Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65628

⸱

13 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Streszczenie

Metody oparte na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS) okazały się skuteczne w wyjaśnianiu metabolicznych podstaw symbiozy parzydełkowców i bruzdnic oraz tego, jak koralowce reagują na stres (np. podczas bielenia wywołanego temperaturą). Profilowanie metabolitów w stanie stacjonarnym holobiontu koralowca, który składa się z parzydełkowca i związanych z nim mikroorganizmów (Symbiodiniaceae i innych protistów, bakterii, archeonów, grzybów i wirusów), zostało z powodzeniem zastosowane w warunkach otoczenia i stresu w celu scharakteryzowania holistycznego stanu metabolicznego koralowca.

Jednakże, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji symbiotycznych, konieczne jest niezależne przeanalizowanie profili metabolitów gospodarza koralowca i jego symbiontów glonów, co można osiągnąć tylko poprzez fizyczną separację i izolację tkanek, a następnie niezależną ekstrakcję i analizę. Chociaż zastosowanie metabolomiki jest stosunkowo nowe w dziedzinie koralowców, nieustanne wysiłki grup badawczych zaowocowały opracowaniem solidnych metod analizy metabolitów w koralowcach, w tym oddzielenia tkanki gospodarza koralowca i symbiontów glonów.

Ten artykuł przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący separacji holobiontów i ekstrakcji metabolitów do analizy GC-MS, w tym kluczowe kroki optymalizacyjne do rozważenia. Pokazujemy, w jaki sposób, po niezależnej analizie, połączony profil metabolitów dwóch frakcji (koralowca i Symbiodiniaceae) jest podobny do profilu całości (holobiontu), ale oddzielając tkanki, możemy również uzyskać kluczowe informacje o metabolizmie i interakcjach między dwoma partnerami, których nie można uzyskać z samej całości.

Wprowadzenie

Metabolity reprezentują końcowe produkty procesów komórkowych, a metabolomika - badanie zestawu metabolitów wytwarzanych przez dany organizm lub ekosystem - może dostarczyć bezpośredniego miernika funkcjonowania organizmu1. Jest to szczególnie ważne dla badania ekosystemów, interakcji symbiotycznych i narzędzi do odbudowy, ponieważ celem większości strategii zarządzania jest zachowanie (lub przywrócenie) określonych funkcji usług ekosystemowych2. Rafy koralowe są jednym z ekosystemów wodnych, który demonstruje potencjalną wartość metabolomiki dla wyjaśnienia interakcji symbiotycznych i powiązania fizjologicznych reakcji koralowców z wpływami na poziomie społeczności i ekosystemu3. Zastosowanie wysokoprzepustowej chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) jest szczególnie cenione ze względu na jej zdolność do szybkiej analizy szerokiego zakresu klas metabolitów jednocześnie z wysoką selektywnością i czułością, zapewnia szybką identyfikację związku, gdy dostępne są biblioteki spektralne, oraz zapewnia wysoki poziom odtwarzalności i dokładności przy stosunkowo niskim koszcie na próbkę.

Koralowce to holobionty składające się ze zwierzęcia koralowego, fotosyntetycznych endosymbiontów bruzdnic (rodzina: Symbiodiniaceae4) oraz złożonego mikrobiomu5,6. Ogólnie rzecz biorąc, sprawność holobiontu jest utrzymywana głównie poprzez wymianę małych cząsteczek i pierwiastków, które wspierają funkcjonowanie metaboliczne każdego członka7,8,9,10. Podejścia metabolomiczne okazały się szczególnie skuteczne w wyjaśnianiu metabolicznych podstaw swoistości symbiozy9,11, reakcja bielenia na stres termiczny7,8,12,13, odpowiedzi na choroby14, reakcje na narażenie na zanieczyszczenie15, Fotoaklimatyzacja16 i sygnalizacja chemiczna17 w koralowcach, a także pomoc w odkrywaniu biomarkerów18,19. Ponadto metabolomika może dostarczyć cennego potwierdzenia wniosków wywnioskowanych z technik opartych na DNA i RNA9,20. Istnieje zatem znaczny potencjał wykorzystania metabolomiki do oceny stanu zdrowia raf koralowych i opracowania narzędzi do ochrony raf3, na przykład poprzez wykrywanie metabolicznych biomarkerów stresu18,19 oraz do badania potencjału strategii aktywnego zarządzania, takich jak subsydia żywieniowe21.

