Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

knockdown FAM83A w celu sprawdzenia jego roli we wzroście komórek raka szyjki macicy i wrażliwości na cisplatynę

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65667

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Jingzhou Hospital, Yangtze University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Gong An County People's Hospital, 3Department of Ultrasound, Zhijiang People's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy procedury knockdownu FAM83A; testy wykrywające jego wpływ na proliferację, migrację i inwazję komórek raka szyjki macicy; oraz uwrażliwienie tych komórek na cisplatynę. Badanie to stanowi obiecujący gen docelowy dla raka szyjki macicy i punkt odniesienia dla dalszych badań nad lekami.

Streszczenie

Eksploracja genów docelowych nowotworów ma ogromne znaczenie dla zapobiegania i leczenia raka szyjki macicy. W tym badaniu przedstawiamy etapy związane z identyfikacją docelowego genu nowotworowego FAM83A w raku szyjki macicy. Po pierwsze, zestaw danych Cancer Genome Atlas został wykorzystany do walidacji ekspresji i znaczenia prognostycznego FAM83A u kobiet. Mały interferujący RNA (siRNA) został użyty do knockdown genu FAM83A w komórkach HeLa i C33a. Następnie przeprowadzono barwienie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) w celu określenia wpływu na zdolności proliferacyjne komórek nowotworowych. Przeprowadzono testy gojenia się ran i wkładania porowatej błony w celu oceny zdolności migracji komórek nowotworowych i inwazji.

Western blot został użyty do ilościowego określenia poziomów białka związanych z apoptozą. Barwienie JC-1 zastosowano do oceny zmian funkcji mitochondriów. Ponadto zastosowano interwencję cisplatyną (diaminoplatyną, DDP) w celu oceny potencjału terapeutycznego docelowego genu. Przeprowadzono testy cytometrii przepływowej i tworzenia kolonii, aby dokładniej potwierdzić przeciwnowotworowe właściwości genu. W rezultacie wykazano, że knockdown FAM83A hamuje proliferację, migrację i inwazję komórek raka szyjki macicy oraz uwrażliwia te komórki na cisplatynę. Te kompleksowe metodologie łącznie potwierdzają, że FAM83A jest genem docelowym związanym z nowotworem, obiecującym jako potencjalny cel terapeutyczny w profilaktyce i leczeniu raka szyjki macicy.

Wprowadzenie

Rak szyjki macicy jest problemem globalnym, ponieważ jest jednym z wiodących rodzajów nowotworów ginekologicznych na świecie i jest główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem u kobiet1. Radykalna chirurgia i chemioradioterapia wiążą się z wysokimi wskaźnikami wyleczeń na pierwotnym etapie. Jednak wyniki leczenia pacjentek w zaawansowanym stadium raka szyjki macicy, u których rozwija się choroba z przerzutami, są bardzo niekorzystne2. Dlatego tak ważne jest dalsze zrozumienie mechanizmów biologicznych leżących u podstaw migracji i inwazji komórek raka szyjki macicy oraz zidentyfikowanie potencjalnych celów terapeutycznych w profilaktyce i leczeniu tej choroby.

Identyfikacja docelowych genów zaangażowanych w progresję raka i znalezienie sposobów na zahamowanie ich ekspresji lub działania stanowi obiecujące opcje leczenia. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy FAM83 jako gen powodujący raka i dalej badaliśmy jego hamujące działanie na komórki C33a i HeLa. Onkogeny rodziny FAM83 (FAM83A-H) są szeroko opisywane w nowotworach u ludzi3,4. Ostatnio doniesiono, że FAM83A jest regulowany w górę w nowotworach płuc5, breast6, ovarian7 i pancreatic8, co wskazuje, że FAM83A odgrywa ważną rolę w progresji raka poprzez promowanie proliferacji, inwazji, cech podobnych do komórek macierzystych i oporności na leki w komórkach nowotworowych. Co ważne, FAM83A został zidentyfikowany jako jeden z nowych genów kandydujących związanych z progresją zmian w szyjce macicy i kancerogenezą9. Pomimo potwierdzenia podwyższonej ekspresji FAM83A w ludzkich komórkach raka szyjki macicy, specyficzny wpływ i mechanizmy leżące u podstaw FAM83A w raku szyjki macicy pozostają niejasne.

