Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Summary

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Abstract

Krajobraz komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza potencjalnie zawiera informacje do odkrycia biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych. Immunohistochemia multipleksowa jest cennym narzędziem do wizualizacji i identyfikacji różnych typów komórek odpornościowych w tkankach nowotworowych przy jednoczesnym zachowaniu informacji przestrzennych. Tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły analizy populacji komórek limfocytów, mieloidalnych i dendrytycznych w skrawkach tkanek. Począwszy od wycinania utrwalonych w formalinie skrawków zatopionych w parafinie, poprzez automatyczne procedury barwienia multipleksowego na zautomatyzowanej platformie, skanowanie preparatów pod mikroskopem obrazowania wielospektralnego, aż po analizę obrazów za pomocą opracowanego przez nas algorytmu uczenia maszynowego ImmuNet. Protokoły te można zastosować do różnych próbek guza, po prostu przełączając markery nowotworowe w celu analizy komórek odpornościowych w różnych przedziałach próbki (margines guza kontra margines inwazyjny) i stosując analizę najbliższego sąsiada. Analiza ta nie ogranicza się do próbek guza, ale może być również stosowana do innych (nie)patogennych tkanek. Ulepszenia sprzętu i przepływu pracy w ciągu ostatnich kilku lat znacznie skróciły czas realizacji, co ułatwia przyszłe zastosowanie tej procedury w warunkach diagnostycznych.

Introduction

Komórki odpornościowe odgrywają kluczową rolę w ochronie przed patogenami, takimi jak wirusy i bakterie, ale także przed komórkami rakowymi¹. W związku z tym układ odpornościowy w mikrośrodowisku guza (TME) jest bardzo obiecujący w odkrywaniu biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych². Nacieki komórek odpornościowych są skorelowane z rokowaniem w różnych typach raka, chociaż nie zostało to jeszcze wdrożone w opiece klinicznej^3,4. W większości typów nowotworów duża liczba cytotoksycznych limfocytów T i limfocytów T pomocniczych 1 i/lub niska liczba regulatorowych limfocytów T wiąże się z dobrymi rokowaniami. Trwają prace nad włączeniem tak zwanego "Immunoscore" do oceny stopnia zaawansowania TNM raka jelita grubego, przekształcając go w stopień zaawansowania TNM-I^5,6. Wynik immunologiczny jest uzyskiwany na podstawie całkowitej liczby limfocytów T (wykrytych za pomocą CD3) i cytotoksycznych limfocytów T (wykrytych za pomocą CD8) w dwóch różnych regionach guza: rdzeń guza kontra margines inwazyjny (IM) guzów. Zaproponowano również, że Immunoscore ma wartość prognostyczną, w przypadku innych typów nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc i rak piersi^6,7,8,9. Co więcej, nacieki komórek odpornościowych mogą również korelować z odpowiedzią na immunoterapię blokującą punkty kontrolne¹⁰. Jednak te biomarkery predykcyjne muszą zostać zwalidowane w badaniach prospektywnych, zanim będą mogły być rutynowo wdrażane w praktyce klinicznej. Co więcej, zaproponowano również, że pojedynczy biomarker będzie niewystarczający do miarodajnego przewidywania¹¹. W związku z tym zaproponowano stworzenie kompletnej mapy próbki pacjenta poprzez połączenie różnych biomarkerów jako bardziej kompleksowego biomarkera predykcyjnego w tak zwanym "immunogramie raka"¹².

Wśród metod badania komórek odpornościowych w TME, najstarszą i najbardziej znaną techniką jest immunohistochemia (IHC), rutynowo stosowana do testów diagnostycznych w wielu chorobach, zwłaszcza raku¹³. Technika ta przez długi czas ograniczała się do użycia jednego lub tylko kilku markerów¹⁴ i dlatego została wyparta w warunkach badawczych przez inne techniki, takie jak cytometria przepływowa i profilowanie ekspresji genów (GEP). Jednak tkanki nowotworowe utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), zwykle stosowane w rutynowej diagnostyce i badaniach, nie nadają się (optymalnie) do cytometrii przepływowej i GEP. Ponadto, chociaż GEP i cytometria przepływowa dostarczają wielu informacji na temat fenotypu i funkcji komórek, brak informacji przestrzennych jest główną wadą. W związku z tym niejednorodność w próbce, taka jak różnice w obszarach guza naciekanych przez komórki odpornościowe i wykluczonych z komórek odpornościowych, może pozostać niewykryta¹⁵. Opracowano nowatorskie platformy do analizy multipleksowej tkanek FFPE, takie jak multiplex IHC, obrazowanie cytometrii masowej i CO-Detection by indEXing (CODEX), które można wykorzystać do jednoczesnego wykrywania wielu markerów w obrębie przekroju tkanki¹⁶. Komórki odpornościowe w TME są szeroko badane w celu znalezienia najlepszych biomarkerów do immunoterapii. Jednak techniki multipleksowe i zautomatyzowana analiza obrazu stanowią przeszkody same w sobie.

Nasze laboratorium ma duże doświadczenie w barwieniu multipleksowym IHC przy użyciu metody wzmocnienia sygnału Opal/Tyramid (TSA) i zautomatyzowało to na platformie IHC (zobacz Tabelę Materiałów)^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31}. Zoptymalizowaliśmy panele komórek odpornościowych do wykrywania różnych podzbiorów limfocytów, komórek szpikowych i komórek dendrytycznych (DC). Tkanki, które zawierają gęste obszary komórek odpornościowych - dla limfocytów lub złożonych morfologii komórek (tj. komórek szpikowych i DC) - są szczególnie trudne do analizy, co wiąże się z ryzykiem przeszacowania lub niedoszacowania liczby obecnych komórek odpornościowych. Aby przezwyciężyć ten problem, nasza grupa 32, a ten potok uczenia maszynowego znacznie poprawił jakość wykrywania tych różnych typów komórek odpornościowych. Szczegółowy protokół od uzyskania materiału FFPE do analizy gęstości komórek odpornościowych w różnych przedziałach tkankowych i odległościach między typami komórek odpornościowych opisano tutaj.

Ten protokół opisuje, w jaki sposób multipleksowe panele IHC są wykonywane w Centrum Medycznym Uniwersytetu Radboud od czasu wdrożenia cyfrowego obrazowania patologii w 2022 roku. Opisane multipleksowe panele IHC mogą być stosowane w przypadku różnych nowotworów (np. płuc, prostaty, jelita grubego, pęcherza moczowego, piersi) z zastosowaniem przeciwciała pan-cytokeratyny jako markera nowotworowego lub w przypadku czerniaka z zastosowaniem przeciwciał związanych z melanocytami jako markerów nowotworowych. Te multipleksowe protokoły IHC zostały starannie zoptymalizowane pod względem stężenia przeciwciał pierwotnych, kombinacji fluoroforów i kolejności procedury barwienia. My i inni opisaliśmy wcześniej optymalizację panelu multipleksowego IHC^17,33,34,35. Panele Multiplex IHC można dostosować, ale opisane potoki analityczne muszą zostać ocenione i potencjalnie odpowiednio dostosowane lub ponownie przeszkolone. Opisane siedmiokolorowe multipleksowe protokoły IHC wykorzystują fluorofory Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), dzięki czemu łatwe rozmieszanie i szybkie skanowanie na imagerze jest możliwe dzięki "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). Barwienie i skanowanie dziewięciokolorowe nie jest opisane w tym protokole, ponieważ wymaga to jeszcze bardziej precyzyjnego dostrojenia konfiguracji eksperymentalnej i innego trybu skanowania w imagerze, który wykorzystuje przestrajalny filtr ciekłokrystaliczny.

Protocol

Materiał pacjenta, który jest pokazany w tym protokole, był częścią wcześniej przeprowadzonego badania i został oficjalnie uznany za zwolniony z zatwierdzenia etyki medycznej przez lokalną Komisję Etyki Medycznej Radboudumc zgodnie z holenderskim ustawodawstwem (numer pliku 2017-3164)³⁰.

