Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

4.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65702

⸱

8 września 2023

 ,  ,  , 
1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Streszczenie

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryoEM) stała się potężną techniką badania struktury atomowej kompleksów makromolekularnych. Przygotowanie próbki do krioEM wymaga konserwacji próbek w cienkiej warstwie szklistego lodu, zwykle zawieszonego w otworach folii nośnej z fenestracją. Jednak wszystkie powszechnie stosowane podejścia do przygotowania próbek do badań krioEM wystawiają próbkę na działanie granicy faz powietrze-woda, wprowadzając silny efekt hydrofobowy na próbkę, który często prowadzi do denaturacji, agregacji i złożonej dysocjacji. Co więcej, preferowane oddziaływania hydrofobowe między regionami próbki a granicą faz powietrze-woda wpływają na orientacje przyjmowane przez makrocząsteczki, co skutkuje rekonstrukcjami 3D z anizotropową rozdzielczością kierunkową.

Wykazano, że adsorpcja próbek krioEM do monowarstwy grafenu pomaga złagodzić interakcje z interfejsem powietrze-woda, jednocześnie minimalizując wprowadzanie szumu tła. Nośniki grafenu oferują również korzyść w postaci znacznego obniżenia wymaganego stężenia białek wymaganych do obrazowania krioEM. Pomimo zalet tych podpór, siatki pokryte grafenem nie są szeroko stosowane przez społeczność krioEM ze względu na zaporowe koszty opcji komercyjnych i wyzwania związane z produkcją na dużą skalę. W artykule opisano efektywną metodę przygotowania partii siatek krioEM, które mają prawie pełne pokrycie monowarstwowym grafenem.

Wprowadzenie

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jednocząsteczkowa (cryoEM) jest coraz częściej stosowaną technologią wykorzystywaną do badania struktur 3D biomakromolekuł. Postęp technologiczny w optyce mikroskopu elektronowego, bezpośredniej detekcji elektronów1, oraz algorytmy komputerowe2,3,4 w ciągu ostatniej dekady umożliwiły użytkownikom cryoEM określenie struktur biochemicznie stabilnych kompleksów makromolekularnych z rozdzielczością bliską atomowi5,6,7,8. Pomimo tych postępów nadal istnieją znaczące bariery w przechowywaniu próbek do obrazowania krioelektromagnetycznego, które uniemożliwiają rozdzielczość większości próbek biologicznych do tak wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do analizy krioelektromagnetycznej o wysokiej rozdzielczości polega na uwięzieniu makrocząsteczek, które są równomiernie rozmieszczone w szerokim zakresie orientacji w cienkiej warstwie zeszklonego lodu. Metody zamrażania typu "blot and plunge" są najczęściej stosowanymi metodami stosowanymi do generowania cienkich warstw próbek biologicznych na siatkach do badań krioelektromagnetycznych9,10. Metody te polegają na nałożeniu kilku mikrolitrów roztworu próbki na siatkę EM zawierającą folię z okienkiem, która stała się hydrofilowa, a następnie wytarcie większości próbki bibułą filtracyjną przed szybkim zanurzeniem siatki w kriogenie ciekłego etanu lub mieszaniny etanu i propanu9.

Chociaż ta metoda została z powodzeniem wykorzystana do określenia struktur szerokiej gamy próbek biologicznych, wszystkie powszechnie stosowane metody przygotowania próbek krioEM wystawiają próbki na działanie hydrofobowego interfejsu powietrze-woda (AWI), co często wprowadza problemy ograniczające określanie struktury w wysokiej rozdzielczości. Ustalono, że próbki biologiczne mają wysoką skłonność do denaturacji po wystawieniu na działanie AWI, co może prowadzić do złożonej agregacji i demontażu11,12,13,14. Co więcej, hydrofobowe plamy na powierzchniach próbek biologicznych powodują, że cząstki przyjmują preferowaną orientację w ice12. W wielu scenariuszach pojedynczy hydrofobowy obszar próbki zmusza wszystkie cząstki do przyjęcia określonej orientacji w lodzie, eliminując w ten sposób zdolność do generowania wiarygodnej rekonstrukcji. Oprócz problemów z AWI, próbki mogą wykazywać powinowactwo do powierzchni warstwy folii z okienkami, ograniczając liczbę cząstek zawieszonych w lodzie w otworach15.

Kilka metodologicznych i technologicznych rozwiązań zostało opracowanych w celu zmniejszenia tych problemów wynikających z interakcji z AWI lub filmami16,17. Jednym z popularnych podejść jest pokrycie folii z fenestracją siatek EM cienką (dziesiątki nanometrów) warstwą amorficznego węgla. Powłoka ta zapewnia ciągłą powierzchnię w poprzek otworów, do których cząsteczki mogą się adsorbować, z korzyścią częściowej ochrony próbki przed interakcjami z AWI15,18,19,20. Jednak dodatkowa warstwa węgla zwiększa ilość sygnału tła w obrazowanych obszarach, wprowadzając szumy, które mogą zagrozić osiągalnej rozdzielczości, szczególnie w przypadku małych (<150 kDa) próbek. W ostatnich latach wykazano, że stosowanie płatków tlenku grafenu (GO) do produkcji folii nośnych na siatkach krioEM ma przewagę nad tradycyjnym węglem amorficznym. Płatki GO są wytwarzane w wyniku utleniania warstw grafitu, w wyniku czego powstają pseudokrystaliczne arkusze grafitu jednowarstwowego, które są hydrofilowe ze względu na znaczną zawartość tlenu w postaci grup karboksylowych, hydroksylowych i epoksydowych na powierzchniach i krawędziach. Komercyjne płatki GO w zawiesinach wodnych są niedrogie i istnieje wiele opublikowanych metod nakładania płatków GO na siatki EM18,21. Jednak te metody często skutkują siatkami, które są tylko częściowo pokryte płatkami Go, a także regionami, które zawierają wiele warstw płatków Go. Co więcej, płatki GO wnoszą zauważalny sygnał tła do obrazów krioEM, który jest zbliżony do obserwowanego w przypadku cienkiego amorficznego węgla22,23.

