Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody oparte na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS) okazały się skuteczne w wyjaśnianiu metabolicznych podstaw symbiozy parzydełkowców i bruzdnic oraz tego, jak koralowce reagują na stres (np. podczas bielenia wywołanego temperaturą). Profilowanie metabolitów w stanie stacjonarnym holobiontu koralowca, który składa się z parzydełkowca i związanych z nim mikroorganizmów (Symbiodiniaceae i innych protistów, bakterii, archeonów, grzybów i wirusów), zostało z powodzeniem zastosowane w warunkach otoczenia i stresu w celu scharakteryzowania holistycznego stanu metabolicznego koralowca.
Jednakże, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji symbiotycznych, konieczne jest niezależne przeanalizowanie profili metabolitów gospodarza koralowca i jego symbiontów glonów, co można osiągnąć tylko poprzez fizyczną separację i izolację tkanek, a następnie niezależną ekstrakcję i analizę. Chociaż zastosowanie metabolomiki jest stosunkowo nowe w dziedzinie koralowców, nieustanne wysiłki grup badawczych zaowocowały opracowaniem solidnych metod analizy metabolitów w koralowcach, w tym oddzielenia tkanki gospodarza koralowca i symbiontów glonów.
Ten artykuł przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący separacji holobiontów i ekstrakcji metabolitów do analizy GC-MS, w tym kluczowe kroki optymalizacyjne do rozważenia. Pokazujemy, w jaki sposób, po niezależnej analizie, połączony profil metabolitów dwóch frakcji (koralowca i Symbiodiniaceae) jest podobny do profilu całości (holobiontu), ale oddzielając tkanki, możemy również uzyskać kluczowe informacje o metabolizmie i interakcjach między dwoma partnerami, których nie można uzyskać z samej całości.
Wprowadzenie
Metabolity reprezentują końcowe produkty procesów komórkowych, a metabolomika - badanie zestawu metabolitów wytwarzanych przez dany organizm lub ekosystem - może dostarczyć bezpośredniego miernika funkcjonowania organizmu1. Jest to szczególnie ważne dla badania ekosystemów, interakcji symbiotycznych i narzędzi do odbudowy, ponieważ celem większości strategii zarządzania jest zachowanie (lub przywrócenie) określonych funkcji usług ekosystemowych2. Rafy koralowe są jednym z ekosystemów wodnych, który demonstruje potencjalną wartość metabolomiki dla wyjaśnienia interakcji symbiotycznych i powiązania fizjologicznych reakcji ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Projekt eksperymentalny, pobieranie i przechowywanie próbek zostały szczegółowo opisane gdzie indziej2,30,31. Zezwolenie na zbieranie dzikich koralowców musi być uzyskane przed zebraniem i eksperymentami. Próbki zostały pobrane z kolonii Montipora mollis (kolor zielony) importowanych z Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), pierwotnie zebranych z rafy u wybrzeży Wysp Abrohlos (Australia Zachodnia; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) na głębokości 1 m na podstawie licencji akwakultury AQ1643. Przed pobraniem próbek kolonie przetrzymywano w akwarium o pojemności 800 litró....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wszystkie dane uzyskane w ramach niniejszej pracy są dostępne w informacjach uzupełniających.
Oddzielenie symbionta od gospodarza
Rysunek 1<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Oddzielenie gospodarza i symbionta jest łatwe i szybkie do osiągnięcia poprzez proste wirowanie, a wyniki pokazują, że oddzielenie frakcji może dostarczyć cennych informacji wskazujących na specyficzny wkład członków holobiontu, co może przyczynić się do funkcjonalnej analizy zdrowia koralowców. U dorosłych koralowców synteza lipidów jest przeprowadzana głównie przez rezydentny symbiontglonów 40, który dostarcza lipidy (np. triacyloglicerol i fosfolipidy)41 oraz kw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
J.L.M. był wspierany przez stypendium badawcze Kanclerza UTS.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100% metanol klasy LC | Niezbędne | 439193 | klasy LC |
| 2 ml, polipropylen PP | Eppendorf | 30121880 | zapewnia wysoką odporność na chemikalia, naprężenia mechaniczne i ekstremalne temperatury |
| 2030 Chromatograf gazowy Shimadzu Shimadzu | GC-2030 | ||
| 710-1180 µ m Koraliki szklane płukane kwasem | Merck | G1152 | Ten rozmiar jest optymalny do rozbijania komórek Symbiodiniaceae |
| AOC-6000 Plus Wielofunkcyjny automatyczny podajnik | Shimadzu | AOC6000 | |
| odczynnik Bradford | Merck | B6916 | Dopuszczalny jest dowolny odczynnik kolorymetryczny do białek |
| Pistolet na sprężone powietrze | Ozito | 6270636 | Podobny projekt do przyjęcia. Posiadanie złączki pasującej do końcówki o pojemności 1 ml ma kluczowe znaczenie. |
| Kolumna DB-5 z kolumną o średnicy wewnętrznej 0,25 mm i 1 &mikro; m grubość powłoki | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C i/lub 13C5– 15N Walina | Merck | 605514/ 600148 | Do metanolu można dodać jeden lub oba wzorce wewnętrzne. |
| 96-dołkowa płytka z płaskim dnem | Merck | CLS3614 | |
| Szklane fiolki scyntylacyjne | Merck | V7130 | 20 ml, z nieplastikową uszczelką |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | jeśli nie jest dostępna, albumina surowicy bydlęcej jest dopuszczalna |
| Podkład | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Oprogramowanie | Shimadzu LabSolutions Insight | v3.6 | |
| Wodorotlenek sodu | Merck | S5881 | Granulki do przygotowania 1 M roztworu |
| tidyverse | v1.3.1 | Pakiet R | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Lub podobny |
| TQ8050NX potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 płytka dołkowa | Greiner | M3812 | |
| Worek na próbki Whirl-Pak | Merck | WPB01018WA | Worek do pobierania próbek; Rozmiar: wystarczająco duży, aby pomieścić ~5 cm fragment koralowca, ale nie za duży, aby woda była zbyt rozlana |
Bibliografia
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Bea....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