1. Zbieranie materiału FFPE, wybór bloków i przygotowanie próbek

1. Odzyskaj identyfikatory bloków FFPE z plików pacjentów za pośrednictwem lekarzy prowadzących lub patologów. Sprawdź w lokalnych przepisach, czy wymagane jest pozwolenie etyczne.
2. Poproś o bloki FFPE z lokalnego archiwum patologicznego lub zewnętrznego szpitala (szpitali).
   UWAGA: Możliwe jest również, że materiał nowotworowy lub biopsja zostaną pobrane do konkretnego badania. Może to mieć miejsce w przypadku małych badań klinicznych lub badań na zwierzętach. W takich przypadkach za przetworzenie próbki tkanki może odpowiadać badacz.
3. Gdy dostępnych jest wiele bloków FFPE, wybierz najbardziej reprezentatywny blok FFPE zawierający żywotną tkankę nowotworową, najlepiej z otaczającą tkanką zrębu, oceniając szkiełka barwione hematoksyliną i eozyną (HE) (Rysunek 1).
   UWAGA: Zaleca się uzyskanie opinii eksperta w sprawie tej selekcji (np. patologa). Możliwe jest, że HE są niedostępne do oceny zawartości bloku FFPE i konieczne będzie wykonanie nowych do selekcji. Przejdź do sekcji 2, aby uzyskać opis.
4. Wytnij wstęgi FFPE o grubości 4 μm na mikrotomie.
   UWAGA: Grubość może wynosić od 1 μm do 6 μm bez zauważalnego wpływu barwienia; Jednak 4 μm jest najbardziej standardowe.
5. Zamontuj próbki na szkiełkach podstawowych w pozycji korzystnej dla płynności automatycznego stainera (rysunek 2A-C), stosując jedną z metod opisanych poniżej:
   1. Umieścić skrawki na powierzchni destylowanej wody o temperaturze 40 °C w łaźni wodnej, aby się rozciągnęły i podnieść je za pomocą szkiełka podstawowego.
      OR
      Szkiełka należy umieścić na płycie grzewczej o temperaturze 40 °C, pamiętając o zalaniu miejsca, w którym ma być zamontowana sekcja na szkiełku, kroplą wody destylowanej. Umieść sekcję na tej kropli za pomocą kleszczy i pozwól jej się rozciągnąć. Wchłoń wodę destylowaną za pomocą ręcznika papierowego i usuń nadmiar wody, stukając w szkiełko.
      UWAGA: Umieszczenie skrawków tkanki zbyt blisko etykiety szkiełka spowoduje nieoptymalne barwienie (Rysunek 2D,E). Zwykle montujemy 6-10 szkiełek na próbkę, aby wykonać różne multipleksowe panele IHC i mieć kopię zapasową.
6. Pozostawić zamontowane szkiełka do wyschnięcia w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 37 °C.
7. Do eksperymentu należy użyć zamontowanych szkiełek podstawowych lub przechowywać je w pudełkach w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Z naszego dotychczasowego doświadczenia wynika, że te zamontowane prowadnice mogą być przechowywane przez wiele lat przed przeprowadzeniem barwienia multipleksowego IHC.

2. Generowanie preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki z sekcji 2 należy wykonać w dygestoriach.

1. Odparafinować szkiełka w ksylenie (2 x 5 min).
2. Uwodnić w etanolu (99,6% 1 x 5 min; 95% 1 x 5 min; 70% 1 x 2 min). Alternatywnie zanurz szkiełka 3x w 99,6% etanolu.
3. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej (2 min).
4. Wybarwić jądra hematoksyliną (10 min).
5. Umyć szkiełka destylowanym H₂O (5 min).
6. Zabarwić szkiełka eozyną (5 min).
7. Odwodnić szkiełka, zanurzając 3x w 99,6% etanolu.
8. Zanurz szkiełka 2x w ksylenie.
9. Dodaj kilka kropli podłoża montażowego i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
10. Poczekaj, aż szkiełka stwardnieją i wyjmij je z dygestoria, gdy wszystkie chemikalia wyparują.

3. Wykonywanie monopleksu i multipleksu IHC w autostainerze

1. Oblicz, ile odczynnika jest potrzebne w zależności od liczby próbek do barwienia.
   UWAGA: Na jeden przebieg autostainer ma pojemność 30 szkiełek i potrzebuje ~18 godzin, aby ukończyć protokół multipleksowy IHC z sześcioma przeciwciałami. Gdy konieczne jest zabarwienie większej liczby szkiełek, każdej nocy w tygodniu (roboczym) można wprowadzić wiele partii; 4 noce po 30 zjeżdżalni = 120 zjeżdżalni tygodniowo.
   1. Przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki na początku tygodnia. System automatycznego stainera dozuje 150 μl odczynnika na szkiełko. Użyć pojemników do miareczkowania o pojemności 6 ml na odczynniki przeciwciała i opal, a pojemników o pojemności 30 ml na odczynnik blokujący i drugorzędową przeciwciało-peroksydazę chrzanową.
      UWAGA: Pojemniki o pojemności 6 ml posiadają wygodne wkłady, które w razie potrzeby można łatwo wyjąć i wymienić. Przy obliczeniach odczynników należy wziąć pod uwagę martwą objętość 1,6 ml lub 300 μl odpowiednio dla pojemnika o pojemności 30 ml lub pojemnika do miareczkowania o pojemności 6 ml.
   2. Rozcieńczyć wszystkie fluorofory Opal i digoksygeninę (DIG) w stosunku 1:100 w dostarczonym rozcieńczalniku; rozcieńczyć Opal780 w stosunku 1:25 w rozcieńczalniku przeciwciał. Rozcieńczyć wszystkie pierwszorzędowe przeciwciała w rozcieńczalniku z rozcieńczalnikiem określonym w pliku uzupełniającym 1.
2. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, uruchom monoplex IHC (Supplemental File 2) na szkiełkach zawierających zarówno tkankę kontrolną migdałków, jak i inne interesujące typy tkanek (nowotworowych) przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu multiplex IHC, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dobrze przygotowane.
   UWAGA: Monoplex IHC trwa ~3,5 godziny i można go sprawdzić przed końcem tego dnia pod kątem wzorców i intensywności sygnału. Jeśli niektóre sygnały są zbyt słabe (Rysunek 3), można dokonać korekty odczynników.
3. W celu korekcji autofluorescencji należy przygotować szkiełko z tkanką (nowotworową) zawierającą struktury autofluorescencyjne, takie jak krew i kolagen. Preparat ten należy przygotować jednocześnie ze szkiełkami monopleksowymi IHC, ale z odczynnikiem blokującym zastępującym przeciwciało i odczynnikami Opal (plik uzupełniający 3).
   UWAGA: W zasadzie taki preparat może być ponownie wykorzystany do obrazowania wielospektralnego do momentu, gdy korekcja autofluorescencji nie będzie już optymalna. Jednak w przypadku tkanek o wysokim poziomie autofluorescencji, takich jak mózg i wątroba, zaleca się użycie tej tkanki do korekcji autofluorescencji.
4. Przy każdym przebiegu multipleksu IHC należy załadować 29 próbek do systemu automatycznego barwienia za pomocą jednego szkiełka tkankowego w celu sprawdzenia wydajności każdego przebiegu multipleksu IHC.
5. Pobierz protokoły multipleksu IHC ze strony internetowej autostainera w zakładce Downloads (Pobrane) i dostosuj je tak, aby pasowały do każdego dostosowanego panelu multipleksu IHC³⁶. W przypadku multipleksowych IHC, patrz Plik uzupełniający 4, aby zapoznać się z protokołem, a w przypadku niestandardowych multipleksowych paneli IHC, patrz Plik uzupełniający 1.
6. Po zakończeniu protokołu barwienia wyjmij szkiełka z automatycznego stainera i umieść je w pojemniku z buforem do mycia.
7. Aby zapobiec zanieczyszczeniu systemu automatycznego barwienia DAPI, ponieważ próbki są już barwione w bardzo niskich stężeniach, należy nałożyć DAPI ręcznie przed pokryciem szkiełek nakrywkowych. Dodać dwie krople DAPI na ml buforu do płukania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   UWAGA: W przypadku tworzenia bibliotek spektralnych ważne jest, aby w próbkach nie było żadnych barwników DAPI. Możliwa jest również jedna kropla DAPI na ml buforu do przemywania i 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.
8. Umyj szkiełka 3x buforem do mycia.
9. Umieść szkiełka na ręcznikach papierowych i strzepnij nadmiar bufora do mycia ze szkiełek.
10. Odpipetuj kilka kropli podłoża mocującego na tkankę.
11. Delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu medium montażowego, aby zakryć szkiełko pod kątem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
12. Usuń nadmiar podłoża montażowego i pęcherzyków powietrza, delikatnie naciskając szklane szkiełko nakrywkowe kleszczami lub czystą końcówką pipety.
13. Pozostaw szkiełka w spokoju przez ~24 godziny, zanim podłoże montażowe zastygnie, albo poziomo na płytce do szkiełek mikroskopowych, albo załaduj je bezpośrednio do mikroskopu w celu obrazowania.
14. Po zestaleniu się podłoża montażowego lub po zobrazowaniu szkiełek należy przechowywać szkiełka w pojemnikach mikroskopowych w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie za pomocą cyfrowego imagera patologicznego i adnotacji do plików skanowania