Nieskazitelny jednowarstwowy grafen, który składa się z pojedynczego 2D krystalicznego układu atomów węgla, różni się od GO tym, że nie wytwarza kontrastu fazowego w mikroskopie elektronowym. Jednowarstwowy grafen może być zatem wykorzystany do wygenerowania niewidocznej warstwy nośnej do obrazowania próbek biologicznych. Grafen jednowarstwowy jest również mocniejszy niż GO i może być stosowany jako pojedyncza monowarstwa na siatce EM, a ostatnie postępy w produkcji siatek EM pokrytych grafenem umożliwiły przygotowanie monowarstwowych siatek grafenowych o wysokim pokryciu we własnym zakresie24,25,26,27,28,29,30. Jednak pomimo korzyści płynących z używania siatek pokrytych grafenem do określania struktury krioEM, nie są one powszechnie stosowane ze względu na zbyt wysokie koszty opcji komercyjnych i złożoność produkcji wewnętrznej. Poniżej opisujemy przewodnik krok po kroku, jak efektywnie wytwarzać siatki EM pokryte monowarstwą grafenu do oznaczania struktury krioEM próbek biologicznych (Rysunek 1)". Postępując zgodnie z tym szczegółowym protokołem, badacze cryoEM mogą w powtarzalny sposób przygotować dziesiątki wysokiej jakości grafenowych siatek nośnych w ciągu jednego dnia. Jakość siatek pokrytych grafenem można łatwo sprawdzić za pomocą niskiej klasy transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) wyposażonego w żarnik LaB6.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów i akcesoriów niezbędnych do produkcji siatek grafenowych

UWAGA: Gralen łatwo zanieczyszcza, co zmniejsza efektywność powłoki grafenowej i jakość siatek grafenowych; dlatego ważne jest, aby dokładnie oczyścić wszystkie materiały, które mają kontakt z grafenem. Przygotowanie materiałów i wszystkie etapy powinny odbywać się w dygestorium.

  1. Zbierz niezbędne materiały, które zostaną użyte do pokrycia siatek grafenem (Rysunek 2A).
  2. Kilkakrotnie spłucz szklane naczynia wodą dejonizowaną (DI), aby usunąć kurz, kłaczki i tłuste pozostałości.
  3. Użyj jednorazowych chusteczek do czyszczenia szklanych szkiełek nakrywkowych z 75% etanolem i użyj miotełki do kurzu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
    UWAGA: Blok uchwytu siatki zaciskowej TEM używany w tym protokole może pomieścić do 45 siatek. W przypadku dużej produkcji seryjnej siatek grafenowych można przygotować jednorazowo 45 siatek lub mniej. Zaleca się jednak rozpoczęcie od produkcji małoseryjnej (od czterech do sześciu siatek) do momentu ustalenia metody w laboratorium.

2. Przygotowanie 0,2 M nadsiarczanu amonu (APS) w wodzie

UWAGA: Ten roztwór APS jest używany jako wytrawiacz do usuwania podpory miedzi (Cu) z arkusza grafenu/Cu w późniejszym kroku. Zawsze przygotowuj świeży roztwór APS. Ponownie użyte lub stare roztwory nie będą skutecznie wytrawiać miedzi i mogą pozostawić pozostałości miedzi na grafenie w późniejszych etapach.

  1. Przepłucz kolbę o pojemności 500 ml wodą dejonizowaną (DI), a następnie dodaj 200 ml wody DI i kuchenkę mikrofalową przy maksymalnych ustawieniach przez około 1 minutę, aby odgazować wodę.
  2. Dodać 9 g nadsiarczanu amonu do 200 ml wody DI, aby uzyskać roztwór 0,2 M APS.
    UWAGA: APS jest toksyczny, zaleca się noszenie środków ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z APS. Odpady APS należy utylizować w zatwierdzonym zakładzie utylizacji odpadów.
  3. Wymieszać roztwór za pomocą mieszadła na mieszadle magnetycznym, podłączając kolbę do źródła podciśnienia pod wyciągiem.
    UWAGA: Odgazowanie roztworu APS pomoże zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, które mogą zmniejszyć wydajność trawienia Cu w kroku 6.

3. Przenieś grafen/miedź na czyste szkiełko nakrywkowe za pomocą kawałka bibuły

UWAGA: Używamy warstwy grafenu o wymiarach 15 x 15 cm do chemicznego osadzania z fazy gazowej (CVD) na Cu od dostawcy grafenu. Zakupione na rynku jednowarstwowe arkusze grafenu/Cu powinny być przechowywane w próżni. Ponieważ grafen jest hodowany po obu stronach Cu metodą CVD, dostawcy grafenu zazwyczaj przeprowadzają kontrole jakości i zalecają lepszą stronę do użycia. Tę zalecaną stronę grafenu nazywamy "górną" stroną, podczas gdy druga strona jest "tylną" stroną w tym protokole.

