Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65720

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Streszczenie

Jelita psów mają podobieństwa w anatomii, mikrobiologii i fizjologii do ludzkich, a psy naturalnie rozwijają spontaniczne zaburzenia jelitowe podobne do ludzkich. Przezwyciężenie nieodłącznego ograniczenia trójwymiarowych (3D) organoidów w dostępie do wierzchołkowej powierzchni nabłonka jelitowego doprowadziło do powstania dwuwymiarowych (2D) kultur jednowarstwowych, które odsłaniają dostępną powierzchnię światła za pomocą komórek pochodzących z organoidów. Integracja tych organoidów i jednowarstwowych kultur pochodzących z organoidów w mikroprzepływowy system Gut-on-a-Chip przyczyniła się do dalszego rozwoju technologii, umożliwiając opracowanie bardziej fizjologicznie istotnych dynamicznych modeli jelitowych in vitro.

W tym badaniu prezentujemy protokół generowania morfogenezy 3D nabłonka jelitowego psów przy użyciu pierwotnych próbek tkanki jelitowej pobranych od psów dotkniętych nieswoistym zapaleniem jelit (IBD). Przedstawiamy również protokół generowania i utrzymywania kultur jednowarstwowych 2D i systemów intestine-on-a-chip z wykorzystaniem komórek pochodzących z organoidów jelitowych 3D. Protokoły przedstawione w tym badaniu służą jako podstawowe ramy do ustanowienia mikroprzepływowego systemu Gut-on-a-Chip zaprojektowanego specjalnie dla psów. Kładąc podwaliny pod to innowacyjne podejście, dążymy do rozszerzenia zastosowania tych technik w badaniach biomedycznych i translacyjnych, zgodnie z zasadami inicjatywy "Jedno zdrowie". Wykorzystując to podejście, możemy opracować bardziej fizjologicznie istotne dynamiczne modele in vitro do badania fizjologii jelit zarówno u psów, jak i ludzi. Ma to znaczące implikacje dla zastosowań biomedycznych i farmaceutycznych, ponieważ może pomóc w opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia chorób jelit u obu gatunków.

Wprowadzenie

Morfogeneza nabłonka jelitowego została w dużej mierze zbadana za pomocą laboratoryjnych modeli zwierzęcych, które są kosztowne, czasochłonne i nie reprezentują dokładnie procesów rozwojowych człowieka1. Co więcej, konwencjonalne statyczne modele hodowli komórkowych 2D nie są w stanie naśladować złożonej organizacji przestrzennej architektury nabłonka 3D2. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania protokołu do indukowania morfogenezy 3D in vitro przy użyciu komórek nabłonka jelitowego z modeli zwierzęcych istotnych dla człowieka, aby pogłębić naszą wiedzę na temat architektury nabłonka jelitowego.

Psy do towarzystwa rozwinęły anatomię jelit i skład mikrobiomu, które są niezwykle podobne do ludzi, ze względu na ich wspólne środowisko i dietę podczas udomowienia3. Oprócz tego podobieństwa, zarówno ludzie, jak i psy mają różne przewlekłe choroby, które uważa się za przypisywane zdrowiu jelit. U psów, podobnie jak u ludzi, mogą spontanicznie rozwijać się choroby przewlekłe, takie jak otyłość, dysfunkcje poznawcze, cukrzyca, nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i gruczolakorak jelita grubego4,5,6,7,8,9,10. Pomimo rozwoju i wykorzystania ludzkich i mysich komórek nabłonkowych w poprzednich badaniach Gut-on-a-Chip2,11,12,13,14, nabłonek jelitowy psów nie był do tej pory wykorzystywany. Nasze nowatorskie podejście, wykorzystujące nabłonek organoidów jelitowych psów w dynamicznym systemie hodowli z morfogenezą nabłonka 3D, ma znaczące implikacje zarówno dla medycyny psów, jak i ludzi.

Ostatnie postępy w hodowli organoidów jelitowych doprowadziły do powstania hodowli organoidów jelitowych u psów15. Ten system hodowli polega na hodowli jelitowych komórek macierzystych w określonym kondycjonowaniu morfogenu, w wyniku czego powstaje model 3D o właściwościach samoodnawiających się pochodzących z dorosłych komórek macierzystych16. Jednak przeprowadzanie testów transportu lub kokultur gospodarz-mikrobiom stwarza trudności z tym modelem 3D ze względu na zamknięty charakter światła jelitowego17. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy stworzyli monowarstwę 2D pochodzącą z organoidów jelitowych, która pozwala na naświetlenie powierzchni światła18,19. Jednak zarówno organoidy 3D, jak i monowarstwy 2D są utrzymywane w warunkach statycznych, które nie odzwierciedlają dokładnie biomechaniki mikrośrodowiska jelitowego in vivo. Połączenie technologii organoidów psów pochodzących od pacjentów z morfogenezą 3D in vitro stwarza okazję do badań translacyjnych nad przewlekłymi chorobami wieloczynnikowymi. Podejście to umożliwia naukowcom opracowanie skuteczniejszych metod leczenia przynoszących korzyści zarówno ludziom, jak i psom oraz dalszy postęp badań translacyjnych, zgodnie z inicjatywą One Health, która jest podejściem opartym na współpracy, które uznaje wzajemne powiązania między zdrowiem ludzi, zwierząt i środowiska. Promuje interdyscyplinarną współpracę w celu sprostania złożonym wyzwaniom zdrowotnym i osiągnięcia optymalnych wyników zdrowotnych dla wszystkich. Poprzez zrozumienie współzależności między ludźmi, zwierzętami i ekosystemami, inicjatywa ma na celu ograniczenie ryzyka związanego z pojawiającymi się chorobami zakaźnymi, degradacją środowiska i innymi wspólnymi problemami zdrowotnymi20,21,22.

