Ilościowa szybka diagnostyka zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki oparta na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)

H. pylori to spiralna, wysoce ruchliwa, Gram-ujemna bakteria, która żyje głównie w okolicy odźwiernika żołądka¹. Jest to powszechny patogen, który infekuje prawie 50% światowej populacji². Większość osób z zakażeniem H. pylori nie ma żadnych objawów klinicznych, a większość z nich rozwija różne choroby po kilku latach infekcji, w tym przewlekłe zapalenie żołądka, wrzody trawienne, wrzody żołądka i rak żołądka³. W kilku badaniach opartych na różnych populacjach wykazano skuteczność eliminacji H. pylori w zapobieganiu rakowi żołądka i zmianom przedrakowym^4,5. Dlatego Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) zaleciła eradykację H. pylori jako środek zapobiegawczy⁶.

Użycie nieinwazyjnych metod do identyfikacji infekcji H. pylori jest kluczowym elementem leczenia dla większości osób z bezobjawową niestrawnością. Mocznikowy test oddechowy (UBT), test antygenu kałowego H. pylori (SAT) i testy serologiczne są popularnymi technikami nieinwazyjnymi. Wśród nich UBT jest najmniej inwazyjną i najdokładniejszą dostępną procedurą. UBT wykorzystuje ureazę, obficie obecną w H. pylori, do hydrolizy znakowanego izotopowo mocznika do amoniaku i dwutlenku węgla (13C lub 14C). W przeciwieństwie do tego, test immunochromatograficzny (ICA)⁷ jest wygodny, prosty i nieinwazyjny do pobierania próbek. Jednak na dokładność testu ma wpływ kilka czynników, takich jak jakość próbki kału, temperatura i odstęp czasu między pobraniem próbki a badaniem. Innym testem opartym na odpowiedzi immunologicznej jest test na przeciwciała H. pylori w surowicy, który wykrywa przeciwciała w surowicy pacjenta. Jednak ten test nie nadaje się do analizy po leczeniu, ponieważ przeciwciała pozostają długo po usunięciu bakterii⁸. Inną poważną wadą jest to, że metody te diagnozują jedynie zakażenie H. pylori i nie pozwalają na badanie oporności na leki, które mogłoby kierować leczeniem opartym na wrażliwości.

Dla metod badań inwazyjnych, tkanka biopsji żołądka musi być pobrana za pomocą endoskopii, a następnie poddana histologii, szybkiemu testowi ureazy i hodowli bakteryjnej. Te metody testowania są również bardzo ograniczone ze względu na kilka czynników. Obecnie techniki te są ograniczone do pacjentów w podeszłym wieku, pacjentów z wysokim ryzykiem choroby przedrakowej lub nowotworowej oraz pacjentów, u których nie powiodła się terapia pierwszego rzutu z powodu choroby refluksowej przełyku lub zakażenia H. pylori⁹. Po drugie, ze względu na unikalne cechy wzrostu H. pylori, wskaźnik sukcesu hodowli bakteryjnej osiąga tylko 50%¹⁰. W związku z tym metody wykrywania molekularnego dają nową nadzieję na sprostanie wysokim wymaganiom inwazyjnych metod wykrywania i ukierunkowanie leczenia opartego na czułości. Wśród metod wykrywania molekularnego, ilościowy PCR ogromnie się rozwinął w ostatnich latach. qPCR, w przeciwieństwie do tradycyjnego PCR, nie wymaga elektroforezy żelowej i dokładnie określa ilościowo DNA/RNA w próbkach poprzez dodanie starterów i sond na etapie wyżarzania. Zestawy qPCR do wykrywania zakażenia H. pylori i lekooporności są już dostępne na rynku. Niemniej jednak każda metoda ma swoje ograniczenia; Dlatego rozpoznanie kliniczne i leczenie pacjenta należy rozpatrywać w połączeniu z jego objawami, objawami, historią, innymi badaniami laboratoryjnymi i odpowiedzią na leczenie.

Obecnie podstawową metodą leczenia zakażeń H. pylori jest przyjmowanie antybiotyków, ale ostatnio coraz trudniej jest leczyć te infekcje ze względu na wzrost oporności na antybiotyki. W związku z tym na całym świecie zaobserwowano znaczny spadek skuteczności leczenia H. pylori, co sprawia, że eradykacja H. pylori jest poważnym problemem zdrowia publicznego¹¹.