  1. Pokrój kawałek bibuły na prostokątny kształt o wymiarach około 20 mm x 40 mm. Ta bibuła jest używana jako wyściółka arkusza grafenu / Cu i pochłania nadmiar metakrylanu metylu (MMA (8.5) MMA EL6) używanego do powlekania arkusza grafenu / Cu; dlatego pamiętaj, aby pociąć go na rozmiar większy niż arkusz grafenu / Cu, który ma być użyty.
  2. Użyj taśmy poliimidowej, aby przykleić cztery rogi bibuły do wierzchu czystego szkiełka nakrywkowego, które będzie pasować do domowej powlekarki wirowej.
    UWAGA: Taśma poliamidowa jest używana, ponieważ jest cienka i można ją łatwo usunąć, co ułatwia obsługę.
  3. Usuń jeden kawałek arkusza grafenu/Cu z magazynu próżniowego.
  4. Użyj czystych i bezpyłowych nożyczek, aby ostrożnie wyciąć mały kwadrat arkusza Cu-grafenu, który będzie wystarczający do całkowitego pokrycia liczby siatek do przygotowania. Na przykład w przypadku 25 siatek ułożonych w układzie 5 x 5 wytnij kawałek o wymiarach 18 mm x 18 mm. Umieść arkusz grafenu/Cu na bibułce za pomocą czystej, suchej pęsety. Upewnij się, że tylna strona arkusza grafenu/Cu jest skierowana w dół i uważaj, aby przypadkowo nie obrócić arkusza grafenu/Cu, ponieważ trudno jest odróżnić górną stronę od tylnej.
  5. Przyklej cztery rogi arkusza grafenu/Cu do bibuły/szkiełka nakrywkowego, minimalizując kontakt między taśmą a arkuszem grafenu/Cu, ponieważ żadne obszary pokryte taśmą nie zostaną pokryte MMA w następnym kroku.
    UWAGA: Wyładowania elektrostatyczne mogą uszkodzić folie grafenowe, dlatego zaleca się pozostanie uziemionym elektrycznie i zminimalizowanie gromadzenia się ładunków elektrostatycznych podczas obchodzenia się z grafenem lub siatkami grafenowymi. Można to osiągnąć, nosząc opaskę uziemiającą na nadgarstek lub dotykając uziemionego metalowego przedmiotu bezpośrednio przed kontaktem z grafenem lub siatkami grafenowymi.

4. Pokryj jednowarstwowy arkusz grafenu/Cu cienką warstwą MMA(8.5)MMA EL6 (MMA)

UWAGA: Po wytrawieniu Cu, ta warstwa MMA będzie wspierać monowarstwę grafenu, aby umożliwić obsługę arkusza grafenu w przyszłych krokach. Powłoka MMA umożliwia również wizualizację warstwy grafenu, ponieważ sama monowarstwa grafenu byłaby przezroczysta.

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe z zaklejonym taśmą arkuszem grafenu/Cu na domowej powlekarki wirowej (można ją zmontować za pomocą wentylatora komputerowego) wewnątrz okapu wyciągowego (Rysunek 2B), jak wcześniej opisano przez Han et al.25.
  2. Zakładając okulary ochronne, dodaj dwie krople MMA za pomocą szklanej pipety na arkusz grafenu i natychmiast zacznij wirować z maksymalną prędkością.
  3. Podczas wirowania dodaj jeszcze dwie krople na środku. Wirowanie przez 1 min.
    UWAGA: Upewnij się, że nałożono wystarczającą ilość MMA, aby w pełni pokryć grafen. Jeśli nie masz pewności, dodaj jeszcze kilka kropli. Jeśli grafen nie jest w pełni pokryty, po wytrawieniu Cu w filmie pojawiają się "".
  4. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w dygestorium.

5. Usuń grafen z tyłu arkusza grafenu/Cu

UWAGA: Grafen wyhodowany na tylnej stronie miedzi (stronie niepokrytej MMA) musi zostać usunięty przed przejściem do kolejnych kroków, ponieważ nadmiar grafenu zmniejszy skuteczność trawienia Cu. Usuwamy ten grafen poprzez wystawienie grafenu na działanie plazmy, co można osiągnąć za pomocą dowolnego urządzenia do wyładowań jarzeniowych, zwykle używanego do przygotowania siatek EM do przygotowania próbek biologicznych.

  1. Ostrożnie usuń taśmę i wyjmij arkusz grafenu/Cu pokryty MMA z szkiełka nakrywkowego za pomocą czystej, suchej pęsety.
  2. Przyklej kawałek arkusza MMA/grafenu/Cu stroną MMA do dołu do czystego i wolnego od kurzu szklanego szkiełka nakrywkowego.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe z arkuszem MMA/grafenu/Cu w urządzeniu do wyładowywania jarzeniowego i zastosuj ustawienia, które zwykle są używane podczas przygotowywania siatek do barwienia ujemnego lub przygotowania próbki krioEM.
    UWAGA: Należy unikać długotrwałego wyładowania jarzeniowego, aby zapobiec utlenianiu Cu na tylnej stronie, co może spowodować zanieczyszczenie cząstek tlenku miedzi (CuO) (nano)na folii grafenowej.

