Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65710

⸱

16 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Streszczenie

Szczepienie organoidów w unaczynione tkanki u modelowych zwierząt, takich jak błona kosmówkowo-omocznaniowa myszy lub piskląt z niedoborem odporności (CAM), okazało się skuteczne w modelowaniu neowaskularyzacji. CAM jest bogato unaczynioną błoną pozazarodkową, która wykazuje ograniczoną immunoreaktywność, stając się tym samym doskonałym modelem gospodarza dla przeszczepów komórek pochodzenia ludzkiego.

Ten artykuł opisuje strategię wszczepiania do CAM organoidów ludzkiego mózgu, zróżnicowanych na wielu etapach dojrzewania. Skład komórkowy organoidów mózgowych zmienia się z czasem, odzwierciedlając kamienie milowe rozwoju ludzkiego mózgu. Wszczepiliśmy organoidy mózgowe na odpowiednich etapach dojrzewania: ekspansji neuroepitelialnej (18 DIV), wczesnej neurogenezy (60 DIV) i wczesnej glejogenezy (180 DIV) do CAM zarodków kurczaków w dniu embrionalnym (E)7. Wszczepione organoidy mózgowe pobrano 5 dni później i przeanalizowano ich cechy histologiczne.

Nie wykryto histologicznych oznak neowaskularyzacji w przeszczepionych organoidach lub nieprawidłowych naczyniach krwionośnych sąsiadujących z przeszczepami. Ponadto zaobserwowano niezwykłe zmiany w składzie komórkowym przeszczepionych organoidów, a mianowicie wzrost liczby astrocytów glejowych fibrylarnych z dodatnim dodatnim białkiem i reaktywnymi białkami. Jednak zmiany cytoarchitektoniczne były zależne od etapu dojrzewania organoidów. Podsumowując, wyniki te sugerują, że organoidy mózgowe mogą rosnąć w CAM i wykazują różnice w cytoarchitekturze w zależności od ich etapu dojrzewania podczas szczepienia.

Wprowadzenie

Organoidy ludzkiego mózgu to nowa technika, która pozwala nam podsumować wczesny rozwój ludzkiego mózgu in vitro1,2,3. Niemniej jednak jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak unaczynienia, które odgrywa nieodzowną rolę nie tylko w homeostazie mózgu, ale także w jego rozwoju4. Oprócz dostarczania tlenu i składników odżywczych, coraz więcej dowodów sugeruje, że układ naczyniowy mózgu reguluje różnicowanie neuronów, migrację i synaptogenezę podczas rozwoju5,6. W związku z tym istnieje pilna potrzeba ustanowienia wiarygodnych modeli, które mogą dostarczyć brakującą sygnalizację naczyniową i strukturę organoidów mózgowych, zwiększając złożoność generowania organoidów w ludzkim mózgu7.

Wśród proponowanych metod unaczynienia, można rozważyć dwie główne kierunki: wszczepianie organoidów do żywego organizmu oraz technologie czysto in vitro kokulturujące komórki śródbłonka i komórki nerwowe8,9,10,11,12. Przeszczep domózgowy u myszy jest kosztowny i czasochłonny, co sprawia, że inne technologie są istotne dla prostszych modeli. Test błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) piskląt był szeroko stosowany do badania angiogenezy13,14,15. W ciągu ostatniej dekady kilka grup z powodzeniem wszczepiło różne typy organoidów, w tym kidney16,17, cardiac18 i tumor organoids19,20, do CAM. Niemniej jednak niewiele wiadomo na temat skuteczności, toksyczności/odrzucenia, efektu fizjologicznego i metod wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu do CAM. Innym interesującym i jeszcze niezbadanym aspektem jest tworzenie się chimerycznej bariery krew-mózg (BBB) między CAM a organoidowym interfejsem astrocytarnym. Wcześniejsze pionierskie prace sugerowały przypuszczalną możliwość wygenerowania BBB w CAM poprzez przeszczepienie astrocytów i pożywki kondycjonowanej przez astrocyty21,22,23. Jednak dojrzałe astrocyty wydają się nie być w stanie tego osiągnąć24,25. Tak więc indukowane przez astrocyty powstawanie bariery krew-mózg pozostaje dyskusyjne, a przeszczepienie organoidów ludzkiego mózgu pozwoliłoby nam rzucić światło na tę kontrowersję.

