Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia ustandaryzowany model myszy do rozszerzania szwów oraz metodę wizualizacji 3D do badania mechanobiologicznych zmian szwu i przebudowy kości pod wpływem siły rozciągającej.

Streszczenie

Szwy twarzoczaszki odgrywają kluczową rolę poza tym, że są włóknistymi stawami łączącymi kości twarzoczaszki; służą również jako główna nisza dla wzrostu kości nazębnej i twarzowej, mieszcząc mezenchymalne komórki macierzyste i osteoprogenitory. Ponieważ większość kości twarzoczaszki rozwija się w wyniku kostnienia śródbłoniastego, obszary brzeżne szwów działają jako punkty inicjacji. Ze względu na to znaczenie, szwy te stały się intrygującymi celami w terapiach ortopedycznych, takich jak wspomagane sprężyną rozszerzanie sklepienia czaszki, szybkie rozszerzanie szczęki i wysuwanie szczęki. Pod wpływem ortopedycznej siły śledzącej komórki macierzyste szwu są szybko aktywowane, stając się dynamicznym źródłem przebudowy kości podczas ekspansji. Pomimo ich znaczenia, zmiany fizjologiczne zachodzące w okresach przebudowy kości pozostają słabo poznane. Tradycyjne metody cięcia, przede wszystkim w kierunku strzałkowym, nie pozwalają uchwycić kompleksowych zmian zachodzących w całym szycie. W tym badaniu ustanowiono standardowy model mysi do rozszerzania szwów strzałkowych. Aby w pełni uwidocznić zmiany w przebudowie kości po rozszerzeniu szwów, metodę oczyszczania tkanek PEGASOS połączono z barwieniem EdU w całości i podwójnym znakowaniem chelatującym wapń. Pozwoliło to na wizualizację wysoce proliferujących komórek i tworzenie się nowych kości w całych kościach kalwarii po ekspansji. Protokół ten oferuje ustandaryzowany model myszy z rozszerzaniem szwów i metodę wizualizacji 3D, rzucając światło na zmiany mechanobiologiczne w szwach i przebudowie kości pod wpływem obciążenia siłą rozciągającą.

Wprowadzenie

Szwy twarzoczaszki to włókniste tkanki, które łączą kości twarzoczaszki i odgrywają istotną rolę we wzroście i przebudowie kości twarzoczaszki. Struktura szwu przypomina rzekę, zapewniając przepływ zasobów komórkowych do odżywiania i budowy "brzegu rzeki", znanego jako fronty osteogenne, które przyczyniają się do tworzenia kości twarzoczaszki poprzez wewnątrzbłoniastą osteogenezę¹.

Zainteresowanie szwami twarzoczaszkowymi wynika z potrzeb klinicznych, aby zrozumieć przedwczesne zamykanie szwów czaszkowych i dysfunkcję szwów twarzowych, co może prowadzić do deformacji twarzoczaszki, a nawet stanów zagrażających życiu u dzieci. Otwarta szycie jest rutynowo stosowane w leczeniu klinicznym, ale długotrwała obserwacja wykazała niepełny nawrót ponownego kostnienia u niektórych pacjentów². Minimalnie inwazyjna kraniotomia wspomagana sprężynami rozprężnymi lub endoskopowa kraniektomia paskowa może zapewnić bezpieczniejsze podejście do zachowania potencjalnego szwu niż odrzucanie tkanek³. Podobnie, terapie ortopedyczne, takie jak maski na twarz i aparaty ekspansyjne, są szeroko stosowane w leczeniu strzałkowej lub poziomej hipoplazji szczęki, a niektóre badania rozszerzają ograniczenie wiekowe na leczenie dorosłych pacjentów za pomocą ekspanderów podniebiennych wspomaganych miniśrubami^4,5,6. Dodatkowo, regeneracja szwów czaszkowych za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w połączeniu z materiałami biodegradowalnymi jest potencjalną terapią w przyszłości, oferując nowy kierunek leczenia chorób pokrewnych⁷. Jednak proces funkcjonalny lub mechanizm regulacyjny szwów pozostaje nieuchwytny.