Ten protokół przedstawia kompleksowe metody hodowli komórek nabłonka jelitowego psów uzyskanych z organoidów pacjentów na mikrourządzeniu Gut-on-a-Chip z porowatą membraną na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS). Ustalenie morfogenezy nabłonka 3D poprzez integrację organoidów jelitowych psów i tej technologii Gut-on-a-Chip umożliwia nam badanie, w jaki sposób jelito rozwija się i utrzymuje swoją organizację komórkową i niszę komórek macierzystych. Platforma ta oferuje cenną okazję do zbadania wpływu społeczności mikrobiomu na zdrowie jelit i zrozumienia, w jaki sposób te społeczności generują metabolity drobnoustrojów, które przyczyniają się do patofizjologii jelit14,23. Postępy te można teraz rozszerzyć na próbki jelit psów, dając naukowcom możliwość zbadania skomplikowanego związku między mikrobiomem jelitowym a fizjologią gospodarza. Otwiera to możliwości uzyskania cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw patofizjologii jelit i zrozumienia potencjalnej roli metabolitów drobnoustrojów zarówno w zdrowiu psów, jak i ludzi, a także w różnych stanach chorobowych. Protokół zastosowany w psim Gut-on-a-Chip jest powtarzalny, co czyni go odpowiednim modelem eksperymentalnym dla medycyny porównawczej, ponieważ takie podejście umożliwia badanie interakcji gospodarz-mikrobiom, infekcji patogenami i efektów terapeutycznych opartych na probiotykach zarówno u psów, jak i ludzi.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Waszyngtonu (ASAF# 6993). W niniejszym protokole wykorzystano uznane urządzenie mikrofluidyczne Gut-on-a-Chip wykonane z PDMS, które zostało wytworzone we własnym zakresie2 (Rycyna 1D). Szczegółowe metody wykonania mikrourządzenia Gut-on-a-Chip można znaleźć w poprzednich raportach2,24. Niniejszy protokół przedstawia unikalną integrację organoidów jelitowych z systemem mikrofluidycznym (Rycina 2).

1. Aktywacja powierzchni modelu Gut-on-a-Chip wykonanego z PDMS

  1. Przygotować 1% roztwór polietylenoiminy (PEI), dodając 1 mL 50% roztworu PEI do 49 mL wody destylowanej (DI) w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy, aby dokładnie wymieszać roztwór, a następnie przefiltrować go za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm.
    UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 0,1% roztwór glutaraldehydu (GA), dodając 100 µL 50% roztworu GA do 49,9 mL wody DI w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Odwrócić probówkę dwa lub trzy razy, aby dokładnie wymieszać roztwór, a następnie przefiltrować go za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm.
    UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed bezpośrednim działaniem światła.
  3. Umieścić urządzenie Gut-on-a-Chip w suszarce ustawionej na 60 °C i inkubować przez minimum 30 min, aby usunąć pozostałą wilgoć.
  4. Poddać urządzenie Gut-on-a-Chip działaniu UV i ozonu przez 60 min przy użyciu generatora UV/ozonu.
    UWAGA: Aby zapewnić optymalną aktywację powierzchni PDMS podczas procesu, zachować odległość około 3 cm lub mniej między lampą UV a urządzeniem. Unikać nadmiernego zagęszczenia urządzeń w generatorze, aby zapewnić efektywną aktywację powierzchni.
  5. Zabezpieczyć przewody wlotowy, obejściowy (bypass) i wylotowy górnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą żabek biurowych. Zacisnąć również przewód wlotowy dolnego mikrokanału.
  6. Odłączyć przewód wylotowy dolnego mikrokanału. Upewnić się, że przewód obejściowy dolnego mikrokanału pozostaje otwarty.
  7. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 100 µL 1% roztworu PEI przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie tego procesu, gdy urządzenie jest jeszcze ciepłe po ekspozycji na UV/ozon. Obserwować przepływ roztworu PEI przez mikrokanał oraz wypływanie kropel roztworu PEI z przewodu obejściowego dolnego mikrokanału.
  8. Ponownie podłączyć przewód wylotowy dolnego mikrokanału.
  9. Zabezpieczyć przewody wlotowy, obejściowy i wylotowy dolnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą żabek biurowych. Zacisnąć również przewód wlotowy górnego mikrokanału.
  10. Odłączyć przewód wylotowy górnego mikrokanału. Upewnić się, że przewód obejściowy górnego mikrokanału pozostaje otwarty.
  11. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 100 µL 1% roztworu PEI przez otwór wylotowy górnego mikrokanału.
    UWAGA: Obserwować przepływ roztworu PEI przez mikrokanał oraz wypływanie kropel roztworu PEI z przewodu obejściowego górnego mikrokanału.
  12. Ponownie podłączyć przewód wylotowy górnego mikrokanału.
  13. Po wypełnieniu obu mikrokanałów (górnego i dolnego) 1% roztworem PEI, inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.
  14. Powtórzyć kroki 1.5-1.12 z użyciem 0,1% roztworu GA.
  15. Po wypełnieniu obu mikrokanałów (górnego i dolnego) 0,1% roztworem GA, inkubować urządzenie w temperaturze RT przez 20 min.
  16. Powtórzyć kroki 1.5-1.12 z użyciem wody DI, aby usunąć nadmiar roztworu aktywującego powierzchnię.
  17. Umieścić chip w suszarce w temperaturze 60 °C i pozostawić do wyschnięcia przez noc.
    ​UWAGA: Należy upewnić się, że żabki zostały usunięte ze wszystkich przewodów, aby uniknąć ich zgniecenia. Proces suszenia jest krytyczny dla równomiernej aktywacji powierzchni mikrokanału w urządzeniu Gut-on-a-Chip12.

2. Powlekanie macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i przygotowanie pożywki hodowlanej dla układu Gut-on-a-Chip

