Artykuł metodologiczny

Szybka diagnostyka reakcji łańcuchowej opartej na ilościowej reakcji polimerazy (qPCR) w przypadku zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65689

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Division of Microbiology and Immunology, School of Biomedical Sciences, The University of Western Australia, 3Center for Precision Health, School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 4Medical Technology School of Xuzhou Medical University, 5Marshall Laboratory of Biomedical Engineering, School of Medicine, Shenzhen University, 6The Marshall Centre for Infectious Diseases Research and Training, The University of Western Australia, 7Marshall International Digestive Diseases Hospital, Zhengzhou University, 8Marshall Medical Research Center, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia nieinwazyjną metodę szybkiego diagnozowania zakażeń żołądka Helicobacter pylori za pomocą testu sznurkowego oraz określa jego oporność antybiotykową na klarytromycynę i lewofloksacynę za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR).

Streszczenie

Helicobacter pylori to poważny patogen ludzki, który zaraża około połowy światowej populacji i staje się poważnym zagrożeniem dla zdrowia z powodu rosnącej oporności na antybiotyki. Jest czynnikiem powodującym przewlekłe aktywne zapalenie żołądka, owrzodzenia żołądka oraz raka żołądka i został sklasyfikowany jako rakotwórczy z grupy I przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem. Dlatego szybka i dokładna diagnoza H. pylori oraz określenie jego oporności na antybiotyki są ważne dla skutecznej eliminacji tego patogenu bakteryjnego. Obecnie metody diagnostyczne H. pylori obejmują głównie test oddechowy z mocznika (UBT), test antygenowy, test na przeciwciała w surowici, gastroskopię, szybki test ureazy (RUT) oraz hodowlę bakteryjną. Spośród nich pierwsze trzy metody wykrywania są nieinwazyjne, co oznacza, że są łatwe do przeprowadzenia testów. Jednak bakterii nie da się odzyskać tymi technikami; dlatego nie można przeprowadzić testów na oporność na leki. Ostatnie trzy badania są inwazyjne, ale kosztowne, wymagają wysokich umiejętności i mogą wyrządzić szkody pacjentom. Dlatego nieinwazyjna, szybka i jednoczesna metoda wykrywania H. pylori oraz testów odporności na leki jest bardzo ważna dla efektywnej eradykacji H. pylori w praktyce klinicznej. Protokół ten ma na celu przedstawienie konkretnej procedury obejmującej test sznurka w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR) w celu szybkiego wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na antybiotyki. W przeciwieństwie do hodowli bakteryjnych, ta metoda umożliwia łatwą, szybką i nieinwazyjną diagnozę stanu zakażenia H. pylori oraz oporności na leki. Konkretnie, użyliśmy qPCR do wykrywania rea dla zakażenia H. pylori oraz mutacji w genach 23S rRNA i gyrA , które kodują oporność na klarytromycynę i lewofloksacynę. W porównaniu z rutynowo stosowanymi technikami hodowlania, protokół ten zapewnia nieinwazyjną, niskokosztową i oszczędzającą czas metodę wykrywania zakażenia H. pylori oraz określania jej oporności na antybiotyki za pomocą qPCR.

Wprowadzenie

H. pylori to spiralna, wysoce ruchoma, Gram-ujemna bakteria, która głównie żyje w okolicy odźwiernika żołądka1. Jest to powszechny patogen, który zakaża prawie 50% światowej populacji2. Większość osób z zakażeniem H. pylori nie ma objawów klinicznych i większość rozwija inne choroby po kilku latach infekcji, w tym przewlekłe zapalenie żołądka, wrzody żołądka, wrzody żołądka oraz raka żołądka3. W kilku badaniach obejmujących różne populacje wykazano skuteczność eliminacji H. pylori w zapobieganiu rakowi żołądka i zmianom przedrakowym 4,5. Dlatego Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) zaleciła eradykację H. pylori jako środek zapobiegawczynr 6.