W tym badaniu opisujemy protokoły związane z identyfikacją FAM83A jako genu docelowego dla nowotworu w raku szyjki macicy i używamy małego interferującego RNA (siRNA) do knockdownu genu FAM83A w komórkach HeLa i C33a. Przeprowadzono barwienie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) w celu określenia wpływu na proliferację komórek nowotworowych, podczas gdy gojenie się ran i testy wkładania porowatej błony pomogły ocenić migrację komórek nowotworowych i zdolności inwazji.

Western blot został przeprowadzony w celu określenia poziomów białek związanych z apoptozą, a barwienie JC-1 zostało użyte do oceny zmian funkcji mitochondriów. W związku z tym poinformowaliśmy, że FAM83A odgrywa kluczową rolę w proliferacji komórek, przerzutach i inwazji w raku szyjki macicy. Poprzez dysfunkcję mitochondriów i apoptozę związaną ze szlakiem PI3K/AKT, knockdown FAM83A uwrażliwił komórki raka szyjki macicy na cisplatynę (diaminadichloroplatynę, DDP). Badanie to stanowi nowy cel dla raka szyjki macicy i prawdopodobnie innych nowotworów oraz odniesienie dla rozwoju strategii przezwyciężania oporności komórek rakowych na niektóre leki chemioterapeutyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie było całkowicie zgodne z wytycznymi publikacji dostarczonymi przez TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Źródło danych i analiza bioinformatyczna

  1. Uzyskaj dane sekwencjonowania RNA z bazy danych Atlasu genomu raka (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) w celu analizy skupień. Skorzystaj z GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), narzędzia internetowego do ponownego obliczania surowych danych sekwencyjnych RNA próbek z projektów TCGA, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem potencjalnych celów dla leków przeciwnowotworowych za pomocą standardowego potoku przetwarzania.
    UWAGA: Strona internetowa GEPIA jest dostępna bezpłatnie dla wszystkich użytkowników.
  2. Wejdź na stronę główną witryny GEPIA i kliknij Analiza typu nowotworu, wybierz opcję Różnicowa analiza genów i ustaw następujące parametry: Nazwa raka = CESE (zdefiniowana na tej stronie jako rak płaskonabłonkowy szyjki macicy i gruczolakorak szyjki macicy), |Log2FC| Punkt odcięcia = 1, punkt odcięcia wartości q = 0,01, metody różnicowe = ANOVA i dystrybucja chromosomów = oba. Następnie kliknij Lista, aby uzyskać listę genów, która pokazuje różnicową ekspresję między guzem a grupami normalnymi.
    UWAGA: Wymaga obszernego przeglądu literatury w celu zidentyfikowania genów kandydujących o zróżnicowanej ekspresji. W tym badaniu, biorąc pod uwagę tło z dostępnej literatury, skupiamy się na genie nowotworu, który jest przedmiotem zainteresowania, FAM83A.
  3. Następnie zbadaj ekspresję FAM83A w raku szyjki macicy i normalnych tkankach za pomocą GEPIA, przechodząc do opcji Expression DIY na stronie internetowej i wybierz Boxplot jako typ wykresu. Wprowadź FAM83A w polu parametru genu i ustaw następujące parametry: |Log2FC| Wartość graniczna = 1; Wartość graniczna q = 0,01. Wybierz CESE jako nazwę nowotworu i Dopasuj dane normalne TCGA dla pola danych Dopasowane normalne, pozostawiając wszystkie inne ustawienia domyślne. Kliknij Wykres i zezwól witrynie na wygenerowanie wykresu skrzynkowego reprezentującego różnicową ekspresję genu FAM83A; Zapisz wykres skrzynkowy do wykorzystania w przyszłości i analizy.
  4. Na koniec przeanalizuj całkowite przeżycie pacjentek z guzami o różnych poziomach ekspresji FAM83A w raku szyjki macicy. Przejdź do opcji Wykresy przeżycia na stronie internetowej, ustaw Gen na FAM83A i wybierz Całkowite przeżycie jako typ analizy. Dodaj nazwę guza CESE, wybierz Miesiące dla jednostek osi i pozostaw wszystkie inne parametry w ustawieniach domyślnych. Kliknij Wykres i pozwól witrynie wygenerować wykres krzywej przeżycia; Zachowaj ten wykres do wykorzystania i analizy w przyszłości.
  5. Należy wziąć pod uwagę zarówno różnicową ekspresję FAM83A w nowotworach, jak i jej korelację z analizą przeżycia pacjenta, aby zidentyfikować FAM83A jako potencjalny terapeutyczny gen docelowy w raku szyjki macicy.