6. Wytrawić Cu z arkusza MMA/grafenu/Cu w roztworze APS

  1. Do dygestorium wlać 200 ml świeżo przygotowanego roztworu APS do czystego i wolnego od kurzu naczynia krystalizującego (150 x 75 mm).
  2. Wyjmij arkusz MMA/grafenu/Cu ze szkiełka podstawowego. Śledź, po której stronie znajduje się MMA.
  3. Aby rozpocząć wytrawianie, umieść arkusz MMA/grafenu/Cu stroną z Cu poddanej obróbce plazmowej do dołu na powierzchni roztworu APS. Przykryj szeroką szklaną zlewkę kawałkiem folii aluminiowej lub pokrywką, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
  4. Inkubować przez 3 godziny. Jeśli większość Cu nie zostanie wytrawiona po 1 godzinie, powtórz kroki w sekcjach 2-6, a następnie przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Jeśli większość Cu nie zostanie wytrawiona po 1 godzinie, prawdopodobnie strona folii MMA/grafenowa została umieszczona na powierzchni roztworu APS zamiast po stronie Cu. Cu powinno być całkowicie wytrawione po 3 godzinach, a film MMA/grafen jest bezbarwny, jeśli Cu jest całkowicie wytrawiony. Grafen łatwo zanieczyszcza, dlatego należy przykryć wszelkie pojemniki, aby uniknąć gromadzenia się kłaczków lub tłustych pozostałości na powierzchniach, ponieważ wpłynie to negatywnie na jakość grafenu.

7. Opłucz folię MMA/grafenową w wodzie DI

  1. W dygestorium napełnij czyste i wolne od kurzu naczynie krystalizujące wodą DI.
  2. Delikatnie nabierz folię grafenowo-MMA za pomocą czystego, bezpyłowego szkła nakrywkowego umieszczonego pod kątem ~45° w stosunku do powierzchni roztworu APS.
  3. Ustaw szkiełko pod kątem prawie 90° do wody i delikatnie opuść szklane szkiełko nakrywkowe do wody, aby MMA/grafen powoli zsunął się ze zjeżdżalni i unosił się na powierzchni wody.
  4. Pozostaw film MMA/grafenowy na powierzchni wody na 1 godzinę, aby zmyć APS.

8. Oczyść kratki, które mają być pokryte monowarstwą grafenu

UWAGA: Siatki, do których grafen zostanie przeniesiony, muszą być jak najbardziej czyste, aby zmaksymalizować przyczepienie grafenu do powierzchni folii siatki. Siatki kupowane na rynku często zawierają szczątkowe zanieczyszczenia, które należy usunąć przed transferem grafenu.

  1. Oczyść i osusz trzy krystalizujące naczynia, aby były wolne od kurzu.
  2. W dygestorium wlej 200 ml chloroformu, acetonu i alkoholu izopropylowego (IPA) do każdej z trzech naczyń krystalizacyjnych. Przykryj naczynia krystalizujące folią aluminiową, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalników organicznych.
    UWAGA: Chloroform i aceton powodują podrażnienie skóry i mogą być toksyczne w przypadku wdychania. Ogranicz narażenie na te rozpuszczalniki organiczne i noś środki ochrony indywidualnej.
  3. Umieść podstawę zaciskowego bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml chloroformu.
  4. Przenieś każdą siatkę indywidualnie ze skrzynki kratowej do studzienki w bloku uchwytu siatki, upewniając się, że strona z folią z okienkami jest skierowana do góry. Przykryj naczynie krystalizujące folią aluminiową, umieść je na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie wstrząsaj przez 30 minut.
  5. Umieść metalową pokrywę na bloku uchwytu rusztu, który zabezpieczy kratki podczas przenoszenia do następnego naczynia krystalizującego. Ostrożnie wyjmij blok uchwytu siatki z naczynia krystalizującego za pomocą wygiętego widelca i długiej pęsety i umieść go na dnie drugiego naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząsaj wytrząsarką orbitalną przez 30 minut.
  6. Umieść pokrywkę na bloku uchwytu siatki i przenieś do naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml roztworu IPA w celu usunięcia pozostałości acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu rusztu i delikatnie potrząsaj przez 20 minut.
  7. Pojedynczo przenieś kratki stroną z folii okiennej skierowaną do góry z bloku uchwytu siatki na szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą.
  8. Suszyć kratki przez co najmniej 30 minut pod wyciągiem, upewniając się, że kratki są przykryte, aby zapobiec osadzaniu się na nich kurzu.

9. Przenieś czyste kratki na bibułę umieszczoną na siatce drucianej ze stali nierdzewnej lub perforowanej tacy pod wodą DI

UWAGA: Siatki muszą być zanurzone w wodzie DI na płaskiej powierzchni, aby grafen mógł być unoszony na wodzie i opuszczany na kratki. Można to zrobić za pomocą komercyjnej rynny powlekającej siatkę lub za pomocą szalki Petriego i pompy perystaltycznej, używanej do generowania siatek grafenowo-tlenkowych, jak opisano przez Palovcak et al.18.

  1. Umieść siatkę lub tacę ze stali nierdzewnej w korycie do powlekania siatki i spłucz wodą DI.
  2. Wytnij bibułę, która jest nieco mniejsza niż siatka/taca ze stali nierdzewnej i umieść ją na platformie, zanurzoną w wodzie DI.
    UWAGA: Bibuła jest nieco mniejsza niż platforma, aby umożliwić przemieszczanie i przenoszenie.
  3. Delikatnie przenieś oczyszczone kratki stroną z folii z okienkami skierowanymi do góry na bibułę. Kratki będą prawdopodobnie hydrofobowe, więc zanurz je w wodzie pionowo, w przeciwnym razie mogą się wygiąć z powodu naprężenia wody. Ustaw siatki w kwadratowej tablicy tak, aby znajdowały się jak najbliżej siebie, ale nie nakładały się na siebie (Rysunek 2C).
  4. Siatki są teraz gotowe do pokrycia monowarstwą grafenu. Napełnij koryto powlekające ruszt większą ilością wody DI, tak aby powierzchnia wody znajdowała się co najmniej 5 mm nad kratkami.