Stosowanie nieinwazyjnych metod do wykrywania zakażenia H. pylori jest kluczowym elementem leczenia u większości osób z bezobjawową dyspepsją. Test na mocznik (UBT), test antygenowy na kał H. pylori (SAT) oraz testy serologiczne to popularne techniki nieinwazyjne. Spośród nich UBT jest najmniej inwazyjną i najdokładniejszą dostępną procedurą. UBT wykorzystuje ureazę, obficie obecną w H. pylori, do hydrolizy izotopowo oznakowanego mocznika na amoniak i dwutlenek węgla (13C lub 14C). Natomiast test immunochromatograficzny (ICA)7 jest wygodny, prosty i nieinwazyjny do pobierania próbek. Jednak na dokładność testu wpływa kilka czynników, takich jak jakość próbki kału, temperatura oraz odstęp między pobraniem próbki a testem. Innym testem opartym na odpowiedzi immunologicznej jest test przeciwciał w surowicy H. pylori , który wykrywa przeciwciała w surowicy pacjenta. Jednak ten test nie nadaje się do analizy po leczeniu, ponieważ przeciwciała pozostają długo po usunięciu bakterii8. Kolejną poważną wadą jest to, że te metody diagnozują jedynie zakażenie H. pylori i nie pozwalają na testy oporności na leki, które mogłyby wskazać leczenie oparte na wrażliwości.

W przypadku inwazyjnych metod testowania tkanka biopsji żołądka musi być pobrana gastroskopią, a następnie poddana histologii, szybkiemu testowi urease'u oraz hodowli bakteryjnej. Metody testowania są również bardzo ograniczone z powodu kilku czynników. Obecnie techniki te są ograniczone do pacjentów starszych, pacjentów o wysokim ryzyku choroby przednowotworowej lub złośliwej oraz pacjentów, którzy nie poradzili sobie z leczeniem pierwszego rzutu w leczeniu choroby refluksowej przełyku lub zakażenia H. pylori 9. Po drugie, ze względu na unikalne cechy wzrostu H. pylori, skuteczność hodowli bakteryjnej sięga jedynie 50%10. Dlatego metody detekcji molekularnej dają nową nadzieję na pokonanie wysokich wymagań inwazyjnych metod detekcji i kierowanie leczeniem opartym na wrażliwości. Wśród metod detekcji molekularnej ilościowa PCR rozwinęła się w ostatnich latach ogromnie. qPCR, w przeciwieństwie do tradycyjnego PCR, nie wymaga elektroforezy żelowej i precyzyjnie ilościowo określa DNA/RNA w próbkach poprzez dodanie starterów i sond na etapie wyżarzania. Obecnie komercyjnie dostępne są zestawy qPCR do wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na leki. Niemniej jednak każda metoda ma swoje ograniczenia; Dlatego diagnoza kliniczna i leczenie pacjenta powinny być rozpatrywane w kontekście jego objawów, objawów, wypowiedzi, innych badań laboratoryjnych oraz reakcji na leczenie.

Obecnie główną metodą leczenia zakażeń H. pylori jest przyjmowanie antybiotyków, jednak ostatnio coraz trudniej jest leczyć te infekcje ze względu na wzrost oporności na antybiotyki. Następnie na całym świecie zaobserwowano znaczący spadek skuteczności leczenia H. pylori , co czyni eliminację H. pylori poważnym problemem zdrowia publicznego11.

Klarytromycyna i lewofloksacyna to dwa antybiotyki o szerokim spektrum stosowane w leczeniu infekcji wywołanych przez H. pylori, jednak kilka badań wykazało szeroką oporność na te dwa leki w izolatach H. pylori . A2143G, A2142G i A2142C to trzy z licznych punktowych mutacji występujących w genie 2,9 kb 23S rRNA, które powodują oporność na klarytromycynę poprzez uniemożliwienie wiązania makrolidów. Jednocześnie loci mutacji genu oporności na lewofloksacynę znajdują się głównie w sześciu miejscach mutacji (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) genu gyrA 12. Odkrycie tych mechanizmów oporności opartych na mutacjach genetycznych doprowadziło do stopniowego przesunięcia wykrywania H. pylori poprzez badania kulturowe na badania molekularne.