1. Włącz wywoływarkę, naciskając przycisk zasilania po prawej stronie urządzenia. Po upływie co najmniej 20 sekund uruchom oprogramowanie.
   UWAGA: Poczekaj 20 sekund, aby sprzęt uruchomił się poprawnie.
2. Załaduj szkiełka do kaset na cztery szkiełka.
   1. Opcjonalnie: Wprowadź slajdy do pliku .csv, dla którego można pobrać szablon (Plik uzupełniający 5). Aby załadować plik .csv do programu, zapisz go w folderze C:\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States.
      UWAGA: Jednocześnie można załadować maksymalnie 20 kaset lub 80 szkiełek.
3. Ustawienia referencyjne
   1. Otwórz Sprawdź pulpit nawigacyjny z menu głównego.
      UWAGA: Kaseta ze szkiełkami referencyjnymi jest dostarczana przez producenta i opcjonalnie może być przechowywana na stałe w gnieździe 20.
   2. Raz w tygodniu należy ustawić odniesienia w jasnym polu na dostarczonym slajdzie zgodnie z instrukcjami producenta (zajmuje to kilka minut).
   3. Raz w miesiącu należy ustawić odniesienia fluorescencji na dostarczonym szkiełku zgodnie z instrukcjami producenta (trwa to dłużej niż 1 godzinę).
4. Sporządzanie lub dostosowywanie protokołu
   1. Wróć do menu głównego i kliknij Edytuj protokół, aby utworzyć protokół.
   2. Kliknij przycisk Nowy... i wybierz opcję Fluorescencja jako tryb obrazowania, Multispektralne skanowanie slajdów i Opal Polaris 5, 6 i 7 color w opcji Staining (Barwienie).
   3. Nadaj protokołowi nazwę w polu Nazwa protokołu i zapisz ją w badaniu, wybierając badanie z listy Dostępne badania lub utwórz badanie w obszarze Utwórz nowe badanie | Nazwa badania.
   4. Zakończ, wybierając pozycję Utwórz protokół.
   5. Do tego typu skanowania należy używać tylko lewego okna Ustawienia skanowania slajdów wielospektralnych; ignorować okno po prawej stronie Ustawienia pola wielospektralnego.
   6. Skanuj slajdy w różnych powiększeniach. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, skanuj w 20-krotnym powiększeniu, pozostawiając rozdzielczość pikseli na 0,50 μm (20x).
   7. Ustaw czasy ekspozycji, wybierając opcję Scan Exposures (Ekspozycje skanowania).
   8. Załaduj kasetę, w której trzymane są prowadnice, wybierając odpowiednią szczelinę w opcji Nośnik ładunku.
   9. Aby ułatwić nawigację po slajdach, wybierz opcję Pobierz przegląd, aby uzyskać obraz ogólny nośnika zawierającego slajdy po załadowaniu nośnika. Aby włączyć lub wyłączyć tę funkcję automatycznie, kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu, przejdź do Preferencje... i zaznacz opcję włączoną lub wyłączoną w obszarze Obraz przeglądu nawigacji, aby włączyć opcję Automatycznie nośnik obrazu podczas ładowania dla zadań interaktywnych.
   10. Ustaw czasy ekspozycji dla każdego filtra na odpowiednich szkiełkach barwionych monopleksem IHC, wybierając opcję Ustaw ekspozycje skanowania i znajdując różne miejsca z sygnałem dodatnim. Ręcznie ustaw ostrość lub użyj automatycznego ustawiania ostrości i wybierz opcję Autoekspozycja po przełączeniu na filtr zgodny z tym sygnałem. Wybierz najniższy czas naświetlenia, aby zapobiec prześwietleniu i zrób zdjęcia każdego slajdu w celach informacyjnych po ustawieniu wszystkich czasów ekspozycji (Rysunek 3).
       UWAGA: Zignoruj opcję Ustaw ekspozycje pola dla tego typu skanowania.
   11. Ustaw czasy ekspozycji na szkiełku barwionym multipleksem, sprawdzając wszystkie filtry w kilku miejscach z sygnałem dodatnim. Skróć najkrótszy czas automatycznej ekspozycji o 10%, aby zapobiec prześwietleniu, i zrób kilka zdjęć po ustawieniu wszystkich czasów ekspozycji.
   12. Zrób zdjęcia niezabarwionego slajdu w celu kompensacji autofluorescencji, używając filtra Sample AF do nawigacji (Rysunek 3H).
       UWAGA: Interesujące są lokalizacje z erytrocytami i strukturami kolagenowymi. W przypadku silnych obszarów autofluorescencyjnych może być konieczne skrócenie czasu ekspozycji filtra Opal480. Jeśli sygnał Opal480 jest wystarczająco silny, powinien być nadal dobrze oddzielony (patrz sekcja 6) od struktur autofluorescencyjnych ze względu na implementację zastrzeżonego filtra Sample AF.
   13. Ocenić jakość barwienia i obrazowania za pomocą oprogramowania (patrz punkty 5 i 6; Rysunek 4, Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S1 i Rysunek uzupełniający S2).
   14. Wybierz przycisk Zapisz..., aby upewnić się, że protokół i jego dostosowane czasy ekspozycji są zapisane w protokole.
       UWAGA: Gdy protokół jest już zapisany, oprogramowanie nie wysyła do tej pory dodatkowego powiadomienia o niezapisanych zmianach.
5. Automatyczne skanowanie slajdów
   1. Wróć do menu głównego i kliknij Skanuj slajdy, aby zeskanować slajdy.
   2. Ręcznie wprowadź nazwy/identyfikatory slajdów oraz odpowiadające im zadania i protokół w obszarze Konfiguruj zadania lub automatycznie z wcześniej utworzonego pliku .csv za pomocą opcji Załaduj ustawienia.
   3. Kliknij przycisk Skanuj, aby rozpocząć skanowanie.
   4. Poczekaj, aż pojawi się okno, aby zapisać konfigurację skanowania. Kliknij przycisk Zapisz, aby użyć ustawień domyślnych i rozpocząć skanowanie.
      UWAGA: Skanowanie tą metodą zajmuje ~10-20 minut na slajd. W zależności od liczby slajdów skanowanie może potrwać nawet cały dzień.
   5. Sprawdź, czy skanowanie slajdów zakończyło się pomyślnie dla wszystkich slajdów, szukając komunikatów o błędach. Aby dowiedzieć się, czy skanowanie zakończyło się pomyślnie, poszukaj zapisanego pliku skanowania całego slajdu Akoya (.qptiff) skanu i całej tkanki w skanie.

5. Adnotacja danych za pomocą przeglądarki slajdów

1. Wróć do menu głównego i kliknij Uruchom Phenochart, aby otworzyć przeglądarkę slajdów.
2. Jeśli skanowane pliki nie są bezpośrednio widoczne, wyznacz ich lokalizację, klikając najpierw ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu, przejdź do Zmień lokalizację przeglądarki... i losowo wybierz jeden z plików .qptiff interesującego Cię zestawu danych.
   UWAGA: Dane są domyślnie przechowywane w folderze D:\Data\VectraPolaris.
3. Załaduj slajd, zaznaczając go i klikając przycisk Załaduj w prawym górnym rogu lub klikając go dwukrotnie.
4. Zaloguj się, klikając przycisk Zaloguj się w prawym górnym rogu.
   UWAGA: Nazwa użytkownika może składać się tylko z inicjałów lub imienia i jest używana do śledzenia, kto dodał jakie adnotacje.
5. Aby przeprowadzić rozmieszanie, kliknij przycisk Unmixing u góry i wybierz opcję Opal + AF.
   UWAGA: Jest to przydatne do pozbycia się części sygnału autofluorescencyjnego w pobliżu kanału Opal 480, ale nie wszystkich.
6. Aby wygenerować algorytm przetwarzania wsadowego danych, wybierz reprezentatywne obrazy za pomocą opcji Stempel, korzystając z opcji dla projektów inForm 1 x 1 obrazów (rozmiar obrazu: 928 μm x 696 μm).
   UWAGA: Kilka reprezentatywnych znaczków zawierających guz, zrąb, tło i różne typy komórek odpornościowych jest wybieranych w całym zestawie danych, aby uzyskać ~ 20-30 obrazów.
7. W zależności od tego, co ma być analizowane w tkance, wybierz obszar zainteresowania za pomocą opcji ROI i wybierz dla Partia w formie. Ręcznie usuń obrazy, które nie muszą być analizowane, takie jak obrazy znajdujące się zbyt daleko od guza lub w tle.
   UWAGA: Zwykle rysujemy ROI wokół całego guza i wybieramy jeden dodatkowy obraz z dala od obszaru guza, aby móc przeanalizować IM ~0,5 mm.
   Jeśli narysowany zwrot z inwestycji jest stosunkowo niewielki, będzie on składał się z 2-9 połączonych obrazów 20x. Ponieważ nie jest to przez nas preferowane, należy ręcznie stemplować tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (wybraną dla partii inForm), aby to obejść.
8. Po zakończeniu dodawania adnotacji pozwól, aby adnotacje zostały automatycznie zapisane i załaduj następny slajd.
9. Podczas procesu dodawania adnotacji sprawdź, czy slajdy są poprawnie zeskanowane.
   1. Jeśli brakuje pliku .qptiff lub szkiełko nie zostało pomyślnie zeskanowane, sprawdź, czy na szkiełku znajduje się jakaś chusteczka, wyczyść szkiełko 70% etanolem i zeskanuj ponownie.
   2. Jeśli tkanka nie zostanie w pełni zeskanowana, przez co pominięty zostanie potencjalnie ważny obszar (guza), lub jeśli skanowanie ważnego obszaru było nieostre, wyczyść szkiełko 70% etanolem i zeskanuj ponownie.
      UWAGA: W obu przypadkach pomocne może być również otoczenie tkanki markerem na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby pomóc systemowi zlokalizować tkankę i spróbować ponownie zeskanować (Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S3). W naszych rękach cienki czerwony marker sprawdził się lepiej niż gruby marker.
10. Po zakończeniu skanowania i adnotacji wszystkich próbek należy wykonać kopię zapasową danych, przechowując je na innym komputerze lub dysku zewnętrznym.