2. Eksperymenty na komórkach

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodowla ludzkich komórek nowotworowych w zmodyfikowanym podłożu w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
      UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o linii komórkowej i składnikach pożywki hodowlanej.
  2. Transfekcja komórek
    1. Użyj siRNA, aby obniżyć ekspresję FAM83A w komórkach.
      UWAGA: Patrz Tabela 1 dla specyficznej sekwencji siRNA.
    2. Komórki nasienne na płytkach 6-dołkowych inkubować w mieszaninie 50 nM si-FAM83A lub siRNA-NC i 8 μL środka do transfekcji lub tylko 8 μl środka do transfekcji przez 4-6 godzin po osiągnięciu 50%-70% konfluencji. Do kontroli ujemnej dodać tylko DMEM bez surowicy.
    3. Po inkubacji należy zastąpić pożywkę zawierającą środek do transfekcji DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej. Następnie, 48 godzin po transfekcji, potraktuj 5 μM cisplatyną (DDP) przez 24 godziny zgodnie z przeznaczeniem i zbierz wszystkie komórki do ekstrakcji całkowitego RNA i analizy qRT-PCR.

3. Wykrywanie EdU w teście proliferacji komórek

UWAGA: Użyj zestawu do proliferacji komórek EdU, aby ocenić proliferację komórek in vitro zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Wysiewać komórki na 6-dołkowych płytkach i inkubować je z 10 μM roztworem EdU przez 2 godziny. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) i przepuszczać 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć bufor permeabilizacyjny i dodać 500 μl 1x roztworu reakcyjnego. Następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności w celu barwienia jądrowego.
  3. Wybarwić komórki 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i uwidocznić je pod mikroskopem fluorescencyjnym w 200-krotnym powiększeniu. Wybarwić jądra proliferujących komórek za pomocą EdU i zbadać je pod kątem czerwonej fluorescencji.
  4. Na koniec użyj oprogramowania do ilościowego określenia wyników, licząc co najmniej 10 losowych pól i oblicz tempo proliferacji przy użyciu stosunku komórek fluorescencyjno-dodatnich do całkowitej liczby komórek.

4. Test gojenia się ran

  1. Komórki nasienne w płytkach 6-dołkowych o gęstości 2 × 105 komórek na dołek.
  2. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, użyj sterylnej końcówki mikropipety o pojemności 10 μl, aby delikatnie utworzyć liniowe rysowanie w monowarstwie komórki. Delikatnie opłucz studzienki sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie oderwane komórki i zanieczyszczenia spowodowane zarysowaniem.
  3. Następnie inkubować komórki w pożywce zawierającej 1% FBS. Następnie obserwuj i rób zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu, aby zagoić zraniony obszar po 12, 24 i 48 godzinach.

5. Test wkładki z porowatą membraną

  1. Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce do hodowli komórkowych o pożądanym stężeniu komórek (zawierających 4 ×10 4 komórek), w tym transfekowane lub kontrolne komórki C33a i HeLa. Dodaj zawiesinę komórek do górnej komory wkładów membranowych, zapewniając równomierne rozprowadzenie. Dodaj kompletną pożywkę do dolnej komory.
  2. Po inkubacji przez 24 godziny użyj alkoholu metylowego i 0,1% fioletu krystalicznego do utrwalenia i barwienia komórek migrujących do dolnych komór.
  3. Użyj odwróconego mikroskopu, aby zrobić obrazy, a następnie przeanalizuj liczbę migrujących komórek, licząc co najmniej 10 losowych pól za pomocą ImageJ.
    1. Aby przeprowadzić analizę liczbową za pomocą ImageJ, otwórz obraz w oprogramowaniu ImageJ, przejdź do zakładki Obraz w menu narzędzi, wybierz Dostosuj, a następnie kliknij Próg. W razie potrzeby dostosuj ustawienia progu, aż tylko komórki będą widoczne na białym tle.
    2. Kliknij Zastosuj w oknie Próg, aby zastosować te ustawienia do obrazu. Teraz wybierz narzędzie Różdżka (śledzenie) z paska narzędzi (znajdującego się w górnej części okna).
    3. Kliknij obszar obrazu, w którym znajdują się komórki, aby zaznaczyć wszystkie komórki na obrazie z progiem. Po podświetleniu komórek przejdź do Analizuj w menu Narzędzie, a następnie kliknij Analizuj cząstki. W oknie Analizuj cząstki wprowadź żądany rozmiar (np. 0 - nieskończoność) i wartości kołowości (np. 0,00 - 1,00) zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, aby uwzględnić wszystkie komórki w zliczaniu.
    4. Kliknij OK i poczekaj, aż oprogramowanie policzy komórki i pojawi się nowe okno z wynikami analizy.