Ogólnie rzecz biorąc, istnieje pilna potrzeba klinicznej nieinwazyjnej, skutecznej i jednoczesnej metody diagnostycznej wykrywania zakażeń H. pylori oraz oporności na leki. Zastosowaliśmy połączenie testu łańcuchowego i metody qPCR, aby pokonać trudności w pobieraniu próbek i osiągnąć cel jednoczesnego wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na leki przy użyciu różnych sond zapalniczych.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonym przez komitet etyczny Szpitala Ludowego Prowincji Guangdong, Południowy Uniwersytet Medyczny, Guangzhou, Chiny (Numer zatwierdzenia: KY-Q-2022-384-02). W tym badaniu uwzględniono pacjentów w wieku od 18 do 60 lat. Pacjenci przyjmujący antybiotyki, antybakteryjne leki chińskie, takie jak inhibitory pompy protonowej (PPI) czy antagoniści receptorówH2 itp., w ciągu 2 tygodni przed testami, nie zostali uwzględnieni w tym badaniu. Pacjenci, którzy otrzymali leczenie H. pylori w ciągu ostatnich 3 miesięcy, również zostali wykluczeni z tego badania. Osoby z poważnymi problemami serca, wątroby, nerek, ciężką neuropatią lub chorobami psychicznymi również nie mogły uczestniczyć w tym badaniu. W badaniu nie uwzględniono kobiet w ciąży ani matek karmiących piersią. Szczegóły dotyczące materiałów (odczynników, chemikaliów, sprzętu i oprogramowania) używanych w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Test sznurka do pobierania płynu żołądkowego

  1. Poproś pacjenta o post przez noc przed pobraniem próbki.
  2. Następnego dnia otwórz zestaw testowy sznurka, weź kapsułkę i przytrzymaj pętlę na końcu sznurka.
  3. Przyklej sznurek do policzka pacjenta i poproś go, by położył kapsułkę na języku blisko tyłu gardła i połknął ją łykiem wody.
  4. Pozwól, by kapsułka rozpuściła się w żołądku pacjenta, odsłaniając w ten sposób sznurek w kapsule, aby wchłonął śluz żołądka.
  5. Poproś wykwalifikowanego asystenta, aby ostrożnie wyciągnął sznurek 1 godzinę po połknięciu kapsuły przez pacjenta.
  6. Odetnij dolny koniec sznurka (40 cm) nasączonego płynem żołądkowym, umieść go w roztworze do konserwacji próbek TSE (Tris/solanka/EDTA), a następnie wyślij do laboratorium klinicznego w temperaturze pokojowej (RT) w celu późniejszego wykrycia H. pylori i określenia profili oporności antybiotykowej za pomocą qPCR.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Umieść probówki do zbierania próbek na stojaku na stojaku z probówkami, odpowiednio oznaczone, i zacznij je wirować przez 10 sekund.
  2. Odwróć płytkę z 32 dołkami (zestaw do ekstrakcji lub oczyszczania kwasów nukleinowych) kilka razy, aby ponownie zawiesić kulki magnetyczne. Po krótkim cyklu wirującym przez 10 sekund ostrożnie usuń folię aluminiową z płyty.
  3. Przenieś 200 μL płynu żołądkowego z każdej próbki oraz DNA H. pylori jako dodatniej kontroli do oddzielnych dołków.
  4. Umieść płytkę 32-dołkową w odpowiednim szczelinie do próbki w maszynie do ekstrakcji kwasów nukleinowych, aby uzyskać automatyczną ekstrakcję DNA.
  5. Po ekstrakcji DNA i potwierdzeniu rozpocznij testy oporności na antybiotyki na klarytromycynę i lewofloksacynę za pomocą qPCR na pozytywnych próbkach.
  6. Umieść nadmiar płynu żołądkowego i pobrane próbki DNA w temperaturze −20 °C do długoterminowego przechowywania i przyszłego użytku.
  7. Wszystkie te kroki wykonuj w szafce bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć skażeń.