  1. Przygotować mieszaninę ECM w podstawowym pożywce do organoidów tak, aby końcowe stężenia kolagenu I oraz Matrigelu wynosiły odpowiednio 60 µg/mL i 2% (vol/vol).
    UWAGA: Przygotować 50 µL mieszaniny ECM na jeden chip jelitowy (tj. 20 µL mieszaniny ECM dla każdego z górnego i dolnego mikrokanału oraz 10 µL zapasu). Przygotować roztwór w dniu użycia i przechowywać go w temperaturze 4 °C lub w lodzie do momentu zastosowania.
  2. Wyjąć z suszarki chip Gut-on-a-Chip, który został poddany działaniu UV/ozonu, PEI oraz GA.
    UWAGA: Sprawdzić pod mikroskopem fazowo-kontrastowym, czy nie pozostała w nim wilgoć.
  3. Pozostawić chip Gut-on-a-Chip do ochłodzenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 10 min.
  4. Zabezpieczyć wlot, bypass i wylot rurek górnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą klipsów biurowych. Zacisnąć również rurkę wlotową dolnego mikrokanału.
  5. Odłączyć rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
  6. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 20 µL mieszaniny ECM przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału.
    UWAGA: Obserwować przepływ mieszaniny ECM przez mikrokanał, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. W przypadku obecności pęcherzyków wprowadzić dodatkową ilość mieszaniny ECM do dolnego mikrokanału, aż znikną.
  7. Ponownie podłączyć rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
  8. Zabezpieczyć wlot, bypass i wylot rurek dolnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą klipsów biurowych. Zacisnąć również rurkę wlotową górnego mikrokanału.
  9. Odłączyć rurkę wylotową górnego mikrokanału.
  10. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 20 µL mieszaniny ECM przez otwór wylotowy górnego mikrokanału.
  11. Ponownie podłączyć rurkę wylotową górnego mikrokanału.
  12. Umieścić chip w nawilżanym inkubatorze CO2 z 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 1 h, aby uformować warstwę ECM na membranie PDMS potraktowanej PEI i GA (Rysunek 3A).
    UWAGA: Upewnić się, że wszystkie rurki są zacisnięte podczas inkubacji.
  13. Podczas inkubacji powłoki ECM przygotować dwie strzykawki 1 mL zawierające zimną pożywkę do wysiewu, którą jest pożywka do hodowli organoidów pozbawiona A8301, ale zawierająca 10 µM Y-27632 i 2,5 µM CHIR99021, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi Gut-on-a-Chip pochodzących z ludzkich organoidów2.
    UWAGA: A8301 usunięto z pożywki, aby zwiększyć przyleganie komórek do powlekanej ECM, jak zgłoszono wcześniej2. Dzień 0 hodowli Gut-on-a-Chip wymaga przepływu tylko w górnym mikrokanale. W związku z tym przygotować pełną strzykawkę dla kanału górnego, a dla kanału dolnego minimum 0,2 mL.
  14. Po zakończeniu nakładania powłoki ECM wyjąć chip z inkubatora i zwolnić zacisk rurki bypassu podłączonej do dolnego mikrokanału.
  15. Podłączyć strzykawkę 1 mL wypełnioną pożywką do wysiewu do igły tępokoniecznej połączonej z dolnym mikrokanałem chipa Gut-on-a-Chip. Ostrożnie wprowadzić pożywkę do wysiewu (~50 µL) do rurki bypassu. Gdy rurka zostanie wypełniona wprowadzoną pożywką, zabezpieczyć rurkę bypassu podłączoną do dolnego mikrokanału klipsem biurowym.
  16. Zwolnić zacisk rurki wylotowej podłączonej do dolnego mikrokanału. Ostrożnie wprowadzić pożywkę do wysiewu do dolnego mikrokanału, zapewniając jej gładki przepływ przez system. Po perfuzji zabezpieczyć rurkę wylotową podłączoną do dolnego mikrokanału klipsem biurowym.
  17. Następnie otworzyć rurkę bypassu podłączoną do górnego mikrokanału.
  18. Podłączyć strzykawkę 1 mL wypełnioną pożywką do wysiewu do igły tępokoniecznej połączonej z górnym mikrokanałem chipa Gut-on-a-Chip. Ostrożnie wprowadzić pożywkę do wysiewu (~50 µL) do rurki bypassu. Gdy rurka zostanie wypełniona wprowadzoną pożywką, zabezpieczyć rurkę bypassu podłączoną do górnego mikrokanału klipsem biurowym.
  19. Zwolnić rurkę wylotową podłączoną do dolnego mikrokanału. Ostrożnie wprowadzić pożywkę do wysiewu do górnego mikrokanału, zapewniając jej gładki przepływ przez system. Po perfuzji zabezpieczyć rurkę wylotową podłączoną do górnego mikrokanału klipsem biurowym.

3. Przygotowanie komórek organoidów jelitowych psa do wysiewu

UWAGA: Do stworzenia modelu Gut-on-a-Chip w niniejszym protokole wykorzystano psie organoidy okrężnicy (zwane kolonoidami), pochodzące od psów cierpiących na IBD. Kolonoidy te uzyskano z trzech do pięciu małych fragmentów pobranej biopsją tkanki okrężnicy, zgodnie z wcześniej opisaną metodą15,18. Dla uzyskania optymalnych wyników kluczowe jest zastosowanie psich kolonoidów, które przeszły minimum trzy pasaża hodowlane, aby utworzyć stabilne organoidy odpowiednie do zastosowań in vitro. Zaleca się hodowlę psich kolonoidów przez co najmniej 3-4 dni, aby umożliwić odpowiednie różnicowanie komórek wieloliniowych w obrębie organoidów, zapewniając ich dojrzałość funkcjonalną i przydatność do dalszych eksperymentów w modelu Gut-on-a-Chip. Maksymalna liczba pasaży dla niniejszej pracy wynosi poniżej 20, co wynika z wcześniejszego badania wykazującego niezmieniony fenotyp i kariotyp przez 20 kolejnych pasaży25. Dane opisowe tych dawców przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S1.

  1. Hodować kolonoidy psie w płytkach 24-dołkowych, zatopione w 30 µL Matrigelu15,18, w pożywce do hodowli organoidów wymienionej w Tabeli materiałów, która stanowi modyfikację wcześniej opisanej pożywki15,26,27. Pożywka warunkowana została otrzymana poprzez hodowlę komórek Rspo1 oraz komórek HEK293 zmodyfikowanych tak, aby wydzielały Noggin28.
  2. Usunąć pożywkę do hodowli organoidów za pomocą odsysania próżniowego i wprowadzić do każdego dołka 500 µL roztworu Cell Recovery Solution w temperaturze lodowej. Inkubować przez 30 minut w 4 °C.
    UWAGA: Zazwyczaj trzy dołki z 24-dołkowej płytki z dojrzałymi jelitowymi organoidami psimi zapewniają wystarczającą ilość dysocjowanych komórek do zasiewu w jednym urządzeniu Gut-on-a-Chip z gęstością 40-50 organoidów na jedno pole widzenia przy powiększeniu x10.
  3. Mechanicznie rozbić kopułki Matrigelu przez 5 s za pomocą mikropipety P1000. Następnie zebrać zawiesinę organoidów do stożkowatej probówki 15 mL.
  4. Wirować probkę stożkową przy 200 × g i 4 °C przez 5 min, a następnie usunąć nadsącz.
  5. Wprowadzić 1 mL proteazy typu trypsyny w temperaturze pokojowej, uzupełnionej o 10 µM Y-27632, i resuspendować pellet komórkowy poprzez pipetowanie mikropipetą P1000.
  6. Umieścić zawiesinę komórkową w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C i inkubować przez 10 min, okresowo wstrząsając mieszaniną.
  7. Wprowadzić 5 mL ciepłej podstawowej pożywki do organoidów i energicznie pipetować zawiesinę komórkową mikropipetą P1000, aż stanie się mętna i pozbawiona widocznych skupisk komórek.
  8. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm, aby usunąć resztki Matrigelu i duże agregaty komórkowe.
  9. Wirować probkę stożkową przy 200 × g i 4 °C przez 5 min, a następnie resuspendować pellet w pożywce do zasiewu. W przypadku zasiewu jednego urządzenia Gut-on-a-Chip dla psów, użyć 20 µL pożywki do zasiewu w celu resuspensji pelletu komórkowego (tzn. użyć 20 µL pożywki do zasiewu podczas zasiewania jednego urządzenia Gut-on-a-Chip).
  10. Zmodyfikować stężenie żywych komórek do poziomu 1 × 107 komórek/mL za pomocą pożywki do zasiewu, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami2. Przeprowadzić ocenę żywotności za pomocą hemocytometru, łącząc 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu Trypan, a następnie obserwować komórki pod mikroskopem.
    ​UWAGA: Kluczowe jest odpowiednie dostosowanie stężenia komórek, aby zapewnić optymalną adhezję komórek i utworzenie jednolitej warstwy monowarstwy na membranie chipa. Jeśli początkowa liczba komórek będzie niewystarczająca, może to doprowadzić do opóźnienia lub niepowodzenia w utworzeniu zlewnej monowarstwy. I odwrotnie, jeśli liczba komórek będzie zbyt duża, komórki nieprzylegające mogą agregować w skupiska wewnątrz kanału, co prowadzi do niepożądanych efektów stężeń.