6. Test tworzenia kolonii

  1. Nasiona 2 × 105 komórek na basenik grup Si-NC i Si-FAM83A na płytce 6-dołkowej z lub bez traktowania cisplatyną 5 μM (DDP) przez 24 godziny.
  2. Po 24-godzinnym okresie leczenia farmakologicznego należy odłączyć komórki za pomocą 0,25% trypsyny i ponownie zawiesić je w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% FBS. Wysiewać zawieszone komórki na 6-dołkowej płytce o gęstości 1 × 103 komórek na studzienkę, a następnie inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  3. Po inkubacji przez ~ 7-10 dni, gdy widoczne są kolonie, utrwal komórki 4% polioksymetylenem i wybarwiaj je roztworem barwiącym Giemsa przez 20 minut.
  4. Lekko umyj komórki i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu. Zrób zdjęcia klastrów kolonii za pomocą mikroskopu i policz liczbę kolonii, które zawierają więcej niż 50 komórek.

7. Analiza depolaryzacji błony mitochondrialnej (MMP) przy użyciu barwnika JC-1

  1. Siew 1,2 × 106 komórek nowotworowych z Si-NC i Si-FAM83A grupuje się w sześciodołkowej płytce i hoduje przez 24 godziny z lub bez leczenia cisplatyną 5 μM (DDP).
  2. Inkubować z 1x roztworem barwiącym JC-1 przez 15-20 minut w temperaturze poniżej 5% CO2 w temperaturze 37 °C przy użyciu zestawu do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Umyj komórki i zbadaj je pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 200-krotnym powiększeniu przy użyciu długości fal wzbudzenia i emisji dla JC-1 odpowiednio przy ~490 nm i 590 nm. Aby zobrazować fluorescencję JC-1, należy użyć odpowiednich filtrów, takich jak niebieski filtr wzbudzenia (450-490 nm) i czerwony filtr emisyjny (długoprzepustowy > 590 nm), aby selektywnie wychwycić emitowany sygnał fluorescencyjny.

8. Analiza mPTP metodą cytometrii przepływowej

  1. Siew 1,2 × 106 komórek nowotworowych z Si-NC i Si-FAM83A grupuje się w sześciodołkowej płytce i hoduje przez 24 godziny z lub bez leczenia cisplatyną 5 μM (DDP).
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek, ponownie zawiesić komórki w PBS i dodać po 300 μl (1x objętość) roztworu barwiącego Calcein AM i roztworu roboczego do wygaszania fluorescencji, aby równomiernie pokryć komórki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w środowisku chronionym przed światłem przez 30-45 minut, a następnie zastąpić pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną w temperaturze 37 °C. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w środowisku chronionym przed światłem przez dodatkowe 30 minut, aby zapewnić całkowitą hydrolizę kalceiny AM przez esterazy wewnątrzkomórkowe, w wyniku czego powstaje wewnątrzkomórkowa kalceina o zielonej fluorescencji.
  3. Usuń pożywkę hodowlaną, przemyj komórki 2-3 razy PBS i dodaj bufor detekcyjny. Wykrywanie mPTP komórek za pomocą cytometrii przepływowej i długości fali wzbudzenia 488 nm.

