Artykuł metodologiczny

Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65717

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical BioSciences, Radboudumc, 2Division of Immunotherapy, Oncode Institute, Radboudumc, 3Data Science, Institute for Computing and Information Sciences, Radboud University, 4Department of Medical Oncology, Radboudumc, 5Department of Pulmonary Diseases, Radboudumc, 6Department of Pathology, Radboudumc

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak przeprowadzana jest charakterystyka komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza za pomocą multipleksowej immunohistochemii.

Streszczenie

Krajobraz komórek odpornościowych mikrośrodowiska guza potencjalnie zawiera informacje do odkrycia biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych. Immunohistochemia multipleksowa jest cennym narzędziem do wizualizacji i identyfikacji różnych typów komórek odpornościowych w tkankach nowotworowych przy jednoczesnym zachowaniu informacji przestrzennych. Tutaj przedstawiamy szczegółowe protokoły analizy populacji komórek limfocytów, mieloidalnych i dendrytycznych w skrawkach tkanek. Począwszy od wycinania utrwalonych w formalinie skrawków zatopionych w parafinie, poprzez automatyczne procedury barwienia multipleksowego na zautomatyzowanej platformie, skanowanie preparatów pod mikroskopem obrazowania wielospektralnego, aż po analizę obrazów za pomocą opracowanego przez nas algorytmu uczenia maszynowego ImmuNet. Protokoły te można zastosować do różnych próbek guza, po prostu przełączając markery nowotworowe w celu analizy komórek odpornościowych w różnych przedziałach próbki (margines guza kontra margines inwazyjny) i stosując analizę najbliższego sąsiada. Analiza ta nie ogranicza się do próbek guza, ale może być również stosowana do innych (nie)patogennych tkanek. Ulepszenia sprzętu i przepływu pracy w ciągu ostatnich kilku lat znacznie skróciły czas realizacji, co ułatwia przyszłe zastosowanie tej procedury w warunkach diagnostycznych.

Wprowadzenie

Komórki odpornościowe odgrywają kluczową rolę w ochronie przed patogenami, takimi jak wirusy i bakterie, ale także przed komórkami rakowymi1. W związku z tym układ odpornościowy w mikrośrodowisku guza (TME) jest bardzo obiecujący w odkrywaniu biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych2. Nacieki komórek odpornościowych są skorelowane z rokowaniem w różnych typach raka, chociaż nie zostało to jeszcze wdrożone w opiece klinicznej3,4. W większości typów nowotworów duża liczba cytotoksycznych limfocytów T i limfocytów T pomocniczych 1 i/lub niska liczba regulatorowych limfocytów T wiąże się z dobrymi rokowaniami. Trwają prace nad włączeniem tak zwanego "Immunoscore" do oceny stopnia zaawansowania TNM raka jelita grubego, przekształcając go w stopień zaawansowania TNM-I5,6. Wynik immunologiczny jest uzyskiwany na podstawie całkowitej liczby limfocytów T (wykrytych za pomocą CD3) i cytotoksycznych limfocytów T (wykrytych za pomocą CD8) w dwóch różnych regionach guza: rdzeń guza kontra margines inwazyjny (IM) guzów. Zaproponowano również, że Immunoscore ma wartość prognostyczną, w przypadku innych typów nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc i rak piersi6,7,8,9. Co więcej, nacieki komórek odpornościowych mogą również korelować z odpowiedzią na immunoterapię blokującą punkty kontrolne10. Jednak te biomarkery predykcyjne muszą zostać zwalidowane w badaniach prospektywnych, zanim będą mogły być rutynowo wdrażane w praktyce klinicznej. Co więcej, zaproponowano również, że pojedynczy biomarker będzie niewystarczający do miarodajnego przewidywania11. W związku z tym zaproponowano stworzenie kompletnej mapy próbki pacjenta poprzez połączenie różnych biomarkerów jako bardziej kompleksowego biomarkera predykcyjnego w tak zwanym "immunogramie raka"12.

Wśród metod badania komórek odpornościowych w TME, najstarszą i najbardziej znaną techniką jest immunohistochemia (IHC), rutynowo stosowana do testów diagnostycznych w wielu chorobach, zwłaszcza raku13. Technika ta przez długi czas ograniczała się do użycia jednego lub tylko kilku markerów14 i dlatego została wyparta w warunkach badawczych przez inne techniki, takie jak cytometria przepływowa i profilowanie ekspresji genów (GEP). Jednak tkanki nowotworowe utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), zwykle stosowane w rutynowej diagnostyce i badaniach, nie nadają się (optymalnie) do cytometrii przepływowej i GEP. Ponadto, chociaż GEP i cytometria przepływowa dostarczają wielu informacji na temat fenotypu i funkcji komórek, brak informacji przestrzennych jest główną wadą. W związku z tym niejednorodność w próbce, taka jak różnice w obszarach guza naciekanych przez komórki odpornościowe i wykluczonych z komórek odpornościowych, może pozostać niewykryta15. Opracowano nowatorskie platformy do analizy multipleksowej tkanek FFPE, takie jak multiplex IHC, obrazowanie cytometrii masowej i CO-Detection by indEXing (CODEX), które można wykorzystać do jednoczesnego wykrywania wielu markerów w obrębie przekroju tkanki16. Komórki odpornościowe w TME są szeroko badane w celu znalezienia najlepszych biomarkerów do immunoterapii. Jednak techniki multipleksowe i zautomatyzowana analiza obrazu stanowią przeszkody same w sobie.

Nasze laboratorium ma duże doświadczenie w barwieniu multipleksowym IHC przy użyciu metody wzmocnienia sygnału Opal/Tyramid (TSA) i zautomatyzowało to na platformie IHC (zobacz Tabelę Materiałów)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Zoptymalizowaliśmy panele komórek odpornościowych do wykrywania różnych podzbiorów limfocytów, komórek szpikowych i komórek dendrytycznych (DC). Tkanki, które zawierają gęste obszary komórek odpornościowych - dla limfocytów lub złożonych morfologii komórek (tj. komórek szpikowych i DC) - są szczególnie trudne do analizy, co wiąże się z ryzykiem przeszacowania lub niedoszacowania liczby obecnych komórek odpornościowych. Aby przezwyciężyć ten problem, nasza grupa 32, a ten potok uczenia maszynowego znacznie poprawił jakość wykrywania tych różnych typów komórek odpornościowych. Szczegółowy protokół od uzyskania materiału FFPE do analizy gęstości komórek odpornościowych w różnych przedziałach tkankowych i odległościach między typami komórek odpornościowych opisano tutaj.

Ten protokół opisuje, w jaki sposób multipleksowe panele IHC są wykonywane w Centrum Medycznym Uniwersytetu Radboud od czasu wdrożenia cyfrowego obrazowania patologii w 2022 roku. Opisane multipleksowe panele IHC mogą być stosowane w przypadku różnych nowotworów (np. płuc, prostaty, jelita grubego, pęcherza moczowego, piersi) z zastosowaniem przeciwciała pan-cytokeratyny jako markera nowotworowego lub w przypadku czerniaka z zastosowaniem przeciwciał związanych z melanocytami jako markerów nowotworowych. Te multipleksowe protokoły IHC zostały starannie zoptymalizowane pod względem stężenia przeciwciał pierwotnych, kombinacji fluoroforów i kolejności procedury barwienia. My i inni opisaliśmy wcześniej optymalizację panelu multipleksowego IHC17,33,34,35. Panele Multiplex IHC można dostosować, ale opisane potoki analityczne muszą zostać ocenione i potencjalnie odpowiednio dostosowane lub ponownie przeszkolone. Opisane siedmiokolorowe multipleksowe protokoły IHC wykorzystują fluorofory Opal Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 i 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), dzięki czemu łatwe rozmieszanie i szybkie skanowanie na imagerze jest możliwe dzięki "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). Barwienie i skanowanie dziewięciokolorowe nie jest opisane w tym protokole, ponieważ wymaga to jeszcze bardziej precyzyjnego dostrojenia konfiguracji eksperymentalnej i innego trybu skanowania w imagerze, który wykorzystuje przestrajalny filtr ciekłokrystaliczny.

Protokół

Materiał pacjenta, który jest pokazany w tym protokole, był częścią wcześniej przeprowadzonego badania i został oficjalnie uznany za zwolniony z zatwierdzenia etyki medycznej przez lokalną Komisję Etyki Medycznej Radboudumc zgodnie z holenderskim ustawodawstwem (numer pliku 2017-3164)30.