6. Widmowe rozmieszanie

1. Otwórz oprogramowanie do automatycznej analizy obrazów inForm.
2. Załaduj obrazy do oprogramowania za pomocą Plik | Otwórz obraz; Wybierz pliki .qptiff. Poczekaj, aż stemple oznaczone w kroku 5.6 jako projekty inForm zostaną załadowane do projektu.
3. Załaduj pliki .qptiff, które są obrazowane w celu kompensacji autofluorescencji.
4. Aby skompensować autofluorescencję, użyj narzędzia Wybierz autofluorescencję na obrazie, aby narysować linię na obrazie od niezabarwionego slajdu przez różne typy struktur, które są autofluorescencyjne, takie jak erytrocyty i kolagen.
5. W sekcji Edit Markers and Colors... (Edytuj znaczniki i kolory) przypisz nazwy znaczników, które odpowiadają fluoroforowi Opal, i dostosuj kolor do preferowanego.
6. Aby rozmieszać fluorofory, wybierz opcję Przygotuj wszystko w lewym dolnym rogu.
7. Przejrzyj obrazy i sprawdź, czy wszystkie sygnały są widoczne na obrazach i czy rozmieszanie poszło dobrze. Wybierz ikonę gałki ocznej, aby wyłączyć i włączyć wszystkie znaczniki jeden po drugim, aby sprawdzić jakość.
8. Opcjonalnie można wytrenować algorytmy segmentacji tkanek, segmentacji komórek i fenotypowania.
9. Przejdź do zakładki Eksport i utwórz nowy pusty katalog eksportu, klikając przycisk Przeglądaj... pod Eksportuj katalog.
10. W obszarze Obrazy do wyeksportowania: wybierz opcję Composite Image and Component Images (Multi-image TIFF) (Obrazy kompozytowe i składowe (TIFF z wieloma obrazami).
11. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz | Projekt, aby zapisać algorytm w określonej lokalizacji.
12. Przejdź pionowo do karty Analiza wsadowa po lewej stronie, aby przeprowadzić przetwarzanie wsadowe slajdów.
13. Wybierz opcję Utwórz oddzielne katalogi dla każdego elementu w obszarze Opcje eksportu.
14. Aby dodać slajdy do analizy, wybierz pliki .qptiff pod przyciskiem Dodaj slajdy... i załaduj je do analizy wsadowej.
15. Wybierz pozycję Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe slajdów.

7. Rysunek ROI

1. Utwórz folder zawierający tylko pliki składowe z sekcji 6, ale zachowaj nienaruszoną hierarchiczną strukturę folderów (pliki składowe znajdują się w folderach nazwanych przez próbkę/slajd).
2. Otwórz oprogramowanie do przeglądania całych slajdów QuPath.
3. Kliknij Utwórz projekt po lewej stronie i wybierz/utwórz nowy pusty folder o odpowiedniej nazwie.
4. Kliknij przycisk Automatyzuj i wybierz opcję Pokaż edytor skryptów.
5. Skopiuj i wklej skrypt, który jest dostępny w pliku uzupełniającym 7. W wierszu 34 zmień lokalizację na lokalizację, w której znajdują się foldery slajdów zawierające wszystkie pliki składowe (folder utworzony w kroku 7.1.
6. Wybierz opcję Uruchom i wróć po zakończeniu zszywania wsadowego slajdów (następnego dnia lub później), aby kontynuować.
7. Przeciągnij wygenerowane pliki .ome.tif do projektu QuPath i zapisz je jako projekt.
8. Gdy automatycznie pojawi się nowe okno, wybierz Ustaw typ obrazu | Fluorescencja i kliknij przycisk Importuj.
9. W menu po lewej stronie obserwuj listę próbek; kliknij dwukrotnie na jedną, aby otworzyć próbkę (Rysunek 5A).
10. Aby dostosować intensywność kanałów, aby były lepiej widoczne, kliknij ikonę kontrastu.
11. Wybierz wszystkie kanały i kliknij przycisk Resetuj.
12. Wyłącz autofluorescencję.
13. Aby rozpocząć rysowanie ROI dla guza, kliknij ikonę kontrastu i wybierz opcję Pokaż skalę szarości. Wybierz kanał markera nowotworowego i dostosuj intensywność, aby był optymalnie widoczny (Rysunek 5B).
14. Kliknij narzędzie pędzla, aby z grubsza narysować ROI guza.
15. Wybierając narzędzie różdżki, kliknij poza obszarem ROI, naciskając Alt, aby wygładzić ROI od zewnątrz (Rysunek 5C).
16. Połącz oddzielone kawałki guza z tym samym zwrotem z inwestycji.
17. Nadaj ROI odpowiednią nazwę, taką jak guz, klikając prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie; wybierz opcję Ustaw właściwości i wprowadź nazwę.
18. Aby utworzyć ROI dla IM, rozwiń istniejący ROI z regionu guza, wybierając: Obiekty | Adnotacje... | Rozwiń adnotacje.
19. Wybierz, jaki powinien być rozmiar promienia rozwinięcia i wybierz Usuń wnętrze i Ogranicz do rodzica (Rysunek 5D).
20. Kliknij ikonę kontrastu, wybierz kanał autofluorescencji i dostosuj intensywność, aby był optymalnie widoczny.
21. Kliknij różdżkę i dostosuj ROI, naciskając alt, aby wygładzić ROI z zewnątrz i usunąć wszelkie tło, które nie powinno być częścią tego ROI.
22. Nadaj zwrotowi ROI odpowiednią nazwę, taką jak inwazyjny margines lub IM, klikając prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie, wybierz Ustaw właściwości, wprowadź nazwę i opcjonalnie zmień jej kolor na zielony.
23. Zapisz adnotacje: Plik | Eksport obiektów | Eksportuj wszystkie obiekty i kliknij przycisk OK z domyślnym wyborem opcji Eksportuj jako FeatureCollection i zapisz go w preferowanej lokalizacji.

8. Wykrywanie komórek odpornościowych

1. Ponieważ ImmuNet wykorzystuje dane komponentów (wielokanałowe pliki TIFF) zarówno do trenowania, jak i wnioskowania, podziel adnotacje na zestawy treningowe i walidacyjne. Aby wytrenować model, wykonaj kroki opisane w pliku Readme repozytorium, zastępując przykładowy zestaw danych i adnotacje żądanymi danymi. Oprócz różnych komórek odpornościowych, podaj modelowi negatywne przykłady, robiąc adnotacje w tle w miejscach, które nie powinny być rozpoznawane jako komórka zainteresowania: komórki nowotworowe, inne komórki lub "brak komórek" (struktury, które można pomylić z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania); zobacz publikację ImmuNet, aby uzyskać szczegółowe informacje³².
2. Korzystając z adnotacji walidacji, upewnij się, że wydajność jest zadowalająca. Przyjrzyj się współczynnikowi błędów na typ adnotacji — odsetek adnotacji walidacji, które nie zostały wykryte przez model — najprostsza metryka oceny. Oceń wydajność w odniesieniu do wyników fałszywie dodatnich, wykonując kilka w pełni opisanych zwrotów z inwestycji i obliczając wyniki F.
3. Oprócz oceny ilościowej, przeprowadź wizualną inspekcję prognozy, aby uzyskać jakościowe zrozumienie błędów, które model ma tendencję do popełniania (Rysunek 6, Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S4 i Rysunek uzupełniający S5). Jeśli wydajność modelu zostanie oceniona jako niewystarczająca, zwizualizuj przewidywanie dla niektórych kafelków zgodnie z opisem w repozytorium i sprawdź, które witryny są najbardziej podatne na błędy. Twórz więcej adnotacji w takich witrynach i ponownie uruchamiaj trenowanie i ocenę modelu.
4. Po osiągnięciu docelowej wydajności uruchom wnioskowanie dla całego zestawu danych zgodnie z opisem w sekcji Wnioskowanie dla całego zestawu danych w pliku Readme repozytorium. Użyj uzyskanych plików .csv z predykcją modelu jako danych wejściowych do analizy danych (w tym celu napisz skrypt w języku Python lub R).