4. Wysiewanie i tworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy komórek

  1. Odłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału. Upewnij się, że rurka obejściowa górnego mikrokanału pozostaje otwarta. Zabezpiecz zarówno wlot, jak i wylot dolnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą klipsów biurowych.
  2. Za pomocą mikropipety P100 lub P20 wprowadź 20 µL zawiesiny komórkowej z Protokołu 3 do otworu wylotowego górnego mikrokanału (Rysunek 3B Wysiewanie).
  3. Zabezpiecz rurkę obejściową i wlotową górnego mikrokanału, zaciskając je za pomocą klipsów biurowych. Następnie ponownie podłącz rurkę wylotową do otworu wylotowego górnego mikrokanału, dbając o to, aby rurka pozostawała otwarta przez cały proces, co zapobiegnie przyłożeniu ciśnienia do górnego mikrokanału. Po tym kroku powoli zabezpiecz rurkę wylotową górnego kanału, zaciskając ją klipsem biurowym.
  4. Zweryfikuj pod mikroskopem, czy komórki są równomiernie rozłożone w całym górnym mikrokanale.
    UWAGA: Ważne jest zaciskanie rurek w celu zatrzymania przepływu medium w kanale, aby zapewnić stabilne warunki statyczne do momentu uzyskania pożądanego przylegania komórek.
  5. Umieść chip w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Przyczepienie komórek organoidów jelita psa do powłoki ECM trwa około 3 h (Rysunek 3B Przyczepianie).
  6. Podłącz strzykawkę przymocowaną do górnego mikrokanału Gut-on-a-Chip do pompy strzykawkowej umieszczonej w inkubatorze CO2.
    UWAGA: Ostrożnie przepłucz mikrokanał medium, używając pokrętła pompy strzykawkowej, i usuń nieprzymocowane komórki. Sprawdź chip pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie nieprzymocowane komórki zostały skutecznie wypłukane.
  7. Uruchom przepływ medium hodowlanego z prędkością 30 µL/h, stosując medium do wysiewania. Ten ciągły przepływ dotyczy początkowo tylko górnego mikrokanału, aż do utworzenia dwuwymiarowej warstwy jednowarstwowej na Gut-on-a-Chip. W przypadku dolnego mikrokanału pozostaw mikrokanały zaciśnięte i nie przepłukuj medium.
  8. Od dnia następującego po wysiewaniu komórek zmień medium do wysiewania na medium do hodowli organoidów, które zawiera A8301 i nie zawiera 10 µM Y-27632 oraz 2.5 µM CHIR99021.
  9. Po utworzeniu warstwy jednowarstwowej uruchom ciągły przepływ medium również do dolnego mikrokanału. Utworzenie nabłonkowych warstw jednowarstwowych przez komórki nabłonka organoidów jelita psa trwa zazwyczaj od 2 do 3 dni (Rysunek 3C).

5. Ustanowienie morfogenezy 3D w psim modelu Gut-on-a-Chip

UWAGA: Po utworzeniu konfluentnych monowarstw w układzie Gut-on-a-Chip wprowadzono przepływ medium w kanale górnym i dolnym oraz naprężenia komórkowe, aby zainicjować morfogenezę 3D z monowarstwy 2D, jak przedstawiono na Rysunku 2.

  1. Wprowadź pożywkę do hodowli organoidów do górnego i dolnego mikrokanału, aby zainicjować rozwój morfogenezy 3D w systemie Gut-on-a-Chip. Aby uzyskać naprężenie ścinające wynoszące 0.02 dyne/cm2 w obecnym projekcie Gut-on-a-Chip (tj. mikrokanale o wysokości 500 µm), zwiększ szybkość przepływu do 50 µL/h29.
  2. Zastosuj 10% odkształcenia komórek i częstotliwość 0.15 Hz, zgodnie z wcześniejszymi zaleceniami2, wykorzystując bioreaktor sterowany komputerowo, który wywiera cykliczne odkształcenie na komórki hodowane in vitro. Proces ten polega na zastosowaniu ssania próżniowego w urządzeniu Gut-on-a-Chip.
  3. Utrzymuj te warunki hodowli przez minimum 2 do 3 dni. Morfogeneza 3D psiej monowarstwy jelitowej zazwyczaj następuje od 2 do 3 dni po rozpoczęciu przepływu w kanale Dural i ssania próżniowego (Rycina 3C).