Przebudowa kości polega głównie na równowadze między tworzeniem kości prowadzonym przez osteoblasty a resorpcją kości prowadzoną przez osteoklasty, gdzie osteogenne różnicowanie komórek macierzystych stymulowane przez sygnały mechaniczne odgrywa ważną rolę. Po dziesięcioleciach badań stwierdzono, że szwy twarzoczaszki są wysoce plastycznymi niszami mezenchymalnych komórek macierzystych⁸. Komórki macierzyste do szwów (SuSCs) to niejednorodna grupa komórek macierzystych, należąca do mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) lub komórek macierzystych kości (SSC). SuSC są znakowane in vivo za pomocą czterech markerów, w tym Gli1, Axin2, Prrx1 i Ctsk. W szczególności SuSC Gli1⁺ ściśle zweryfikowały biologiczne cechy komórek macierzystych, nie tylko wykazując wysoką ekspresję typowych markerów MSC, ale także wykazując doskonały potencjał osteogenny i chondrogene⁹. Wcześniejsze badania wykazały, że Gli1⁺ SuSC aktywnie przyczyniają się do tworzenia nowych kości pod wpływem siły rozciągającej, identyfikując je jako źródło komórek macierzystych szwów wspomagających osteogenezę rozpraszającą¹⁰.

W przeszłości, obszerne właściwości mechaniczne komórek macierzystych były badane in vitro za pomocą Flexcell, czteropunktowego zginania, systemu ładowania mikromagnesami i innych. Chociaż mysie komórki mezenchymalne pochodzące ze szwów czaszkowych zostały zidentyfikowane in vitro¹¹, a ostatnio wyizolowano również ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste wykonane szwem ludzkim ¹², odpowiedź biomechaniczna komórek szwowych pozostaje niejasna w systemie in vitro. W celu dalszego zbadania procesu przebudowy kości, stworzono model rozszerzania szwów oparty na izolowanej hodowli narządów kalwarii, torując drogę do ustanowienia użytecznego modelu rozszerzania szwów in vivo^1,13. Rabbits¹⁴ i rats¹⁵ były najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w badaniach podstawowych nad rozszerzaniem szwów. Jednak myszy są preferowanymi modelami zwierzęcymi do badania chorób ludzkich ze względu na ich wysoce homologiczny genom z ludźmi, liczne linie modyfikacji genów i silną zdolność hybrydyzacji reprodukcyjnej. Istniejące mysie modele rozszerzania szwów czaszkowych zazwyczaj opierają się na ortodontycznych drutach sprężynowych ze stali nierdzewnej, aby przyłożyć siłę rozciągającą do szwu strzałkowego^16,17. W tych modelach po obu stronach kości ciemieniowych wykonuje się dwa otwory, aby zamocować urządzenie rozprężne, a przewody są osadzone pod skórą, co może wpływać na tryb aktywacji komórek.

Jeśli chodzi o metodę wizualizacji, dwuwymiarowa obserwacja przekrojów w kierunku strzałkowym jest powszechnie stosowana od dziesięcioleci. Biorąc jednak pod uwagę, że przebudowa kości jest złożonym trójwymiarowym procesem dynamicznym, uzyskanie kompletnych informacji trójwymiarowych stało się pilną potrzebą. Aby spełnić ten wymóg, powstała technika przezroczystości tkanek PEGASOS^18,19. Oferuje unikalne korzyści w zakresie przezroczystości tkanek twardych i miękkich, umożliwiając odtworzenie całego procesu przebudowy kości w przestrzeni trójwymiarowej.

Aby uzyskać głębsze i bardziej kompleksowe zrozumienie zmian fizjologicznych w okresach przebudowy kości, stworzono standardowy model myszy z rozszerzaniem szwów strzałkowych z ustawieniem sprężyny między ręcznie robionymi uchwytami¹⁰. Dzięki znormalizowanej procedurze trawienia i klejenia kwasem, urządzenie do rozprężania może być mocno połączone z kością czaszki, generując siłę rozciągającą prostopadłą do szwu strzałkowego. Ponadto po dwukrotnym znakowaniu zmineralizowanej kości po rozprężeniu zastosowano metodę oczyszczania tkanek PEGASOS, aby w pełni uwidocznić zmiany modelowania kości po rozszerzeniu szwów.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). W tym badaniu wykorzystano 4-tygodniowe samce myszy C57BL/6. Wszystkie użyte narzędzia zostały wysterylizowane przed zabiegiem.