Ten artykuł wideo opisuje protokół przeszczepu organoidów ludzkiego mózgu in ovo do CAM, który sprzyja wzrostowi, poprawie i unaczynieniu, co skutkuje powstawaniem organoidów zawierających histologicznie kompatybilne elementy BBB. W tym miejscu przedstawiamy protokół zapewniający przeżycie zarodka kurczaka i informujemy o dopuszczalności CAM w celu podtrzymania wzrostu organoidów mózgowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zarodki kurczaka rasy White Leghorn (Gallus gallus) były leczone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych z Instytutu Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Komisji Nauk Przyrodniczych, Narodowej Rady ds. Badań Naukowych, USA, a eksperymenty zostały zatwierdzone przez Radę ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Doświadczalnych z Uniwersytetu w Barcelonie.

1. Niekierowane przygotowanie organoidów mózgowych

  1. Utrzymywać ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) H9 w mTESR1 wstępnie ogrzane w temperaturze pokojowej (RT) pod zbiegiem 70% na 6-dołkowych płytkach pokrytych Matrigelem rozpuszczonym w DMEM (1:40) w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Matrigel musi być przechowywany w lodzie do czasu użycia go jako powłoki zapobiegającej jego polimeryzacji.
  2. Generuj organoidy mózgowe zgodnie z protokołem mózgu bez kierowania 2.
    1. Dysocjować hESC H9 za pomocą 500 μl roztworu do dysocjacji komórek i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Zawiesić w mTESR1 zawierającym inhibitor ROCK Y27632 (końcowe stężenie 50 μM) i zasiać 9 000 komórek na basenie na wstępnie poddanej obróbce 96-dołkowej płytce o niskiej przyczepności.
    2. Gdy organoidy agregują się w mTESR1 zawierającym inhibitor ROCK Y27632 (końcowe stężenie 50 μM), przenieś je do pożywki indukcyjnej na 5-6 dni.
    3. Postępując zgodnie z protokołem organoidów mózgowych bez kierowania26, przenieś organoidy do pożywki indukcyjnej neuronów w ~ dniach 4-5.
    4. Gdy osiągną rozmiar i pierścień nabłonka nerwowego, przenieś je do lodowatej kropli Matrigel. Po polimeryzacji Matrigelu przenieś organoidy na 5-centymetrową szalkę Petriego o niskiej przyczepności z 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża do dojrzewania.
    5. Po 4 dniach umieść organoidy mózgowe w pobudzeniu orbitalnym.
  3. Organoidy do zbioru należy zebrać w świeżych DPBS bezpośrednio przed szczepieniem.

2. Utrzymanie jaj, aktywacja rozwoju i nakłucie skorupki jajka

  1. Zapłodnione jaja należy przechowywać (w dniu 0) w inkubatorze w temperaturze 18 °C do czasu użycia.
    UWAGA: W tej temperaturze nie rozwijają się, pozostając na tym samym etapie dojrzewania.
  2. Gdy jest to wymagane do użycia, inkubuj je w temperaturze 38 °C i wilgotności względnej 60% z miękkim kołysaniem pod kątem 45 °C.
  3. Pierwszego dnia oczyść powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem i osusz ją ręcznikiem papierowym, aby ją wysterylizować.
  4. Umieść bandaż samoprzylepny z papieru chirurgicznego, zwany dalej "bandażem", na wierzchu jajka, zakrywając komorę powietrzną jajka.
    UWAGA: Zapobiegnie to wpadaniu kurzu ze skorupki jajka do CAM, gdzie utknie.
  5. Wykonaj nakłucie perforacji komory powietrznej, zwane dalej otworem komory powietrznej (ACH), sterylną igłą 21 G x 11/2 '', delikatnie nakłuwając skorupkę jajka. Otwórz ACH na górnej końcówce jajka, aby uniknąć naruszania CAM, który w tym momencie leży oddzielony od skorupki.
  6. Aby znaleźć najlepszą pozycję do nakłucia ACH, użyj lampy, aby określić najcieńszą powierzchnię skorupki jajka na górnym końcu jajka. Bezpośrednia transmisja wiązki światła wskazuje najlepszą pozycję do wiercenia.
  7. Przykryj ACH nowym bandażem, aby chronić zarodek przed środowiskiem zewnętrznym i umieść jajo z powrotem w inkubatorze.
  8. Od tego momentu należy przerwać obracanie jaj w inkubatorze i utrzymywać jaja w pozycji pionowej z okienkiem skierowanym na górę.
    UWAGA: Ułatwi to rozwój zarodka, a CAM stanie się dostępny u góry z komorą powietrzną między zarodkiem a skorupką jaja, co pozwoli na późniejsze szczepienie.
  9. Otwórz ACH od dnia 1 do dnia 4. Żywotność wzrasta w 4 dniu (3 dni przed dniem szczepienia).