6. Charakterystyka psiego modelu Gut-on-a-Chip

  1. Obrazowanie żywych komórek
    1. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z układu Gut-on-a-Chip, delikatnie przepływając medium za pomocą pompy strzykawkowej.
    2. Odłącz urządzenie Gut-on-a-Chip od pompy strzykawkowej.
      UWAGA: Unikaj wszelkich czynności, które mogą wywrzeć ciśnienie wewnątrz układu Gut-on-a-Chip.
    3. Umieść urządzenie na mikroskopie, aby zarejestrować obrazy utworzonego nabłonka 3D. Do wizualizacji struktury warstw nabłonka 3D w kontraście fazowym użyj obiektywów 10x i 20x (Rycina 3C).
  2. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Przygotuj roztwór blokujący, rozpuszczając 1 g BSA w 50 mL soli fizjologicznej z fosforanem (PBS), aby otrzymać 2% BSA. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 µm. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj roztwór permeabilizujący, łącząc 150 µL Triton X-100 z 50 mL roztworu blokującego, tak aby uzyskać końcowe stężenie 0,3% Triton X-100. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 µm. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C.
    3. Przeprowadź fiksację komórek, wstrzykując 100 µL 4% PFA do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    4. Przepłucz komórki, wstrzykując 100 µL PBS do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    5. Przeprowadź permeabilizację komórek, wstrzykując 100 µL 0,3% Triton do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11. Pozostaw urządzenie w temperaturze pokojowej (RT) na 30 min.
    6. Przepłucz komórki, wstrzykując 100 µL PBS do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    7. Przeprowadź blokowanie komórek w celu zapobiegania nieswoistemu wiązaniu, wstrzykując 100 µL 2% BSA do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11. Pozostaw urządzenie w RT na 1 h.
    8. Wstrzyknij 20 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA i pozostaw w RT na 3 h, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie dreny są zaklemowane podczas nocnej inkubacji w 4 °C. Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego powinno być 2-5 razy wyższe niż zalecane stężenie do barwienia monowarstwy lub organoidów 3D (Rycina uzupełniająca S1).
    9. Przepłucz komórki, wstrzykując 100 µL PBS do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    10. Wstrzyknij 20 µL roztworu przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w 2% BSA i pozostaw w RT na 1 h.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie dreny są zaklemowane podczas inkubacji. Od tego kroku konieczne jest osłonięcie zestawu urządzenia folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu.
    11. Przepłucz komórki, wstrzykując 100 µL PBS do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    12. Przygotuj mieszany roztwór do przeciwbarwienia F-aktyny i DAPI (diamidino-2-fenyloindolu). Wstrzyknij 20 µL mieszanego roztworu do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
    13. Przepłucz komórki, wstrzykując 100 µL PBS do górnego i dolnego mikrokanału, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.11.
      Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne architektury komórek nabłonkowych 3D przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.

7. Funkcja bariery nabłonkowej

  1. Usuń pęcherzyki powietrza z układu Gut-on-a-Chip, delikatnie przepływając medium za pomocą pompy strzykawkowej. Upewnij się, że wszystkie przewody są otwarte podczas pomiaru.
  2. Zdejmij Gut-on-a-Chip z pompy strzykawkowej i pozostaw go w RT przez co najmniej 10 min.
  3. Wyjmij elektrody Ag/AgCl z 70% roztworu EtOH.
  4. Wprowadź dwie elektrody Ag/AgCl odpowiednio do górnego wlotu i dolnego wylotu, aby zmierzyć oporność warstwy nabłonkowej za pomocą multimetru.
  5. Wprowadź dwie elektrody Ag/AgCl odpowiednio do dolnego wlotu i górnego wylotu. Średnią z tych dwóch wartości podaj jako wartość oporności dla Gut-on-a-Chip.
    UWAGA: Pomiar tła TEER należy przeprowadzić na Gut-on-a-Chip z samą powłoką ECM, bez nabłonka.
  6. Wartość transepithelial electrical resistance (TEER) (kΩ × cm2) można obliczyć za pomocą równania (1).
    TEER = (Ωt - Ωblank) × A     (1)
    ​Gdzie Ωt to wartość oporności zmierzona w konkretnym punkcie czasowym od rozpoczęcia eksperymentu, Ωblank to wartość oporności zmierzona bez nabłonka, a A to powierzchnia pokryta warstwą komórek (około 0,11 cm2 dla tej konstrukcji Gut-on-a-Chip29).
    1. Oblicz znormalizowany TEER za pomocą równania (2).
      TEER = figure-protocol-1      (2)
      Gdzie Ω0 to wartość oporności w początkowym punkcie pomiarowym eksperymentu, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami30 (Rysunek 4C).

Wyniki

Niniejszy protokół pozwala na niezawodne ułatwienie spontanicznego rozwoju 3D morfogenezy jelitowej w systemie Gut-on-a-Chip. Podejście to wykorzystuje psie komórki nabłonka jelitowego uzyskane z organoidów jelitowych pochodzących od psów cierpiących na nieswoiste zapalenia jelit (IBD) (Rysunek 1B). Po 6-9 dniach przepływu medium w całym mikrokanale można zaobserwować sporadyczne grupowanie się 3D morfogenezy psich komórek nabłonka jelitowego (Rysunek 3C). Zmiany morfologiczne te można monitorować przy użyciu technik kontrastu fazowego. W niniejszym badaniu wykorzystano organoidy pochodzące od dwóch psów zdiagnozowanych z IBD. Co istotne, pomyślną 3D morfogenezę zaobserwowano w dwóch powtórzeniach biologicznych, z których każde wykonano w dwóch powtórzeniach technicznych. Wyniki tego badania stanowią podstawę do przyszłych analiz z wykorzystaniem organoidów jelitowych pochodzących od innych psich dawców. Wyniki te demonstrują potencjalną przydatność i powtarzalność naszego podejścia eksperymentalnego, które było wcześniej raportowane dla próbek ludzkich. Odkrycia te stanowią dalsze potwierdzenie, że technologia Gut-on-a-Chip ma zastosowanie w przypadku psich komórek nabłonka jelitowego, co było wcześniej raportowane w badaniach z wykorzystaniem ludzkich komórek nabłonka jelitowego2.

Niniejszy protokół wykazał, że barwienie immunofluorescencyjne może być wykorzystane do oceny struktury 3D monowarstw pochodzących z organoidów, które utworzyły struktury przypominające kosmki w chipach mikrofluidycznych, przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 4 A,B). Protokół ten można dostosować w celu walidacji zróżnicowanych i zorganizowanych przestrzennie fenotypów komórkowych poprzez barwienie immunofluorescencyjne. Wizualizacja morfogenezy 3D w układzie Gut-on-a-Chip stwarza doskonałą okazję do badania odpowiedzi gospodarza podczas różnych interakcji patologicznych14,23,31. W połączeniu z komórkami nabłonkowymi pochodzącymi od pacjentów-dawców, jak wcześniej opisano w przypadku ludzi, technologia ta może być wykorzystana do konstruowania spersonalizowanych modeli chorób jelit13. Dzięki integracji obrazowania immunofluorescencyjnego z ukierunkowanymi technikami wizualizacji RNA, takimi jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, możliwe jest przeprowadzenie analizy wizualnej transkryptomów i proteomów gospodarza w systemie Gut-on-a-Chip.