Oddzielenie komórek gospodarza i komórek symbiontycznych oraz analiza ich profili metabolitów niezależnie, a nie razem jako holobiont, może dostarczyć więcej informacji o interakcjach partnerskich, niezależnych stanach fizjologicznych i metabolicznych oraz potencjalnych mechanizmach molekularnych adaptacji11,12,22,23,24. Bez oddzielenia koralowców i Symbiodiniaceae, prawie niemożliwe jest niezależne wyjaśnienie udziału i metabolizmu koralowców i/lub Symbiodiniaceae, z wyjątkiem złożonej rekonstrukcji genomu i modelowania metabolicznego25, ale nie zostało to jeszcze zastosowane do symbiozy koralowców i bruzdnic. Co więcej, próba wydobycia informacji o indywidualnym metabolizmie gospodarza lub symbionta glonów z profilu metabolitów holobiontu może prowadzić do błędnej interpretacji.

Na przykład, do niedawna, obecność wielonienasyconych kwasów tłuszczowych C18:3n-6, C18:4n-3 i C16 w ekstraktach z tkanek koralowców i holobiontów była uważana za pochodzącą od symbionta glonów, ponieważ zakładano, że koralowce nie posiadają desaturazy ωx niezbędne do produkcji kwasów tłuszczowych omega-3 (ω3); jednak ostatnie dowody genomiczne sugerują, że wiele parzydełkowców ma zdolność do wytwarzania ω3 PUFA de novo i dalej biosyntetyzować ω3 długołańcuchowe PUFA26. Połączenie GC-MS ze stabilnym znakowaniem izotopowym (np. 13C-wodorowęglan, NaH13CO3) może być wykorzystane do śledzenia losów fotosyntetycznie związanego węgla przez sieci metaboliczne holobiontów koralowców zarówno w warunkach kontrolnych, jak i w odpowiedzi na zewnętrzne czynniki stresogenne27,28. Jednak krytycznym krokiem w śledzeniu losu 13C jest oddzielenie tkanki koralowca od komórek glonów - tylko wtedy obecność związku znakowanego 13C we frakcji gospodarza koralowca może być jednoznacznie przypisana jako metabolit pochodzący z Symbiodiniaceae translokowany do koralowca lub dalszy produkt translokowanego znakowanego związku. Technika ta zademonstrowała swoją moc, kwestionując długo utrzymywane założenie, że glicerol jest podstawową formą, w której fotosynteza jest translokowana z symbiontu do hosta29, a także wyjaśniając, jak zmienia się przepływ składników odżywczych między partnerami podczas bielenia27,28 oraz w odpowiedzi na niekompatybilne gatunki Symbiodiniaceae11.

Chociaż decyzja o rozdzieleniu tkanek jest przede wszystkim podyktowana pytaniem badawczym, praktyczność, niezawodność i potencjalne skutki metaboliczne tego podejścia są ważne do rozważenia. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe, zademonstrowane metody ekstrakcji metabolitów z holobiontu, a także oddzielnych frakcji gospodarza i symbiontów. Porównujemy profile metabolitów gospodarza i symbionta niezależnie oraz porównujemy te profile z profilem metabolitów holobiontów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Projekt eksperymentalny, pobieranie i przechowywanie próbek zostały szczegółowo opisane gdzie indziej2,30,31. Zezwolenie na zbieranie dzikich koralowców musi być uzyskane przed zebraniem i eksperymentami. Próbki zostały pobrane z kolonii Montipora mollis (kolor zielony) importowanych z Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), pierwotnie zebranych z rafy u wybrzeży Wysp Abrohlos (Australia Zachodnia; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) na głębokości 1 m na podstawie licencji akwakultury AQ1643. Przed pobraniem próbek kolonie przetrzymywano w akwarium o pojemności 800 litrów przy 35 PSU, w niebieskim i białym świetle o temperaturze 150 μmol fotonów·m−2·s−1 i w temperaturze 25 °C ± 0,5 °C przez 3 miesiące. Fragmenty koralowców (~5 cm2, N = 6) zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.