9. Predykcja fenotypowania i analiza danych

UWAGA: W tej sekcji podajemy przykład prostej analizy danych dla pojedynczej próbki czerniaka wybarwionej panelem limfocytów, który łączy lokalizacje komórek odpornościowych zidentyfikowane przez ImmuNet (sekcja 8) i ROI wyznaczone za pomocą QuPath (sekcja 7). Analiza została przeprowadzona w R 4.1.1 (skrypt jest dostarczany jako plik uzupełniający 8). Skrypt wymaga pakietów: plyr 1.8.8, dplyr 1.0.8, tidyr 1.2.0, sf 1.0-7, ggplot2 3.4.0, RANN 2.6.1 i RColorBrewer 1.1-2, które można zainstalować za pomocą polecenia install.packages(). Jako dane wejściowe pobierany jest plik .csv z przewidywaniami ImmuNet dotyczącymi próbki oraz plik z ROI wyeksportowany z QuPath. Kroki 9.1-9.6 opisują analizę pojedynczej próbki wykonywaną w dostarczonym skrypcie, a sekcje 9.7-9.9 opisują opcje analizy wielu próbek.

1. Po załadowaniu przewidywań ImmuNet do R, określ progi przewidywanej ekspresji markerów, wykreślając markery definiujące fenotypy względem siebie i wybierając progi, które najlepiej oddzielają populacje.
   UWAGA: Strategia bramkowania zastosowana dla danej próbki jest pokazana w Rysunek 7B. Strategie bramkowania dla paneli komórek szpikowych i dendrytycznych są pokazane w pliku uzupełniającym 6: rysunek uzupełniający S6 i rysunek uzupełniający S7.
2. Po określeniu progów, użyj ich, aby przypisać każdej predykcji ImmuNet fenotyp zdefiniowany w panelu. W niektórych przewidywaniach należy zauważyć, że żaden z przewidywanych markerów nie przekracza progu lub kombinacja markerów uznanych za wyrażone po progowaniu może być niespójna (np. przewidywania CD3 ⁺ CD20 ⁺ w panelach limfocytów). Jeśli w kroku 8.3 zostanie osiągnięta dobra wydajność modelu, ułamek takich przewidywań będzie niewielki; Odfiltruj je przed analizą.
3. Aby oddzielnie przeanalizować ROI dla guza i jego marginesu inwazyjnego do 100 μm narysowanego w QuPath, załaduj odpowiednie pliki GeoJSON w R i dla każdej prognozy określ ROI, w którym mieści się prognoza.
4. W celu sprawdzenia poczytalności i w ramach eksploracyjnej analizy danych, wizualizuj komórki odpornościowe znajdujące się w próbce oddzielnie w odpowiednich ROI wraz z granicami ROI (Rysunek 7A).
5. Teraz oblicz gęstości różnych komórek odpornościowych osobno dla każdego ROI. Gęstości stwierdzone w danej próbce przedstawiono w tabeli 1.
6. Jeśli dostępnych jest wiele próbek, zwizualizuj rozkład gęstości komórek. Przekształć logarytmicznie wartości gęstości, aby uzyskać wartości o rozkładzie normalnym.
   UWAGA: Gdy liczba niektórych fenotypów wynosi 0, nie można ich przekształcić logarytmicznie, co prowadzi do brakujących wartości. Aby przezwyciężyć ten problem, można zastosować wygładzanie LaPlaca, dodając najpierw 0,5 do wszystkich liczb komórek, a następnie dzieląc je przez powierzchnię.
7. Przeanalizuj wartości gęstości i wykreśl je za pomocą wybranego oprogramowania (Rysunek 8).
8. Zachowane lokalizacje komórek umożliwiają analizę przestrzenną. Na przykład dla każdej wykrytej komórki odpornościowej znajdź najbliższego sąsiada, a następnie dla każdego fenotypu oblicz procent przypadków, w których różne fenotypy występują jako najbliższy sąsiad.
   UWAGA: Ponieważ liczba komórek NK znalezionych w tej próbce była bardzo mała, wykluczyliśmy je z tej analizy. Uzyskane wyniki dla ROI guza i IM są podane w Rysunek 9.

Results

Bloki FFPE zawierające tkankę nowotworową zostały wybrane na podstawie raportów patologicznych i preparatów barwionych HE. Kiedy wiele zmian nowotworowych jest wycinanych od pacjenta i/lub próbki guza są duże, są one dzielone na wiele bloków FFPE. Preferujemy analizę komórek odpornościowych zarówno w przedziale guza, jak i w tak zwanym marginesie inwazyjnym (IM) guza. IM to nienowotworowa tkanka zrębowa, która przylega do guza. Dlatego, gdy dostępnych jest wiele bloków FFPE dla jednej próbki guza, wybierane są bloki FFPE zawierające oba typy tkanek. Jak widać na szkiełkach barwionych HE, jeden blok FFPE zawierał tkankę nowotworową i tkankę zrębu przylegającą do guza (Figura 1A). Inny blok FFPE z tego samego guza zawierał znacznie mniej otaczającej tkanki zrębu (Ryc. 1B). Jednak w przypadku niektórych próbek tkanek nie ma wyboru w blokach FFPE lub IM nie występuje w żadnym z bloków FFPE. Dzieje się tak często w przypadku biopsji (igłowych), o których należy pamiętać podczas interpretacji danych.

Rysunek 1: Preparaty z próbką czerniaka wybarwione HE. (A) Przykład próbki guza z tkanką zrębu przylegającą do guza (IM) w prawym górnym rogu próbki (oznaczonej czarnymi grotami strzałek). (B) Inna próbka z tej samej zmiany nowotworowej z niewielką ilością lub brakiem tkanki zrębu w próbce. Podziałka = 5 mm. Skróty: HE = hematoksylina i eozyna; IM = margines inwazyjny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Multipleksowe barwienie IHC z proponowanym siedmiokolorowym panelem (Plik uzupełniający 4) można wykonać ręcznie w 3-dniowym procesie barwienia (biorąc pod uwagę normalne godziny pracy) lub w nocy w autostainerze. W przypadku korzystania z automatycznego stainera, sekcje muszą być zamontowane w określonym miejscu na szkiełku, które umożliwia optymalną płynność systemu (Rysunek 2A). Gdy sekcje są prawidłowo zamontowane na prowadnicach (Rysunek 2B), zostaną one równomiernie wybarwione (Rysunek 2C). Jeśli sekcje nie są optymalnie zamontowane na szkiełku podstawowym (Rysunek 2D), często skutkuje to nieoptymalnym wzorem barwienia ( Rysunek 2E), ponieważ płyny automatycznego barwienia nie docierają do (kompletnej) tkanki. Może się to zdarzyć, gdy próbki są bardzo duże lub gdy zamontowane szkiełka są dostarczane przez kogoś, kto nie jest świadomy tego problemu. W takich przypadkach do analizy należy wybrać tylko dobrze zabarwioną część szkiełka. Innym wyborem dla tego typu próbek może być ich ręczne barwienie w celu optymalnego rozprowadzenia cieczy.

Rysunek 2: Montaż sekcji FFPE do szkiełka i uderzenie. (A) Schemat miejsca montażu na szkiełku w celu optymalnego zabarwienia na autostainerze. (B) Przykład prawidłowo zamontowanego zamka. (C) Prawidłowo zamontowane szkiełka skutkują równomiernym wycinkiem tkanki. (D) Przykład nieoptymalnie zamontowanej prowadnicy. (E) Nieoptymalnie zamontowane szkiełka mogą spowodować niekompletny wycinek tkanki, jak widać po lewej stronie tego obrazu. Podziałka = 5 mm. Skrót: FFPE = utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gdy duże eksperymenty IHC multipleksowe są wykonywane w wielu rundach barwienia i trzeba przygotować duże ilości roztworów, najlepiej jest najpierw przetestować te odczynniki w monopleksowym przebiegu IHC przed przejściem do multipleksu IHC. Monoplex IHC jest sprawdzany za pomocą cyfrowego imagera patologicznego pod kątem oczekiwanych wzorów barwienia, a czasy ekspozycji są ustawiane za pomocą odpowiednich filtrów na szkiełkach kontrolnych (Rysunek 3A-H). Tkanka migdałków jest używana jako kontrola pozytywna dla większości markerów komórek odpornościowych. Ponieważ czas ekspozycji na DAPI w tkance kontrolnej migdałków jest zawsze wyższy niż w innych tkankach (Rysunek 3G), czas ekspozycji na DAPI należy ustawić dla typu tkanki, która ma być badana. Regularne czasy naświetlania przy tego typu skanowaniu wynoszą od 1 ms do 30 ms, w zależności od fluoroforu i filtra (Rysunek 3I). Gdy monopleksowy IHC przekroczy te liczby lub wzór barwienia nie jest tak wyraźny, jak oczekiwano, roztwór przeciwciała należy dostosować lub wymienić. W przedstawionym tutaj przykładzie zdecydowaliśmy się zwiększyć stężenie FOXP3 (Rysunek 3C i Rysunek 3I), aby intensywność była bardziej zbliżona do innych markerów. Autofluorescencja może być również silniejsza w innych tkankach niż w tkance kontrolnej migdałków. W naszych ustawieniach czas naświetlania filtra Sample AF wynosi od 25 ms do 50 ms (Rysunek 3H,I).