3. Przeszczepianie organoidów mózgowych

  1. Przeszczep należy wykonać w 7 dniu, kiedy CAM jest dobrze rozwinięty i unaczyniony, pokrywając komórkę jajową na całym zarodku.
  2. Zdejmij bandaż i przetrzyj powierzchnię skorupki jajka 70% etanolem, aby wysterylizować skorupkę jajka, przed ostrożnym poszerzeniem ACH do okna do szczepienia.
  3. Umieść nowy, większy bandaż zakrywający przedłużenie poza ostatnim oknem szczepienia, aby uniknąć wpadania fragmentów skorupki jaja do CAM podczas powiększania okna szczepienia.
    UWAGA: To większe okno jest potrzebne, aby wybrać najlepszą pozycję do szczepienia i do późniejszego szczepienia.
  4. Powiększ okienko do szczepienia, delikatnie nakłuwając skorupkę jajka, aż okienko osiągnie średnicę około 2 cm. Delikatnie usuń krawędzie okienka skorupki jajka pęsetą, aż okienko zostanie powiększone. Usuń pozostały kurz i kawałki skorupki jajka, które pozostaną przyczepione do bandaża, delikatnie odklejając bandaż.
  5. Umieścić organoid za pomocą pipety automatycznej P200. Odetnij końcówki sterylnymi i ostrymi nożyczkami, aby powiększyć otwór odpowiednio do wielkości organoidu i zapobiec uszkodzeniu organoidu lub użyj sterylnych końcówek przenoszących o szerokim przekroju. Zebrać organoid w maksymalnej objętości 50 μl PBS i przenieść go bezpośrednio do CAM, po stronie przeciwnej do lokalizacji zarodka.
  6. Upewnij się, że pozycja przeszczepu jest oddalona od żółtka, aby uniknąć jego pęknięcia podczas zbioru, a najlepiej umieść go w pobliżu naczynia krwionośnego.
  7. Umieścić kroplę 7 μl Matrigelu otaczającą organoid po umieszczeniu organoidu na CAM.
    UWAGA: Zapobiegnie to przemieszczaniu się organoidu po membranie.
  8. Zamknij okno za pomocą małego kawałka parafilmu pasującego dokładnie do rozmiaru okna i przymocuj go do skorupy za pomocą bandaża samoprzylepnego.
    UWAGA: Ważne jest, aby całkowicie zakryć okno parafilmem, aby uniknąć wysychania zarodka, jednocześnie umożliwiając wymianę gazową. Prawidłowo ogranicz zasięg okna, unikając przekraczania okna, ponieważ może to utrudnić wymianę gazową niezbędną do prawidłowego rozwoju zarodka27.

4. Pobieranie przeszczepionych organoidów

  1. Zbierz szczepione organoidy i otaczający je CAM w 12 dniu rozwoju kurcząt, co odpowiada 38 etapowi rozwoju hamburgera i Hamiltona (HH38)28, 5 dni po szczepieniu. Na tym etapie CAM jest w pełni zróżnicowany z dojrzałym unaczynieniem, podczas gdy zarodki piór pokrywają skrzydła, a także górną powiekę zarodka.
  2. Po zdjęciu bandaża samoprzylepnego należy jeszcze bardziej powiększyć okienko, aby ułatwić pobieranie próbki za pomocą nożyczek i cienkiej pęsety.
  3. W razie potrzeby zwizualizuj organoid za pomocą mikroskopii rozwarstwiania obuocznego, a następnie wykonaj 2-minutowy etap prefiksacji z 4% paraformaldehydem (PFA), aby pomóc w zbieraniu organoidów i CAM.
  4. Pobrać 1,5cm2 odcinek CAM zawierający organoid.
  5. Utrwalanie próbki
    1. Przemyć próbki 1x PBS i utrwalić je 4% PFA (w PBS, pH 7,2) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Następnie myć próbki przez 3 x 5 minut w PBS.
    2. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C w PBS z azydkiem sodu lub bezpośrednio kriochronić je w 30% sacharozie-PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Po poddaniu krioprotekcji należy zanurzyć próbki w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu podziału. Wytnij plastry tkanki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu i zbierz je na ksylanizowanych szkiełkach. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy zostaną użyte do barwienia.