1. Przygotowanie roztworów i sprzętu do ekstrakcji

  1. Co najmniej 1 dzień przed usunięciem tkanki koralowca przygotuj roztwory ekstrakcyjne i sprzęt.
  2. Ultraczystą wodę schłodzić w czystym, niezawierającym detergentów szkle w temperaturze 4 °C.
  3. Zmieszać 100% metanol klasy LC z końcowym stężeniem 10 μg·mL−1 odpowiedniego wzorca (wzorców) wewnętrznego (np. 13C6 sorbitolu).
  4. Stwórz 50% roztwór do ekstrakcji metanolu, używając połowy 100% metanolu klasy LC i połowy ultraczystej wody. Przechowywać oba roztwory metanolu w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Aby zapobiec degradacji metabolitów, zaleca się przeprowadzanie etapów przetwarzania próbki w partiach po pięć fragmentów koralowców na raz, z jedną dodatkową biologiczną (tylko woda) ślepą próbą (całkowita liczba próbek N = 6). Po rozdzieleniu każdej próbki koralowca na dwie frakcje (tkankę gospodarza koralowca, zwaną dalej "gospodarzem" i komórki mikroglonów, zwane dalej "Symbiontem"), całkowita liczba próbek w jednej partii przetwarzania wyniesie 12.

2. Wygaszanie metabolizmu koralowców

UWAGA: Projekt eksperymentalny, pobieranie i przechowywanie próbek zostały szczegółowo opisane gdzie indziej2,30,31. Należy jednak zauważyć, że czas potrzebny do wygaszenia metabolizmu (tj. czas między pobraniem próbki koralowca a jej zachowaniem) ma kluczowe znaczenie dla uchwycenia oryginalnej odpowiedzi30. Próbkę należy zachować tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, aby zapobiec zmianom w składzie metabolitu spowodowanym degradacją próbki lub reakcjami fizjologicznymi niebędącymi celem sup32.

  1. Umieść fragment koralowca w sterylnej torbie do pobierania próbek i spuść nadmiar wody morskiej tak bardzo, jak to możliwe. Zanurz próbkę w ciekłym azocie na co najmniej 30 s. Próbki należy jak najszybciej przenieść do zamrażarki w temperaturze −80 °C w celu przechowywania.
    UWAGA: Próbki można zamrażać w temperaturze -80°C w pojemnikach z blokadą światła do czasu przetworzenia, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Usuwanie tkanki koralowej ze szkieletu

UWAGA: Próbki powinny być przechowywane na lodzie (4 °C) przez cały czas, aby upewnić się, że są jednocześnie w postaci płynnej, zapobiegając jednocześnie trwającemu metabolizmowi.

  1. Umieść czystą, sterylną torbę do pobierania próbek na lodzie, tak aby torba była stabilna i otwarta na wierzchu lodu w płytkiej studni, ale nie była zanurzona w lodzie. Dodaj 10 ml zimnej (4 °C) ultraczystej wody do torebki.
    UWAGA: Pomoże to uniknąć powtarzającego się zamrażania i rozmrażania fragmentu koralowca z powodu zimnego sprężonego powietrza i otaczającego lodu.
  2. Wybierz fragment koralowca za pomocą wysterylizowanej pęsety i spłucz zimną (4 °C) ultraczystą wodą za pomocą sterylnej pipety Pasteura, aż nie pozostaną resztki wody morskiej. Zanurz opłukany fragment koralowca w torbie zawierającej 10 ml ultraczystej wody.
    UWAGA: To płukanie ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wszelkich pozostałości soli, które mogłyby zakłócać dalszą analizę. Unikać kontaktu dłoni z wodą lub fragmentem koralowca przez worek w celu utrzymania próbki w temperaturze 4 °C.
  3. Przyklej sterylną końcówkę pipety o pojemności 1 ml do końca pistoletu pneumatycznego taśmą izolacyjną, odcinając koniec końcówki o grubości ~5 mm (Rysunek 1A).
  4. Skieruj pistolet pneumatyczny na fragment koralowca z workiem do połowy zamkniętym i przepływem powietrza na niskim podłożu, aby delikatnie usunąć tkankę, zachęcając do okrężnego ruchu wody nad fragmentem koralowca.
  5. Po ~3 minutach lub gdy wydaje się, że cała tkanka została usunięta ze szkieletu, wyłącz powietrze i wyjmij aerograf. Całkowicie zamknij torbę.
  6. Ściśnij całą usuniętą tkankę koralową do dolnego rogu torby. Odetnij przeciwległy róg i delikatnie wlej zawartość torebki do 15 ml probówki na lodzie.