10. Przenieś grafen do siatek

  1. Ostrożnie zgarnij folię MMA/grafenową z naczynia krystalizującego za pomocą czystego szkiełka nakrywkowego, powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe do koryta pod kątem, w pewnej odległości od filmu grafenowego. Umieść szkiełko nakrywkowe pod arkuszem grafenu MMA tak, aby krawędzie arkusza i szkiełka nakrywkowego były równoległe, a następnie podnieś szkiełko nakrywkowe pionowo z wody, zabierając ze sobą folię MMA/grafenową.
  2. Przenieś folię MMA/grafenową do koryta, opuszczając szkiełko nakrywkowe do wody pod kątem ~45°, tak aby folia MMA/grafenowa oderwała się od szkiełka nakrywkowego i unosiła się na powierzchni wody.
  3. Umieść folię MMA/grafenową bezpośrednio nad kratkami, zanim poziom wody zostanie obniżony. Użyj szklanej pipety Pasteura, której końcówka została stopiona, aby uszczelnić otwór, aby ostrożnie manipulować położeniem folii MMA/grafenowej.
  4. Powoli obniż poziom wody za pomocą strzykawki, z prędkością około 1.25 ml/min, tak aby folia MMA/grafenowa całkowicie pokryła powierzchnie siatki, gdy wyląduje na bibule filtracyjnej
    UWAGA: Dalsza manipulacja arkuszem grafenu-MMA może być konieczna, aby utrzymać jego pozycję nad kratkami w miarę obniżania się poziomu wody.
  5. Użyj pęsety do czystej, suchej pęsety, aby podnieść bibułę przytrzymującą kratki na czystą, suchą, wolną od kurzu szalkę Petriego lub przenieś całą platformę ze stali nierdzewnej.
  6. Suszyć na powietrzu siatki MMA/grafenu przez co najmniej 30 minut pod wyciągiem. Kratki należy przykryć folią aluminiową lub pokrywką, aby zapobiec zanieczyszczeniu cząsteczkami kurzu.
  7. Przenieś kratki do inkubatora i piecz je w inkubatorze o temperaturze 65 °C przez 30 minut.
  8. Wyjmij kratki z inkubatora i pozostaw je pod przykryciem na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby schłodzić kratki do temperatury pokojowej.

11. Usuwanie MMA i czyszczenie siatek

UWAGA: MMA musi być dokładnie zmyte acetonem, aby zapobiec pozostałościom MMA na siatkach pokrytych grafenem.

  1. W dygestorium przygotować dwie naczynia krystalizujące zawierające 200 ml acetonu i jedno naczynie krystalizujące zawierające 200 ml izopropanolu (IPA) w temperaturze pokojowej. Przykryj naczynia krystalizujące folią aluminiową, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalników organicznych.
    UWAGA: Podczas pracy z acetonem należy nosić środki ochrony indywidualnej, ponieważ może on powodować podrażnienie skóry i może być szkodliwy w przypadku wdychania.
  2. Umieść podstawę zacisku bloku uchwytu siatki TEM na dnie pierwszego naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml świeżego acetonu.
  3. Przenieś każdą siatkę indywidualnie z bibuły do dołka w bloku uchwytu siatki, upewniając się, że strona MMA jest skierowana do góry. Przykryj naczynie krystalizujące folią, umieść je na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie potrząsaj przez 30 minut.
  4. Umieść metalową pokrywę na bloku uchwytu rusztu, który zabezpieczy kratki podczas przenoszenia do następnego naczynia krystalizującego. Ostrożnie wyjmij blok uchwytu siatki z naczynia krystalizującego za pomocą wygiętego widelca i długiej pęsety i umieść go na dnie drugiego naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml świeżego acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu siatki i delikatnie potrząsaj wytrząsarką orbitalną przez 30 minut.
  5. Umieść pokrywkę na bloku uchwytu siatki i przenieś do naczynia krystalizującego zawierającego 200 ml roztworu IPA w celu usunięcia pozostałości acetonu. Zdejmij pokrywkę z bloku uchwytu rusztu i delikatnie potrząsaj przez 20 minut.
  6. Przenieś kratki na małą szklaną szalkę Petriego pokrytą bibułą i susz je na powietrzu przez co najmniej 10 minut. Kratki należy przykryć pokrywką, aby zapobiec zanieczyszczeniu cząsteczkami kurzu.
  7. Kratki są gotowe do użycia lub przeniesione do skrzynki siatkowej owiniętej folią aluminiową wewnątrz eksykatora próżniowego.
    UWAGA: Przechowywanie siatek grafenowych wewnątrz eksykatora próżniowego może zapobiec zanieczyszczeniu cząstek hydrofobowych w warunkach otoczenia. Siatki te mogą być przechowywane przez okres do kilku miesięcy przed użyciem27.