1. Zbieranie materiału FFPE, wybór bloków i przygotowanie próbek

  1. Odzyskaj identyfikatory bloków FFPE z plików pacjentów za pośrednictwem lekarzy prowadzących lub patologów. Sprawdź w lokalnych przepisach, czy wymagane jest pozwolenie etyczne.
  2. Poproś o bloki FFPE z lokalnego archiwum patologicznego lub zewnętrznego szpitala (szpitali).
    UWAGA: Możliwe jest również, że materiał nowotworowy lub biopsja zostaną pobrane do konkretnego badania. Może to mieć miejsce w przypadku małych badań klinicznych lub badań na zwierzętach. W takich przypadkach za przetworzenie próbki tkanki może odpowiadać badacz.
  3. Gdy dostępnych jest wiele bloków FFPE, wybierz najbardziej reprezentatywny blok FFPE zawierający żywotną tkankę nowotworową, najlepiej z otaczającą tkanką zrębu, oceniając szkiełka barwione hematoksyliną i eozyną (HE) (Rysunek 1).
    UWAGA: Zaleca się uzyskanie opinii eksperta w sprawie tej selekcji (np. patologa). Możliwe jest, że HE są niedostępne do oceny zawartości bloku FFPE i konieczne będzie wykonanie nowych do selekcji. Przejdź do sekcji 2, aby uzyskać opis.
  4. Wytnij wstęgi FFPE o grubości 4 μm na mikrotomie.
    UWAGA: Grubość może wynosić od 1 μm do 6 μm bez zauważalnego wpływu barwienia; Jednak 4 μm jest najbardziej standardowe.
  5. Zamontuj próbki na szkiełkach podstawowych w pozycji korzystnej dla płynności automatycznego stainera (rysunek 2A-C), stosując jedną z metod opisanych poniżej:
    1. Umieścić skrawki na powierzchni destylowanej wody o temperaturze 40 °C w łaźni wodnej, aby się rozciągnęły i podnieść je za pomocą szkiełka podstawowego.
      OR
      Szkiełka należy umieścić na płycie grzewczej o temperaturze 40 °C, pamiętając o zalaniu miejsca, w którym ma być zamontowana sekcja na szkiełku, kroplą wody destylowanej. Umieść sekcję na tej kropli za pomocą kleszczy i pozwól jej się rozciągnąć. Wchłoń wodę destylowaną za pomocą ręcznika papierowego i usuń nadmiar wody, stukając w szkiełko.
      UWAGA: Umieszczenie skrawków tkanki zbyt blisko etykiety szkiełka spowoduje nieoptymalne barwienie (Rysunek 2D,E). Zwykle montujemy 6-10 szkiełek na próbkę, aby wykonać różne multipleksowe panele IHC i mieć kopię zapasową.
  6. Pozostawić zamontowane szkiełka do wyschnięcia w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Do eksperymentu należy użyć zamontowanych szkiełek podstawowych lub przechowywać je w pudełkach w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Z naszego dotychczasowego doświadczenia wynika, że te zamontowane prowadnice mogą być przechowywane przez wiele lat przed przeprowadzeniem barwienia multipleksowego IHC.

2. Generowanie preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki z sekcji 2 należy wykonać w dygestoriach.

  1. Odparafinować szkiełka w ksylenie (2 x 5 min).
  2. Uwodnić w etanolu (99,6% 1 x 5 min; 95% 1 x 5 min; 70% 1 x 2 min). Alternatywnie zanurz szkiełka 3x w 99,6% etanolu.
  3. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej (2 min).
  4. Wybarwić jądra hematoksyliną (10 min).
  5. Umyć szkiełka destylowanym H2O (5 min).
  6. Zabarwić szkiełka eozyną (5 min).
  7. Odwodnić szkiełka, zanurzając 3x w 99,6% etanolu.
  8. Zanurz szkiełka 2x w ksylenie.
  9. Dodaj kilka kropli podłoża montażowego i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym.
  10. Poczekaj, aż szkiełka stwardnieją i wyjmij je z dygestoria, gdy wszystkie chemikalia wyparują.

3. Wykonywanie monopleksu i multipleksu IHC w autostainerze

  1. Oblicz, ile odczynnika jest potrzebne w zależności od liczby próbek do barwienia.
    UWAGA: Na jeden przebieg autostainer ma pojemność 30 szkiełek i potrzebuje ~18 godzin, aby ukończyć protokół multipleksowy IHC z sześcioma przeciwciałami. Gdy konieczne jest zabarwienie większej liczby szkiełek, każdej nocy w tygodniu (roboczym) można wprowadzić wiele partii; 4 noce po 30 zjeżdżalni = 120 zjeżdżalni tygodniowo.
    1. Przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki na początku tygodnia. System automatycznego stainera dozuje 150 μl odczynnika na szkiełko. Użyć pojemników do miareczkowania o pojemności 6 ml na odczynniki przeciwciała i opal, a pojemników o pojemności 30 ml na odczynnik blokujący i drugorzędową przeciwciało-peroksydazę chrzanową.
      UWAGA: Pojemniki o pojemności 6 ml posiadają wygodne wkłady, które w razie potrzeby można łatwo wyjąć i wymienić. Przy obliczeniach odczynników należy wziąć pod uwagę martwą objętość 1,6 ml lub 300 μl odpowiednio dla pojemnika o pojemności 30 ml lub pojemnika do miareczkowania o pojemności 6 ml.
    2. Rozcieńczyć wszystkie fluorofory Opal i digoksygeninę (DIG) w stosunku 1:100 w dostarczonym rozcieńczalniku; rozcieńczyć Opal780 w stosunku 1:25 w rozcieńczalniku przeciwciał. Rozcieńczyć wszystkie pierwszorzędowe przeciwciała w rozcieńczalniku z rozcieńczalnikiem określonym w pliku uzupełniającym 1.
  2. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, uruchom monoplex IHC (Supplemental File 2) na szkiełkach zawierających zarówno tkankę kontrolną migdałków, jak i inne interesujące typy tkanek (nowotworowych) przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu multiplex IHC, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są dobrze przygotowane.
    UWAGA: Monoplex IHC trwa ~3,5 godziny i można go sprawdzić przed końcem tego dnia pod kątem wzorców i intensywności sygnału. Jeśli niektóre sygnały są zbyt słabe (Rysunek 3), można dokonać korekty odczynników.
  3. W celu korekcji autofluorescencji należy przygotować szkiełko z tkanką (nowotworową) zawierającą struktury autofluorescencyjne, takie jak krew i kolagen. Preparat ten należy przygotować jednocześnie ze szkiełkami monopleksowymi IHC, ale z odczynnikiem blokującym zastępującym przeciwciało i odczynnikami Opal (plik uzupełniający 3).
    UWAGA: W zasadzie taki preparat może być ponownie wykorzystany do obrazowania wielospektralnego do momentu, gdy korekcja autofluorescencji nie będzie już optymalna. Jednak w przypadku tkanek o wysokim poziomie autofluorescencji, takich jak mózg i wątroba, zaleca się użycie tej tkanki do korekcji autofluorescencji.
  4. Przy każdym przebiegu multipleksu IHC należy załadować 29 próbek do systemu automatycznego barwienia za pomocą jednego szkiełka tkankowego w celu sprawdzenia wydajności każdego przebiegu multipleksu IHC.
  5. Pobierz protokoły multipleksu IHC ze strony internetowej autostainera w zakładce Downloads (Pobrane) i dostosuj je tak, aby pasowały do każdego dostosowanego panelu multipleksu IHC36. W przypadku multipleksowych IHC, patrz Plik uzupełniający 4, aby zapoznać się z protokołem, a w przypadku niestandardowych multipleksowych paneli IHC, patrz Plik uzupełniający 1.
  6. Po zakończeniu protokołu barwienia wyjmij szkiełka z automatycznego stainera i umieść je w pojemniku z buforem do mycia.
  7. Aby zapobiec zanieczyszczeniu systemu automatycznego barwienia DAPI, ponieważ próbki są już barwione w bardzo niskich stężeniach, należy nałożyć DAPI ręcznie przed pokryciem szkiełek nakrywkowych. Dodać dwie krople DAPI na ml buforu do płukania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: W przypadku tworzenia bibliotek spektralnych ważne jest, aby w próbkach nie było żadnych barwników DAPI. Możliwa jest również jedna kropla DAPI na ml buforu do przemywania i 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj szkiełka 3x buforem do mycia.
  9. Umieść szkiełka na ręcznikach papierowych i strzepnij nadmiar bufora do mycia ze szkiełek.
  10. Odpipetuj kilka kropli podłoża mocującego na tkankę.
  11. Delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu medium montażowego, aby zakryć szkiełko pod kątem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
  12. Usuń nadmiar podłoża montażowego i pęcherzyków powietrza, delikatnie naciskając szklane szkiełko nakrywkowe kleszczami lub czystą końcówką pipety.
  13. Pozostaw szkiełka w spokoju przez ~24 godziny, zanim podłoże montażowe zastygnie, albo poziomo na płytce do szkiełek mikroskopowych, albo załaduj je bezpośrednio do mikroskopu w celu obrazowania.
  14. Po zestaleniu się podłoża montażowego lub po zobrazowaniu szkiełek należy przechowywać szkiełka w pojemnikach mikroskopowych w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie za pomocą cyfrowego imagera patologicznego i adnotacji do plików skanowania