Klarytromycyna i lewofloksacyna to dwa antybiotyki o szerokim spektrum działania stosowane w leczeniu infekcji wywołanych przez H.pylori, ale kilka badań wykazało powszechną oporność na te dwa leki w izolatach H.pylori. A2143G, A2142G i A2142C to trzy z licznych mutacji punktowych występujących w genie 2,9 kb 23S rRNA, które powodują oporność na klarytromycynę, zapobiegając wiązaniu makrolidów. Jednocześnie loci mutacji genu oporności na lewofloksacynę są zlokalizowane głównie w sześciu miejscach mutacji (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) genu gyrA¹². Odkrycie tych mechanizmów oporności opartych na mutacjach genetycznych doprowadziło do stopniowego przesunięcia w wykrywaniu H. pylori poprzez badania kulturowe do testów molekularnych.

Ogólnie rzecz biorąc, istnieje pilna kliniczna potrzeba nieinwazyjnej, skutecznej i jednoczesnej metody diagnostycznej do wykrywania infekcji H. pylori i oporności na leki. Przyjęliśmy połączony test strunowy i metodę qPCR, aby przezwyciężyć trudności związane z pobieraniem próbek i osiągnąć cel, jakim jest jednoczesne wykrywanie infekcji H. pylori i oporności na leki przy użyciu różnych sond starterowych.

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi ustalonymi przez komisję etyczną Szpitala Ludowego Prowincji Guangdong, Południowy Uniwersytet Medyczny, Guangzhou, Chiny (Numer zatwierdzenia: KY-Q-2022-384-02). Do badania włączono pacjentów w wieku 18-60 lat. Pacjenci przyjmujący antybiotyki, przeciwbakteryjne leki chińskie, leki takie jak inhibitory pompy protonowej (PPI) lub antagoniści receptora_H2 itp., w ciągu 2 tygodni przed badaniem, nie zostali włączeni do tego badania. Pacjenci, którzy byli leczeni przeciwko H. pylori w ciągu ostatnich 3 miesięcy, również zostali wykluczeni z tego badania. Osoby z poważnymi problemami z sercem, wątrobą, nerkami, ciężką neuropatią lub chorobami psychicznymi również nie zostały dopuszczone do udziału w tym badaniu. W badaniu nie uwzględniono kobiet w ciąży i matek karmiących. Szczegółowe informacje na temat materiałów eksploatacyjnych (odczynników, chemikaliów, sprzętu i oprogramowania) użytych w tym badaniu podano w Tabeli Materiałów.

1. Test strunowy do pobierania próbek płynu żołądkowego

1. Poproś pacjenta, aby pościł przez noc przed pobraniem próbki.
2. Następnego dnia otwórz zestaw do testowania sznurków, weź kapsułkę i przytrzymaj pętlę na końcu sznurka.
3. Przyklej sznurek do policzka pacjenta i poproś, aby umieścił kapsułkę na języku w pobliżu tylnej części gardła i połknął ją, popijając łykiem wody.
4. Pozwól, aby kapsułka rozpuściła się w żołądku pacjenta, odsłaniając w ten sposób sznurek wewnątrz kapsułki do wchłonięcia śluzu żołądkowego.
5. Poproś przeszkolonego asystenta, aby ostrożnie wyciągnął sznurek 1 godzinę po połknięciu kapsułki przez pacjenta.
6. Odetnij dolny koniec sznurka (40 cm) nasączonego płynem żołądkowym, umieść go w roztworze konserwującym próbkę TSE (Tris/saline/EDTA), a następnie wyślij do laboratorium klinicznego w temperaturze pokojowej (RT) w celu późniejszego wykrycia H. pylori i określenia profili oporności na antybiotyki za pomocą qPCR.