5. Immunofluorescencja

  1. Usunąć OCT. z sekcji roztworem PBS z 0,1% Triton X-100 (PBS-T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Skrawki należy potraktować roztworem blokującym (BS) z 2% BSA, 3% roztworem PBS-T 0,01% surowicy osła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Rozcieńczyć wybrane przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w BS i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego dnia umyć próbki 3 x 10 minut w 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w BS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).
  6. Inkubować próbki przez 10 minut z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) w celu oznaczenia jąder komórkowych w RT, rozcieńczonych w PBS-T w rozcieńczeniu 1:1,000.
  7. Zamontuj szkiełka z medium montażowym i przykryj szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.
  8. Wykonaj wszystkie zdjęcia za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego o powiększeniu 2,5, 10, 20 i 40x.
  9. Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C.

6. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

UWAGA: Aby udowodnić, że szczepienie zadziałało, wykonaj barwienie H&E.

  1. Usuń OCT za pomocą PBS-T 0,1% na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przeprowadzić seryjne odwadnianie w okapie w następujący sposób: 10 min w wodzie destylowanej (DW), 45 s w hematoksylinie, 1 min w DW, 20 s w PBS, 2 x 30 s w 70% EtOH, 2 x 30 s w 80% EtOH, 2 x 30 s w 96% EtOH, 30 s w eozynie, 2 x 15 s w 96% EtOH, 2 x 15 s w 100% EtOH, 1 min w ksylolu-100% ETOH, 1 min w ksylolu, 1 min w ksylolu (świeżym).
  3. Zamontuj szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wybór harmonogramu dojrzewania zarodków do transplantacji
Eksperyment rozpoczyna się w dniu D0, kiedy zapłodzone jaja są inkubowane w temperaturze 38 °C i względnej wilgotności 60%. Błona chorioallantoiczna (CAM) to silnie unaczyniona błona pozazarodkowa, która rozwija się podczas inkubacji jaj. Powstaje ona w wyniku połączenia allantois i chorionu. W dniu D1, po 24 h inkubacji, wykonuje się nakłucie komory powietrznej, aby zapobiec przywieraniu CAM do wewnętrznej błony skorupki. Nakłucie komory powi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół z wieloma kluczowymi krokami, które zapewniają korzystny wzrost i rozwój organoidów ludzkiego mózgu po szczepieniu bez zakłócania przeżywalności zarodków kurczaków. Zalecamy użycie sterylnych igieł do nakłuwania komory powietrznej jaja po 24 godzinach inkubacji (dzień 1). Dodatkowo staraliśmy się również wykonać nakłucie w 4 dniu (po sprawdzeniu przez skorupkę jaja przy świetle, aby przetestować rozwój układu krwionośnego, aby mieć pewność, że pracujemy tylko ze zdrowymi zarod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Alcántara i dr Ortega z UB oraz reszcie członków laboratorium dr Acosty za wnikliwe dyskusje. S.A. jest profesorem zwyczajnym Serra-Hunter z Generalitat de Catalunya na Universitat de Barcelona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-TUBB3 [Tuj1], mysz BioLegend8012011:1,000
Anti-GFAP, królikGeneTexGTX1087111:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, koza.InvitrogenA-212061:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, kozaJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Zapłodnione jaja kurczaka White Leghorn (Gallus gallus)Granja Gibert (Cambrils, Hiszpania)
DAPIInvitrogenD13061:10,000
DPXSigma100579medium montażowe na bazie ksylenu 
Delikatne rozwiązanie dysocjacyjneCreativeBiolabsITS-0622-YT187roztwór do dysocjacji komórek
MatrigelBD Biosciences356234
Mowiol 4-88 nośnik montażowyMerk81381
Ręcznik papierowy, laboratoryjnyinhibitor Sigma-AldrichZ188956
ROCK Y27632MilliporeSCM07510 nM
Nożyczki chirurgiczne z ostrym czubkiemVWR470106-340
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe adhezyjneEprediaJ1800AMNZ

Bibliografia

  1. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  3. Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794(2022).
  4. Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707(2022).
  5. Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
  6. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  7. Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
  8. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  9. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  10. Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705(2020).
  11. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  12. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
  13. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
  14. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  15. Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452(2021).
  16. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
  17. Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995(2020).
  18. Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
  19. Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613(2021).
  20. Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663(2019).
  21. Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
  22. Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
  23. Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
  24. Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
  25. Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
  26. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
  27. Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
  28. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  29. Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
  30. Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
  31. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
  32. Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583(2017).
  33. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy mózgutransplantacja organoidówrozwój ludzkiego mózguszczepienie na błonę bielma (CAM)dojrzewanie organoidówbarwienie hematoksyliną i eozynąrozwój mikroglejumodel unaczyniony
Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.