  1. Włącz wywoływarkę, naciskając przycisk zasilania po prawej stronie urządzenia. Po upływie co najmniej 20 sekund uruchom oprogramowanie.
    UWAGA: Poczekaj 20 sekund, aby sprzęt uruchomił się poprawnie.
  2. Załaduj szkiełka do kaset na cztery szkiełka.
    1. Opcjonalnie: Wprowadź slajdy do pliku .csv, dla którego można pobrać szablon (Plik uzupełniający 5). Aby załadować plik .csv do programu, zapisz go w folderze C:\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States.
      UWAGA: Jednocześnie można załadować maksymalnie 20 kaset lub 80 szkiełek.
  3. Ustawienia referencyjne
    1. Otwórz Sprawdź pulpit nawigacyjny z menu głównego.
      UWAGA: Kaseta ze szkiełkami referencyjnymi jest dostarczana przez producenta i opcjonalnie może być przechowywana na stałe w gnieździe 20.
    2. Raz w tygodniu należy ustawić odniesienia w jasnym polu na dostarczonym slajdzie zgodnie z instrukcjami producenta (zajmuje to kilka minut).
    3. Raz w miesiącu należy ustawić odniesienia fluorescencji na dostarczonym szkiełku zgodnie z instrukcjami producenta (trwa to dłużej niż 1 godzinę).
  4. Sporządzanie lub dostosowywanie protokołu
    1. Wróć do menu głównego i kliknij Edytuj protokół, aby utworzyć protokół.
    2. Kliknij przycisk Nowy... i wybierz opcję Fluorescencja jako tryb obrazowania, Multispektralne skanowanie slajdów i Opal Polaris 5, 6 i 7 color w opcji Staining (Barwienie).
    3. Nadaj protokołowi nazwę w polu Nazwa protokołu i zapisz ją w badaniu, wybierając badanie z listy Dostępne badania lub utwórz badanie w obszarze Utwórz nowe badanie | Nazwa badania.
    4. Zakończ, wybierając pozycję Utwórz protokół.
    5. Do tego typu skanowania należy używać tylko lewego okna Ustawienia skanowania slajdów wielospektralnych; ignorować okno po prawej stronie Ustawienia pola wielospektralnego.
    6. Skanuj slajdy w różnych powiększeniach. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, skanuj w 20-krotnym powiększeniu, pozostawiając rozdzielczość pikseli na 0,50 μm (20x).
    7. Ustaw czasy ekspozycji, wybierając opcję Scan Exposures (Ekspozycje skanowania).
    8. Załaduj kasetę, w której trzymane są prowadnice, wybierając odpowiednią szczelinę w opcji Nośnik ładunku.
    9. Aby ułatwić nawigację po slajdach, wybierz opcję Pobierz przegląd, aby uzyskać obraz ogólny nośnika zawierającego slajdy po załadowaniu nośnika. Aby włączyć lub wyłączyć tę funkcję automatycznie, kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu, przejdź do Preferencje... i zaznacz opcję włączoną lub wyłączoną w obszarze Obraz przeglądu nawigacji, aby włączyć opcję Automatycznie nośnik obrazu podczas ładowania dla zadań interaktywnych.
    10. Ustaw czasy ekspozycji dla każdego filtra na odpowiednich szkiełkach barwionych monopleksem IHC, wybierając opcję Ustaw ekspozycje skanowania i znajdując różne miejsca z sygnałem dodatnim. Ręcznie ustaw ostrość lub użyj automatycznego ustawiania ostrości i wybierz opcję Autoekspozycja po przełączeniu na filtr zgodny z tym sygnałem. Wybierz najniższy czas naświetlenia, aby zapobiec prześwietleniu i zrób zdjęcia każdego slajdu w celach informacyjnych po ustawieniu wszystkich czasów ekspozycji (Rysunek 3).
      UWAGA: Zignoruj opcję Ustaw ekspozycje pola dla tego typu skanowania.
    11. Ustaw czasy ekspozycji na szkiełku barwionym multipleksem, sprawdzając wszystkie filtry w kilku miejscach z sygnałem dodatnim. Skróć najkrótszy czas automatycznej ekspozycji o 10%, aby zapobiec prześwietleniu, i zrób kilka zdjęć po ustawieniu wszystkich czasów ekspozycji.
    12. Zrób zdjęcia niezabarwionego slajdu w celu kompensacji autofluorescencji, używając filtra Sample AF do nawigacji (Rysunek 3H).
      UWAGA: Interesujące są lokalizacje z erytrocytami i strukturami kolagenowymi. W przypadku silnych obszarów autofluorescencyjnych może być konieczne skrócenie czasu ekspozycji filtra Opal480. Jeśli sygnał Opal480 jest wystarczająco silny, powinien być nadal dobrze oddzielony (patrz sekcja 6) od struktur autofluorescencyjnych ze względu na implementację zastrzeżonego filtra Sample AF.
    13. Ocenić jakość barwienia i obrazowania za pomocą oprogramowania (patrz punkty 5 i 6; Rysunek 4, Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S1 i Rysunek uzupełniający S2).
    14. Wybierz przycisk Zapisz..., aby upewnić się, że protokół i jego dostosowane czasy ekspozycji są zapisane w protokole.
      UWAGA: Gdy protokół jest już zapisany, oprogramowanie nie wysyła do tej pory dodatkowego powiadomienia o niezapisanych zmianach.
  5. Automatyczne skanowanie slajdów
    1. Wróć do menu głównego i kliknij Skanuj slajdy, aby zeskanować slajdy.
    2. Ręcznie wprowadź nazwy/identyfikatory slajdów oraz odpowiadające im zadania i protokół w obszarze Konfiguruj zadania lub automatycznie z wcześniej utworzonego pliku .csv za pomocą opcji Załaduj ustawienia.
    3. Kliknij przycisk Skanuj, aby rozpocząć skanowanie.
    4. Poczekaj, aż pojawi się okno, aby zapisać konfigurację skanowania. Kliknij przycisk Zapisz, aby użyć ustawień domyślnych i rozpocząć skanowanie.
      UWAGA: Skanowanie tą metodą zajmuje ~10-20 minut na slajd. W zależności od liczby slajdów skanowanie może potrwać nawet cały dzień.
    5. Sprawdź, czy skanowanie slajdów zakończyło się pomyślnie dla wszystkich slajdów, szukając komunikatów o błędach. Aby dowiedzieć się, czy skanowanie zakończyło się pomyślnie, poszukaj zapisanego pliku skanowania całego slajdu Akoya (.qptiff) skanu i całej tkanki w skanie.

5. Adnotacja danych za pomocą przeglądarki slajdów

  1. Wróć do menu głównego i kliknij Uruchom Phenochart, aby otworzyć przeglądarkę slajdów.
  2. Jeśli skanowane pliki nie są bezpośrednio widoczne, wyznacz ich lokalizację, klikając najpierw ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu, przejdź do Zmień lokalizację przeglądarki... i losowo wybierz jeden z plików .qptiff interesującego Cię zestawu danych.
    UWAGA: Dane są domyślnie przechowywane w folderze D:\Data\VectraPolaris.
  3. Załaduj slajd, zaznaczając go i klikając przycisk Załaduj w prawym górnym rogu lub klikając go dwukrotnie.
  4. Zaloguj się, klikając przycisk Zaloguj się w prawym górnym rogu.
    UWAGA: Nazwa użytkownika może składać się tylko z inicjałów lub imienia i jest używana do śledzenia, kto dodał jakie adnotacje.
  5. Aby przeprowadzić rozmieszanie, kliknij przycisk Unmixing u góry i wybierz opcję Opal + AF.
    UWAGA: Jest to przydatne do pozbycia się części sygnału autofluorescencyjnego w pobliżu kanału Opal 480, ale nie wszystkich.
  6. Aby wygenerować algorytm przetwarzania wsadowego danych, wybierz reprezentatywne obrazy za pomocą opcji Stempel, korzystając z opcji dla projektów inForm 1 x 1 obrazów (rozmiar obrazu: 928 μm x 696 μm).
    UWAGA: Kilka reprezentatywnych znaczków zawierających guz, zrąb, tło i różne typy komórek odpornościowych jest wybieranych w całym zestawie danych, aby uzyskać ~ 20-30 obrazów.
  7. W zależności od tego, co ma być analizowane w tkance, wybierz obszar zainteresowania za pomocą opcji ROI i wybierz dla Partia w formie. Ręcznie usuń obrazy, które nie muszą być analizowane, takie jak obrazy znajdujące się zbyt daleko od guza lub w tle.
    UWAGA: Zwykle rysujemy ROI wokół całego guza i wybieramy jeden dodatkowy obraz z dala od obszaru guza, aby móc przeanalizować IM ~0,5 mm.
    Jeśli narysowany zwrot z inwestycji jest stosunkowo niewielki, będzie on składał się z 2-9 połączonych obrazów 20x. Ponieważ nie jest to przez nas preferowane, należy ręcznie stemplować tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (wybraną dla partii inForm), aby to obejść.
  8. Po zakończeniu dodawania adnotacji pozwól, aby adnotacje zostały automatycznie zapisane i załaduj następny slajd.
  9. Podczas procesu dodawania adnotacji sprawdź, czy slajdy są poprawnie zeskanowane.
    1. Jeśli brakuje pliku .qptiff lub szkiełko nie zostało pomyślnie zeskanowane, sprawdź, czy na szkiełku znajduje się jakaś chusteczka, wyczyść szkiełko 70% etanolem i zeskanuj ponownie.
    2. Jeśli tkanka nie zostanie w pełni zeskanowana, przez co pominięty zostanie potencjalnie ważny obszar (guza), lub jeśli skanowanie ważnego obszaru było nieostre, wyczyść szkiełko 70% etanolem i zeskanuj ponownie.
      UWAGA: W obu przypadkach pomocne może być również otoczenie tkanki markerem na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby pomóc systemowi zlokalizować tkankę i spróbować ponownie zeskanować (Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S3). W naszych rękach cienki czerwony marker sprawdził się lepiej niż gruby marker.
  10. Po zakończeniu skanowania i adnotacji wszystkich próbek należy wykonać kopię zapasową danych, przechowując je na innym komputerze lub dysku zewnętrznym.