3. qPCR do wykrywania H. pylori i oporności na antybiotyki (klarytromycyna i lewofloksacyna)

  1. Wykonaj qPCR w celu wykrycia H. pylori oraz podejrzeń mutacji oporności na antybiotyki w jego genomie.
    1. Rozmroz mieszaninę reakcji qPCR (zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori ) na lodzie i mieszaj ją poprzez przekręcanie i obracanie, aby zapobiec utracie odczynnika.
    2. Dla każdej próbki na płytkach z 32 dołkami wymieszaj 20 μL mieszaniny reakcji PCR (premix reakcji genotypującej [zawierający enzym Taq, deoksyrybonukleozydowy trifosforan, bufor reakcji i chlorek magnezu], z zapalnikami przyprawowymi i wstecznymi oraz sondą moczowodu) oraz 5 μL wyodrębnionego DNA.
    3. Uruchom płytkę qPCR z 32 dołkami na maszynie qPCR. Zaprogramuj cykler termiczny: mieszanina reakcji będzie najpierw reagowana sekwencyjnie w temperaturach 42 °C i 95 °C (oba przez jeden cykl) przez 2 minuty każda; następnie 40 cykli w 95 °C, denaturacja przez 10 sekund oraz wyżarzanie i rozciąganie w 58 °C przez 45 sekund.
    4. Ustaw akwizycję sygnału fluorescencyjnego na FAM (H. pylori), a akwizycję danych na okres przedłużenia wzmacniania. Po zakończeniu reakcji zachowaj dane do przyszłej analizy wyników.
    5. Analizuj dane za pomocą specjalistycznego oprogramowania qPCR, ponieważ instrument automatycznie wybierze progi wyjściowe.
    6. Jeśli wynik testu na H. pylori jest pozytywny, urządzenie automatycznie rozpocznie testy oporności na leki na próbce. Zamień zestaw odczynników na odczynniki wykrywające mutacje genu 23S rRNA oraz gyrA w zestawie H. pylori (qPCR).
      UWAGA: Zestaw odczynników (odczynniki wykrywające mutacje genu 23S rRNA i genu gyrA w Helicobacter pylori [qPCR]) zawiera mieszaninę reakcji PCR (premix reakcji genotypującej [zawierający enzym Taq, deoksyrybonukleozyd, bufor reakcji, chlorek magnezu], spaliwa i sondy). Wszystkie produkty do kontroli negatywnej jakości to sterylna, oczyszczona woda. Produktem pozytywnej kontroli jakości w zestawie do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori są inaktywowane standardowe kulki H. pylori (ATCC 43504). Silne produkty kontroli jakości z H. pylori, plus i słabe pozytywne, w zestawie (odczynniki wykrywające mutacje genu 23S rRNA i genu gyrA w H. pylori) to DNA inaktywowanego szczepu H. pylori , zawierające gen docelowy oraz gen mutanta. Podobnie, w zależności od rzeczywistej sytuacji, wszystkie standardy diagnostyczne, w tym obecność zakażenia H. pylori lub oporności na leki, są ustawione na tomografię ≤ 35 i mają typową krzywą w kształcie litery S. Stężenie słabej kontroli jakości wynosi 1,0 x 103 kopie/mL, natomiast stężenie silnej kontroli jakości to 1,0 x 108 kopii /mL.