2. Ekstrakcja DNA

1. Umieść probówki do pobierania próbek na stojaku na probówki, odpowiednio oznaczone, i wiruj je przez 10 sekund.
2. Kilkakrotnie obróć 32-dołkową płytkę (zestaw do ekstrakcji lub oczyszczania kwasów nukleinowych) do góry nogami, aby ponownie zawiesić kulki magnetyczne. Po krótkim wirze przez 10 s ostrożnie zdejmij uszczelkę z folii aluminiowej z płyty.
3. Przenieść 200 μl płynu żołądkowego z każdej próbki i DNA H. pylori jako kontrolę pozytywną do oddzielnych studzienek.
4. Umieść 32-dołkową płytkę w odpowiednim gnieździe próbki w maszynie do ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu automatycznej ekstrakcji DNA.
5. Po ekstrakcji DNA i potwierdzeniu należy rozpocząć badanie oporności na antybiotyki dla klarytromycyny i lewofloksacyny poprzez qPCR na próbkach dodatnich.
6. Nadmiar płynu żołądkowego i wyekstrahowane próbki DNA należy umieścić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania i wykorzystania w przyszłości.
7. Wykonaj wszystkie te czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.

3. qPCR do wykrywania H. pylori i oporności na antybiotyki (klarytromycyna i lewofloksacyna)

1. Wykonaj qPCR w celu wykrycia H. pylori i podejrzewanych mutacji oporności na antybiotyki w jego genomie.
   1. Rozmrozić mieszaninę reakcyjną qPCR (zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori) na lodzie i wymieszać ją, trzepiąc i obracając, aby zapobiec utracie odczynnika.
   2. Dla każdej próbki na 32-dołkowej płytce wymieszać 20 μl mieszaniny reakcyjnej PCR (premiks reakcji genotypowania [zawierający enzym Taq, trifosforan deoksyrybonukleozydu, bufor reakcyjny i chlorek magnezu] ze starterami mocznika do przodu i do tyłu oraz sondą mocznikowo-a) i 5 μl wyekstrahowanego DNA.
   3. Uruchom 32-dołkową płytkę qPCR na maszynie qPCR. Zaprogramować termocykler: mieszanina reakcyjna będzie najpierw reagowała sekwencyjnie w temperaturze 42 °C i 95 °C (obie dla jednego cyklu) przez 2 minuty każdy; następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C, denaturacja przez 10 s oraz wyżarzanie i wydłużanie w temperaturze 58 °C przez 45 s.
   4. Ustaw akwizycję sygnału fluorescencji na FAM (H. pylori), a akwizycję danych na okres przedłużenia wzmocnienia. Po zakończeniu reakcji zapisz dane do przyszłej analizy wyników.
   5. Analizuj dane za pomocą specjalnego oprogramowania do qPCR, ponieważ przyrząd automatycznie wybierze progi linii bazowej.
   6. Jeśli wynik testu na obecność H. pylori jest pozytywny, maszyna automatycznie rozpocznie badanie oporności na leki na próbce. Zastąp zestaw odczynników odczynnikami do wykrywania mutacji genu 23S rRNA i genu gyrA w zestawie H. Pylori (qPCR).
      UWAGA: Zestaw odczynników (odczynniki wykrywające mutacje genu 23S rRNA i genu gyrA w Helicobacter pylori [qPCR]) zawiera mieszaninę reakcyjną PCR (premiks reakcji genotypowania [zawierający enzym Taq, trifosforan dezoksyrybonukleozydu, bufor reakcyjny, chlorek magnezu], startery i sondy). Wszystkie produkty negatywnej kontroli jakości to sterylna, oczyszczona woda. Produktem pozytywnej kontroli jakości w zestawie do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori są inaktywowane standardowe kulki H. pylori (ATCC 43504). Silnie dodatnie i słabo dodatnie produkty kontroli jakości H. pylori w zestawie (odczynniki do wykrywania mutacji genu 23S rRNA i genu gyrA u H. pylori) to DNA inaktywowanego szczepu H. pylori zawierającego gen docelowy i gen zmutowany. Podobnie, w oparciu o rzeczywistą sytuację, wszystkie standardy diagnostyczne, w tym obecność zakażenia H. pylori lub oporności na leki, są ustawione na CT ≤ 35 i mają typową krzywą w kształcie litery S. Stężenie słabej kontroli jakości wynosi 1,0 x 10³ kopii/ml, podczas gdy stężenie silnej kontroli jakości wynosi 1,0 x 10⁸ kopii/ml.