6. Widmowe rozmieszanie

  1. Otwórz oprogramowanie do automatycznej analizy obrazów inForm.
  2. Załaduj obrazy do oprogramowania za pomocą Plik | Otwórz obraz; Wybierz pliki .qptiff. Poczekaj, aż stemple oznaczone w kroku 5.6 jako projekty inForm zostaną załadowane do projektu.
  3. Załaduj pliki .qptiff, które są obrazowane w celu kompensacji autofluorescencji.
  4. Aby skompensować autofluorescencję, użyj narzędzia Wybierz autofluorescencję na obrazie, aby narysować linię na obrazie od niezabarwionego slajdu przez różne typy struktur, które są autofluorescencyjne, takie jak erytrocyty i kolagen.
  5. W sekcji Edit Markers and Colors... (Edytuj znaczniki i kolory) przypisz nazwy znaczników, które odpowiadają fluoroforowi Opal, i dostosuj kolor do preferowanego.
  6. Aby rozmieszać fluorofory, wybierz opcję Przygotuj wszystko w lewym dolnym rogu.
  7. Przejrzyj obrazy i sprawdź, czy wszystkie sygnały są widoczne na obrazach i czy rozmieszanie poszło dobrze. Wybierz ikonę gałki ocznej, aby wyłączyć i włączyć wszystkie znaczniki jeden po drugim, aby sprawdzić jakość.
  8. Opcjonalnie można wytrenować algorytmy segmentacji tkanek, segmentacji komórek i fenotypowania.
  9. Przejdź do zakładki Eksport i utwórz nowy pusty katalog eksportu, klikając przycisk Przeglądaj... pod Eksportuj katalog.
  10. W obszarze Obrazy do wyeksportowania: wybierz opcję Composite Image and Component Images (Multi-image TIFF) (Obrazy kompozytowe i składowe (TIFF z wieloma obrazami).
  11. Wybierz punkt menu Plik | Zapisz | Projekt, aby zapisać algorytm w określonej lokalizacji.
  12. Przejdź pionowo do karty Analiza wsadowa po lewej stronie, aby przeprowadzić przetwarzanie wsadowe slajdów.
  13. Wybierz opcję Utwórz oddzielne katalogi dla każdego elementu w obszarze Opcje eksportu.
  14. Aby dodać slajdy do analizy, wybierz pliki .qptiff pod przyciskiem Dodaj slajdy... i załaduj je do analizy wsadowej.
  15. Wybierz pozycję Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe slajdów.

7. Rysunek ROI

  1. Utwórz folder zawierający tylko pliki składowe z sekcji 6, ale zachowaj nienaruszoną hierarchiczną strukturę folderów (pliki składowe znajdują się w folderach nazwanych przez próbkę/slajd).
  2. Otwórz oprogramowanie do przeglądania całych slajdów QuPath.
  3. Kliknij Utwórz projekt po lewej stronie i wybierz/utwórz nowy pusty folder o odpowiedniej nazwie.
  4. Kliknij przycisk Automatyzuj i wybierz opcję Pokaż edytor skryptów.
  5. Skopiuj i wklej skrypt, który jest dostępny w pliku uzupełniającym 7. W wierszu 34 zmień lokalizację na lokalizację, w której znajdują się foldery slajdów zawierające wszystkie pliki składowe (folder utworzony w kroku 7.1.
  6. Wybierz opcję Uruchom i wróć po zakończeniu zszywania wsadowego slajdów (następnego dnia lub później), aby kontynuować.
  7. Przeciągnij wygenerowane pliki .ome.tif do projektu QuPath i zapisz je jako projekt.
  8. Gdy automatycznie pojawi się nowe okno, wybierz Ustaw typ obrazu | Fluorescencja i kliknij przycisk Importuj.
  9. W menu po lewej stronie obserwuj listę próbek; kliknij dwukrotnie na jedną, aby otworzyć próbkę (Rysunek 5A).
  10. Aby dostosować intensywność kanałów, aby były lepiej widoczne, kliknij ikonę kontrastu.
  11. Wybierz wszystkie kanały i kliknij przycisk Resetuj.
  12. Wyłącz autofluorescencję.
  13. Aby rozpocząć rysowanie ROI dla guza, kliknij ikonę kontrastu i wybierz opcję Pokaż skalę szarości. Wybierz kanał markera nowotworowego i dostosuj intensywność, aby był optymalnie widoczny (Rysunek 5B).
  14. Kliknij narzędzie pędzla, aby z grubsza narysować ROI guza.
  15. Wybierając narzędzie różdżki, kliknij poza obszarem ROI, naciskając Alt, aby wygładzić ROI od zewnątrz (Rysunek 5C).
  16. Połącz oddzielone kawałki guza z tym samym zwrotem z inwestycji.
  17. Nadaj ROI odpowiednią nazwę, taką jak guz, klikając prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie; wybierz opcję Ustaw właściwości i wprowadź nazwę.
  18. Aby utworzyć ROI dla IM, rozwiń istniejący ROI z regionu guza, wybierając: Obiekty | Adnotacje... | Rozwiń adnotacje.
  19. Wybierz, jaki powinien być rozmiar promienia rozwinięcia i wybierz Usuń wnętrze i Ogranicz do rodzica (Rysunek 5D).
  20. Kliknij ikonę kontrastu, wybierz kanał autofluorescencji i dostosuj intensywność, aby był optymalnie widoczny.
  21. Kliknij różdżkę i dostosuj ROI, naciskając alt, aby wygładzić ROI z zewnątrz i usunąć wszelkie tło, które nie powinno być częścią tego ROI.
  22. Nadaj zwrotowi ROI odpowiednią nazwę, taką jak inwazyjny margines lub IM, klikając prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie, wybierz Ustaw właściwości, wprowadź nazwę i opcjonalnie zmień jej kolor na zielony.
  23. Zapisz adnotacje: Plik | Eksport obiektów | Eksportuj wszystkie obiekty i kliknij przycisk OK z domyślnym wyborem opcji Eksportuj jako FeatureCollection i zapisz go w preferowanej lokalizacji.

8. Wykrywanie komórek odpornościowych

  1. Ponieważ ImmuNet wykorzystuje dane komponentów (wielokanałowe pliki TIFF) zarówno do trenowania, jak i wnioskowania, podziel adnotacje na zestawy treningowe i walidacyjne. Aby wytrenować model, wykonaj kroki opisane w pliku Readme repozytorium, zastępując przykładowy zestaw danych i adnotacje żądanymi danymi. Oprócz różnych komórek odpornościowych, podaj modelowi negatywne przykłady, robiąc adnotacje w tle w miejscach, które nie powinny być rozpoznawane jako komórka zainteresowania: komórki nowotworowe, inne komórki lub "brak komórek" (struktury, które można pomylić z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania); zobacz publikację ImmuNet, aby uzyskać szczegółowe informacje32.
  2. Korzystając z adnotacji walidacji, upewnij się, że wydajność jest zadowalająca. Przyjrzyj się współczynnikowi błędów na typ adnotacji — odsetek adnotacji walidacji, które nie zostały wykryte przez model — najprostsza metryka oceny. Oceń wydajność w odniesieniu do wyników fałszywie dodatnich, wykonując kilka w pełni opisanych zwrotów z inwestycji i obliczając wyniki F.
  3. Oprócz oceny ilościowej, przeprowadź wizualną inspekcję prognozy, aby uzyskać jakościowe zrozumienie błędów, które model ma tendencję do popełniania (Rysunek 6, Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S4 i Rysunek uzupełniający S5). Jeśli wydajność modelu zostanie oceniona jako niewystarczająca, zwizualizuj przewidywanie dla niektórych kafelków zgodnie z opisem w repozytorium i sprawdź, które witryny są najbardziej podatne na błędy. Twórz więcej adnotacji w takich witrynach i ponownie uruchamiaj trenowanie i ocenę modelu.
  4. Po osiągnięciu docelowej wydajności uruchom wnioskowanie dla całego zestawu danych zgodnie z opisem w sekcji Wnioskowanie dla całego zestawu danych w pliku Readme repozytorium. Użyj uzyskanych plików .csv z predykcją modelu jako danych wejściowych do analizy danych (w tym celu napisz skrypt w języku Python lub R).

9. Predykcja fenotypowania i analiza danych

UWAGA: W tej sekcji podajemy przykład prostej analizy danych dla pojedynczej próbki czerniaka wybarwionej panelem limfocytów, który łączy lokalizacje komórek odpornościowych zidentyfikowane przez ImmuNet (sekcja 8) i ROI wyznaczone za pomocą QuPath (sekcja 7). Analiza została przeprowadzona w R 4.1.1 (skrypt jest dostarczany jako plik uzupełniający 8). Skrypt wymaga pakietów: plyr 1.8.8, dplyr 1.0.8, tidyr 1.2.0, sf 1.0-7, ggplot2 3.4.0, RANN 2.6.1 i RColorBrewer 1.1-2, które można zainstalować za pomocą polecenia install.packages(). Jako dane wejściowe pobierany jest plik .csv z przewidywaniami ImmuNet dotyczącymi próbki oraz plik z ROI wyeksportowany z QuPath. Kroki 9.1-9.6 opisują analizę pojedynczej próbki wykonywaną w dostarczonym skrypcie, a sekcje 9.7-9.9 opisują opcje analizy wielu próbek.