12. Renderowanie siatek grafenowych hydrofilowych z obróbką UV/Ozonem

UWAGA: Grafen jest ekstremalnie hydrofobowy, co nie jest kompatybilne z przygotowaniem próbek krioEM, ponieważ metody zanurzania w blot wymagają hydrofilowej powierzchni, na której kropla próbki może równomiernie rozprowadzić. Podczas gdy tradycyjne urządzenia do wyładowań jarzeniowych można skonfigurować tak, aby delikatnie pulsowały plazmą, aby powierzchnia grafenu była hydrofilowa, urządzenia te mają tendencję do niszczenia cienkiej monowarstwy grafenu. Wcześniej wykazano, że środek czyszczący UV/ozon może być użyty do częściowego natlenienia powierzchni grafenu25, czyniąc go hydrofilowym do przygotowania próbki krioEM bez uszkadzania monowarstwy.

  1. Jeśli używasz systemu UV/Ozon, który wymaga zalewania, włącz system i zalej lampę na 10 minut (na tym etapie upewnij się, że żadne kratki nie są odsłonięte). Podczas zalewania środka czyszczącego UV/ozonem usuń kratki z eksykatora próżniowego i przenieś je na czyste szkiełko nakrywkowe.
  2. Gdy system UV/Ozone jest gotowy, umieść szkiełko nakrywkowe zawierające kratki stroną grafenową skierowaną do góry w urządzeniu do czyszczenia UV/ozonem i wystawij kratki na działanie ozonu przez 4 minuty.
  3. Po wystawieniu na działanie ozonu należy natychmiast użyć kratek do przygotowania próbki krioelektromagnetycznej.
    UWAGA: W przypadku korzystania z systemu UV/Ozon, który wymaga gruntowania, kratki należy umieścić w odkurzaczu natychmiast po zalaniu lampy przez 10 minut, w przeciwnym razie będzie zbyt chłodno, aby wytworzyć wystarczającą ilość ozonu do natlenienia grafenu w celu przygotowania próbki. Nie wystawiaj siatek na działanie ozonu przez więcej niż 6 minut, ponieważ zniszczy to warstwę grafenu.

Wyniki

Prawidłowe wykonanie opisanego tutaj protokołu wytwarzania siatek grafenowych pozwoli na uzyskanie siatek EM w pełni pokrytych pojedynczą warstwą grafenu. Pokrycie siatek grafenem można sprawdzić za pomocą dowolnego TEM. Ponieważ pojedyncza warstwa czystego grafenu jest prawie niewidoczna w TEM, należy badać ją w trybie dyfrakcyjnym mikroskopu i obserwować plamki Bragga odpowiadające heksagonalnej organizacji atomów węgla tworzących grafen (Rycina 3A). Normalne jest sporadyczne obserwowanie zmarszczek pojedynczej warstwy grafenu, które powstają podczas powlekania MMA (Rycina 3B). Można również sprawdzić poziom zanieczyszczeń obecnych na grafenie, wykonując obraz o dużym powiększeniu w centrum jednego z otworów pokrytych grafenem (Rycina 3C). Jeśli obraz zostanie wykonany przy użyciu detektora o wysokiej rozdzielczości, transformata Fouriera tego obrazu powinna zawierać plamki Bragga odpowiadające odstępom węgiel-węgiel wynoszącym 2.14 Å (Rycina 4C). Pojedyncza warstwa atomów węgla nie powoduje wystarczającego rozpraszania elektronów, aby wytworzyć kontrast fazowy, zatem obraz czystego grafenu nie będzie wykazywał pierścieni Thona związanych z funkcją przenoszenia kontrastu w transformacie Fouriera obrazu. Jednakże bardzo trudno jest zapobiec zanieczyszczeniu siatek grafenowych po ich wytworzeniu, a niewystarczające płukanie siatek EM lub niecałkowite usunięcie MMA po powleczeniu grafenem spowoduje obecność wyraźnych zanieczyszczeń na siatkach, widocznych na obrazach w przestrzeni rzeczywistej (Rycina 3C). Jak pokazano na Rycynie 4, siatki grafenowe wywierają efekt koncentrujący na próbce, co zaobserwowano przy porównaniu aplikacji 0.5 mg/mL apoferrytyny na dziurawane siatki złote z (Rycina 4A) i bez (Rycina 4B) podłoża grafenowego. Podobne protokoły wytwarzania grafenu były wcześniej opisywane w celu rozwiązywania struktur cryoEM białek takich jak apoferrytyna w wysokiej rozdzielczości25,27.