Wyniki

Wykrywanie zakażenia H. pylori i oporności na antybiotyki w płynie żołądkowym za pomocą qPCR
Wykonaliśmy qPCR w celu wykrycia zakażenia H. pylori poprzez amplifikację genu moczowodziecowego A oraz określiliśmy jego profil oporności na antybiotyki, celując w punktowe mutacje w genie 23S rRNA i genie gyrA (Tabela 1). Wartości kontroli jakości CT we wszystkich trzech grupach eksperymentów qPCR mieściły się w zalecanym zakresie, co wskazywało, że próbki były w stanie prawidłowym w momencie eksperymentu i że wyniki testu były wiarygodne. W tym badaniu wybrano pięć próbek o różnych wynikach testów (S1-S5), aby scharakteryzować wiarygodność protokołu eksperymentalnego. S1 reprezentuje reprezentatywny szczep H. pylori bez infekcji, natomiast próbki S2-S5 to te zakażone H. pylori o różnych wynikach oporności (Rysunek 1). Ustawiliśmy system tak, aby nie przeprowadzał dalszych testów oporności na próbkach niezainfekowanych H. pylori, więc próbka S1 nie weszła do testu oporności po tym, jak test systemowy wykazał wynik negatywny na H. pylori. Jeśli chodzi o próbki pozytywne na zakażenie H. pylori , wartości tomografii komputerowej S2 mieściły się w zakresie wykrywalności, co wskazywało, że próbka była dodatnia na H. pylori i wykazywała podwójną oporność na klarytromycynę i lewofloksacynę, a klinicystom zalecono wybór innych metod leczenia według własnego uznania. Wartości tomografii komputerowej S3 mieszczą się w zakresie wykrywania zakażenia H. pylori oraz testu oporności na lewofloksacynę, natomiast w teście oporności na klarytromicynę nie wykryto wartości tomografii komputerowej, co wskazuje, że próbka S3 pochodziła od pacjenta opornego na lewofloksacynę. Podobnie wartość tomografii próbki S4 mieściła się w zakresie wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na klarytromicynę, natomiast nie wykryto wartości tomografii oporności na lewofloksacynę, co wskazuje na oporność pacjenta na klarytromycynę, i zalecano przyjmowanie lewotloksacyny w leczeniu. Wreszcie, badanie próbki S5 wykazało wartości tomografii komputerowej mieszczące się w zakresie wykrywania tylko dla zakażenia H. pylori , co wskazuje, że pacjent jest wrażliwy na oba antybiotyki i można go leczyć jednym z tych leków. W porównaniu z metodą hodowli bakteryjnej, która również wykrywa zakażenie H. pylori i oporność na leki, ta metoda jest bezpieczna i skuteczna w wykrywaniu zakażenia H. pylori oraz oporności na leki bez wyrządzania szkód pacjentowi, a także może służyć lekarzowi do opracowania odpowiedniego planu leczenia.

figure-results-1
Rysunek 1: Wykrywanie H. pylori i jego oporności na antybiotyki w płynie żołądkowym za pomocą qPCR.
(A) ilościowe wzmocnienie PCR zakażenia H. pylori, (B) wykrycie oporności na klarytromicynę oraz (C) wykrycie oporności na lewofloksaczynę. "S" oznacza próbkę. "S1" to próbka, która wyszła negatywnie na zakażenie H. pylori i była również testowana na oporność antybiotykową; "S2" to próbka zakażona H. pylori, odporna zarówno na klarytromicynę, jak i levofloksacynę; "S3" również jest próbką dodatnią na H. pylori, ale jest podatna na klarytromycynę i lewofloksacynę; "S4" jest również próbką dodatnią na H. pylori, ale jest oporna na klarytrycynę i podatna na lewofloksacynę; "S5" to próbka dodatnia z H. pylori, ale podatna zarówno na klarytromicynę, jak i lewofloksacynę. Stężenie słabej kontroli jakości wynosi 1,0 x 103 kopie/mL, natomiast stężenie silnej kontroli jakości to 1,0 x 108 kopii/mL. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

PrzykładH. pyloriKlarytromycynaLewofloksacyna
+/-CT+/-CT+/-CT
S1-U-U-U
S2+22.61+22.77+23
S3+28.32-U+30.18
Sezon 4+28.76+27.67-U
Sezon 5+31.59-U-U

Tabela 1: Tabela pokazująca wyniki qPCR wykrywania zakażenia H. pylori oraz oporności na klarytromycynę i levofloksacynę. Ta tabela przedstawia jakościowe wyniki dla zakażenia H. pylori , wykrycia mutacji genu 23S rRNA wykazujących oporność izolatu na klarytromicynę oraz wykrycia mutacji genu gyrA wykazujących oporność izolatu na lewofloksacynę. +/−, wynik jakościowy; +, wynik pozytywny; −, wynik negatywny.