  1. Po załadowaniu przewidywań ImmuNet do R, określ progi przewidywanej ekspresji markerów, wykreślając markery definiujące fenotypy względem siebie i wybierając progi, które najlepiej oddzielają populacje.
    UWAGA: Strategia bramkowania zastosowana dla danej próbki jest pokazana w Rysunek 7B. Strategie bramkowania dla paneli komórek szpikowych i dendrytycznych są pokazane w pliku uzupełniającym 6: rysunek uzupełniający S6 i rysunek uzupełniający S7.
  2. Po określeniu progów, użyj ich, aby przypisać każdej predykcji ImmuNet fenotyp zdefiniowany w panelu. W niektórych przewidywaniach należy zauważyć, że żaden z przewidywanych markerów nie przekracza progu lub kombinacja markerów uznanych za wyrażone po progowaniu może być niespójna (np. przewidywania CD3 + CD20 + w panelach limfocytów). Jeśli w kroku 8.3 zostanie osiągnięta dobra wydajność modelu, ułamek takich przewidywań będzie niewielki; Odfiltruj je przed analizą.
  3. Aby oddzielnie przeanalizować ROI dla guza i jego marginesu inwazyjnego do 100 μm narysowanego w QuPath, załaduj odpowiednie pliki GeoJSON w R i dla każdej prognozy określ ROI, w którym mieści się prognoza.
  4. W celu sprawdzenia poczytalności i w ramach eksploracyjnej analizy danych, wizualizuj komórki odpornościowe znajdujące się w próbce oddzielnie w odpowiednich ROI wraz z granicami ROI (Rysunek 7A).
  5. Teraz oblicz gęstości różnych komórek odpornościowych osobno dla każdego ROI. Gęstości stwierdzone w danej próbce przedstawiono w tabeli 1.
  6. Jeśli dostępnych jest wiele próbek, zwizualizuj rozkład gęstości komórek. Przekształć logarytmicznie wartości gęstości, aby uzyskać wartości o rozkładzie normalnym.
    UWAGA: Gdy liczba niektórych fenotypów wynosi 0, nie można ich przekształcić logarytmicznie, co prowadzi do brakujących wartości. Aby przezwyciężyć ten problem, można zastosować wygładzanie LaPlaca, dodając najpierw 0,5 do wszystkich liczb komórek, a następnie dzieląc je przez powierzchnię.
  7. Przeanalizuj wartości gęstości i wykreśl je za pomocą wybranego oprogramowania (Rysunek 8).
  8. Zachowane lokalizacje komórek umożliwiają analizę przestrzenną. Na przykład dla każdej wykrytej komórki odpornościowej znajdź najbliższego sąsiada, a następnie dla każdego fenotypu oblicz procent przypadków, w których różne fenotypy występują jako najbliższy sąsiad.
    UWAGA: Ponieważ liczba komórek NK znalezionych w tej próbce była bardzo mała, wykluczyliśmy je z tej analizy. Uzyskane wyniki dla ROI guza i IM są podane w Rysunek 9.

Wyniki

Bloki FFPE zawierające tkankę nowotworową wybrano na podstawie raportów patomorfologicznych i preparatów barwionych H&E. W przypadku resekcji wielu zmian nowotworowych u pacjenta i/lub gdy próbki guza są duże, są one dzielone na wiele bloków FFPE. Preferujemy analizę komórek odpornościowych zarówno w obrębie guza, jak i w obszarze znanym jako margines inwazyjny (IM) nowotworu. IM to niezwyrodowana tkanka zrębu przylegająca do guza. Dlatego w sytuacjach, gdy dla jednej próbki nowotworu dostępnych jest wiele bloków FFPE, wybierane są te bloki, które zawierają oba typy tkanek. Jak widać na preparatach barwionych H&E, jeden blok FFPE zawierał tkankę nowotworową oraz tkankę zrębu przylegającą do guza (Rysunek 1A). Inny blok FFPE z tego samego guza zawierał znacznie mniej otaczającej tkanki zrębu (Rysunek 1B). Jednak w przypadku niektórych próbek tkankowych nie ma możliwości wyboru bloków FFPE lub margines inwazyjny nie występuje w żadnym z dostępnych bloków. Często zdarza się to w przypadku biopsji (igłowych), co należy uwzględnić podczas interpretacji danych.

Porównanie histologiczne, barwione próbki tkanek, schemat, wykazanie obecności IM, analiza badawcza.
Rycina 1: Preparaty barwione HE z próbki guza czerniaka. (A) Przykład próbki guza z tkanką zrębową sąsiadującą z guzem (IM) w prawym górnym rogu próbki (oznaczone czarnymi grotami strzałek). (B) Inna próbka z tej samej zmiany nowotworowej z niewielką ilością lub całkowitym brakiem tkanki zrębowej w próbce. Paski skali = 5 mm. Skróty: HE = hematoksylina i eozyna; IM = margines inwazyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Multiplexowe barwienie IHC z zastosowaniem proponowanego panelu siedmiokolorowego (Plik uzupełniający 4) można przeprowadzić ręcznie w ramach 3-dniowego procesu barwienia (przy uwzględnieniu standardowych godzin pracy) lub w trybie nocnym w automatycznym barwiarzu. Podczas korzystania z automatycznego barwiarza preparaty muszą zostać zamontowane w określonym miejscu na szkiełku przedmiotowym, co zapewnia optymalny przepływ cieczy w systemie (Rysunek 2A). Gdy skrawki są prawidłowo zamontowane na szkiełkach (Rysunek 2B), zostaną one zabarwione równomiernie (Rysunek 2C). Jeśli skrawki nie są zamontowane optymalnie na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 2D), często prowadzi to do suboptymalnego wzoru barwienia (Rysunek 2E), ponieważ ciecze w automatycznym barwiarzu nie docierają do (całej) tkanki. Może się to zdarzyć, gdy próbki są bardzo duże lub gdy zamontowane szkiełka zostały przygotowane przez osobę nieznającą tego problemu. W takich przypadkach do analizy należy wybrać tylko prawidłowo zabarwioną część szkiełka. Innym rozwiązaniem dla tego typu próbek może być barwienie ręczne w celu optymalnego rozprowadzenia cieczy.

Proces barwienia preparatu mikroskopowego, schemat i zdjęcia pokazujące równomierne i nierównomierne barwienie histologiczne.
Rycina 2: Mocowanie skrawka FFPE do szkiełka przedmiotowego i jego wpływ na wynik. (A) Schemat wskazujący miejsce mocowania na szkiełku przedmiotowym w celu uzyskania optymalnego barwienia w autobarwiarce. (B) Przykład prawidłowo przygotowanego szkiełka. (C) Prawidłowo przygotowane szkiełka pozwalają na uzyskanie równomiernie zabarwionego skrawka tkanki. (D) Przykład nieprawidłowo przygotowanego szkiełka. (E) Nieprawidłowe mocowanie skrawka może prowadzić do niepełnego zabarwienia tkanki, co widoczne jest po lewej stronie zdjęcia. Paski skali = 5 mm. Skrót: FFPE = utrwalone formaliną i zatopione w parafinie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Gdy duże eksperymenty z multipleksową IHC są przeprowadzane w wielu rundach barwienia i konieczne jest przygotowanie dużych ilości roztworów, najlepiej jest najpierw przetestować te odczynniki w serii monopleksowej IHC przed przystąpieniem do IHC multipleksowej. Monopleksową IHC sprawdza się za pomocą cyfrowego obrazownika patomorfologicznego pod kątem oczekiwanych wzorów barwienia, a czasy ekspozycji ustawia się z odpowiednimi filtrami na preparatach kontrolnych (Rycina 3A-H). Tkanka migdałka jest stosowana jako kontrola pozytywna dla większości markerów komórek odpornościowych. Ponieważ czas ekspozycji DAPI w kontrolnej tkance migdałka jest zawsze wyższy niż w innych tkankach (Rycina 3G), czas ekspozycji DAPI musi zostać ustawiony dla typu tkanki, która jest badana. Typowe czasy ekspozycji przy tym rodzaju skanowania wynoszą od 1 ms do 30 ms, w zależności od fluoroforu i filtra (Rycina 3I). Jeśli w przypadku monopleksowej IHC wartości te zostaną przekroczone lub wzór barwienia nie jest tak wyraźny, jak oczekiwano, roztwór przeciwciał należy skorygować lub wymienić. W przedstawionym tutaj przykładzie zdecydowano o zwiększeniu stężenia FOXP3 (Rycina 3C oraz Rycina 3I), aby intensywność była bardziej zbliżona do pozostałych markerów. Autofluorescencja może być również silniejsza w innych tkankach niż w kontrolnej tkance migdałka. W naszych warunkach czas ekspozycji dla filtra Sample AF wynosi od 25 ms do 50 ms (Rycina 3H,I).

