroku 8.3.2.
      2. Wartości całkowitego przemieszczenia i całkowitego odkształcenia reprezentują całkowite przemieszczenie lub całkowite odkształcenie, jakie próbka doświadczyła podczas badania i odpowiadają punktowi uszkodzenia.
      3. Przemieszczenie po plonowaniu i odkształcenie po plonowaniu: Przemieszczenie po plonowaniu jest powszechnie zgłaszane i można je obliczyć, odejmując przemieszczenie do plonu od całkowitego przemieszczenia. Oblicz szczep po plonowaniu, odejmując szczep do plonu od całkowitego szczepu, ale zgłaszaj to z ostrożnością, ponieważ szczep jest najpierw wyprowadzany przy założeniu, że materiał jest liniowo elastyczny (przed plonem). Sprawia to, że środek po udzieleniu plonu jest podatny na nieważność.
   5. Właściwości energetyczne
      1. Oblicz energię jako obszar pod krzywą siła-przemieszczenie lub krzywa naprężenie-odkształcenie.
      2. Obszar pod krzywą siła-przemieszczenie jest znany jako praca. Obszar obliczony w części krzywej przed uzyskaniem plonu, czyli w obszarze sprężystym, jest znany jako praca sprężysta lub energia. Obszar obliczony pod krzywą poza granicą plastyczności lub obszar plastyczności jest znany jako praca po uplastycznieniu lub plastyczność lub utracona energia.
      3. Obliczona całkowita powierzchnia pod krzywą naprężenie-odkształcenie jest znana jako udarność lub moduł udarności, podczas gdy powierzchnia obliczona pod krzywą naprężenie-odkształcenie do granicy plastyczności jest znana jako sprężystość. Wytrzymałość po plonowaniu, podobnie jak szczep po plonowaniu, często nie jest zgłaszana ze względu na założenia równań odkształcenia, że ta właściwość nie podlega.

Rysunek 3: Krzywe siła-przemieszczenie i naprężenie-odkształcenie. (A) Idealna krzywa siła-przemieszczenie; (B) idealna krzywa naprężenie-odkształcenie z linią wyprowadzoną z metody przesunięcia 0,2% użytej do obliczenia granicy plastyczności pokazanej na czerwono (należy zauważyć, że ta linia ma takie samo nachylenie jak obszar sprężysty krzywej). Kluczowe właściwości, które można uzyskać na podstawie krzywej siła-przemieszczenie, obejmują siłę plastyczności, siłę graniczną, przemieszczenie do ustąpienia, przemieszczenie całkowite i pracę. Właściwości na poziomie tkanki, które można uzyskać z krzywej naprężenie-odkształcenie, obejmują granicę plastyczności, naprężenie końcowe, odkształcenie do plonu, odkształcenie całkowite, sprężystość i wytrzymałość. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Po zakończeniu tomografii komputerowej, większość nieodpowiednich skanów może zostać wychwycona podczas rekonstrukcji. Często słabe skany będą miały wysoką kompensację niewspółosiowości, która jest wyraźnym wskaźnikiem błędu podczas skanowania. Jednak w innych krokach mogą wystąpić błędy i mogą również prowadzić do niedokładnych danych. Błędy te można często zauważyć podczas badania poszczególnych obliczonych właściwości architektonicznych. Jeśli wartości znacznie wykraczają poza zakres innych w grupie, skanowanie, zwrot...

Dyskusja

W całym procesie skanowania i testowania zdarzają się momenty, w których rozwiązywanie problemów i optymalizacja są odpowiednie. Pierwszy z nich występuje podczas skanowania kości za pomocą μCT. Podczas gdy wiele systemów jest dostarczanych z uchwytem, w którym można trzymać i skanować jeden obiekt, niestandardowe uchwyty mogą być produkowane w celu skanowania wielu kości w tym samym czasie. Skanowanie wielu kości może być doskonałym punktem do optymalizacji, ale należy zachować ostrożność podczas całego procesu skanowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CTAn	Bruker	NA	Oprogramowanie do analizy skanów CT DataViewer
	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Platforma kodowania używana do analizy danych
Oprogramowanie do rekonstrukcji skanów CT	NRecon	Bruker
NA SKYSCAN 1272-100 kV z detektorem CCD 16 MP, w tym oprogramowanie 3D Suite i nbsp;	Micro Photonics Inc	SKY-016814	System Micro-CT, który może nieniszcząco wizualizować do 209 mPs w każdym wirtualnym przekroju obiektu