4. Opcjonalna homogenizacja

UWAGA: Niektóre gatunki koralowców są bardziej lepkie niż inne, co oznacza, że malowanie powietrzem usunie tkankę w kępkach zamiast w postaci zawiesiny. Jeżeli w homogenacie wymazanym aerografem widoczne są grudki tkanki, można dodać etap homogenizacji w temperaturze 4 °C dla wszystkich próbek.

  1. Mechaniczny homogenizator piłokształtny należy oczyścić dwukrotnie 70% metanolem o temperaturze 4 °C, a na koniec wodą ultraczystą o temperaturze 4 °C.
  2. Homogenizować próbkę koralowca w probówce o pojemności 15 ml przez ~ 1 minutę, aż próbka zostanie w pełni zhomogenizowana i nie będą widoczne żadne grudki.
  3. Czyścić homogenizator jak w kroku 4.1 pomiędzy każdą próbką. Utrzymuj stały czas homogenizacji we wszystkich próbkach.

5. Pobieranie próbek do normalizacji

  1. Zbierz 1,000 μl podwielokrotności z homogenizowanej tkanki do liczby komórek Symbiodiniaceae, analizy zawartości białka w tkance gospodarza koralowca i oszacowania chlorofilu. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do analizy (punkt 10).

6. Opcjonalna separacja tkanek gospodarza koralowców od komórek Symbiodiniaceae

  1. Odwirować homogenat koralowy w temperaturze 2 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z chłodzeniem.
    UWAGA: Ta prędkość jest optymalna do oddzielenia cięższych komórek Symbiodiniaceae, przy jednoczesnym zachowaniu ich ścian komórkowych, od tkanki gospodarza, która jest zawieszona w supernatancie.
  2. Usunąć supernatant zawierający materiał główny i umieścić w nowej probówce o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Lipidy z tkanki gospodarza zazwyczaj tworzą wąską różowo-białą warstwę na wierzchu komórek symbiontowych. Warstwę tę można zebrać wraz z rozpuszczalnym supernatantem gospodarza za pomocą pipetowania (Rysunek 1B).
  3. Energicznie wirować gospodarza dokładnie przez 1 minutę. Próbkę osadu z glonów i próbkę supernatantu gospodarza należy przechowywać na lodzie.
  4. Do granulki glonów dodać 2 ml ultraczystej wody o temperaturze 4 °C. Energicznie wirować dokładnie przez 2 minuty, aby ponownie zawiesić granulkę.
    UWAGA: Jeśli pojedyncze fragmenty o wielkości 1 cm nie zostały pobrane z kolonii koralowców do genotypowania Symbiodiniaceae, można tutaj zebrać 200 μl podwielokrotności zawiesiny komórek Symbiodiniaceae, zachować ją w preferowanym roztworze buforowym DNA i przechowywać zgodnie z opisem w Thurber et al.30 dla genotypowania Symbiodiniaceae (np. zgodnie z González-Pech i wsp.12).
  5. Powtórz kroki 6.1-6.4 jeszcze raz.
    UWAGA: Niezawodna separacja gospodarza i symbionta zależy od biomasy i gatunku koralowca, ponieważ niektóre gatunki mogą być bardziej lepkie niż inne. Zalecane są co najmniej trzy etapy mycia, ale można je zwiększyć w zależności od powodzenia separacji. Powtarzaj kroki płukania 4.7-4.9, aż na dnie frakcji gospodarza nie będzie widać komórek Symbiodiniaceae i do momentu, gdy frakcja Symbiodiniaceae będzie widocznie wolna od materiału gospodarza (np. brak białej warstwy na górze) (Rysunek 1).
  6. Usunąć sklarowany osad zawierający materiał główny i umieścić w nowej probówce o pojemności 15 ml.
  7. Zachowaj osad symbiontu w probówce o pojemności 15 ml.