Dyskusja

Wykrywanie H. pylori można przeprowadzić zarówno metodami inwazyjnymi, jak i nieinwazyjnymi13. Powszechnie stosowane techniki inwazyjne, takie jak histopatologia, szybki test ureazy, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) oraz hodowla bakterii, wymagają gastroskopii i biopsji. Testy serologiczne, testy oddechowe z mocznika oraz enzymatyczne testy immunosorbentne (ELISA) są zalecane wśród nieinwazyjnych procedur14. Chociaż metody nieinwazyjne są łatwe do wykonania, ekonomiczne i wygodniejsze dla pacjentów, izolacja i hodowla H. pylori w celu przeprowadzenia dodatkowych badań, takich jak identyfikacja szczepów czy testy podatności na antybiotyki, wymagają testów inwazyjnych. Wraz ze wzrostem oporności na antybiotyki, wcześniej stosowane antybiotyki stają się nieskuteczne, a tym samym nie leczą infekcji wywołanych izolatami opornymi na leki H. pylori. W takim przypadku może być konieczne pobranie H. pylori w celu przeprowadzenia testów podatności na antybiotyki, aby wybrać antybiotyki, które najprawdopodobniej skutecznie eliminują bakterie oporne.

Rutynowo przeprowadzane testy podatności oparte na hodowli, takie jak metoda rozcieńczania agaru czy test Epsilometr (E-test), mają kilka ograniczeń: są czasochłonne, ponieważ H. pylori jest wolno rosnącą bakterią, kosztowną, wymagającą umiejętności i wymagającą inwazyjnych technik. Alternatywnie różne techniki molekularne, takie jak techniki fluorescencji in situ (FISH) oraz qPCR, mogą być stosowane do identyfikacji kilku mutacji, na przykład w genie 23S rRNA, który koduje odporność na klarytromycynę15,16. Wybrano trzy punktowe miejsca mutacji (A2142G, A2143G, A2142C) genu oporności na rRNA 23S H. pylori oraz sześciopunktowe miejsca mutacji (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) genu odporności na gyrA antybiotyków chinolonowych, aby zaprojektować startery i sondy w celu określenia oporności na klarytromicycynę i levofloksacynę odpowiednio.

Test sznurka, który wywodzi się z testu ENTEO-TEST, wykorzystuje kapsułkę przymocowaną do wysoce chłonącego nylonowego sznurka, który jest połykany, aby zebrać wydzieliny żołądkowe17. Obecnie testy sznurkowe są stosowane do diagnozowania gruźlicy18, do odróżnienia wysoce zjadliwej Klebsiella pneumoniae (hvKp) od tradycyjnej Klebsiella pneumoniae19, identyfikacji bakterii i drożdży Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz do diagnozowania H. pylori na podstawie płynu żołądkowego20. W tym badaniu połączyliśmy test strunowy, technikę minimalnie inwazyjną, z qPCR do identyfikacji zakażeń H. pylori w środowisku klinicznym oraz przeprowadziliśmy testy podatności, celując w wcześniej zgłaszane mutacje kodujące odporność w genomie H. pylori . Wybraliśmy gen ureA , ponieważ jest to gen domowy unikalny dla H. pylori , bez ryzyka reakcji krzyżowej z innymi organizmami. Wszystkie izolaty H. pylori muszą posiadać gen moczowodu , aby przetrwać w ludzkim żołądku, a eksperymenty nokautujące wykazały, że H. pylori bez genu moczowodziecznika nie ma zdolności kolonizacji w żołądku.