Filtry obrazowania fluorescencyjnego Opal480-780, DAPI, AF z czasami naświetlania; analiza mikroskopowa.
Rycina 3: Ustawienie czasów naświetlania na próbkach IHC monopleksowych i niebarwionych próbkach kontrolnych. (A) CD20 - sygnał Opal 480 w kontrolnej tkance migdałka. (B) CD3 - sygnał Opal 520 w kontrolnej tkance migdałka. (C) FOXP3 - sygnał Opal 570 w kontrolnej tkance migdałka. (D) CD56 - sygnał Opal 620 w kontrolnej tkance migdałka (E) CD8 - sygnał Opal 690 w kontrolnej tkance migdałka. (F) Marker nowotworowy - sygnał Opal 780 w kontrolnej tkance migdałka. (G) Sygnał DAPI w kontrolnej tkance migdałka jest często słabszy niż w analizowanym typie tkanki. (H) Autofluorescencja - sygnał AF próbki w kontrolnej tkance nowotworowej. (I) Zrzut ekranu czasów naświetlania przed ich korektą o 10% i weryfikacją na preparatach barwionych metodą IHC multipleksowej. Paski skali = 100 µm. Skróty: AF = autofluorescencja; IHC = immunohistochemia; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Po przeprowadzeniu wielokrotnego barwienia IHC, czasy ekspozycji są dostosowywane do ustawień z pojedynczego barwienia IHC poprzez sprawdzenie kilku preparatów multiplex IHC i wybranie opcji auto-expose. Przy tym rodzaju skanowania nie ma opcji ochrony przed nasyceniem, dlatego niezwykle ważne jest, aby nie ustawiać zbyt wysokiej ekspozycji, unikając w ten sposób prześwietlenia. Prześwietlenie utrudnia spektralne rozdzielenie (unmixing) fluoroforów. Często nie ustawiamy czasów ekspozycji przekraczających czasy określone dla pojedynczego barwienia IHC, a czasy ekspozycji zmniejszamy jedynie dla markerów, które wykazują silniejszy sygnał w multiplex IHC (Rysunek 3G i Rysunek 4A). Poprzez automatyczną ekspozycję w różnych miejscach na kilku preparatach można zaobserwować, że czasy ekspozycji dla niektórych filtrów są wciąż zbyt wysokie. Muszą one zostać dostosowane do najniższej zaobserwowanej wartości przy ustawieniu auto-ekspozycji, a następnie należy odjąć kolejne 10% tej wartości, aby zapobiec prześwietleniu w innych, nieprzebadanych miejscach (Rysunek 4A). Stosując tę metodę, czasy ekspozycji dla niektórych filtrów mogą być krótsze niż te ustawione przy pojedynczym barwieniu IHC. Jednak w przypadku udanego eksperymentu multiplex IHC wszystkie markery powinny być widoczne, przynajmniej na preparacie kontrolnym (Rysunek 4B-H, Plik uzupełniający 6: Rysunek uzupełniający S1 oraz Rysunek uzupełniający S2). Należy wziąć pod uwagę, że niektóre markery mogą nie występować w każdej próbce. Poprzez dołączenie preparatu kontrolnego zawierającego przynajmniej przekrój migdałka, można zweryfikować poprawność barwienia wszystkich markerów ze standardowych paneli oraz siłę sygnału.

Multiplexowa immunofluorescencja, obraz kompozytowy, markery CD, barwniki Opal, analiza spektralna, konfiguracja filtrów.
Rysunek 4: Przykład prawidłowo zabarwionego skrawka z panelem limfocytów w preparacie guza czerniaka. (A) Czasy ekspozycji użyte do rejestracji tej próbki multiplexowej IHC. (B) Obraz kompozytowy multiplexowego panelu limfocytów IHC w tkance nowotworowej. (C) sygnał CD20 - Opal 480 w kolorze magenta. (D) sygnał CD3 - Opal 520 w kolorze czerwonym. (E) sygnał FOXP3 - Opal 570 w kolorze zielonym. (F) sygnał CD56 - Opal 620 w kolorze żółtym. (G) sygnał CD8 - Opal 690 w kolorze cyjanowym. (H) TM - Opal 780 w kolorze białym. Paski skali = 100 µm. Skróty: TM = marker nowotworowy; IHC = immunohistochemia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Preparaty do multipleksowej IHC są w pełni skanowane przez obrazownik cyfrowy. Kafelki do późniejszej analizy są wybierane w przeglądarce slajdów. Jednakże, gdy konieczna jest analiza bardziej specyficznych obszarów, takich jak guz w kontraście do IM, można wyrysować te obszary zainteresowania (ROI) przy użyciu programu QuPath. Po zakończeniu przetwarzania wsadowego kafelków wybranych w przeglądarce slajdów, pliki składowe są ponownie scalane (Rycina 5A oraz Plik uzupełniający 7). Wykorzystując kanał markera nowotworowego (Rycina 5B) oraz narzędzie magicznej różdżki w programie QuPath, można obrysować kontur guza, aby utworzyć „Tumor ROI” (Rycina 5C). Następnie Tumor ROI można rozszerzyć o określoną odległość, w tym przypadku 500 µm, aby utworzyć „invasive margin ROI” (Rycina 5D). Wszelkie niepożądane tło (nietkankowe) jest usuwane z tego ROI za pomocą narzędzia magicznej różdżki poprzez analizę sygnału autofluorescencji (Rycina 5E). Zarówno Tumor ROI, jak i IM ROI są zapisywane jako plik GeoJSON do dalszego przetwarzania (Rycina 5F).

Schemat analizy guza z połączonymi plikami, kanałem markera, ROI; interpretacja danych mikroskopowych.
Rycina 5: Proces wyznaczania ROI guza oraz ROI marginesu inwazyjnego w programie QuPath. (A) Połączone pliki komponentów. (B) Obraz w skali szarości przedstawiający wyłącznie kanał markera guza. (C) ROI guza jest wykreślone wokół sygnału markera guza. (D) Nowe ROI powstaje poprzez rozszerzenie ROI guza o 100-500 µm w celu utworzenia ROI marginesu inwazyjnego (IM). (E) ROI IM jest korygowane tak, aby obejmowało tylko tkankę zrębową, poprzez wykluczenie tła (sygnał ujemny) oraz innych dużych struktur tkankowych, takich jak tłuszcz, naczynia krwionośne i mieszki włosowe. (F) Wynikowe ROI guza oraz ROI IM są zapisywane i eksportowane do plików GeoJSON w celu dalszego przetwarzania obszarów. ROI guza jest wyświetlane z czerwoną obramówką, a ROI IM z zieloną obramówką. Paski skali = 2 mm. Skróty: ROI = obszar zainteresowania; IM = margines inwazyjny; GeoJSON = Geographic JavaScript Object Notation. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sieci ImmuNet mogą być wykorzystywane do wykrywania komórek odpornościowych. W przypadku panelu limfocytów, eksperymentalny obraz kompozytowy (Rycina 6A) może zostać porównany wizualnie z komórkami odpornościowymi wykrytymi przez oprogramowanie (Rycina 6B). Podobne porównania wizualne można przeprowadzić dla panelu mieloidalnego (Plik uzupełniający 6: Rycina uzupełniająca S4) oraz panelu komórek dendrytycznych (Plik uzupełniający 6: Rycina uzupełniająca S5).

Złożony obraz komórek i obraz ImmuNet z markerami DAPI, CD20, CD3; analiza sieci komórek odpornościowych.
Rysunek 6: Limfocyty rozpoznane przez ImmuNet. (A) Złożony obraz z Rysunku 4B przedstawiający komórki rozpoznane przez ImmuNet zaznaczone białymi kropkami. (B) Komórki rozpoznane przez ImmuNet i następująca po tym detekcja ekspresji markerów. Paski skali = 50 µm. Skrót: TM = marker nowotworowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Komórki odpornościowe wykryte przez ImmuNet i zapisane w formacie .csv mogą zostać zaimportowane do dowolnego języka programowania w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Przeprowadziliśmy wizualizację przestrzenną oraz gating w programie R (Supplemental File 8). Wykryte komórki można następnie zwizualizować przestrzennie (Figure 7A, Supplemental File 6: Supplemental Figure S6 oraz Supplemental Figure S7). W celu fenotypowania poszczególnych komórek odpornościowych można przeprowadzić gating w oparciu o ekspresję pseudomarkerów (Figure 7B).

Rozkład komórek nowotworowych, wykresy kropkowe cytometrii przepływowej, schemat analizy komórek odpornościowych, badania onkologiczne.
Rysunek 7: Strategia bramkowania panelu limfocytów. (A) Komórki odpornościowe wykryte w obszarach guza oraz marginesu inwazyjnego wyznaczonych za pomocą oprogramowania QuPath. (B) Bramkowanie wszystkich komórek wykrytych przez system ImmuNet z części A. Limfocyty są w pierwszej kolejności bramkowane na limfocyty B CD20+ i limfocyty T CD3+. Limfocyty T CD3+ są następnie bramkowane pod kątem ekspresji CD8 i FOXP3. Populacja CD20-CD3- jest bramkowana w celu wyodrębnienia komórek natural killer CD56+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Gdy fenotypy przewidywanych komórek są określane za pomocą bramkowania, gęstość komórek o różnych fenotypach może zostać obliczona w obrębie różnych obszarów ROI. Oblicza się to poprzez podzielenie całkowitej liczby komórek danego fenotypu przez powierzchnię ROI (Tabela 1, Rysunek 8 oraz Plik uzupełniający 8). W tym przypadku limfocyty B są definiowane jako CD3-CD20+, limfocyty T pomocnicze jako CD3+CD20-CD8-FoxP3-, limfocyty T regulatorowe jako CD3+CD20-CD8-FoxP3+, limfocyty T cytotoksyczne jako CD3+CD20-CD8+FoxP3-, a komórki NK jako CD3-CD20-CD56+.

FenotypGęstość w guzie (komórki/mm³)2)Gęstość w IM (komórki/mm)2)
limfocyt B185.74145.62
limfocyt T pomocniczy301.46157.51
Regulacyjne limfocyty T38.5319.53
limfocyt T cytotoksyczny185.3583.21
komórka NK0.180

Tabela 1: Gęstość fenotypów w obszarach ROI. Gęstość komórek o różnych fenotypach znalezionych w pojedynczej próbce czerniaka barwionej panelem limfocytarnym. Gęstości obliczono oddzielnie dla obszarów ROI guza i IM. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania.

Wykres słupkowy gęstości komórek; guz vs. ROI IM; typy komórek odpornościowych obejmują komórki NK, B i T; analiza danych.
Rycina 8: Przykład analizy danych dla wielu próbek. Analiza gęstości różnych fenotypów limfocytów w guzie i IM 23 pierwotnych guzów czerniaka. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby pogłębić analizę informacji przestrzennych tych komórek odpornościowych, możliwe jest również określenie odległości między zidentyfikowanymi fenotypami lub procentowego udziału fenotypów najbliższych sąsiadów w próbce (Rycina 9).