7. Suszenie próbki

  1. Zamrozić homogenat holobiontu lub zarówno oddzielonego gospodarza, jak i frakcję Symbiodiniaceae, w temperaturze -80 °C przez ~120 min. Liofilizować próbki przez noc za pomocą próżni 0,01 mbar w temperaturze -85 °C.
    UWAGA: Aby uniknąć utraty próbki podczas liofilizacji, zaleca się użycie wieczka wyciętego z innej sterylnej probówki lub sterylnego parafilmu z otworem ~2 mm starannie przedziurawionym za pomocą sterylnej igły 25 G.
  2. Po wyschnięciu przy użyciu wagi laboratoryjnej zważyć jedną z następujących substancji: 1) 25 mg holobiontu; 2) 15 mg frakcji symbiontowej; lub 3) 30 mg tkanki gospodarza z każdej próbki do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 2 ml bez plastyfikatorów.
    UWAGA: Krok krytyczny: Optymalizacja biomasy do ekstrakcji jest niezbędna, aby zapewnić, że GC-MS nie jest przeciążony przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającego sygnału. Wysuszony materiał koralowy jest bardzo statyczny. Aby uniknąć utraty próbki, należy użyć urządzeń antystatycznych w celu wyeliminowania ładunków elektrostatycznych z próbek i naczyń wagowych. Prostą i opłacalną alternatywą jest umieszczenie arkusza suszarki do prania pod rurką na próbkę. Wysuszony granulat symbiont można przyciąć do żądanej wagi za pomocą sterylnego ostrza.

8. Wewnątrzkomórkowe ekstrakcje metabolitów

  1. Wewnątrzkomórkowa ekstrakcja metabolitów z liofilizowanego holobiontu:
    1. Dodać 400 μl 100% zimnego (−20 °C) metanolu z wewnętrznym wzorcem/ami (IS; 13C6 sorbitol i/lub 13C 5-15N walina, przy 10 μM) do każdej probówki.
    2. Do każdej próbki dodać niewielką ilość szklanych kulek o wielkości 710-1 180 μm (~10 mg) przemytych kwasem. Umieścić w młynku perełkowym o częstotliwości 50 Hz na 3 minuty we wstępnie schłodzonej (−20 °C) wkładce młynka do perełek.
    3. Dodać dodatkowe 600 μl 100% zimnego (-20 °C) metanolu z ISs (13C6 sorbitol i/lub 13C 5-15N waliny, przy 10 μM) do każdej probówki.
    4. Mieszaj przez 1 minutę. Umieść na rożnie w temperaturze 4 °C na 30 minut.
  2. Wewnątrzkomórkowa ekstrakcja metabolitów z oddzielonych liofilizowanych komórek Symbiodiniaceae:
    1. Dodać 200 μl 100% zimnego (-20 °C) metanolu z ISs (13C6 sorbitol i/lub 13C 5-15N walina, w stężeniu 10 μM) do wysuszonego materiału Symbiodiniaceae.
    2. Dodać niewielką ilość kulek szklanych przemytych kwasem o objętości 710-1 180 μm (~10 mg). Umieścić w młynku perełkowym o częstotliwości 50 Hz na 3 minuty we wstępnie schłodzonej (−20 °C) wkładce młynka do perełek.
    3. Dodać kolejne 800 μl 100% zimnego (-20 °C) metanolu z IS i wirować przez 30 sekund.
  3. Wewnątrzkomórkowa ekstrakcja metabolitów z oddzielonej liofilizowanej tkanki gospodarza:
    1. Dodać 1 ml 100% zimnego (−20 °C) metanolu klasy LC zawierającego IS (13C6 sorbitol i/lub 13C 5-15N waliny, przy 10 μM) do wysuszonego materiału macierzystego.
    2. Wirować mieszać przez 20 s. Umieścić w pływającym uchwycie na probówkę w kąpieli sonizacyjnej ustawionej na 4 °C na 30 min.

9. Oczyszczanie ekstraktu metabolitowego

  1. Odwirować próbki (holobiont/gospodarz/symbiont) w temperaturze 3 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Przenieść cały supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu z resztek komórek.
    UWAGA: Są to ekstrakty półpolarne. Mogą one być tymczasowo przechowywane na lodzie, ale przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C w ciemności.
  3. Do pozostałych szczątków komórkowych dodać 1 000 μl 50% zimnego (-20 °C) metanolu. Energicznie wirować przez 1 minutę, aby ponownie zawiesić.
  4. Odwirować próbki o masie 3 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać i połączyć supernatant (ekstrakty polarne) z ekstraktami półpolarnymi z tej samej próbki.
    UWAGA: Szczątki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C i wykorzystywane do normalizacji zawartości białka (sekcja 11).
  6. Odwirować zebrane ekstrakty w stężeniu 16 100 g przez 15 minut w celu usunięcia wszystkich osadów i przenieść supernatant do nowej, wolnej od plastyfikatorów probówki do mikrowirówki (2 ml).
    UWAGA: Ekstrakty próbek można przechowywać w temperaturze -80 °C w ciemności.
  7. Gdy jest gotowy do analizy, podwielokrotność 50 μl każdego ekstraktu do szklanego wkładu. Koncentrat przez 30 minut w temperaturze 30 °C za pomocą koncentratora próżniowego. Powtórzyć jeszcze cztery razy (dla 250 μl całkowitego suchego ekstraktu).
    UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej w warunkach osuszania do czasu analizy.