Schemat procesu przenoszenia grafenu; szczegółowe etapy trawienia miedzi, powlekania MMA i czyszczenia rozpuszczalnikiem.
Rysunek 1: Schemat przygotowania siatek do cryoEM powlekanych grafenem. Przedstawiono kluczowe etapy procesu wytwarzania siatek grafenowych. Skróty: cryoEM = kriomikroskopia elektronowa; MMA = metakrylan metylu; APS = wodorosiarczan amonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przygotowanie próbek do Cryo-EM: wirówka do powlekania, narzędzia do roztworu APS, arkusz miedziowo-grafenowy, proces powlekania siatek.
Rycina 2: Materiały niezbędne do wykonania siatek grafenowych. (A) Odpowiednio oznakowane materiały niezbędne do powlekania siatek do cryo-EM. (B) Zbliżenie na urządzenie do powlekania z arkuszem grafenowym/miedzianym przyklejonym taśmą do papieru filtracyjnego na szklanym podstawce. Urządzenie do powlekania (spin coater) można złożyć, kupując części w lokalnym sklepie komputerowym lub sprzętowym. (C) Zbliżenie na korytko do powlekania siatek podłączone do strzykawki, która może służyć do kontrolowania poziomu wody. Siatki umieszczone są na papierze filtracyjnym na stalowej siatce. Papier filtracyjny ułatwia manewrowanie położeniem siatek, aby można było dopasować do nich arkusz grafenowy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyfrakcja elektronowa i mikroskopia; struktura krystaliczna, analiza w nanoskali, schemat odstępów 2,14 Å.
Rysunek 3: Reprezentatywny obraz wzoru dyfrakcyjnego oraz obrazy w jasnym polu siatki grafenowej wykazujące zmarszczki lub zanieczyszczenia MMA. (A) Siatki EM pokryte monowarstwą grafenu wykazują piki Bragga odpowiadające heksagonalnej sieci grafenu podczas obrazowania w TEM w trybie dyfrakcji. Pik Bragga odpowiadający odstępom węgiel-węgiel 2,14 Å został obwiedziony okręgiem i oznaczony strzałką. (B) Obraz w jasnym polu siatki z monowarstwą grafenu z widocznymi zmarszczkami (oznaczonymi strzałką) w monowarstwie grafenu. (C) Obraz w jasnym polu monowarstwy grafenu z zanieczyszczeniem MMA (oznaczonym strzałką). Paski skali = 100 nm (B,C). Skróty: EM = mikroskopia elektronowa; MMA = metakrylan metylu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy Cryo-EM i wzór dyfrakcyjny; wizualizacja nanocząsteczek; analiza strukturalna; skala 100 nm.
Rysunek 4: Apoferrytyna na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem: (A) Mikrograf cryoEM apoferrytyny o stężeniu 0,5 mg/mL na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem. (B) Apoferrytyna obrazowana przy tym samym stężeniu jest widoczna przy znacznie niższym stężeniu, gdy przygotowano ją przy użyciu dziurawych siatek złotych bez grafenu. (C) FFT mikrografu cryoEM apoferrytyny o stężeniu 0,5 mg/mL na pozłacanych siatkach pokrytych grafenem, z zaznaczonymi pikami Bragga odpowiadającymi heksagonalnej sieci grafenu. Paski skali = 100 nm (A,B). Skróty: cryoEM = kriomikroskopia elektronowa; FFT = szybka transformata Fouriera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zachowanie próbek biologicznych w cienkiej warstwie szklistego lodu jest niezwykle ważnym krokiem w określaniu struktury krioelektromagnetycznej w wysokiej rozdzielczości. Jednak badacze często napotykają problemy wynikające z interakcji z AWI, który wprowadza preferowaną orientację, złożony demontaż, denaturację i agregację. Co więcej, próbki nie zawsze mogą być wystarczająco zagęszczone, aby wypełnić cienki lód zawieszony w poprzek otworów folii z fenestracją. Kilka grup badawczych opracowało metody powlekania siatek EM monowarstwą grafenu, aby pomóc przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń 24,25,26,27,28,29,30, a siatki grafenowe były stosowane z dużym powodzeniem. W tym miejscu przedstawiamy instrukcje krok po kroku, jak skutecznie przygotować partie siatek grafenowych we własnym zakresie i zbadać jakość siatek grafenowych przez TEM. Podkreślamy, że należy zachować szczególną ostrożność podczas niektórych krytycznych kroków, które opisujemy poniżej.

Grafen ma silną tendencję do przyciągania zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu. Dlatego podczas procesu produkcji siatki grafenowej ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie narzędzia, które mają kontakt z arkuszem grafenu/Cu lub kratkami, są czyste i wolne od kurzu. Szkiełka nakrywkowe używane do przenoszenia grafenu można czyścić przez spłukiwanie etanolem i wodą demineralizowaną lub za pomocą miotełki do kurzu. Zaleca się również pracę pod wyciągiem i utrzymywanie arkuszy i siatek grafenowych przykrytych folią lub czystą płytą szklaną przez cały czas. Kurz lub zanieczyszczenia na kratkach mogą uniemożliwić dokładne przyleganie grafenu do siatek EM. Podczas obchodzenia się z grafenem lub siatkami pokrytymi grafenem ważne jest, aby były uziemione elektrycznie, aby zapobiec uszkodzeniu folii grafenowej w wyniku wyładowań elektrostatycznych. Wyładowań elektrostatycznych można uniknąć, używając paska uziemiającego na nadgarstek, dotykając uziemionego metalowego przedmiotu za każdym razem, gdy dotyka się grafenu lub siatek grafenowych i/lub nie nosząc rękawicy na dłoni trzymającej pęsetę24.

Ponieważ monowarstwa grafenu jest bardzo cienka (szerokość atomu węgla), ważne jest, aby podczas przenoszenia grafenu do siatek wspierać grafen warstwą organiczną, taką jak MMA lub poli-MMA (PMMA). PMMA jest najczęściej stosowanym materiałem do transferu grafenu. Jednak PMMA ma silne powinowactwo do grafenu i często może powodować zanieczyszczenie folii grafenowej polimerem. W tym protokole stosuje się MMA, ponieważ pozostawia mniej zanieczyszczeń resztkowych25. Jednak zarówno PMMA, jak i MMA mają tę wadę, że tworzą zmarszczki i pęknięcia, które można zaobserwować w niektórych obszarach filmu grafenowego (ryc. 3B). Uniknięcie tych zmarszczek może być trudne, ponieważ często występują one podczas wzrostu grafenu metodą CVD31. Niedawno opracowano metodę hodowli ultrapłaskiego grafenu bez zmarszczek, w której folia miedziana jest zastępowana przez wafel Cu(111)/szafir jako podłoże wzrostu32.