Rysunek 3: Ustawienie czasów ekspozycji na monopleksowych IHC i niebarwionych próbkach kontrolnych. (A) CD20 - sygnał Opal 480 w tkance kontrolnej migdałków. (B) CD3 - sygnał Opal 520 w tkance kontrolnej migdałków. (C) FOXP3 - sygnał Opal 570 w tkance kontrolnej migdałków. (D) CD56 - sygnał Opal 620 w tkance kontrolnej migdałków (E) CD8 - sygnał Opal 690 w tkance kontrolnej migdałków. (F) Marker nowotworowy - sygnał Opal 780 w tkance kontrolnej migdałków. (G) Sygnał DAPI w tkance kontrolnej migdałków jest często słabszy niż typ tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. (H) Autofluorescencja - sygnał AF próbki w tkance kontrolnej guza. (I) Zrzut ekranu z czasami naświetlania przed dostosowaniem go do 10% i sprawdzeniem na multipleksowych szkiełkach barwionych IHC. Podziałka = 100 μm. Skróty: AF = autofluorescencja; IHC = immunohistochemia; DAPI = 4'6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po wykonaniu multipleksu IHC, czasy ekspozycji są dostosowywane z ustawień multipleksu IHC, sprawdzając kilka multipleksowych slajdów IHC i wybierając automatyczną ekspozycję. W przypadku tego typu skanowania nie ma opcji ochrony przed nasyceniem, dlatego niezwykle ważne jest, aby unikać ustawiania zbyt wysokiej ekspozycji, unikając w ten sposób prześwietlenia. Nadmierna ekspozycja utrudnia widmowe rozmieszanie fluoroforów. Często nie ustawiamy czasów naświetlania przekraczających czasy naświetlania, które były oparte na monopleksie IHC i skracamy czasy naświetlania tylko dla markerów, które są silniejsze w multipleksie IHC (Rysunek 3G i Rysunek 4A). Dzięki automatycznej ekspozycji w różnych miejscach na kilku slajdach można zaobserwować, że czasy naświetlania kilku filtrów są nadal zbyt długie. Należy je ustawić na najniższą wartość obserwowaną podczas korzystania z ustawienia automatycznej ekspozycji i odjąć kolejne 10% wartości, aby zapobiec prześwietleniu w innych niewidocznych miejscach (Rysunek 4A). Dzięki tej metodzie czasy naświetlania mogą być krótsze dla niektórych filtrów niż te, które zostały ustawione na monopleksie IHC. Jednak przy udanym eksperymencie IHC z multipleksem wszystkie markery powinny być obserwowalne, przynajmniej na slajdzie kontrolnym (Rysunek 4B-H, plik uzupełniający 6: rysunek uzupełniający S1 i rysunek uzupełniający S2). Należy wziąć pod uwagę, że niektóre markery mogą nie być obecne w każdej próbce. Dołączając szkiełko kontrolne zawierające co najmniej przekrój migdałka, można zweryfikować pomyślne zabarwienie wszystkich markerów standardowych paneli i siłę sygnału.

Rysunek 4: Przykład pomyślnie wybarwionego przekroju za pomocą panelu limfocytów w próbce guza czerniaka. (A) Czasy ekspozycji użyte do zarejestrowania tej próbki IHC multipleksowej. (B) Złożony obraz multipleksowego panelu limfocytów IHC w tkance nowotworowej. (C) CD20 - sygnał Opal 480 w kolorze magenta. (D) CD3 - sygnał Opal 520 w kolorze czerwonym. (E) FOXP3 - sygnał Opal 570 w kolorze zielonym. (F) CD56 - sygnał Opal 620 w kolorze żółtym. (G) CD8 - sygnał Opal 690 w kolorze błękitnym. (H) TM - Opal 780 w kolorze białym. Podziałka = 100 μm. Skrót: TM = marker nowotworowy; IHC = immunohistochemia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Multipleksowe slajdy IHC są w pełni skanowane przez cyfrowy imager. Kafelki do późniejszej analizy są wybierane w przeglądarce slajdów. Jednakże, gdy konieczne jest przeanalizowanie bardziej szczegółowych regionów, takich jak guz w porównaniu z IM, te obszary zainteresowania (ROI) można narysować za pomocą QuPath. Po zakończeniu przetwarzania wsadowego kafelków wybranych w przeglądarce slajdów, pliki składowe są ponownie scalane (Rysunek 5A i plik uzupełniający 7). Korzystając z kanału markera nowotworowego (Rysunek 5B) i narzędzia magicznej różdżki w QuPath, kontur guza można prześledzić, aby utworzyć "Zwrot z inwestycji w guz" (Rysunek 5C). Następnie ROI guza można zwiększyć o pewną odległość, w tym przypadku 500 μm, aby utworzyć "inwazyjny margines ROI" (Rysunek 5D). Wszelkie niechciane tło (niebędące tkanką) jest usuwane z tego zwrotu z inwestycji za pomocą narzędzia magicznej różdżki, patrząc na sygnał autofluorescencji ( Rysunek 5E). Zarówno zwrot z inwestycji w nowotwór, jak i zwrot z inwestycji w wiadomości są zapisywane jako plik GeoJSON do dalszego przetwarzania (Rysunek 5F).

Rysunek 5: Proces rysowania ROI dla guza i inwazyjnego marginesu w QuPath. (A) Scalone pliki komponentów. (B) Obraz w skali szarości przedstawiający tylko kanał markera nowotworowego. (C) Zwrot z inwestycji w guz jest rysowany wokół sygnału markera nowotworowego. (D) Nowy zwrot z inwestycji jest uzyskiwany przez rozszerzenie zwrotu z inwestycji guza o 100-500 μm, aby utworzyć ROI IM. (E) Zwrot z inwestycji IM jest dostosowywany tak, aby obejmował tylko tkankę zrębu poprzez wykluczenie tła (sygnału ujemnego) i innych dużych struktur tkankowych, takich jak tłuszcz, naczynia krwionośne i mieszki włosowe. (F) Wynikowy ROI guza i ROI IM są zapisywane i eksportowane do plików GeoJSON w celu dalszego przetwarzania regionów. Zwrot z inwestycji w guz jest wyświetlany z czerwonym konturem, a zwrot z inwestycji w IM z zielonym konturem. Podziałka = 2 mm. Skróty: ROI = region zainteresowania; IM = margines inwazyjny; GeoJSON = geograficzna notacja obiektu JavaScript. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sieci ImmuNet mogą być używane do wykrywania komórek odpornościowych. W przypadku panelu limfocytów eksperymentalny złożony obraz (Rysunek 6A) można wizualnie porównać z komórkami odpornościowymi wykrytymi przez oprogramowanie ( Rysunek 6B). Podobnych porównań wizualnych można dokonać dla panelu szpikowego (plik uzupełniający 6: rysunek uzupełniający S4) i panelu komórek dendrytycznych (plik uzupełniający 6: rysunek uzupełniający S5).

Rysunek 6: Limfocyty rozpoznawane przez ImmuNet. (A) Złożony obraz Rysunek 4B przedstawiający komórki rozpoznawane przez ImmuNet z białymi kropkami. (B) Komórki rozpoznane przez ImmuNet, a następnie wykryta ekspresja markera. Podziałka = 50 μm. Skrót: TM = marker nowotworowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Komórki odpornościowe wykryte przez ImmuNet i zapisane w .csv formacie mogą być zaimportowane do dowolnego języka programowania w celu dalszej analizy. Wykonaliśmy wizualizację przestrzenną i bramkowanie w R (Plik Uzupełniający 8). Wykryte komórki można następnie zwizualizować przestrzennie (Rysunek 7A, plik uzupełniający 6: rysunek uzupełniający S6 i rysunek uzupełniający S7). Bramkowanie ekspresji pseudomarkerów można przeprowadzić w celu fenotypu poszczególnych komórek odpornościowych (Figura 7B).

Rysunek 7: Strategia bramkowania panelu limfocytów. (A) Komórki odpornościowe wykryte w obszarach zainteresowania guza i inwazyjnego marginesu wyznaczonych za pomocą QuPath. (B) Bramkowanie wszystkich komórek wykrytych przez ImmuNet z części A. Limfocyty są najpierw bramkowane na limfocytach B CD20 ⁺ i limfocytach T CD3 ⁺. Limfocyty T CD3 ⁺ są dalej bramkowane dla ekspresji CD8 i FOXP3. Populacja CD20-CD3^- jest bramkowana dla komórek NK CD56⁺. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gdy fenotypy przewidywanych komórek są określane za pomocą bramkowania, gęstości komórek o różnych fenotypach mogą być obliczane w ramach różnych ROI. Oblicza się to, dzieląc całkowitą liczbę komórek na fenotyp przez powierzchnię ROI (Tabela 1, Rysunek 8 i Plik uzupełniający 8). Tutaj limfocyty B są zdefiniowane jako CD3-CD20 ⁺, limfocyty T pomocnicze jako CD3 ⁺ CD20-CD8-FoxP3^-, limfocyty T regulatorowe jako CD3 ⁺ CD20-CD8-FoxP3 ⁺, cytotoksyczne limfocyty T jako CD3 ⁺ CD20-CD8 ⁺ FoxP3^-, a komórki NK jako CD3-CD20-CD56 ⁺.

zł pkt. TGL pkt. TGL pkt.