Rozkład typów komórek: B, Tcyt, Thelp, Treg; wykres porównawczy, wartości procentowe, skumulowane wykresy słupkowe.
Rycina 9: Przykład analizy najbliższego sąsiada dla pojedynczej próbki. Procent fenotypów najbliższego sąsiada dla różnych typów komórek w (A) guzie oraz (B) ROI IM w pojedynczej próbce czerniaka barwionej panelem limfocytów. Skróty: IM = margines inwazyjny; ROI = obszar zainteresowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Multiplex IHC podsumowujący specyfikacje protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Protokół automatycznego barwienia dla monopleksu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Protokół autobarwienia dla kompensacji autofluorescencji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Protokół automatycznego barwienia dla multipleksowej immunohistochemii. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Szablon pliku .csv. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Panele komórek mieloidalnych i dendrytycznych w próbce tkanki czerniaka; znakowanie slajdów na wypadek błędu skanowania; komórki mieloidalne i dendrytyczne rozpoznane przez ImmuNet; strategie bramkowania paneli komórek mieloidalnych i dendrytycznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Skrypt do łączenia obrazów (stitch) w QuPath. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Skrypt do analizy danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Analiza przestrzenna TME jest poszukiwaną techniką, aby dowiedzieć się więcej o kompartmencie komórek odpornościowych i odkryć nowe biomarkery prognostyczne i predykcyjne, szczególnie w dziedzinie immunoonkologii16. W tym celu opracowywanych jest wiele różnych technik, obejmujących wykrywanie białek, transkryptów mRNA lub kombinacji tych dwóch, z oszacowaniem do 100-1000 celów. Większa multipleksacja odbywa się jednak kosztem mniej wysokoprzepustowych eksperymentów, wyższych kosztów eksperymentów i wyzwań technicznych, a często tylko niewielka część TME może być analizowana. Multiplex IHC przy użyciu metody opartej na TSA, którą tutaj opisujemy, wykrywa jednocześnie sześć różnych markerów + DAPI, jest stosunkowo tańszy do wykonania, a całe skrawki tkanek są obrazowane w mniej niż 20 minut, gotowe do pełnej analizy. Technika ta stała się mniej złożona dzięki automatyzacji procedury barwienia. Ulepszenia w mikroskopie wielospektralnym, które obejmują dodanie dwóch dodatkowych filtrów, znacznie poprawiły czas rozmieszania widma i skanowania. Możliwe jest jednoczesne wykrycie do ośmiu różnych markerów + DAPI. Jednak dzięki rozszerzeniu multipleksowania o więcej markerów, wyżej wymienione korzyści znikają, ponieważ rozmieszanie spektralne staje się trudniejsze, a czas skanowania całych slajdów znacznie się wydłuża. Podejmowane są wysiłki w celu standaryzacji multipleksów IHC między różnymi instytucjami, aby ułatwić ich wdrożenie w warunkach diagnostycznych. W celu standaryzacji multipleksu IHC zalecamy użytkownikom stosowanie bardziej dostępnego protokołu z sześcioma różnymi znacznikami + DAPI. Niemniej jednak nadal potrzebna jest spora wiedza techniczna, a dalsza analiza może być wyzwaniem, dla którego opracowaliśmy metodologie, które są opisane w tym protokole.

Standaryzacja rozpoczyna się od opracowania paneli multipleksowych IHC. Znaczenie wyboru przeciwciał pierwszorzędowych wykrywających określone cele białkowe zostało podkreślonejuż wcześniej. Nasze multipleksowe panele IHC są w większości opracowywane z pierwotnymi klonami przeciwciał, które są również używane i walidowane pod kątem IHC w naszym dziale diagnostycznym. Jednak w przypadku multipleksowego panelu IHC z komórek dendrytycznych większość przeciwciał nie została użyta w warunkach diagnostycznych (van der Hoorn i wsp., manuskrypt w przedłożeniu). Aby zapewnić swoistość i zminimalizować różnice w partiach, zdecydowaliśmy się na użycie przeciwciał monoklonalnych zamiast przeciwciał poliklonalnych, a także zwalidowaliśmy większość przeciwciał przy użyciu transfekowanych linii komórkowych i komórek pierwotnych. Na przestrzeni lat różne wersje multipleksowych paneli IHC były wykorzystywane w licznych badaniach z wykorzystaniem systemu Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Aby optymalnie zaimplementować te multipleksowe panele IHC w systemie PhenoImager HT, konieczne było wprowadzenie pewnych zmian w pierwotnych kombinacjach przeciwciał i fluoroforów. Aby skorzystać z lepszego rozmieszania spektralnego i szybszych czasów skanowania całych wycinków tkanek, konieczne jest wdrożenie najnowszych fluoroforów Opal480 i Opal780 oraz unikanie stosowania fluoroforów Opal540 i Opal650 w siedmiokolorowych multipleksowych panelach IHC. Czas skanowania jest ~3-10 razy szybszy w zależności od wielkości wycinka tkanki. Regulacja panelu Multiplex IHC była dość łatwa do osiągnięcia, ale należy pamiętać o kilku kwestiach. Widmo fluorescencyjne Opal480 w dużym stopniu pokrywa się ze spektrum autofluorescencji, a zatem zakłóca widmowe mieszanie erytrocytów i innych struktur autofluorescencyjnych. Zastosowanie zwiększonego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego w połączeniu z Opal480 rozwiązało ten problem w większości przypadków. Implementacja opatentowanego filtra Sample AF w PhenoImager HT ułatwia rozmieszanie Opal480 i autofluorescencji. Jednak najlepiej jest użyć przeciwciała pierwszorzędowego, które daje wyraźny sygnał, gdy jest stosowane z Opal480, tak aby jego sygnał był wyższy niż autofluorescencja.

Mimo że te multipleksowe panele IHC są już znane, należy wziąć pod uwagę różnice między partiami. Wykonując monopleksowe kontrole IHC przed rozpoczęciem pełnego eksperymentu multipleksowego IHC, czasami zaobserwowaliśmy, że pierwszorzędowe przeciwciała działają albo silniej, albo słabiej z eksperymentu na eksperyment. Przyczyną tego mogą być błędy pipetowania, nieoptymalne warunki przechowywania odczynnika i okres przydatności do spożycia. Rozwiązaliśmy ten problem, dostosowując roztwór przeciwciała pierwotnego w oparciu o nasze doświadczenie. Nawet jeśli żadna z wyżej wymienionych regulacji nie musiała być wykonywana, przy każdym eksperymencie wsadowym multipleksu IHC ważne jest, aby ustawić czasy naświetlania na podstawie monopleksowych szkiełek kontrolnych barwionych IHC.

Ponieważ nasze badania początkowo koncentrowały się na różnych typach raków i czerniaka, wymagane było, aby multipleksowe panele IHC były wymienne między typami nowotworów przy minimalnych dostosowaniach. Dlatego zawsze uwzględnialiśmy wiele typów tkanek (nowotworowych) w procesie optymalizacji i zaobserwowaliśmy, że rozcieńczenia pierwotnych przeciwciał dla markerów komórek odpornościowych mogą być podobne między różnymi typami nowotworów. Jednak wykrywanie tkanki nowotworowej między rakiem a czerniakiem wymaga różnych markerów nowotworowych. W związku z tym marker nowotworowy był zawsze optymalizowany do pracy na końcu każdego multipleksowego panelu IHC i obecnie jest zawsze używany w połączeniu z Opal780, który przypadkowo musi również znajdować się na ostatnim fluoroforze w procedurze barwienia multipleksowego IHC. Używając markera nowotworowego w konsekwencji na końcu multipleksowego IHC, te multipleksowe panele IHC można łatwo wymienić na inne typy nowotworów, takie jak glejak (tj. GFAP) i chłoniak Hodgkina (tj. CD30). W przypadku naczyniakomięsaka użyliśmy tego panelu IHC z multipleksem limfocytów z genem związanym z transformacją erytroblastów (ERG) jako markerem nowotworu z tylko dwoma eksperymentami optymalizacyjnymi25. Optymalizacja obejmowała miareczkowanie przeciwciała pierwszorzędowego ERG i testowanie multipleksowego panelu IHC z ERG na końcu.

Inne modyfikacje tych multipleksowych paneli IHC można również wprowadzić poprzez wymianę określonego markera komórek odpornościowych na inny marker immunologiczny lub funkcjonalny. Każda zmiana wymaga optymalizacji. Protokół optymalizacji można postępować zgodnie z opisem wcześniejszym17. Pewne zmiany w proponowanych multipleksowych panelach IHC będą kolidować ze stworzonymi przez nas algorytmami ImmuNet. Należy wygenerować wystarczającą ilość danych i poświęcić czas na wdrożenie tych zmian do algorytmu (co najmniej 750 adnotacji dla każdego nowego markera i/lub fenotypu komórki oraz 150 adnotacji dla walidacji wcześniej wytrenowanych markerów). Prezentowane tutaj panele nie zawierają markerów funkcjonalnych, chociaż implementacja markerów immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak PD-1 i PD-L1, do multipleksowych paneli IHC odbywa się w naszym laboratorium. Jednak analiza markerów, które są mniej binarne w sygnałach ujemnych i dodatnich, okazała się trudniejsza i stanowi obszar aktywnych badań w naszej grupie.