1. Przygotowanie modelu rozszerzania szwów

1. Przygotowanie dwóch uchwytów retencyjnych.
   1. Użyj drutu australijskiego 0,014 cala lub drutu ze stali nierdzewnej (patrz tabela materiałów), aby wykonać spiralną pętlę za pomocą szczypiec do drutu lekkiego. Średnica pętli wynosi 2 mm, a 1 mm ogon jest zarezerwowany z dwóch stron (Rysunek 1A).
   2. Wysterylizuj druty i uchwyty do zabiegu w autoklawie, sterylizatorze plazmowym lub odpowiednim zimnym sterylizatorze (np. aldehydzie glutarowym).
2. Przygotowanie sprężyn.
   1. Przygotuj niestandardowe sprężyny ze stali nierdzewnej.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano sprężynę dociskową o średnicy drutu 0,2 mm, średnicy zewnętrznej 1,5 mm, odstępie 1 mm i długości 7 mm (Rysunek 1B). Każde ściśnięcie sprężyny o 1 mm uzyskiwało ciąg około 30 g.
   2. Przytnij sprężynę na dostępną długość przed ustawieniem. Potwierdź siłę dla specjalistycznej sprężyny przed eksperymentem.
      UWAGA: Rozmiary sprężyn są różne, o ile wielkość siły jest taka sama w równoległych eksperymentach. Siła jest mierzona za pomocą jednoosiowego przyrządu testowego lub małego elektronicznego dynamometru (patrz Tabela materiałów), jeśli warunek jest ograniczony. Zmiana długości jest obliczana do wielkości siły (Rysunek 1C-E). W szczególności konieczna jest zmiana wartości obciążenia sprężyny w zależności od wieku, stanu kości myszy i obiektów badawczych.
   3. Przygotuj jeden prosty drut australijski lub prosty drut stalowy o długości 7 mm i zrób dwa kawałki papieru o średnicy 2 mm, które będą używane jako bariery (Rysunek 1F).

2. Operacja rozszerzenia szwu strzałkowego

1. Znieczulenie: Znieczulenie myszy tiletaminą (25 mg/kg), zolazepamem (25 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). W tym samym czasie nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Oceń głębokość znieczulenia myszy za pomocą szczypania palca u nogi.
   UWAGA: Następujące cechy wskazują na to, że mysz jest prawidłowo znieczulona: powolny i jednostajny oddech, osłabienie kończyn, rozluźnienie mięśni, zanik odruchu akupunktury skóry i odruchu powiek, a także słabszy odruch rogówkowy.
2. Usuwanie i dezynfekcja sierści: Ostrożnie usuń sierść na czubku głowy za pomocą kremu do depilacji; unikaj dotykania oczu. Wkrótce potem użyj naprzemiennych rund jodoforu i 75% alkoholu, aby zdezynfekować miejsce operowane. Meloksykam (1 mg/kg) należy podawać myszom w postaci środka przeciwbólowego we wstrzyknięciu podskórnym.
3. Fiksacja pozycji ciała: Połóż mysz leżąc z przodu i użyj taśm chirurgicznych, aby przymocować kończyny na stole operacyjnym.
4. Otwórz płat skóry głowy: Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać łukowaty płat wzdłuż skóry głowy w pobliżu szyi myszy, całkowicie odsłaniając szew strzałkowy i otaczającą czaszkę. Następnie przymocuj płat skóry głowy za pomocą szwu 6-0 na stole operacyjnym.
5. Sklej uchwyty retencyjne po wytrawianiu kwasem.
   1. Wysuszyć czaszkę i wytrawić ją 37% kwasem fosforowym przez 20 sekund, a następnie użyć zwykłej soli fizjologicznej, aby oczyścić kwasowe wytrawianie (Rysunek 2A). Kredowy osad będzie widoczny po wysuszeniu czaszki gumową gruszką do pipet.
   2. Zacementuj dwa uchwyty (przygotowane w kroku 1.1) po obu stronach kości ciemieniowych w odległości 3 mm od szwów strzałkowych za pomocą światłoutwardzalnego kleju (Rysunek 2B).
6. Zresetuj płatek skóry głowy.
   1. Ręcznie załóż płatek skóry głowy (Rysunek 2C). Oznacz pozycję uchwytów, wytnij dwa małe otwory w skórze głowy w odpowiedniej pozycji obustronnych uchwytów retencyjnych, a następnie zresetuj trzepoczącą skórę głowy.
   2. W tym samym czasie przełóż małe pętle przez otwory, aby odsłonić powierzchnię skóry. Zszyj zakrzywione nacięcie szwem 6-0 (Rysunek 2D). Na regenerację skóry przeznacza się od jednego do trzech dni. Meloksykam (1 mg/kg) należy podawać myszom we wstrzyknięciu podskórnym co 24 godziny przez 1 do 3 dni.
      UWAGA: Po zabiegu codziennie sprawdzaj aktywność skóry głowy myszy i czy uchwyty nie odpadają. Istnieją różne rodzaje skóry pod względem koloru i grubości; Zdrowa skóra głowy zachowa pierwotny kolor, a krawędzie skóry będą się stopniowo zrastać po zszyciu. Jeśli zostanie stwierdzona infekcja skóry głowy lub jeśli odpadło urządzenie chirurgiczne, należy usunąć mysz z badania i poddać ją eutanazji.
7. Zamontuj sprężynę i przewód doprowadzający.
   1. Przyciąć sprężynę o 1 mm dłuższą niż odległość między dwoma uchwytami.
   2. Ściśnij wybraną sprężynę dociskową i umieść ją między małymi zwojami po obu stronach.
   3. Przełóż drut ze stali nierdzewnej przez małe zwoje i sprężynę, a następnie zwolnij sprężynę, aby uzyskać początkowy ciąg około 30 g.
   4. Sprawdź, czy skóra głowy pod obszarem sprężyny myszy nie jest objęta żadną kompresją.
   5. Po upewnieniu się, że wiązanie jest mocne, bez żadnych luzów, przyklej dwa skrawki papieru między sprężyną a uchwytami za pomocą światłoutwardzalnego kleju, aby ustawić bariery na obu końcach sprężyny (Rysunek 2E,F).