9. Cytometria przepływowa

  1. Siew 1,2 × 106 komórek nowotworowych z Si-NC i Si-FAM83A grupuje się w sześciodołkowej płytce i hoduje przez 24 godziny z lub bez leczenia cisplatyną 5 μM (DDP).
  2. Po 24 godzinach leczenia farmakologicznego ponownie zawiesić komórki w 200 μl wiążącego roztworu buforowego i delikatnie wymieszać 10 μl aneksyny V-FITC i 5 μl jodku propidyny (PI) z zawiesiną komórki. Inkubować mieszaninę przez 15 minut, unikając światła, i dodać 300 μl wiążącego roztworu buforowego do komórek. Wykrywanie apoptozy komórek za pomocą cytometrii przepływowej przy długości fali wzbudzenia 488 nm.

10. Analiza RT-PCR

  1. Siew 1,2 × 106 komórek nowotworowych z Si-NC i Si-FAM83A grupuje się w sześciodołkowej płytce i hoduje przez 24 godziny z lub bez leczenia cisplatyną 5 μM (DDP).
  2. Ekstrahować całkowite RNA z komórek nowotworowych za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA i przekształcać wyekstrahowany RNA w komplementarne DNA (cDNA) za pomocą mieszanki syntezy cDNA przez inkubację w temperaturze 42 °C przez 45 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  3. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zawierającą polimerazę DNA, nukleotydy, bufor i zaprojektowane startery specyficzne dla genu. Dodać matrycę cDNA do mieszaniny reakcyjnej w celu przeprowadzenia reakcji PCR w czasie rzeczywistym i przeprowadzić PCR na ilościowym przyrządzie do PCR w czasie rzeczywistym w następujących warunkach termocyklu: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 30 s, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s oraz etap krzywej topnienia w temperaturze 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min i 95 °C przez 15 s. Określ ilościowo poziomy mRNA za pomocą metody 2−ΔΔCq przy użyciu GAPDH jako kontroli wewnętrznej.
    UWAGA: System reakcji RT-PCR przedstawiono w tabeli 1, a sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 1.
    1. Aby obliczyć wartość 2−ΔΔCq, należy zmierzyć wartości Cq dla genu docelowego i genu referencyjnego (GAPDH) w próbkach. Obliczyć ΔCq, odejmując wartość Cq genu odniesienia od wartości Cq genu docelowego dla każdej próbki. Obliczyć ΔΔCq, odejmując ΔCq próbki kontrolnej od ΔCq każdej próbki doświadczalnej. Na koniec oblicz wartość 2−ΔΔCq, podnosząc 2 do potęgi wartości ΔΔCq.
      UWAGA: Wartość Cq reprezentuje numer cyklu, w którym sygnał fluorescencji osiąga ustawiony próg.

11. Analiza Western blot

  1. Siew 1,2 × 106 komórek nowotworowych z Si-NC i Si-FAM83A grupuje się w sześciodołkowej płytce i hoduje przez 24 godziny z lub bez leczenia cisplatyną 5 μM (DDP).
  2. Zebrać wyhodowane komórki i przemyć je lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia wszelkich pozostałości pożywki wzrostowej lub surowicy. Lizuj komórki za pomocą buforu lizy RIPA zawierającego fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) w celu uwolnienia białek komórkowych. Inkubować komórki na lodzie przez kilka minut, aby zapewnić pełną lizę i odwirowywać w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 15 minut. Zebrać supernatant w celu określenia stężenia białka.
  3. Określ stężenie białka w lizacie komórkowym za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać lizat komórkowy z buforem ładującym i podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95-100 °C przez 5-10 minut, aby zdenaturować białka i zapewnić równomierne oddzielenie na żelu.
  4. Z każdej próbki załadować 30 μg białka całkowitego do żelu SDS-PAGE i uruchomić SDS-PAGE pod stałym napięciem 80 V. Zatrzymaj elektroforezę, gdy błękit bromofenolowy dotrze do dna żelu separacyjnego.
  5. Przenieść oddzielone białka z żelu na membranę z polifluorku winylu za pomocą mokrego systemu transferowego na łaźni lodowej o natężeniu 200 mA przez 1,5 godziny.
  6. Zawiesić błonę 5% mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,05% buforem Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z odpowiednimi przeciwciałami podanymi w tabeli materiałów.
  7. Przemyć błonę kilkakrotnie TBST i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć TBST. Wizualizacja prążków białkowych za pomocą ulepszonego zestawu do wykrywania chemiluminescencji i systemu obrazowania.