Liczba markerów, które mogą być jednocześnie oceniane za pomocą multipleksu IHC, jest ograniczona w porównaniu z innymi nowatorskimi technikami. Chociaż można to obejść, analizując różne panele na kolejnych wycinkach bloku FFPE, trudno będzie porównać te wycinki przestrzennie. Orientacja i złożone artefakty prawdopodobnie nie są takie same po przygotowaniu slajdów. Niemniej jednak multipleks IHC jest dość dostępny, co czyni go atrakcyjnym narzędziem dla większej liczby instytucji i badaczy, a tym samym bardziej odpowiednim do przyszłego wdrożenia w warunkach diagnostycznych. Dzięki standaryzacji multipleksowych paneli komórek odpornościowych IHC dla wielu typów nowotworów i dalszym analizom można uzyskać więcej wiedzy na temat różnic w TME między pacjentami a typami nowotworów. Może to na przykład prowadzić do lepszego wglądu w rolę TME w odpowiedzi przeciwnowotworowej na określone terapie. Może to nawet doprowadzić do powstania nowych biomarkerów do przewidywania takich czynników, jak odpowiedź na leczenie i oczekiwane przeżycie. Ogólnie rzecz biorąc, może to sprawić, że multipleks IHC stanie się narzędziem klinicznym pomagającym w podejmowaniu decyzji klinicznych w ramach podejścia medycyny spersonalizowanej. Trzeba przyznać, że więcej etapów procedury analizy powinno zostać prawdopodobnie zautomatyzowanych i ustandaryzowanych, aby można było ją stosować w codziennych warunkach diagnostycznych, więc jak na razie jest to głównie perspektywa futurystyczna.

Analiza wielu markerów na jednym szkiełku próbki może być bardzo potężnym narzędziem, pomimo wyzwań technicznych. Dzięki ustandaryzowanym protokołom eksperymentalnym i solidnej metodzie analizy, jak opisaliśmy tutaj przy użyciu ImmuNet, kwantyfikacja wielu markerów sprawia, że jest ona bardziej pouczająca niż klasyczna IHC, podczas gdy multipleksowy IHC pozostaje stosunkowo wysoką przepustowością w porównaniu z nowatorskimi metodami eksperymentalnymi o wyższej pleksji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

PhenoImager HT został zakupiony dzięki funduszom dostarczonym przez Centrum Medyczne Uniwersytetu Radboud i Centrum Technologii Radboud dla Mikroskopii. Mukowiscydoza jest wspierana finansowo przez grant Holenderskiego Towarzystwa Onkologicznego (10673) oraz grant ERBN Adv ARTimmune (834618). JT jest wspierany finansowo przez grant NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). Autorzy chcieliby podziękować Ericowi van Dintherowi i Ankurowi Ankanowi za ich pomoc w tworzeniu przepływów pracy do przechowywania danych IHC multipleksu, a Bengtowi Phungowi dziękujemy za instrukcje, jak zaimplementować dane IHC multipleksu w QuPath do rysowania ROI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-CD14Cell 114R-16sekcja 3, klon EPR3653
anty-CD163Marka 163M-15sekcja 3, klon MRQ-26
anty-CD19Abcamab134114sekcja 3, klon
EPR5906 anty-CD1c (BDCA1)Thermo ScientificTA505411sekcja 3, klon OTI2F4
anty-CD20Thermo ScientificMS-340-Ssekcja 3, klon L26
anty-CD3Thermo ScientificRM-9107sekcja 3, klon sp7
anty-CD303/ BDCA2Dendrytics via Enzo Lifesciences/AxxoraDDX0043sekcja 3, klon 124B3.13
anty-CD56Cell Marque 156R-94sekcja 3, klon MRQ-42
anty-CD66bBD Biosciences555723sekcja 3, klon G10F5
anty-CD68Dako AgilentM087601 sekcja 3, klon PG-M1
anty-CD8Dako AgilentM7103sekcja 3, klon C8/144B
anty-Foxp3Thermo Scientific14-4777sekcja 3, klon 236A/E7
anty-Gp100Dako AgilentM063401sekcja 3, klon HMB45
anty-HLA-DR, DP, DQSanta Cruzsc-53302sekcja 3, klon CR3/43
anty-MART-1Thermo ScientificMS-799sekcja 3, klon A103
anty-pan-cytokeratynaAbcamab86734sekcja 3, klon AE1/AE3 + 5D3
anty-SOX10Sigma Aldrich383Rsekcja 3, klon EP268
anty-tyrozynazaSanbioMONX10591sekcja 3, klon T311
anty-XCR1Cell Signaling Technologies za pośrednictwem Bioké44665Ssekcja 3, klon
rozcieńczalnika przeciwciałAkoya BioSciencesSKU  ARD1001EAsekcja 3, z zestawu Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (opcjonalnie może być również zastąpiony przez TBST z 10% BSA)
Sonda aspiracyjna BondLeica BiosciencesS21.0605sekcja 3
Czyszczenie sondy zasysającej BondLeica BiosciencesCS9100sekcja 3
Roztwór do odwoskowywania BondLeica BiosciencesAR9222sekcja 3
Etykieta Bond Objectglas + kłaczki do drukuLeica BiosciencesS21.4564.Asekcja 3
System detekcji badań nad Bondem 2Leica BiosciencesDS9777sekcja 3
Automatyczny stainer Bond RX Leica Biosciences-sekcja3, platforma automatyczna
Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 LLeica BiosciencesAR9961sekcja 3
Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 LLeica BiosciencesAR9640sekcja 3
Bond TM Wash Solution 10x - 1 LLeica BiosciencesAR9590sekcja 3
BOND Uniwersalna osłonaLeica BiosciencesS21.4611sekcja 3
Zestaw do miareczkowania Bond™Leica BiosciencesOPT9049sekcja 3
Szkiełko nakrywkowe 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)Fisher Scientific 15717592sekcja 2
szkiełko nakrywkowe 24 x 50 mmVWR631-0146sekcja 2
DAPI Fluoromount-GVWR0100-20sekcja 3, ilekroć szkiełka monoplex muszą być szybko sprawdzone, a nie do oficjalnej analizy, DAPI jest barwiony oddzielnie w celu uzyskania lepszych wyników
Eozynasekcja 2, domowej roboty
Etanol 99,5%VWR4099.9005sekcja 2
Fluoromount-GVWR0100-01sekcja 3 
hematoksylina-sekcja 2, domowy
rurociąg wykrywania i fenotypowania komórek immunologicznychImmuNet
w oprogramowaniu inForm 2.4.10Akoya BioSciences-sekcja4 i 6
Pakiet odczynników OPAL 480Akoya BioSciencesFP1500001KTsekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 520Akoya BioSciencesFP1487001KTsekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 570Akoya BioSciencesFP1488001KTsekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 620Akoya BioSciencesFP1495001KTsekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 690Akoya BioSciencesFP1497001KTsekcja 3
Pakiet odczynników OPAL 780Akoya BioSciencesFP1501001KTsekcja 3
Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slajdAkoya BioSciencesNEL821001KTsekcja 3
PhenoChart 1.1.0Akoya BioSciences-sekcja5
PhenoImagerHTAkoya BioSciencesCLS143455sekcja 4, cyfrowy imager patologiczny z przeglądarką slajdów i oprogramowaniem do obrazowania (wcześniej znany jako Vectra Polaris)
Nośnik montażowy Quick-DKlinipath7280sekcja 2
QuPath 0.3.2platforma oprogramowania do analizy obrazu całego slajdu
R 4.1.1
Skrzynki przesuwneVWR631-0737sekcja 1
SuperFrost PlusThermo Scientific przez VWR631-9483sekcja 1
Oprogramowanie Vectra Polaris 1.0.13Akoya BioSciences-sekcja4
KsylenVWR4055-9005SEKCJA 2
Marka komórka D2F8T

Bibliografia

  1. Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).
  2. van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. Migrating into the tumor: a roadmap for T cells. Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).
  3. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  4. Fridman, W. H., et al. The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact. Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).
  5. Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
  6. Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. The Immunoscore: colon cancer and beyond. Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).
  7. Angell, H., Galon, J. From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer. Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).
  8. Galon, J., et al. Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force. Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).
  9. Galon, J., et al. World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge", Napoli, November 30th-December 3rd, 2016. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).
  10. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  11. Creemers, J. H. A., et al. A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).
  12. Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. CANCER IMMUNOLOGY. The "cancer immunogram". Science. 352 (6286), 658-660 (2016).
  13. Teruya-Feldstein, J. The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).
  14. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  15. Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition. Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).
  16. Parra, E. Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  17. Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  18. Roelofsen, T., et al. Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report. Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).
  19. van den Brand, D., et al. Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).
  20. van den Brand, D., et al. EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer. Cancers. 12 (7), 1762(2020).
  21. Di Blasio, S., et al. The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture. Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).
  22. van Beek, J. J. P., et al. Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination. Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).
  23. Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).
  24. Hoeijmakers, Y. M., et al. Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome. Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).
  25. van Ravensteijn, S. G., et al. Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups. Cancers. 14 (23), 5938(2022).
  26. van der Woude, L. L., et al. Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).
  27. Graham Martinez, C., et al. The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).
  28. Cortenbach, K. R. G., et al. Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry. International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).
  29. van Wilpe, S., et al. Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype. Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).
  30. Gorris, M. A. J., et al. Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).
  31. van Wilpe, S., et al. Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome. Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).
  32. Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging. bioRxiv. , (2021).
  33. Parra, E. R., et al. Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue. Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).
  34. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  35. Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers. PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).
  36. LeicaBiosystems. BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols. , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Multipleksowa immunohistochemiaprzestrzenne profilowanie immunologiczneutrwalanie w formalinie i zatapianie w parafinierozdzielanie widmowecyfrowe obrazowanie patomorfologiczneanaliza z wykorzystaniem uczenia maszynowegopopulacje limfocytówkomórki dendrytyczne
Multipleksowa analiza immunohistochemiczna przestrzennego krajobrazu komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.