Method Article

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

DOI:

10.3791/65688

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture, Liaocheng University, 2College of Life Science, Liaocheng University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja roślin kompozytowych z transgenicznymi korzeniami oraz nietransgenicznymi łodygami i pąkami za pomocą transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes jest potężnym narzędziem do badania biologii związanej z korzeniami. Przemiana korzeni owłosionych występuje w szerokim zakresie roślin dwuliściennych oraz u kilku gatunków jednoliściennych i jest prawie niezależna od genotypu. Tradycyjna metoda wstrzykiwania hipokotylu z A. rhizogenes w celu uzyskania roślin kompozytowych jest nieefektywna, czasochłonna, pracochłonna i często powoduje śmierć delikatnych i maleńkich roślin hipokotylowych. Wcześniej ustalono wysoce wydajną, jednoetapową transformację owłosionych korzeni, w której pośredniczy A. rhizogenes, która eliminuje potrzebę przesadzania po wytworzeniu owłosionych korzeni. W tym badaniu usunięto częściowy hipokotyl i pierwotny korzeń, miejsce nacięcia hipokotylu pokryto A. rhizogenes, a następnie hipokotyle posadzono w sterylnym wermikulicie. Po 12 dniach uprawy nacięcie hipokotylu rozszerzyło się i wyindukowano nowe owłosione korzenie. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy A. rhizogenes, a jej skuteczność wykazano poprzez produkcję roślin złożonych z dzikiej soi, Solanum americanum i dyni.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobacterium rhizogenes to Gram-ujemna bakteria glebowa z rodziny Rhizobiaceae. A. rhizogenes może zakażać prawie wszystkie rośliny dwuliścienne, kilka jednoliściennych i pojedyncze rośliny nagonasienne przez rany, wytwarzając owłosione korzenie u zakażonych roślin. Bakteria jest nosicielem plazmidu Ri (indukującego korzenie), a T-DNA plazmidu Ri przenosi gen syntezy opiny i geny rol (geny locus korzenia). Po tym, jak T-DNA plazmidu Ri dostanie się do komórki roślinnej i zostanie zintegrowane z chromosomem gospodarza, ekspresja genów rol indukuje produkcję owłosionych korzeni1. Roślinny wektor ekspresji binarnej przenoszący gen docelowy jest przekształcany w A. rhizogenes, a przekształcony A. rhizogenes jest używany do zakażenia rośliny. Korzenie transgeniczne mogą być indukowane w zainfekowanych roślinach, wytwarzając rośliny złożone zawierające transgeniczne korzenie oraz nietransgeniczne łodygi i pąki. Ogólnie rzecz biorąc, roślinę kompozytową można uzyskać w ciągu 14-20 dni. Transformacja owłosionych korzeni za pośrednictwem A. ryzogenów na ogół nie jest ograniczona genotypem u roślin dwuliściennych2. Owłosione korzenie wytwarzane przez rośliny porażone przez A. rhizogenes charakteryzują się szybkim tempem wzrostu, stabilnym dziedziczeniem i łatwą obsługą. Transformacja owłosionych korzeni, w której pośredniczy A. rhizogenes, jest obecnie szeroko stosowana do badania biologii związanej z korzeniami. Co więcej, transformacja owłosionych korzeni może być również wykorzystana do walidacji i optymalizacji wydajności edycji celów systemu CRISPR/Cas93,4,5 i lokalizacji subkomórkowej białek. Dlatego transformacja owłosionych korzeni jest ważnym narzędziem w badaniach nad funkcją genów roślin, inżynierią metaboliczną i interakcjami między korzeniami a mikroorganizmami ryzosfery6,7,8.