Wykrycie zakażenia H. pylori i oporności na antybiotyki w płynie żołądkowym za pomocą qPCR
Przeprowadziliśmy qPCR w celu wykrycia zakażenia H. pylori poprzez amplifikację genu ureA i określiliśmy jego profil oporności na antybiotyki, celując w mutacje punktowe w genie 23S rRNA i genie gyrA (Tabela 1). Wartości CT kontroli jakości we wszystkich trzech grupach eksperymentów qPCR mieściły się w zalecanym zakresie, co wskazuje, że wszystkie próbki były w normalnym stanie w czasie eksperymentu, a wyniki testów były wiarygodne. W tym badaniu wybrano pięć próbek o różnych wynikach testów (S1-S5) w celu scharakteryzowania wiarygodności protokołu eksperymentalnego. S1 reprezentuje reprezentatywny szczep H. pylori bez infekcji, podczas gdy próbki S2-S5 to próbki zakażone H. pylori z różnymi wynikami oporności (Rysunek 1). Ustawiliśmy system tak, aby nie wykonywał dalszych testów odporności na próbkach niezakażonych H. pylori, więc próbka S1 nie została poddana testowi odporności po tym, jak test systemu wykazał negatywny wynik na obecność H. pylori. Jeśli chodzi o próbki dodatnie pod kątem zakażenia H. pylori, wszystkie wartości S2 CT mieściły się w zakresie wykrywalności, co wskazuje, że próbka była dodatnia pod względem H. pylori i wykazywała podwójną oporność na klarytromycynę i lewofloksacynę, a klinicystom zalecono wybór innych metod leczenia według własnego uznania. Wartości S3 CT mieściły się w zakresie wykrywalności zakażenia H. pylori i testu oporności na lewofloksacynę, podczas gdy w teście oporności na klarytromycynę nie wykryto żadnych wartości CT, co wskazuje, że próbka S3 pochodziła od pacjenta opornego na lewofloksacynę. Podobnie, wartość CT próbki S4 mieściła się w zakresie wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na klarytromycynę, podczas gdy nie wykryto wartości CT dla oporności na lewofloksacynę, co wskazuje, że ten pacjent był oporny na klarytromycynę i zalecono przyjmowanie lewofloksacyny w celu leczenia. Wreszcie, test próbki S5 wykazał wartości CT w zakresie wykrywania tylko do wykrywania zakażenia H. pylori, co wskazuje, że ten pacjent był wrażliwy na oba antybiotyki i mógł być leczony przy użyciu jednego z dwóch leków. W porównaniu z metodą hodowli bakteryjnej, która również wykrywa zakażenie H. pylori i oporność na leki, metoda ta jest bezpieczna i skuteczna w wykrywaniu zakażenia H. pylori i oporności na leki bez powodowania szkód u pacjenta i może być stosowana jako pomoc lekarzowi w sformułowaniu odpowiedniego planu leczenia.

Rysunek 1: Wykrywanie H. pylori i jego oporności na antybiotyki w płynie żołądkowym za pomocą qPCR.
(A) Ilościowa amplifikacja PCR zakażenia H. pylori, (B) wykrywanie oporności na klarytromycynę oraz (C) wykrywanie oporności na lewofloksacynę. "S" oznacza próbkę. "S1" to próbka, która dała wynik ujemny w kierunku zakażenia H. pylori i została również przebadana pod kątem oporności na antybiotyki; »S2« jest próbką zakażoną H. pylori i oporną zarówno na klarytromycynę, jak i na lewofloksacynę; »S3« jest również próbką dodatnią pod względem H. pylori, ale jest wrażliwa na klarytromycynę i odporna na lewofloksacynę; »S4« jest również próbką dodatnią pod względem H. pylori, ale jest oporna na klarytromycynę i podatna na lewofloksacynę; "S5" jest próbką dodatnią dla H. pylori, ale jest wrażliwa zarówno na klarytromycynę, jak i lewofloksacynę. Stężenie słabej kontroli jakości wynosi 1,0 x 103 kopii/ml, podczas gdy stężenie silnej kontroli jakości wynosi 1,0 x 108 kopii/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Tabela przedstawiająca wyniki qPCR wykrywania zakażenia H. pylori i odporności na klarytromycynę i lewofloksacynę. W tabeli przedstawiono wyniki jakościowe dotyczące zakażenia H. pylori, wykrycia mutacji genu 23S rRNA wskazujących na oporność izolatu na klarytromycynę oraz wykrycia mutacji genu gyrA wskazujących, że izolat jest oporny na lewofloksacynę. +/−, wynik jakościowy; +, wynik pozytywny; −, wynik negatywny.

Żaden.