W przypadku qPCR standardy kontroli jakości są niezwykle ważne. W wykrywaniu qPCR H. pylori wymagania standardów kontroli jakości są następujące: ujemny produkt kontroli jakości (brak wzrostu sygnału fluorescencyjnego w ścieżce detekcji FAM, brak typowej krzywej amplifikacji typu S, wartość CT > 35,00 lub brak oczywistego sygnału); dodatni produkt kontroli jakości (krzywa wzrostu sygnału fluorescencyjnego szlaku wykrywania FAM pokazująca krzywą w kształcie litery S, wartość CT ≤ 35,00), a powyższe wymagania muszą być spełnione jednocześnie; w przeciwnym razie test zostanie uznany za nieważny i będzie musiał być przeprowadzony ponownie. Ponadto, dla wykrywania oporności H. pylori na antybiotyki (klarytromycyna i lewofloksacyna) w qPCR, z wyjątkiem wartości CT rozróżniającej wyniki pozytywne i ujemne, która zmienia się na 30,00 dla wykrywania oporności, pozostałe wymagania są takie same jak powyżej. Co istotne, informacje o sekwencji dotyczących zapalników i sond nie są dostępne w tym artykule, ponieważ dotyczą praw własności komercyjnej.

Aby wybrać bardziej efektywne antybiotyki dla każdego pacjenta, kluczowe jest przeanalizowanie lokalnej częstości występowania H. pylori oraz jego profilu oporności na antybiotyki ze względu na wzrost oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe na świecie, a dodatkowo ze względu na zróżnicowanie wzorców oporności między różnymi obszarami geograficznymi. Głównym ograniczeniem naszego badania jest bardzo mały rozmiar próby i nie obejmujący różnych regionów geograficznych Chin, aby pokazać częstość występowania zakażenia H. pylori oraz jej pełny profil oporności na antybiotyki, ale technika testu sznurkowego jest dobrze rozwinięta, a łącząc ją z qPCR, uzyskaliśmy jednoczesną diagnozę H. pylori wykrywanie infekcji i oporności na leki. Wyniki te sugerują, że to podejście mogłoby być stosowane na większą skalę w różnych regionach świata.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Projekt Sanming of Medicine w Shenzhen (grant nr SZSM201510050) oraz Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant nr 2022A1515220023). Fundacja Badawcza na rzecz Zaawansowanych Talentów Ludowego Szpitala Prowincjonalnego Guandong (nr KJ012021097) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81871734, 82072380, 82272423). Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu i analizie danych, decyzji o publikacji ani w przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do wykrywania mutacji w punktach genów 23S rRNA i gyrA (sondowanie PCR-fluorescencyjne)Hongmed InfagenWykrywanie oporności Helicobacter pylori na klarytromycynę i lewofloksacynę
ABI 7500 fluorescencyjna ilościowa maszyna PCRThermo Fisher ScientificSEDA 20163220767Ilościowe wzmacnianie PCR fluorescencyjne
Oprogramowanie ABI 7500Thermo Fisher ScientificAnaliza danych
BSC-1500IIA2-XBIOBAZASEDA 20143222263Szafka bezpieczeństwa biologicznego
Zestaw do ekstrakcji DNADaan Gene  
E-CentrifugaWEALTECWiruj resztki cieczy ze ścianki rurki.
Zestaw do wykrywania DNA H. Pylori (PCR-Fluorescence Soning)  Hongmed InfagenTestowanie na zakażenie H. pylori
Automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych Stream SP96Daan GeneSEDA 20140104Do ekstrakcji DNA 
Zestaw do testowania strunHongmed InfagenZawiera kapsułkę przymocowaną do sznurka, nożyczki, patyczek wacikowy oraz probówkę do przechowywania próbek;
Zamrażarki ultra-niskiej temperatury  (DW-YL450)  MELINGSEDA 20172220091-20 &°C; C do przechowywania odczynników  
Vortex-5Kylin-bellDo mieszania odczynników  

Bibliografia

  1. Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
  2. Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12(2022).
  3. Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
  4. Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
  5. Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
  6. IARC Helicobacter pylori Working Group. Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , International Agency for Research on Cancer. Lyon, France. (2014).
  7. Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
  8. Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
  9. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  10. Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
  11. Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
  12. Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
  13. Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393(2021).
  14. Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
  15. Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
  16. Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
  17. Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
  18. DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
  19. Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
  20. Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diagnostyka qPCRtest sznurkowyrak o dkanieinwazyjna detekcjaekstrakcja DNAoporno na klarytromycynoporno na lewofloksacynmutacja 23S rRNA

Powiązane artykuły