Z naszego doświadczenia wynika, że lepiej jest zakupić arkusze grafenu/Cu i wspierać grafen MMA we własnym zakresie, niż kupować płyty Cu-grafenu pokryte polimerem od producentów, które po wytrawianiu miedzi stają się kruche i są trudne w obsłudze w kolejnych krokach. Powlekarka spinowa, której używaliśmy do powlekania MMA, może być tanio zbudowana przy użyciu części z lokalnego sklepu komputerowego/sprzętowego, jak opisano wcześniej25.

Na etapie powlekania MMA ważne jest, aby pokryć MMA całą powierzchnię grafenu na arkuszu Cu-grafen. Po wytrawieniu Cu grafen MMA stanie się półprzezroczysty, a obszary pozbawione pokrycia MMA będą wyglądać jak puste. Aby zapobiec powstawaniu powłoki MMA po stronie miedzianej, ważne jest, aby podczas powlekania umieścić pod nią mały kawałek bibuły, tak aby wchłonął nadmiar MMA, który wydostaje się z folii CVD.

Po wytrawieniu i wypłukaniu arkusz MMA/grafenu jest gotowy do przeniesienia na siatki EM za pomocą komercyjnego lub domowego systemu korytowego ze strzykawką lub pompą perystaltyczną do kontrolowania poziomu wody. Przed etapem przenoszenia ważne jest, aby dokładnie przepłukać kratki w kolejnych kąpielach chloroformu, acetonu i IPA. Pieczenie rusztów pokrytych grafenem w temperaturze 65 °C pomaga zachować integralność grafenu i wspomaga adsorpcję grafenu na siatkach. Wreszcie, aby zapobiec zanieczyszczeniu MMA na siatkach, ważne jest, aby dokładnie usunąć MMA w kąpieli acetonowej i oczyścić kratki w IPA. Wszelkie nieumyte pozostałości MMA będą obserwowane na siatkach EM i zmniejszą stosunek sygnału do szumu obrazów (rysunek 3C). Proces mycia acetonem-IPA można powtórzyć w celu dalszego oczyszczenia powierzchni grafenowych.

Aby uczynić siatki grafenowe hydrofilowymi, wystawiliśmy je na działanie promieniowania UV/ozonu. Różne modele środków czyszczących UV/ozonem mogą wymagać optymalizacji, aby wystarczająco natlenić warstwę grafenu do przygotowania próbki krioEM bez uszkadzania grafenu. Niezależnie od systemu, bardzo ważne jest, aby używać tych siatek do aplikacji próbek krioEM natychmiast po obróbce UV/Ozonem. Alternatywne metody utylizacji siatek grafenowych jako hydrofilowych opisano w innych badaniach 33,34.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Xiao Fan za pomocne dyskusje podczas tworzenia tych metod w Scripps Research. B.B. był wspierany przez staż podoktorski od Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. jest wspierany przez stypendium przeddoktoranckie National Science Foundation. D.E.P jest wspierany przez grant National Institutes of Health (NIH) NS095892 dla GCL. Projekt ten był również wspierany przez granty NIH GM142196, GM143805 i S10OD032467 dla GCL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70% EtOHPharmco (190 pf EtOH)241000190CSGL
AcetonSigma Aldrich650501-4L
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma Aldrich215589-500gNiebezpieczne; Zachowaj szczególną ostrożność
ChloroformSigma AldrichC2432-1L
Zacisk Blok uchwytu siatki TEM do 45 siatekPELCO16830-45
Wentylator komputerowyAmazon (Noctua)B07CG2PGY6
Szkiełko nakrywkoweBellco Glass1203J71Standardowe szkiełka nakrywkowe
Naczynie krystalizującePyrex3140-100
Odkurzacz elektronicznyFalcon Safety Products75-37-6
ZszywkiFalcon Dust-off Air DusterN/A
Bibuły filtracyjneWhatman1001-055
Pęseta z cienką końcówkąDumont0508-L4-PO
KolbaPyrex4980-500
Widelec SupermarketNie dotyczy
Szklana pipeta pasteuraVWR14672-608
Grafen/CuGrapheneaN/ACVD Monowarstwowa
wełna cu Siatkado powlekaniaLadd Research Industries10840Delikatny
izopropanolFisher Scientific67-63-0
Taśma kaptonowaAmazon (MYJOR)MY-RZY001Taśma poliamidowa
KimwipesFisher Scientific06-666
Długa koszulkaCole Parmer EssentialsUX-07387-15
Metalowy uchwyt na siatkęTed Pella16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6KAYAKU Zaawansowane materiałyM31006 0500L 1GLŁatwopalny
piekarnik laboratoryjny Model 10Quincy Lab, Inc.
szalka PetriegoPyrex3610-102
Odkurzacz plazmowy (Solarus 950)Gatan, Inc.Nie dotyczy
NożyczkiFiskars194813-1010
Standardowa analogowa wytrząsarka orbitalnaVWR89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300QuantifoilNieZłote siatki Holey
Systemy czyszczenia ozonem ultrafioletowymUVOCSmodel T10X10/OES
FO19013 dotyczy

Bibliografia

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541(2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747(2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518(2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279(2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie pr bek do CryoEMl d witryfikowanygranica faz powietrze wodadenaturacja bia ekwspieraj ce b ony grafenowetransmisyjna mikroskopia elektronowaprotok przygotowania siatek
Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.