Zachowanie integralności błony jelitowej jest niezbędne dla utrzymania homeostazy jelit, a platforma Gut-on-a-Chip zapewnia istotną przewagę, umożliwiając precyzyjne monitorowanie i kwantyfikację tej kluczowej funkcji. Pomiar TEER z wykorzystaniem technologii Gut-on-a-Chip oferuje szereg korzyści. Przykładowo, w poprzednich badaniach z sukcesem oceniano TEER podczas kokultywacji komórek jelitowych z bakteriami niepatogennymi i probiotycznymi32, a także w warunkach zespołu nieszczelnego jelita23. Pozwala to badaczom analizować wpływ różnych czynników na funkcję bariery jelitowej oraz identyfikować potencjalne interwencje wspierające zdrowie jelit.

figure-results-1
Rysunek 1: Utworzenie modelu Gut-on-a-Chip dla psiej choroby zapalnej jelit (IBD) pochodzącej od pacjenta. (A) Integracja pochodzących od pacjenta organoidów jelitowych z platformą Gut-on-a-Chip. Można przeprowadzić biopsję endoskopową w celu wyizolowania komórek krypt jelitowych do opracowania specyficznych dla dawcy organoidów jelitowych. Komórki nabłonkowe mogą zostać rozdzielone na pojedyncze komórki z organoidów, a następnie wysiane do Gut-on-a-Chip opartego na PDMS i hodowane w unikalnym dynamicznym mikrośrodowisku. (B) Reprezentatywne obrazy kolonoidów od psa z IBD. Pasek skali = 100 µm. (C) Ten schemat ilustruje urządzenie Gut-on-a-Chip składające się z porowatej membrany umieszczonej pomiędzy górnym a dolnym mikrokanałem. Górny mikrokanał jest zaznaczony niebieskim obszarem, natomiast dolny mikrokanał jest zaznaczony czerwonym obszarem. Po każdej stronie mikrokanału znajdują się komory próżniowe, które odkształcają porowatą membranę, aby naśladować ruchy perystaltyczne24. (D) Układ psiego Gut-on-a-Chip obejmuje urządzenie Gut-on-a-Chip oparte na PDMS, zmontowane z rurkami i umieszczone na szkiełku nakrywkowym2,24. Rurka obejściowa jest kluczowa, aby uniknąć wzrostu ciśnienia w mikrokanale podczas obsługi (np. podczas podłączania strzykawek). Do zaciskania rurek używa się klipsów biurowych. Materiały wrażliwe na objętość mogą być wprowadzane przez otwarte otwory górnego lub dolnego wylotu. Pożywkę do hodowli organoidów można wprowadzać, podłączając strzykawki do tępych igieł, a przepływ odbywa się przez górny i dolny wlot. Skróty: IBD = inflammatory bowel disease (choroba zapalna jelit); PDMS = polydimethylsiloxane (polidimetylosiloksan). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Tworzenie struktur przypominających kosmki w psim modelu Gut-on-a-Chip dla IBD. Rozdzielone komórki nabłonkowe zasiano w urządzeniu Gut-on-a-Chip powleczonym ECM. Po przytwierdzeniu się rozdzielonych komórek do membrany PDMS, zainicjowano przepływ apikalny na okres 3 dni (D0-D3). Po utworzeniu się konfluentnej monowarstwy 2D (D3), zainicjowano przepływ basolateralny z częstym rozciąganiem (Stretching, AP, and BL Flow). Po 2-3 dniach podwójnego przepływu i rozciągania membrany, monowarstwa 2D zaczyna wykazywać morfogenezę 3D, a struktury przypominające kosmki tworzą się po 9 dniach hodowli (3D morphogenesis, D9-D12). Skróty: ECM = macierz pozakomórkowa; PDMS = polidimetylosiloksan; AP = apikalny; BL = basolateralny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wysiew psich organoidów jelitowych i morfogeneza 3D w układzie Gut-on-a-Chip. (A) Etapy eksperymentalne aktywacji powierzchni membrany porowatej w układzie Gut-on-a-Chip opartym na PDMS. Zastosowanie obróbki UV/Ozon, PEI oraz GA w połączeniu z nimi ułatwia sieciowanie amin obecnych w roztworach ECM. Proces ten prowadzi do stabilnej immobilizacji białek ECM na membranie porowatej. (B) Obrazy w kontraście fazowym przedstawiają morfologię komórek bezpośrednio po wysiewie (lewo) oraz 3-5 h po wysiewie (prawo). Membrana porowata po 3 h od wysiewu wykazuje cieńsze i ciemniejsze obszary, w których przytwierdziły się pojedyncze komórki, co obrazuje proces adhezji. (C) Obrazy w kontraście fazowym przedstawiają morfogenezę 3D monowarstw jelitowych w systemie Gut-on-a-Chip. Monowarstwy te pochodziły od psów chorych na IBD, a komórki organoidowe były hodowane przez okres 12 dni w warunkach dynamicznych, obejmujących przepływ cieczy i ruchy rozciągające. Paski skali = 50 µm (B,C). Skróty: IBD = nieswoiste zapalne choroby jelit; ECM = macierz zewnątrzkomórkowa; PDMS = polidimetylosiloksan; PEI = polietylenoimina; GA = glutaraldehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena rozwoju morfologicznego 3D w psim modelu Gut-on-a-Chip pochodzącym od pacjenta. (A) Obrazowanie immunofluorescencyjne psiego modelu Gut-on-a-Chip z IBD, przedstawiające widok z góry w pełni rozwiniętego nabłonka 3D po 12 dniach hodowli, ocenione za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Białko połączeń ścisłych (ZO-1) jest widoczne na żółto; błona rąbka szczoteczkowego (F-actin) pojawia się na czerwono; a jądra komórkowe są barwione DAPI i pojawiają się na niebiesko. (B) Obrazowanie immunofluorescencyjne psiego modelu Gut-on-a-Chip z IBD przy użyciu mikroskopu konfokalnego z obiektywem do długich odległości. Zgodnie ze schematem, przedstawiono obraz fluorescencyjny przekroju struktury przypominającej kosmek w pełni rozwiniętego nabłonka 3D po 12 dniach hodowli. Ponadto, obrazowanie Z-stack pokazuje widok boczny nabłonka 3D, co ujawnia formowanie się struktur przypominających kosmki. Błona rąbka szczoteczkowego (F-actin) pojawia się na czerwono, a jądra komórkowe są barwione DAPI i pojawiają się na niebiesko. (C) Funkcję bariery jelitowej oceniono i zmierzono za pomocą TEER w psich modelach Gut-on-a-Chip pochodzących od pacjenta. Stabilne wartości TEER osiągnięto w 5 dniu hodowli w modelu Gut-on-a-Chip. Słupki błędów przedstawiają SEM pomiarów. Wartość TEER była mierzona w dwóch powtórzeniach biologicznych z jednym powtórzeniem technicznym. Paski skali = 50 µm (A), 25 µm (B). Skróty: IBD = nieswoiste zapalne choroby jelit; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; TEER = transepitelialna oporność elektryczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Charakterystyka poliklonalnego przeciwciała anty-ZO-1 w monowarstwach pochodzących z psich kolonoidów oraz na urządzeniach Gut-on-a-Chip. (A) Barwienie immunofluorescencyjne ZO-1 na żółto oraz F-aktyny na czerwono wraz z obrazem nałożonym. Pasek skali = 25 µm. (B) Wizualizacja immunofluorescencyjna ZO-1 na żółto w układach „Leaky Gut Chips” została przeprowadzona w różnych warunkach, w tym przy stymulacji bakteriami probiotycznymi (LGG + cytokiny lub VSL#3 + cytokiny) oraz w kontrolach wolnych od drobnoustrojów bez stymulacji probiotykami (cytokiny). Pasek skali = 50 µm. Rysunek został powielony z pracy Min et al.23. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Podsumowanie informacji o dawcach tkanek. Tabela podsumowująca wiek, płeć, rasę, ocenę histopatologiczną oraz wynik wskaźnika aktywności IBD u psów (CIBDAI) dawców. CIBDAI jest numerycznym systemem punktacji stosowanym do oceny stopnia nasilenia klinicznego IBD u psów33. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Badanie to stanowi pionierską demonstrację zgodności organoidów jelitowych psów z opracowaniem modelu IBD Gut-on-a-Chip u psów. Integracja organoidów jelitowych i kultur jednowarstwowych pochodzących z organoidów w system mikroprzepływowy (tj. system Gut-on-a-Chip) przyczyniła się do dalszego rozwoju technologii, umożliwiając stworzenie modeli jelitowych in vitro , które ściśle naśladują dynamikę fizjologiczną i są bardziej reprezentatywne dla warunków biologicznych. W szczególności, ponieważ istnieje bardzo niewiele doniesień o hodowli Gut-on-a-Chip przy użyciu organoidów pochodzących z IBD u ludzi, obecne badanie z użyciem Gut-on-a-Chip pochodzącego z IBD u psów może dostarczyć wiodących informacji na temat badania IBD u ludzi.