Rośliny kompozytowe zawierające transgeniczne korzenie uzyskane w wyniku transformacji owłosionych korzeni były powszechnie produkowane w roślinach dwuliściennych, zwłaszcza w roślinach strączkowych. Tradycyjna metoda wstrzykiwania hipokotylu z A. rhizogenes została wykorzystana do produkcji kompozytu Lotus corniculatus9, soybeans10, tomato11, słodkie ziemniaki12 i wiele innych roślin5,8. Metoda iniekcji hipokotylu jest nieskuteczna i może spowodować śmierć młodych lub maleńkich roślin hipokotylowych. W związku z tym metoda została ulepszona poprzez odcięcie korzeni zarodkowych, pokrycie nacięcia siewki A. rhizogenes, a następnie umieszczenie hipokotylu na sterylnym podłożu hodowlanym w celu ukorzenienia uprawy13. Jednak te kroki są wykonywane w sterylnym środowisku, a etapy operacji są stosunkowo uciążliwe. W szczególności powstałe rośliny kompozytowe należy przesadzić, co zwiększa ilość pracy. W poprzedniej pracy jednoetapowa transformacja owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes (ARM) została ustalona w ogórku, soi, Lotus japonicus, Medicago truncatula i pomidorach2,14,15,16,17. Pierwotny korzeń i częściowy hipokotyl zostały usunięte, miejsce nacięcia pozostałego hipokotylu pokryto przekształconym A. rhizogenes, a następnie sadzonkę posadzono w wilgotnym sterylnym wermikulicie. Po 12 dniach uprawy w miejscu nacięcia wytworzyły się owłosione korzenie. Jednoetapowa metoda ARM jest bardzo wydajna i wymaga mniej czasu na wytworzenie owłosionych korzeni. Przesadzanie po uformowaniu owłosionych korzeni również nie jest konieczne. Ponieważ zanieczyszczenia mikrobiologicznego można uniknąć bez przesadzania, jednoetapowa metoda ARM może być szczególnie przydatna podczas badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami, takich jak symbiotyczne wiązanie azotu między roślinami strączkowymi a Rhizobia oraz symbiozy między roślinami a arbuskularnymi grzybami mikoryzowymi. W tym artykule przedstawiono szczegółowy, jednoetapowy protokół transformacji owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes wraz z przykładami roślin złożonych wytwarzanych w dzikiej soi, Solanum americanum i dyni. Dzięki temu protokołowi badacze mogą płynnie przeprowadzić jednoetapową transformację ARM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Warunki wzrostu roślin i kultura A. rhizogenes

  1. Wysiew nasion
    UWAGA: Nasiona dzikiej soi zebrano w hrabstwie Yanggu w Liaocheng w Chinach; nasiona S. americanum i lokalnej odmiany dyni Yinsu zakupiono na targu.
    1. Zbierz nasiona dzikiej soi, S. americanum i lokalnej odmiany dyni, zasiej je w wermikulicie na głębokości 1 cm i dokładnie podlej. Posadź 20 nasion w plastikowych pudełkach o wymiarach 8 cm x 11 cm x 9 cm. Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej w temperaturze 24 ± 2 °C w cyklu 16 godzin światła/8 godzin ciemności przy wilgotności względnej około 70%.
      UWAGA: Warstwy nasion dzikiej soi muszą być zerwane przed siewem. Jeśli pytanie badawcze koncentruje się na interakcjach między roślinami a mikroorganizmami, nasiona, wermikulit, plastikowe pudełka i woda muszą być sterylizowane przed użyciem.
    2. Aktywacja i hodowla A. rhizogenes K599
      UWAGA: Szczep A. rhizogenes K599 miał jeden wektor binarny pRed13052 niosący gen reporterowy czerwonej fluorescencji DsRed2.
      1. Wyjąć szczep A. rhizogenes K599 z zamrażarki o temperaturze -80 °C i aktywować bakterie na stałym podłożu LB (z 50 mg/l kanamycyny i 50 mg/l streptomycyny) w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.
      2. Wybierz pojedynczy klon szczepu K599 i hoduj go w 1 ml płynnej pożywki LB zawierającej antybiotyk przez 12 godzin.
      3. Równomiernie rozprowadzić 500 μl zawiesiny bakteryjnej na stałym podłożu LB zawierającym antybiotyk, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 24 godziny.