10. Derywatyzacja metabolitów

UWAGA : Dwuetapowy proces derywatyzacji online jest stosowany do metoksymacji i trimetylosililacji metabolitów polarnych.

  1. Dodać 25 μl chlorowodorku metoksyaminy (30 mg/ml w pirydynie) do każdej próbki.
  2. Mieszać w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 750 obr./min przez 2 godziny.
  3. Do każdej próbki dodać 25 μl N,O-bis (trimetylosililo)trifluoroacetamidu + trimetylochlorosilanu.
  4. Mieszać ponownie w temperaturze 37 °C i prędkości 750 obr./min przez 1 godzinę.
  5. Pozostawić próbki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed wstrzyknięciem 1 μl w stosunku 1:10 do GC.

11. Chromatografia gazowa-analiza spektrometrii mas

UWAGA: Spektrometr masowy powinien być dostrojony zgodnie z zaleceniami producenta przy użyciu tris-(perfluorobutylo)-aminy (CF43).

  1. Jako gaz nośny należy stosować hel o ultrawysokiej czystości przy stałym natężeniu przepływu w kolumnie wynoszącym 1 ml/min.
  2. Użyj kolumny DB-5 o długości 30 m z folią o grubości 1 μm i średnicy wewnętrznej 0,25 mm.
  3. Program pieca GC
    1. Ustawić temperaturę na wlocie na 280 °C.
    2. Rozpocząć od wstrzyknięcia przy temperaturze piekarnika 100 °C i utrzymać przez 4 minuty.
    3. Zwiększyć temperaturę o 10 °C/min do 320 °C, a następnie przytrzymać przez 11 minut.
  4. Parametry spektrometru mas
    1. Ustaw linię przesyłową MS na 280 °C i ustaw źródło jonów na 200 °C.
    2. Użyj argonu jako gazu ogniwa zderzeniowego do wytworzenia jonu produktu do monitorowania wielu reakcji (MRM).
    3. Osiągnij wykrywanie metabolitów względem biblioteki MRM z segmentacją czasową zawierającą cele MRM.

12. Liczba komórek Symbiodiniaceae, analiza zawartości białka w tkance gospodarza koralowca i oszacowanie chlorofilu

  1. Liczba komórek Symbiodiniaceae:
    1. Pobrać podwielokrotność homogenatu tkanki koralowca.
    2. Odwirować próbki o masie 2 000 × g, aby granulować glony.
    3. Usuń ~200 μl supernatantu z osadu z glonów i umieść w nowej probówce do mikrowirówek.
      UWAGA: Będzie to próbka białka, która zostanie użyta do normalizacji danych; W razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C przed analizą.
    4. Zawiesić osad z alg w 1 ml przefiltrowanej wody morskiej, delikatnie pipetując w górę iw dół. W razie potrzeby rozcieńczyć zawiesinę glonów, aby ułatwić liczenie komórek.
    5. Przeprowadź zliczanie komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym, dodając 10 μl do jednej z komór. Wykonaj 8-10 zliczeń na próbkę.
      UWAGA: Tam, gdzie jest to możliwe, można również zastosować alternatywne metody liczenia komórek glonów (np. cytometria przepływowa, wysokoprzepustowa mikroskopia konfokalna).
    6. Obliczyć stężenie komórek symbiontycznych (mL−1), biorąc pod uwagę wszelkie zastosowane współczynniki rozcieńczenia.
  2. Oznaczenie zawartości białka
    1. Określ ilościowo zawartość białka w próbce (np. za pomocą testu kolorymetrycznego Bradforda, jak początkowo opisano przez Bradford et al.33, lub testu Lowry'ego34,35, którego protokół został opisany dla parzydełkowców w innym miejscu36).
  3. Ekstrakcja chlorofilu a
    1. Użyj granulki komórkowej składającej się z ~ 200 000 komórek, zamrożonych lub świeżych.
    2. Przenieść każdy osad glonów do 2 ml dimetyloformamidu (DMF) w szklanej fiolce scyntylacyjnej i inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 48 godzin
      UWAGA: DMF jest toksyczny i rakotwórczy, dlatego przygotowanie próbki musi odbywać się pod wyciągiem, który jest możliwie najciemniejszy i na lodzie. Jeśli jest < 200 000 komórek, użyj mniej DMF.
    3. Wirować przez 3 minuty przy 16 000 × g.
    4. Przenieś 200 ml do płytki dołkowej UV-96 w celu pomiarów fotometrycznych. Każdą próbkę należy rozprowadzić w trzech egzemplarzach, z DMF jako ślepą próbą.
    5. Zmierz absorbancję przy długościach fal (E) 663,8 nm, 646 nm i 750 nm. Odejmij absorbancję przy 750 nm od absorbancji przy obu pozostałych długościach fali.
      UWAGA: Pomiar przy długości fali 750 nm koryguje wszelkie rozproszenia i zmętnienia w próbce.
    6. Obliczyć stężenie chlorofilu a (μg/ml) za pomocą równania (1):
      Stężenie Chl a (μg/ml) = (12,00 × E663,8) - (3,11 × E646,8) (1)