Pomyślny rozwój morfogenezy 3D nabłonka jelitowego psów na Gut-on-a-Chip wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na kilka krytycznych etapów. Po pierwsze, hydrofobowa powierzchnia kanałów mikroprzepływowych PDMS może utrudniać adhezję ECM i późniejsze przyłączanie komórek, co wymaga aktywacji powierzchniowej PDMS przed powlekaniem ECM i wysiewaniem komórek (patrz sekcja 1 protokołu). Aby uzyskać stabilną hodowlę jednowarstwową, usunięcie nadmiaru nieprzyłączonych komórek ma kluczowe znaczenie po przyłączeniu komórek (kroki protokołu 4.6-4.7). Dodatkowo, dynamiczna stymulacja, taka jak stały przepływ medium i perystaltyczny ruch próżni, jest niezbędna do morfogenezy 3D nabłonka jelitowego (krok protokołu 5.2). Ostrożne obchodzenie się z nim jest niezbędne, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w mikrokanaliku podczas jakichkolwiek etapów hodowli Gut-on-a-Chip.

Jeśli napotkasz słabe wysiewanie komórek do Gut-on-a-Chip, może to być spowodowane niską liczbą komórek lub słabym przyczepieniem komórek. Aby rozwiązać problem z niską liczbą komórek, ważne jest, aby sprawdzić stan przygotowanych organoidów jelitowych, obserwując ich wzrost w Matrigel. Żywotność komórek można ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanowym po dysocjacji komórek, aby upewnić się, że nie więcej niż 20% komórek jest martwych. Jeśli liczba żywotnych komórek jest niewystarczająca, można spróbować zoptymalizować warunki pożywki organoidowej. Inną możliwością jest niepełna dysocjacja organoidów, w wyniku której powstaje nadmiar grudek komórek większych niż 70 μm, które zostają uwięzione przez filtr. Aby rozwiązać ten problem, jedną z opcji jest wydłużenie czasu pipetowania podczas dysocjacji komórek. Alternatywnie, stożkowa rurka o pojemności 15 ml może być delikatnie mieszana co minutę podczas leczenia proteazą podobną do trypsyny. Słabe przyleganie komórek do Gut-on-a-Chip może być spowodowane niewłaściwą powłoką ECM. Podczas procesu powlekania zaleca się dokładne sprawdzenie obecności pęcherzyków powietrza i zapobieganie ich tworzeniu się poprzez delikatne dodawanie większej ilości roztworu powlekającego w razie potrzeby. Przeludnienie komórek i brak możliwości wypłukania nieprzyłączonych komórek może skutkować niewystarczającą początkową warstwą monowarstwową. W takim przypadku można zastosować łagodne pulsowanie podczas naciskania tłoka strzykawki. Te kroki rozwiązywania problemów mogą pomóc w identyfikowaniu i rozwiązywaniu problemów podczas procesu hodowli Gut-on-a-Chip.

Chociaż ta platforma Gut-on-a-Chip umożliwia tworzenie pofałdowanych warstw nabłonka 3D, zdajemy sobie sprawę z potrzeby dodatkowej złożoności biologicznej, aby w pełni odtworzyć mikrośrodowisko jelitowe. Kluczowe znaczenie ma rozważenie interakcji między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi, odkładania się ECM w celu regeneracji 3D oraz obecności cech kosmków kryptowych, które ustanawiają odpowiednią niszę komórek macierzystych. Komórki zrębu, takie jak fibroblasty, odgrywają istotną rolę w produkcji białek ECM i regulacji morfogenezy jelit 34,35,36. Włączenie komórek mezenchymalnych do tego modelu może potencjalnie poprawić zarówno morfogenezę, jak i efektywność przyłączania komórek. Warstwy śródbłonka, które obejmują naczynia włosowate i naczynia limfatyczne, odgrywają kluczową rolę w zarządzaniu transportem molekularnym i rekrutacją komórek odpornościowych37,38. Włączenie komórek odpornościowych pochodzących od pacjenta może mieć zasadnicze znaczenie w modelowaniu chorób jelit, ponieważ pozwala na wykazanie wzajemnych oddziaływań między odpornością wrodzoną i nabytą, a także ustanowienie odporności swoistej tkankowo39. Po zakończeniu morfogenezy 3D na Gut-on-a-Chip, pożywka do hodowli organoidów może zostać zmodyfikowana do pożywki różnicującej organoidy. Może to być realne podejście do indukowania dodatkowego różnicowania komórkowego, w zależności od celów eksperymentalnych.