2. Jednoetapowa metoda transformacji owłosionego korzenia za pośrednictwem ryzogenów

  1. Nacięcie hipokotylu
    1. Po 7 dniach (zdefiniuj wysiew nasion jako dzień 0), sadzonki liścieni właśnie się rozwinęły (Rysunek 1A), użyj wysterylizowanego, ostrego skalpela, aby przeciąć około 0,5-1 cm hipokotylu (Rysunek 1B). Wyrzuć pierwotny korzeń i część częściowego hipokotylu.
      UWAGA: Używaj skalpela ostrożnie.
  2. Inokulacja K599
    1. Pokryj nacięcie hipokotylu bakteriami K599 (Rysunek 1C).
    2. Posadź sadzonki w wilgotnym wermikulicie (Rysunek 1D).
    3. Zainfekuj 30 roślin każdego gatunku poprzez transformację owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes. Podlej każdą roślinę 5 ml zawieszonej zawiesiny bakteryjnej K599 (OD600 = 0,5-0,6) w ćwiartce mocy (0,25x) pożywki podstawowej Gamborg B-5 (Rysunek 1E).
    4. Przykryj doniczki wysoce przezroczystą plastikową torbą (Rysunek 1F) i umieść je w komorze wzrostowej.

3. Produkcja owłosionych korzeni

  1. Uprawiaj rośliny przez ~ 12 dni po inokulacji, nowe owłosione korzenie zostaną wywołane i wygenerowane w miejscu nacięcia. Po 15 dniach owłosiona długość korzenia zwykle osiąga 2-5 cm (Ryc. 2).
  2. Aby ustalić, czy wytworzone owłosione korzenie są transgeniczne, zbadaj ekspresję genów reporterowych zależnych od przekształconego wektora w K599.
    1. Wykryj ekspresję genu reporterowego DsRed2 za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego z zielonym światłem wzbudzenia przy 540 nm i emisją przy 600 nm (Rysunek 2B, Rysunek 2D i Rysunek 2F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoce efektywna, jednoetapowa transformacja owłosionego korzenia za pośrednictwem A. rhizogenes
Owłosione korzenie wyprodukowano w miejscu nacięcia hipokotylu 12 dni po inokulacji zmodyfikowanym K599. Transgeniczne korzenie owłosione określono na podstawie ekspresji genu reporterowego zawartego w wektorze binarnym. Transgeniczne korzenie przekształcone genem reporterowym DsRed2 złożonej dzikiej soi, S. americanum i dyni obserwowano pod naturalnymi (Rysu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednoetapowa metoda owłosionych korzeni za pośrednictwem A. rhizogenes jest prostszą i bardziej wydajną metodą wytwarzania roślin kompozytowych niż metoda iniekcji hipokotylowej. Jednoetapowa metoda ARM znacznie poprawia efektywność transformacji owłosionych korzeni, skraca czas wytwarzania owłosionych korzeni, zwiększa liczbę owłosionych cebulek, a także zmniejsza ilość związanego z tym nakładu pracy. Ulepszony protokół transformacji jest optymalny do badań nad symbiozami między roślinami strączkowymi a ryzobia...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundusz Badawczy Uniwersytetu Liaocheng (318012028) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Shandong (ZR2020MC034).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
kanamycinSangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.
LB mediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
plastikowe pudełkoLiaoSu8 cm x 11 cm x 9 cm
dynialokalna odmiana Yinsu
streptomycynaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610494 
Tanon-5200Multi machineTanon Co., Ltd., Chiny5200Multisystem obrazowania chemiluminescencyjnego
lokalna odmianaDzika
zebrana w hrabstwie Yanggu, Liaocheng, Chiny
A506636B540113 pomidora soja Zhongshu4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
  2. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
  3. Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
  4. Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062(2022).
  5. Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428(2022).
  6. Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802(2020).
  7. Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
  8. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).
  9. Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
  10. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
  11. Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34(2018).
  12. Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131(2020).
  13. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
  14. Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208(2020).
  15. Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94(2020).
  16. Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
  17. Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905(2023).
  18. Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hairy Root TransformationAgrobacterium RhizogenesComposite PlantsOne Step TransformationHypocotyl InjectionTransgenic RootsRoot Gene FunctionPlant Metabolic EngineeringReporter Gene ExpressionRhizosphere Microorganisms

Related Articles