3. Podwójne etykietowanie zmineralizowanych kości

1. Przygotowanie roztworu podstawowego.
   1. Przygotować roztwór rozcieńczający wodą destylowaną, który zawiera 0,9% NaCl i 2%_NaHCO3.
   2. Za pomocą roztworu rozcieńczalnika przygotować 20 mg/ml dwuwodnego kompleksu alizaryny i 10 mg/ml kalceiny (patrz tabela materiałów).
   3. Ustaw pH na 7,4 za pomocą miernika pH. Przepłukuj sondę pH między pomiarami, aby zapewnić dokładne odczyty.
   4. Umieścić barwnik w sterylnym pojemniku i przechowywać go w lodówce w temperaturze 4 °C; folia służy do ochrony przed światłem.
2. Przygotuj roztwór roboczy. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć roztwór podstawowy do 1 mg/ml w przypadku wapnia i 2 mg/ml w przypadku dwuwodnego kompleksu alizaryny, używając roztworu do rozpuszczania.
3. Dootrzewnowo wstrzyknąć 5 mg/kg zieleni kalceiny i 20 mg/kg czerwieni alizaryny w dwóch punktach czasowych, aby oznaczyć zmineralizowane kości i przeanalizować zmiany między dwoma czasami. Ogólnie rzecz biorąc, próbki należy pobierać 12-14 godzin po wstrzyknięciu.
   UWAGA: Podgrzej barwniki przed wstrzyknięciem i upewnij się, że czas wstrzyknięcia nie jest krótszy niż 3 minuty. Interwał wtryskiwania zależy od czasu rozprężania. W tym badaniu czerwień alizaryny i zieleń kalceiny wstrzykiwano odpowiednio przez noc (O/N) przed ekspansją i O/N przed pobraniem.
4. Pobrać całe kości nazębne przygotowane do zabiegu oczyszczania tkanek dzień po drugim wstrzyknięciu.