Obrazowanie mikroarchitektury 3D in situ jest wyzwaniem ze względu na wymaganą dużą odległość roboczą, którą można pokonać za pomocą obiektywu długodystansowego. Dodatkowo, metody mikrofabrykacji i klejenia warstwa po warstwie utrudniają dostęp do górnych warstw w celu zbadania za pomocą SEM. W przypadku obecnej konstrukcji Gut-on-a-Chip potrzebna jest jedna pompa strzykawkowa na mikrourządzenie Gut-on-a-Chip, co zajmuje miejsce w inkubatorze CO2 i uniemożliwia eksperymenty na dużą skalę. Potrzebne są innowacje, aby zwiększyć skalowalność przyjaznej dla użytkownika platformy i badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Te obecne protokoły pozwalają na spontaniczny rozwój warstw nabłonka 3D in vitro, przewyższając ograniczenia tradycyjnych organoidów 3D, monowarstw 2D i statycznych systemów hodowli mikrourządzeń. To dynamiczne mikrośrodowisko jelitowe in vitro można kontrolować, wprowadzając kohodowlę różnych typów komórek. Wcześniejsze badania dotyczyły metod manipulowania mikrośrodowiskiem Gut-on-a-Chip, w tym kokulturacji mikrobiomu jelitowego14,23 i obwodowych komórek jednojądrzastych30. To zrekonstruowane mikrośrodowisko ma wiele potencjalnych zastosowań, w tym testowanie leków, podstawowe badania mechanistyczne i modelowanie chorób. Zrekonstruowane mikrośrodowisko ma znaczny potencjał dla szerokiego zakresu zastosowań, takich jak testowanie leków 23,40,41 i modelowanie chorób 12,13,14,30, a także podstawowe badania mechanistyczne morfogenezy jelit 42. Różnorodne testy można przeprowadzić, zbierając supernatanty do oceny metabolitów43, zbierając komórki do badania genomowego 2,32 lub wizualnie badając komórki za pomocą barwników z żywych komórek lub utrwalenia do późniejszego obrazowania immunofluorescencyjnego 23,44.

W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół opracowywania morfogenezy 3D warstw nabłonka jelitowego psów w platformie Gut-on-a-Chip. Uzyskana w ten sposób struktura nabłonka 3D zapewnia bardziej realistyczne odwzorowanie mikrośrodowiska jelitowego, co ma ogromny potencjał do zastosowań w różnych badaniach biomedycznych. Wykorzystując tę architekturę jelitową, możemy przeprowadzić więcej badań translacyjnych i potencjalnie przynieść obiecujące wyniki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować WSU Small Animal Internal Medicine Service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) oraz Koordynatorowi Badań Klinicznych WSU VTH Valorie Wiss za ich wsparcie w rekrutacji przypadków i pobieraniu próbek od naukowców-amatorów (dawców pacjentów). Prace te były częściowo wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (K01OD030515 i R21OD031903 do Y.M.A.) oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki za Granicą Program Wyzwań dla Młodych Badaczy (202280196 do I.N.). Rysunki 1A i 3A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Organoid podłoże podstawowe
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
GlutaMAXGibco35050-0612 mM, substytut glutaminy
1 M HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML10 mM
100x penicylina– streptomycynaCorningMT30009CI1x
Organoidy i organoidy pożywka
A-83-01 PeproTech 9094360500 nM
suplement B27 Gibco17504-0441x
CHIR99021Reprocell04-0004-base2.5 µ Komórki M
HEK293 zaprojektowane do wydzielania Noggin Baylor College of Medicine Mysia
EGFPeproTech 315-09-1MG50 ng/ml
Murine Wnt-3aPeproTech 315-20-10UG100 ng/ml
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165-25G1 mM
N2 MAX Suplement prasowy Gibco17502-0481x 
NikotynamidSigmaN0636-100G10 mM
Kondycjonowany Noggin MediumNANA 10% vol/vol 
PrimocinInvivoGenant-pm-1100 &mikro; g/ml
Komórki R-spondyny1 (Rspo1)Trevigen3710-001-01Komórki Rspo1
R-Spondin-1 Kondycjonowane podłożeNANA20% obj./obj."
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG  10 &mikro; M
Y-27632StemCellTechnologies7230810 i mikro; M
[Leu15 ]-Gastrin I człowiek Sigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Odczynniki
4% roztwór paraformaldehyduFisher ScientificAAJ19943K2
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287x250 rozcieńczenie
Anti-Rabbit IgG H& L oznaczone Alexa Fluor 555Abcamab150078x1,000 rozcieńczenie
Przeciwciało poliklonalne anty-ZO-1Thermo Fisher Scientific61-7300x50 rozcieńczenie
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
Kolagen I, Ogon Szczura 3 mg / mlGibcoA10483-01
Diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific62248rozcieńczenie x1 000
EMS Aldehyd glutarowy Wodny 50%mikroskopia elektronowa Sciences16320
Matrigel MatrixCorning356255
roztwór poli(etyleniminy)Sigma408700-250ML
TrypLE ExpressGibco12604-021
Materiały i sprzęt
24-well Płytki hodowlaneMultimetr przemysłowy Corning3524
87 VWirówka Fluke Corporation
Inkubator CO2Eppendorf
DMi8 Suszarka suchaLeica microsystemsDMi8
FlexCell FX-5000 System napinaniaFlexcell International Corporation
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowymLeica microsystemsDMi1
SP8-X odwrócony mikroskop konfokalnyLeica microsystemsSP8-X
Pompa strzykawkowaBraintree Modelnaukowy nr. BS-8000 Strzykawka 120 V
, sterylna 3 mlBD Biosciences14-823-435
Strzykawki, 1 ml sterylnaBD Biosciences14-823-434
Generator UV/ozonuJelight Companymodel nr 30
Software
LAS X oprogramowanie do obrazowania Mikrosystemy
5910R Mikroskop fluorescencyjny Eppendorf C170i Fisher Scientific 15-103-0519 Leica

Bibliografia

  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2(2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368(2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663(2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1(2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300(2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641(2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525(2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13(2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

monowarstwa pochodząca z organoidówchip mikrofluidycznyfunkcja bariery jelitowejinterakcje gospodarz-mikrobiombarwienie immunofluorescencyjnemedycyna porównawcza
Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.