Fenotyp	Gęstość w guzie (komórki/mm2)	Gęstość w IM (komórki/mm2)
Komórka B	185,74	145,62
Limfocyt T pomocniczy	Nr 301,46	157,51
Limfocyt T regulatorowy	Rejon 38,53	godz. 19.53
Cytotoksyczne limfocyty T	Klasa 185,35	83,21
Komórka NK	0,18	0

Tabela 1: Zagęszczenie fenotypów w ROI. Gęstości komórek o różnych fenotypach znajdujących się w pojedynczej próbce czerniaka wybarwionej panelem limfocytów. Gęstości są obliczane oddzielnie w ROI guza i IM. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania.

Rysunek 8: Przykład analizy danych dla wielu próbek. Analiza gęstości różnych fenotypów limfocytów w guzie i IM 23 pierwotnych guzów czerniaka. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby bardziej zagłębić się w informacje przestrzenne tych komórek odpornościowych, możliwe jest również określenie odległości między zidentyfikowanymi fenotypami lub procentu fenotypów najbliższych sąsiadów w próbce (Rysunek 9).

Rysunek 9: Przykład analizy najbliższego sąsiada dla pojedynczej próbki. Odsetek fenotypów najbliższego sąsiada dla różnych typów komórek w (A) guzie i (B) IM ROI znalezionych w pojedynczej próbce czerniaka wybarwionej panelem limfocytów. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Multiplex IHC podsumowujący specyfikacje protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Protokół Autostainer dla monopleksu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Protokół Autostainera do kompensacji autofluorescencji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Protokół Autostainera dla immunohistochemii multipleksowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik szablonu .csv. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Panele komórek szpikowych i dendrytycznych w próbce tkanki czerniaka; oznaczanie slajdów w przypadku niepowodzenia skanowania; komórki szpikowe i dendrytyczne rozpoznawane przez ImmuNet; strategie bramkowania paneli komórek szpikowych i dendrytycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Skrypt ściegowy QuPath. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Skrypt analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Analiza przestrzenna TME jest poszukiwaną techniką, aby dowiedzieć się więcej o kompartmencie komórek odpornościowych i odkryć nowe biomarkery prognostyczne i predykcyjne, szczególnie w dziedzinie immunoonkologii¹⁶. W tym celu opracowywanych jest wiele różnych technik, obejmujących wykrywanie białek, transkryptów mRNA lub kombinacji tych dwóch, z oszacowaniem do 100-1000 celów. Większa multipleksacja odbywa się jednak kosztem mniej wysokoprzepustowych eksperymentów, wyższych kosztów eksperymentów i wyzwań technicznych, a często tylko niewielka część TME może być analizowana. Multiplex IHC przy użyciu metody opartej na TSA, którą tutaj opisujemy, wykrywa jednocześnie sześć różnych markerów + DAPI, jest stosunkowo tańszy do wykonania, a całe skrawki tkanek są obrazowane w mniej niż 20 minut, gotowe do pełnej analizy. Technika ta stała się mniej złożona dzięki automatyzacji procedury barwienia. Ulepszenia w mikroskopie wielospektralnym, które obejmują dodanie dwóch dodatkowych filtrów, znacznie poprawiły czas rozmieszania widma i skanowania. Możliwe jest jednoczesne wykrycie do ośmiu różnych markerów + DAPI. Jednak dzięki rozszerzeniu multipleksowania o więcej markerów, wyżej wymienione korzyści znikają, ponieważ rozmieszanie spektralne staje się trudniejsze, a czas skanowania całych slajdów znacznie się wydłuża. Podejmowane są wysiłki w celu standaryzacji multipleksów IHC między różnymi instytucjami, aby ułatwić ich wdrożenie w warunkach diagnostycznych. W celu standaryzacji multipleksu IHC zalecamy użytkownikom stosowanie bardziej dostępnego protokołu z sześcioma różnymi znacznikami + DAPI. Niemniej jednak nadal potrzebna jest spora wiedza techniczna, a dalsza analiza może być wyzwaniem, dla którego opracowaliśmy metodologie, które są opisane w tym protokole.

Standaryzacja rozpoczyna się od opracowania paneli multipleksowych IHC. Znaczenie wyboru przeciwciał pierwszorzędowych wykrywających określone cele białkowe zostało podkreślone^{już wcześniej}. Nasze multipleksowe panele IHC są w większości opracowywane z pierwotnymi klonami przeciwciał, które są również używane i walidowane pod kątem IHC w naszym dziale diagnostycznym. Jednak w przypadku multipleksowego panelu IHC z komórek dendrytycznych większość przeciwciał nie została użyta w warunkach diagnostycznych (van der Hoorn i wsp., manuskrypt w przedłożeniu). Aby zapewnić swoistość i zminimalizować różnice w partiach, zdecydowaliśmy się na użycie przeciwciał monoklonalnych zamiast przeciwciał poliklonalnych, a także zwalidowaliśmy większość przeciwciał przy użyciu transfekowanych linii komórkowych i komórek pierwotnych. Na przestrzeni lat różne wersje multipleksowych paneli IHC były wykorzystywane w licznych badaniach z wykorzystaniem systemu Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Aby optymalnie zaimplementować te multipleksowe panele IHC w systemie PhenoImager HT, konieczne było wprowadzenie pewnych zmian w pierwotnych kombinacjach przeciwciał i fluoroforów. Aby skorzystać z lepszego rozmieszania spektralnego i szybszych czasów skanowania całych wycinków tkanek, konieczne jest wdrożenie najnowszych fluoroforów Opal480 i Opal780 oraz unikanie stosowania fluoroforów Opal540 i Opal650 w siedmiokolorowych multipleksowych panelach IHC. Czas skanowania jest ~3-10 razy szybszy w zależności od wielkości wycinka tkanki. Regulacja panelu Multiplex IHC była dość łatwa do osiągnięcia, ale należy pamiętać o kilku kwestiach. Widmo fluorescencyjne Opal480 w dużym stopniu pokrywa się ze spektrum autofluorescencji, a zatem zakłóca widmowe mieszanie erytrocytów i innych struktur autofluorescencyjnych. Zastosowanie zwiększonego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego w połączeniu z Opal480 rozwiązało ten problem w większości przypadków. Implementacja opatentowanego filtra Sample AF w PhenoImager HT ułatwia rozmieszanie Opal480 i autofluorescencji. Jednak najlepiej jest użyć przeciwciała pierwszorzędowego, które daje wyraźny sygnał, gdy jest stosowane z Opal480, tak aby jego sygnał był wyższy niż autofluorescencja.

Mimo że te multipleksowe panele IHC są już znane, należy wziąć pod uwagę różnice między partiami. Wykonując monopleksowe kontrole IHC przed rozpoczęciem pełnego eksperymentu multipleksowego IHC, czasami zaobserwowaliśmy, że pierwszorzędowe przeciwciała działają albo silniej, albo słabiej z eksperymentu na eksperyment. Przyczyną tego mogą być błędy pipetowania, nieoptymalne warunki przechowywania odczynnika i okres przydatności do spożycia. Rozwiązaliśmy ten problem, dostosowując roztwór przeciwciała pierwotnego w oparciu o nasze doświadczenie. Nawet jeśli żadna z wyżej wymienionych regulacji nie musiała być wykonywana, przy każdym eksperymencie wsadowym multipleksu IHC ważne jest, aby ustawić czasy naświetlania na podstawie monopleksowych szkiełek kontrolnych barwionych IHC.

Ponieważ nasze badania początkowo koncentrowały się na różnych typach raków i czerniaka, wymagane było, aby multipleksowe panele IHC były wymienne między typami nowotworów przy minimalnych dostosowaniach. Dlatego zawsze uwzględnialiśmy wiele typów tkanek (nowotworowych) w procesie optymalizacji i zaobserwowaliśmy, że rozcieńczenia pierwotnych przeciwciał dla markerów komórek odpornościowych mogą być podobne między różnymi typami nowotworów. Jednak wykrywanie tkanki nowotworowej między rakiem a czerniakiem wymaga różnych markerów nowotworowych. W związku z tym marker nowotworowy był zawsze optymalizowany do pracy na końcu każdego multipleksowego panelu IHC i obecnie jest zawsze używany w połączeniu z Opal780, który przypadkowo musi również znajdować się na ostatnim fluoroforze w procedurze barwienia multipleksowego IHC. Używając markera nowotworowego w konsekwencji na końcu multipleksowego IHC, te multipleksowe panele IHC można łatwo wymienić na inne typy nowotworów, takie jak glejak (tj. GFAP) i chłoniak Hodgkina (tj. CD30). W przypadku naczyniakomięsaka użyliśmy tego panelu IHC z multipleksem limfocytów z genem związanym z transformacją erytroblastów (ERG) jako markerem nowotworu z tylko dwoma eksperymentami optymalizacyjnymi²⁵. Optymalizacja obejmowała miareczkowanie przeciwciała pierwszorzędowego ERG i testowanie multipleksowego panelu IHC z ERG na końcu.