13. Kwantyfikacja biomasy komórki po ekstrakcji metabolitów w celu normalizacji

UWAGA: Istnieją dwie opcje ilościowego oznaczania biomasy komórek opisane poniżej: kwantyfikacja białka związanego z biomasą przy użyciu zmodyfikowanej metody kolorymetrycznej Bradforda oraz pomiar suchej masy resztek komórek. Każda z tych metod jest odpowiednia do zastosowania, ponieważ obie zapewniają dokładne określenie ilościowe biomasy komórek.

  1. Zawartość białka w szczątkach komórkowych
    1. Zawiesić zamrożone szczątki komórek w 1 ml 0,2 M NaOH i inkubować próbki w temperaturze 98 °C przez 20 minut.
    2. Schłodzić próbki na lodzie przez ~10 minut i odwirować przy 3 000 × g przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
    3. Określ ilościowo zawartość białka w próbce (np. za pomocą testu kolorymetrycznego Bradforda, jak początkowo opisali Bradford i wsp.33 i zmodyfikowano Smart et al.37).
  2. Pomiar suchej masy resztek komórek
    1. Zawiesić resztki komórkowe z wewnątrzkomórkowej ekstrakcji metabolitu w wodzie podwójnie destylowanej (~10 ml).
    2. Przefiltrować roztwór pod próżnią za pomocą wstępnie zważonego filtra membranowego (pory 0,22 μm, 47 mm).
    3. Umyj probówki zawierające biomasę dwukrotnie ultraczystą wodą, aby zapewnić całkowite przeniesienie biomasy do filtra membranowego.
    4. Wyjmij filtr membranowy zawierający biomasę i wysusz go za pomocą kuchenki mikrofalowej (mała moc; ~250 W przez 20 min).
    5. Przechowywać bibułę filtracyjną w eksykatorze przez noc. Zanotować suchą masę bibuły filtracyjnej i obliczyć suchą masę biomasy, odejmując masę suchego filtra membranowego (przy użyciu czystego, suchego filtra membranowego wysuszonego obok filtra do pobierania próbek) od masy całkowitej.

14. Analiza danych

  1. Analizuj docelowe metabolity przy użyciu baz danych metabolitów, w których każdy cel składa się z kwantyfikatora i kwalifikatora MRM.
  2. Oględziny wykrytych metabolitów i ich ręczna integracja w razie potrzeby.
  3. Użyć powierzchni piku metabolitu, aby obliczyć względną obfitość każdej próbki dla każdej grupy. Wartości są korygowane i normalizowane w celu pobrania próbki wewnętrznego obszaru piku wzorca, a następnie w celu pobrania próbki zawartości białka w szczątkach komórek zgodnie z Smart et al.37.
  4. Należy odrzucić metabolity o względnym odchyleniu standardowym większym niż 35% we wszystkich badanych grupach (N = 23 metabolity).
  5. Przekształć dane (np. pierwiastek sześcienny) i wyśrodkuj je średnią; potwierdź rozkład normalny i jednorodność wariancji.
  6. Przeprowadź analizę danych (ANOVA i konstrukcja mapy cieplnej; np. za pomocą https://www.metaboanalyst.ca)38. Grupować próbki, aby zbadać zmienność w trakcie poddawania działaniu substancji, używając pakietów "cluster", "factoextra" i "klustR". Oblicz statystykę luk (metoda określania optymalnej liczby klastrów39) za pomocą funkcji "clusGap" w R i wykresy za pomocą pakietu R "tidyverse". Wykonać badania PERMANOVA w celu zbadania znaczenia separacji między profilami metabolitów poddanych działaniu substancji (np. w Primerze).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wszystkie dane uzyskane w ramach niniejszej pracy są dostępne w informacjach uzupełniających.