4. Barwienie EdU

1. Wstrzyknięcie dootrzewnowe: Wstrzyknąć dootrzewnowo EdU na 2 godziny przed eutanazją myszy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Dawka wynosi 1 mg/10 g masy ciała.
2. Przygotowanie koktajlu do etykietowania: Wymieszaj sól fizjologiczną buforowaną trisem (100 mmol/l końcowy, pH 7,6), CuSO₄ (4 mmol/l końcowy), azydek sulfocyjaniny 3 (2-5 μmol/l końcowy) i askorbinian sodu (100 mmol/l końcowy, świeży za każdym razem) (patrz tabela materiałów).
3. Barwienie EdU w całości: Po etapie odbarwiania tkanek w metodzie oczyszczania tkanek PEGASOS (krok 7), umieść próbki w koktajlu do etykietowania na 1 dzień w temperaturze pokojowej (RT).

5. Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej

1. Utrwalanie i przechowywanie tkanek: Utrwalić kości łydkowe w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C O/N i przechowywać je w 0,5% PFA przed skanowaniem.
2. Skanowanie i analiza: Skanuj próbki za pomocą systemu obrazowania mikrotomografii komputerowej (μCT) o wysokiej rozdzielczości i wielkości woksela 7 μm.

6. Przygotowanie roztworu roboczego do oczyszczania tkanek PEGASOS

1. 4% poliformaldehydu (PFA): Rozpuścić 4 g proszku PFA w 1× PBS na 100 ml.
2. Roztwór perfuzyjny serca: 0,02% Heparyna, czyli 20 mg heparyny w proszku rozpuszczona w 1× PBS do 100 ml; alternatywnie użyj 0,05 mol/L EDTA, to znaczy 0,05 mola kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (patrz tabela materiałów), rozpuszczonego w dejonizowanym roztworze wodnym do całkowitej objętości 1 l.
3. Roztwór odwapniający: 0,5 mol/L EDTA, czyli 0,5 mola kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), rozpuszczony w dejonizowanym roztworze wodnym do całkowitej objętości 1 l.
4. Roztwór odbarwiający: 25% Quadrol, czyli 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroksypropylo) etylenodiaminy) (patrz Tabela Materiałów) rozpuszczony w wodzie dejonizowanej do całkowitej objętości 1 L.
   UWAGA: Ze względu na lepkość Quadrol można go podgrzać do 60 °C, aby zwiększyć jego płynność przed konfiguracją.
5. Roztwór odtłuszczający: 30%, 50%, 70% tert-butanol (tB) (patrz tabela materiałów), przygotowany z wodą według frakcji objętościowej.
   UWAGA: Biorąc pod uwagę, że czysta tB jest krystaliczna w temperaturze pokojowej, należy ją podgrzać do 60 °C, aż się rozpuści, zanim będzie można ją użyć. Następnie dodaje się od 3% do 5% (v/v) trietanoloaminy (TEA) w celu regulacji pH roztworu >9,5.
6. Roztwór do odwadniania: roztwór TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), w którym PEG-MMA to metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) o średniej masie cząsteczkowej 500 (Poli(glikol etylenowy) Metakrylan 500, PEG-MMA 500) (patrz Tabela materiałów).
7. Przezroczysty roztwór: roztwór BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), w którym BB to benzoesan benzylu (BB).