Inne modyfikacje tych multipleksowych paneli IHC można również wprowadzić poprzez wymianę określonego markera komórek odpornościowych na inny marker immunologiczny lub funkcjonalny. Każda zmiana wymaga optymalizacji. Protokół optymalizacji można postępować zgodnie z opisem wcześniejszym¹⁷. Pewne zmiany w proponowanych multipleksowych panelach IHC będą kolidować ze stworzonymi przez nas algorytmami ImmuNet. Należy wygenerować wystarczającą ilość danych i poświęcić czas na wdrożenie tych zmian do algorytmu (co najmniej 750 adnotacji dla każdego nowego markera i/lub fenotypu komórki oraz 150 adnotacji dla walidacji wcześniej wytrenowanych markerów). Prezentowane tutaj panele nie zawierają markerów funkcjonalnych, chociaż implementacja markerów immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak PD-1 i PD-L1, do multipleksowych paneli IHC odbywa się w naszym laboratorium. Jednak analiza markerów, które są mniej binarne w sygnałach ujemnych i dodatnich, okazała się trudniejsza i stanowi obszar aktywnych badań w naszej grupie.

Liczba markerów, które mogą być jednocześnie oceniane za pomocą multipleksu IHC, jest ograniczona w porównaniu z innymi nowatorskimi technikami. Chociaż można to obejść, analizując różne panele na kolejnych wycinkach bloku FFPE, trudno będzie porównać te wycinki przestrzennie. Orientacja i złożone artefakty prawdopodobnie nie są takie same po przygotowaniu slajdów. Niemniej jednak multipleks IHC jest dość dostępny, co czyni go atrakcyjnym narzędziem dla większej liczby instytucji i badaczy, a tym samym bardziej odpowiednim do przyszłego wdrożenia w warunkach diagnostycznych. Dzięki standaryzacji multipleksowych paneli komórek odpornościowych IHC dla wielu typów nowotworów i dalszym analizom można uzyskać więcej wiedzy na temat różnic w TME między pacjentami a typami nowotworów. Może to na przykład prowadzić do lepszego wglądu w rolę TME w odpowiedzi przeciwnowotworowej na określone terapie. Może to nawet doprowadzić do powstania nowych biomarkerów do przewidywania takich czynników, jak odpowiedź na leczenie i oczekiwane przeżycie. Ogólnie rzecz biorąc, może to sprawić, że multipleks IHC stanie się narzędziem klinicznym pomagającym w podejmowaniu decyzji klinicznych w ramach podejścia medycyny spersonalizowanej. Trzeba przyznać, że więcej etapów procedury analizy powinno zostać prawdopodobnie zautomatyzowanych i ustandaryzowanych, aby można było ją stosować w codziennych warunkach diagnostycznych, więc jak na razie jest to głównie perspektywa futurystyczna.

Analiza wielu markerów na jednym szkiełku próbki może być bardzo potężnym narzędziem, pomimo wyzwań technicznych. Dzięki ustandaryzowanym protokołom eksperymentalnym i solidnej metodzie analizy, jak opisaliśmy tutaj przy użyciu ImmuNet, kwantyfikacja wielu markerów sprawia, że jest ona bardziej pouczająca niż klasyczna IHC, podczas gdy multipleksowy IHC pozostaje stosunkowo wysoką przepustowością w porównaniu z nowatorskimi metodami eksperymentalnymi o wyższej pleksji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anty-CD14	Cell	114R-16	sekcja 3, klon EPR3653
anty-CD163	Marka	163M-15	sekcja 3, klon MRQ-26
anty-CD19	Abcam	ab134114	sekcja 3, klon
EPR5906 anty-CD1c (BDCA1)	Thermo Scientific	TA505411	sekcja 3, klon OTI2F4
anty-CD20	Thermo Scientific	MS-340-S	sekcja 3, klon L26
anty-CD3	Thermo Scientific	RM-9107	sekcja 3, klon sp7
anty-CD303/ BDCA2	Dendrytics via Enzo Lifesciences/Axxora	DDX0043	sekcja 3, klon 124B3.13
anty-CD56	Cell Marque	156R-94	sekcja 3, klon MRQ-42
anty-CD66b	BD Biosciences	555723	sekcja 3, klon G10F5
anty-CD68	Dako Agilent		M087601 sekcja 3, klon PG-M1
anty-CD8	Dako Agilent	M7103	sekcja 3, klon C8/144B
anty-Foxp3	Thermo Scientific	14-4777	sekcja 3, klon 236A/E7
anty-Gp100	Dako Agilent	M063401	sekcja 3, klon HMB45
anty-HLA-DR, DP, DQ	Santa Cruz	sc-53302	sekcja 3, klon CR3/43
anty-MART-1	Thermo Scientific	MS-799	sekcja 3, klon A103
anty-pan-cytokeratyna	Abcam	ab86734	sekcja 3, klon AE1/AE3 + 5D3
anty-SOX10	Sigma Aldrich	383R	sekcja 3, klon EP268
anty-tyrozynaza	Sanbio	MONX10591	sekcja 3, klon T311
anty-XCR1	Cell Signaling Technologies za pośrednictwem Bioké	44665S	sekcja 3, klon
rozcieńczalnika przeciwciał	Akoya BioSciences	SKU  ARD1001EA	sekcja 3, z zestawu Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (opcjonalnie może być również zastąpiony przez TBST z 10% BSA)
Sonda aspiracyjna Bond	Leica Biosciences	S21.0605	sekcja 3
Czyszczenie sondy zasysającej Bond	Leica Biosciences	CS9100	sekcja 3
Roztwór do odwoskowywania Bond	Leica Biosciences	AR9222	sekcja 3
Etykieta Bond Objectglas + kłaczki do druku	Leica Biosciences	S21.4564.A	sekcja 3
System detekcji badań nad Bondem 2	Leica Biosciences	DS9777	sekcja 3
Automatyczny stainer Bond RX	Leica Biosciences-sekcja		3, platforma automatyczna
Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L	Leica Biosciences	AR9961	sekcja 3
Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L	Leica Biosciences	AR9640	sekcja 3
Bond TM Wash Solution 10x - 1 L	Leica Biosciences	AR9590	sekcja 3
BOND Uniwersalna osłona	Leica Biosciences	S21.4611	sekcja 3
Zestaw do miareczkowania Bond™	Leica Biosciences	OPT9049	sekcja 3
Szkiełko nakrywkowe 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)	Fisher Scientific 15717592		sekcja 2
szkiełko nakrywkowe 24 x 50 mm	VWR	631-0146	sekcja 2
DAPI Fluoromount-G	VWR	0100-20	sekcja 3, ilekroć szkiełka monoplex muszą być szybko sprawdzone, a nie do oficjalnej analizy, DAPI jest barwiony oddzielnie w celu uzyskania lepszych wyników
Eozyna			sekcja 2, domowej roboty
Etanol 99,5%	VWR	4099.9005	sekcja 2
Fluoromount-G	VWR	0100-01	sekcja 3
hematoksylina		-	sekcja 2, domowy
rurociąg wykrywania i fenotypowania komórek immunologicznych	ImmuNet
w oprogramowaniu inForm 2.4.10	Akoya BioSciences-sekcja		4 i 6
Pakiet odczynników OPAL 480	Akoya BioSciences	FP1500001KT	sekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 520	Akoya BioSciences	FP1487001KT	sekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 570	Akoya BioSciences	FP1488001KT	sekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 620	Akoya BioSciences	FP1495001KT	sekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 690	Akoya BioSciences	FP1497001KT	sekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 780	Akoya BioSciences	FP1501001KT	sekcja 3
Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slajd	Akoya BioSciences	NEL821001KT	sekcja 3
PhenoChart 1.1.0	Akoya BioSciences-sekcja		5
PhenoImagerHT	Akoya BioSciences	CLS143455	sekcja 4, cyfrowy imager patologiczny z przeglądarką slajdów i oprogramowaniem do obrazowania (wcześniej znany jako Vectra Polaris)
Nośnik montażowy Quick-D	Klinipath	7280	sekcja 2
QuPath 0.3.2			platforma oprogramowania do analizy obrazu całego slajdu
R 4.1.1
Skrzynki przesuwne	VWR	631-0737	sekcja 1
SuperFrost Plus	Thermo Scientific przez VWR	631-9483	sekcja 1
Oprogramowanie Vectra Polaris 1.0.13	Akoya BioSciences-sekcja		4
Ksylen	VWR	4055-9005	SEKCJA 2