Oddzielenie symbionta od gospodarza

figure-results-1
Rycina 1: Konfiguracja i walidacja rozdziału tkanek gospodarza koralowca i komórek Symbiodiniaceae. (A) Układ z pistoletem pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oddzielenie gospodarza i symbionta jest łatwe i szybkie do osiągnięcia poprzez proste wirowanie, a wyniki pokazują, że oddzielenie frakcji może dostarczyć cennych informacji wskazujących na specyficzny wkład członków holobiontu, co może przyczynić się do funkcjonalnej analizy zdrowia koralowców. U dorosłych koralowców synteza lipidów jest przeprowadzana głównie przez rezydentny symbiontglonów 40, który dostarcza lipidy (np. triacyloglicerol i fosfolipidy)41 oraz kw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

J.L.M. był wspierany przez stypendium badawcze Kanclerza UTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% metanol klasy LCNiezbędne439193klasy LC
2 ml, polipropylen PPEppendorf30121880zapewnia wysoką odporność na chemikalia, naprężenia mechaniczne i ekstremalne temperatury
2030 Chromatograf gazowy Shimadzu ShimadzuGC-2030
710-1180 µ m Koraliki szklane płukane kwasemMerck
G1152		Ten rozmiar jest optymalny do rozbijania komórek Symbiodiniaceae
AOC-6000 Plus Wielofunkcyjny automatyczny podajnikShimadzuAOC6000
odczynnik BradfordMerckB6916Dopuszczalny jest dowolny odczynnik kolorymetryczny do białek
Pistolet na sprężone powietrzeOzito6270636Podobny projekt do przyjęcia. Posiadanie złączki pasującej do końcówki o pojemności 1 ml ma kluczowe znaczenie.
  Kolumna DB-5 z kolumną o średnicy wewnętrznej 0,25 mm i 1 &mikro; m grubość powłokiAgilent122-5013
DMFMerckRTC000098
D-Sorbitol-6-13C i/lub 13C5– 15N WalinaMerck605514/ 600148Do metanolu można dodać jeden lub oba wzorce wewnętrzne.
96-dołkowa płytka z płaskim dnemMerckCLS3614
Szklane fiolki scyntylacyjneMerckV713020 ml, z nieplastikową uszczelką
Immunoglogin GMerck56834jeśli nie jest dostępna, albumina surowicy bydlęcej jest dopuszczalna
Podkładv4
Rv4.1.2
OprogramowanieShimadzu LabSolutions Insightv3.6
Wodorotlenek soduMerckS5881Granulki do przygotowania 1 M roztworu
tidyversev1.3.1Pakiet R
TissueLyser LTQiagen85600Lub podobny
TQ8050NX potrójny kwadrupolowy spektrometr masowyShimadzuGCMS-TQ8050 NX
UV-96 płytka dołkowaGreinerM3812
Worek na próbki Whirl-PakMerckWPB01018WAWorek do pobierania próbek; Rozmiar: wystarczająco duży, aby pomieścić ~5 cm fragment koralowca, ale nie za duży, aby woda była zbyt rozlana
probówki mikrowirówkowe Merck próbek

Bibliografia

  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
  2. Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
  3. Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
  4. LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
  5. Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
  6. Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
  7. Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
  8. Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
  9. Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
  10. Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
  11. Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336(2018).
  12. González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
  13. Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
  14. Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421(2021).
  15. Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601(2020).
  16. Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
  17. Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610(2021).
  18. Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
  19. Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687(2020).
  20. Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
  21. Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760(2018).
  22. Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
  23. Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
  24. Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
  25. Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433(2018).
  26. Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
  27. Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12(2018).
  28. Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
  29. Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
  30. Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176(2022).
  31. Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262(2020).
  32. Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  34. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  35. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  36. Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
  37. Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
  38. Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
  39. Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
  40. Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
  41. Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
  42. Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
  43. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
  44. Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246(2021).
  45. Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
  46. Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
  47. Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
  48. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  49. Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
  50. Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76(2021).
  51. Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

holobiont koralowcaseparacja Symbiodiniaceaeekstrakcja metabolit wizolacja tkanki koralowcaprofilowanie metabolomowedetekcja biomarker wodpowied koralowc w na stres
Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.