12. Analiza statystyczna

  1. Ponieważ wszystkie punkty danych eksperymentalnych będą niezależne, przedstaw dane jako średnią ± SD. Wykonaj analizę statystyczną.
  2. Użyj jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) do wielokrotnych porównań i testu Dunnetta do porównania każdej grupy z grupą kontrolną. Użyj testu t-Studenta (niesparowany dwustronny) do porównania dwóch grup; uznać P < 0,05 za znaczące.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza bazy danych TCGA i walidacja metodą PCR

Na podstawie analizy bazy danych TCGA przeprowadzono analizę porównawczą poziomów ekspresji mRNA w 306 próbkach komórek raka szyjki macicy oraz 13 próbkach komórek prawidłowych, aby zbadać różnicową ekspresję FAM83A. FAM83A była upregulowana w raku szyjki macicy, podczas gdy jej ekspresja w prawidłowej tkance szyjki macicy była pomijalna (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie docelowych genów nowotworowych ma ogromne znaczenie zarówno w profilaktyce, jak i leczeniu raka szyjki macicy. Zrozumienie konkretnych genów, które odgrywają znaczącą rolę w rozwoju i progresji raka szyjki macicy, dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby. Co więcej, identyfikacja tych docelowych genów może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych i terapii celowanych. W tym badaniu opisujemy zastosowanie analizy zestawu danych TCGA do identyfikacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Jingzhou Science and Technology Bureau (nr 2020HC06).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cells and Medium Formula
C33aAmerican Type Culture Collection
HelaAmerican Type Culture Collection
Zmodyfikowana pożywka10% płodowej surowicy bydlęcej i + antybiotyki (100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny)
Informacja o przeciwciałach
AKT4691, Technologia sygnalizacji komórkowej Inc.' 1:1,000
Bcl2 26593-1-AP, Grupa Proteintech, Inc' 1:1,000
Kaspaza 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc' 1:2,000
rozszczepiona kaspaza3abs132005; Absin Bioscience Inc.' 1:1,000
Cytc10993-1-AP; Grupa" 1:1,000
GAPDH 10494-1-AP, Grupa Proteintech, Inc.' 1:8,000
mTOR2983, Technologia sygnalizacji komórkowej Inc.' 1:1,000
PI3K4292, technologia sygnalizacji komórkowej Inc' 1:1 000
p-AKT 4060, Technologia sygnalizacji komórkowej Inc.' 1:1,000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Technologia sygnalizacji komórkowej Inc.' Podjednostka
p-PI3K p85:1,000 17366, Cell Signaling Technology Inc.' 1:1,000
Przeciwciała drugorzędoweGB23303, Servicebio' 1:2 000
Materiały
6-dołkowa płytkaCorning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
Zestaw do oznaczania białek BCA Beyotime, Chiny P0011
System obrazowania ChemiDoc XRS Zestaw do
Enhance Servicebio, Inc., Chinynr kat. G2014
Mikroskop fluorescencyjny Olympus Corporation, Tokio, Japonia
Hifair II 1. nić syntezy cDNA Super Mix 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., Chiny
Mikroskop odwrócony Olimp, Tokio, Japonia;
Wkłady transwellowe Millicell Millipore, Bedford, MA, USA
Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej Beyotime, Chiny
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, Chiny#ST506
Ilościowy instrument PCR w czasie rzeczywistym Biosystemy stosowane, Thermo Fisher Scientific. Chiny.
Bufor do lizy RIPA Beyotime Biotech, Jiangsu, Chiny
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026
Odczynnik TRIzol Takara Bio Inc., Otsu, Japonia
Software
Image-Pro  plus 6,0   
Proteintech 1 wykrywania chemiluminescencji BioRad

Bibliografia

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454(2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172(2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697(2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87(2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302(2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wyciszenie FAM83Aproliferacja komórek nowotworowychmigracja komórekbarwienie EdUWestern Blotcytometria przepływowabiałka apoptozytworzenie kolonii
knockdown FAM83A w celu sprawdzenia jego roli we wzroście komórek raka szyjki macicy i wrażliwości na cisplatynę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.