7. Przezroczystość kości kalwarycznych metodą PEGASOS

1. Znieczulij mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie środków znieczulających (krok 2.1) i oceń głębokość znieczulenia myszy poprzez reakcję szczypania, aby upewnić się, że nie ma reakcji oporu przed perfuzją serca.
2. Wykonaj perfuzję i stabilizację serca.
   1. Trzymaj brzuch myszy do góry, przymocuj kończyny taśmą klejącą i ostrożnie przetnij wzdłuż obwodu klatki piersiowej, aby całkowicie ją odsłonić.
   2. Natychmiast po wykonaniu małego nacięcia w prawym przedsionku nożyczkami okulistycznymi, wprowadź igłę perfuzyjną 22 G na wierzchołku lewej komory.
      UWAGA: Wkładana jest tylko końcówka igły, aby uniknąć uszkodzenia zastawki serca w wyniku nadmiernego włożenia. W przeciwnym razie płyn perfuzyjny serca dostanie się do krążenia płucnego, wpływając na efekt perfuzji krążenia ogólnoustrojowego.
   3. Wepchnąć 30-50 ml płynu perfuzyjnego serca (krok 6.2) do strzykawki. Można zauważyć, że wątroba stopniowo blednie z jaskrawoczerwonej.
   4. Po tym, jak płyn odpływający z prawego przedsionka stanie się całkowicie przezroczysty, wlej 4% roztwór PFA w równej objętości. Operacja perfuzji PFA odbywa się w wentylowanym okapie.
   5. Wypreparować i oddzielić tkanki i narządy, a następnie utrwalić je przez noc za pomocą 4% PFA w temperaturze 4 °C.
3. Odwapnienie tkanek: W przypadku próbek przetwarzanych przez barwienie EdU, utrwaloną twardą tkankę należy umieścić w roztworze EDTA (pH 7,0) o stężeniu 0,5 mol/l (pH 7,0) (10 ml) na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C na około 2 dni i codziennie zmieniać płyn.
   UWAGA: Pomiń proces odwapniania w znormalizowanej metodzie PEGASOS dla kości znakowanych czynnikiem chelatującym wapń, aby w pełni zachować sygnalizację. Odwapnienie jest wymagane w leczeniu kości w celu wizualizacji endogennej fluorescencji lub sygnałów immunologicznych wybarwionych całością.
4. Odbarwienie tkanek: Umieścić nieruchome kości łydkowe w 25% roztworze Quadrol (20 ml) w stole wstrząsającym w temperaturze 37 °C na 1 dzień i zmienić płyn raz.
   UWAGA: Czas odbarwiania jest związany z zawartością hemu w tkance. Zwróć uwagę na kolor płynu zabiegowego, ponieważ głębia koloru oznacza konieczność kontynuowania kuracji wymiany płynu.
5. Barwienie EdU: Płucz próbki w 1× PBS przez 5 minut (trzy razy), a następnie zanurz je w koktajlu do etykietowania na 1 dzień. Następnie przepłukać próbki w 1× PBS przez 1 godzinę (trzy razy).
6. Odtłuszczanie i odwadnianie tkanek
   1. Umieścić tkanki w kolejno roztworach o stężeniu 30%, 50% tB i 70% tB, aby wykonać zmniejszanie gradientu na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C. Umieścić w każdym stężeniu na około 2 godziny.
   2. Następnie odwadniać próbki w roztworze TB-PEG przez 6 godzin na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Powyższy czas przetwarzania może być wydłużony lub skrócony w zależności od liczby tkanki.
7. Przezroczystość tkanki: Umieścić całkowicie odwodnioną tkankę w roztworze BB-PEG na stole do wytrząsania w temperaturze 37 °C (2-4 h), aż stanie się przezroczysta. Obecnie próbki można przechowywać do 1-2 lat.
   UWAGA: Po prawie całkowitym oczyszczeniu otwórz pokrywę probówki, aby wystawić próbki i medium na działanie powietrza z potrząsaniem, co jeszcze bardziej poprawi przezroczystość. Ta metoda jest odpowiednia do poprawy przezroczystości poszczególnych tkanek i narządów, a także całej głowy i ciała młodych myszy. Jednak dla przezroczystości całego ciała dorosłych myszy powyższe kroki należy wykonać metodą perfuzji w pełnym cyklu.

8. Obrazowanie

UWAGA: Mikroskopia konfokalna została użyta do wizualizacji 3D przezroczystych tkanek w tym badaniu. Mikroskopia arkuszy świetlnych jest również odpowiednia dla tego protokołu. Kilka systemów operacyjnych zostało zweryfikowanych jako dostępne wcześniej. W tym przypadku jako przykład podano system operacyjny laserowego mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów).

1. Zgodnie z instrukcją obsługi wykonaj odpowiednie czynności, aby otworzyć interfejs operacyjny lasera konfokalnego i LAS AF. Włącz wymagany laser w różnych kanałach strzelania i dostosuj moc. Ustaw ścieżkę optyczną i odpowiadającą jej długość fali, 561 nm dla czerwieni Alizaryny i 488 nm dla zieleni Calceiny, z których każda jest używana dla sygnału EdU zgodnie z koktajlem etykietowania.
2. Umieść przezroczyste próbki na wklęsłej szklanej szalce Petriego, która może przenosić grube próbki, pudełka do zatapiania lub samodzielnie wykonane urządzenia do umieszczania, takie jak wodoodporny klej, aby zanurzyć przezroczyste próbki w przezroczystej cieczy.
3. Wybierz soczewkę obiektywu o małej mocy, aby szybko zlokalizować próbkę. Zrób przegląd całej tkanki nazębnej dzięki funkcji szybkiego skanowania i znajdź obszar zainteresowania do obrazowania.
4. Ustaw moc wyjściową, wybierz tryb skanowania i najpierw dostosuj współczynniki fotografowania (rozdzielczość, szybkość skanowania, współczynnik powiększenia, jakość obrazu, średni szum tła itp.).
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, Smart Gain waha się od 500 do 800 (zarówno zmiana sygnału, jak i szumu); Inteligentne przesunięcie jest jak najbardziej zbliżone do 0, zapewniając jednocześnie jakość obrazu (w celu zmniejszenia szumów tła). Gdy wzmocnienie PMT jest większe niż 800, lub wzmocnienie HyD jest większe niż 100%, a jasność jest nadal niewystarczająca, intensywność lasera można odpowiednio zwiększyć, ale w zasadzie im niższe, tym lepiej.
5. Ustaw odległość osiową zakresu Z i krok Z, który jest drążony w dół od najpłytszej strony przezroczystej organizacji, czyli ustaw najgłębsze i najpłytsze boki.
   UWAGA: Potwierdź klasyfikację i odległość roboczą dla każdego obiektywu. Ostrożnie ustaw zakres Z i nie używaj odległości roboczej przekraczającej limit wybranego obiektywu. "z-Galvo" można wybrać, gdy potrzebna jest precyzyjna regulacja.
6. Ponownie ustaw parametry fotografowania i rozpocznij fotografowanie. Po zakończeniu scal i przetwórz obrazy za pomocą modułu wielofunkcyjnego. Na koniec przechowuj i wyłącz instrument we wskazanej kolejności.

Wyniki

Korzystając z tego protokołu, stworzono mysi model rozszerzania szwów strzałkowych (Rysunek 1-2). W celu wizualizacji 3D zmian modelowania kości po rozszerzeniu szwów, metodę oczyszczania tkanek PEGASOS zastosowano do całych kości łytkowych po rozciągnięciu. Po perfuzji oddzielono kości kalwaryczne (Ryc. 3A) i kontynuowano odpowiedni proces PEGASOS (Tabela 1 i Tabela 2). Co ciekawe, kości łydkowe stały si...

Dyskusja

Zastosowaliśmy standardowy model myszy z rozszerzaniem szwów, aby obserwować regularne zmiany morfologiczne, które zachodzą co tydzień podczas całego miesięcznego cyklu przebudowy¹⁰. Model ten jest przydatny do badań nad przebudową i regeneracją kości kalwarycznej poprzez rozszerzanie szwów kalwarycznych, a także do badania różnych komórek szwów in vivo. Aby w pełni zaprezentować wyniki takich badań, potrzebna jest trójwymiarowa wizualizacja barwionych tkanek. Dlatego technologia PEGASOS,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% Wytrawianie kwasem	Xihubiom	E10-02/1807011
Czerwień alizarynowa	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIJSKI DRUT	A.J.WILCOCK	0,014''
Benzoesan benzylu	Sigma-Aldrich	B6630
Zieleń kalceinowa	Sigma-Aldrich	C0875
Siarczan miedzi(II), bezwodny	A603008		Sangon Biotech
	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laserowy mikroskop konfokalny	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH-metry	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A4034
Wodorowęglan sodu	Sangon Biotech	A500873
Chlorek sodu	Sangon Biotech	A610476
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S5881
Wiosna	TAOBAO	0,2 * 1,5 * 1 * 7
Azydowa sonda sulfo-cyjanininy3	Lumiprobe	A1330
tert-butanol	Sigma-Aldrich	360538	Chronić przed światłem. Nie zamrażać.
Transbond MIP Niewrażliwy na wilgoć podkład	3M Unitek	712-025
Transbond XT Światłoutwardzalna pasta adhezyjna	3M Unitek	712-035
Trietanoloamina	Sigma-Aldrich	V900257
sola fizjologiczna buforowana trisem	Sangon Biotech	A500027