Method Article

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

DOI:

10.3791/65720

⸱

February 9th, 2024

 ,  , 
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelita psów mają podobieństwa w anatomii, mikrobiologii i fizjologii do ludzkich, a psy naturalnie rozwijają spontaniczne zaburzenia jelitowe podobne do ludzkich. Przezwyciężenie nieodłącznego ograniczenia trójwymiarowych (3D) organoidów w dostępie do wierzchołkowej powierzchni nabłonka jelitowego doprowadziło do powstania dwuwymiarowych (2D) kultur jednowarstwowych, które odsłaniają dostępną powierzchnię światła za pomocą komórek pochodzących z organoidów. Integracja tych organoidów i jednowarstwowych kultur pochodzących z organoidów w mikroprzepływowy system Gut-on-a-Chip przyczyniła się do dalszego rozwoju technologii, umożliwiając opracowanie bardziej fizjologicznie istotnych dynamicznych modeli jelitowych in vitro.

W tym badaniu prezentujemy protokół generowania morfogenezy 3D nabłonka jelitowego psów przy użyciu pierwotnych próbek tkanki jelitowej pobranych od psów dotkniętych nieswoistym zapaleniem jelit (IBD). Przedstawiamy również protokół generowania i utrzymywania kultur jednowarstwowych 2D i systemów intestine-on-a-chip z wykorzystaniem komórek pochodzących z organoidów jelitowych 3D. Protokoły przedstawione w tym badaniu służą jako podstawowe ramy do ustanowienia mikroprzepływowego systemu Gut-on-a-Chip zaprojektowanego specjalnie dla psów. Kładąc podwaliny pod to innowacyjne podejście, dążymy do rozszerzenia zastosowania tych technik w badaniach biomedycznych i translacyjnych, zgodnie z zasadami inicjatywy "Jedno zdrowie". Wykorzystując to podejście, możemy opracować bardziej fizjologicznie istotne dynamiczne modele in vitro do badania fizjologii jelit zarówno u psów, jak i ludzi. Ma to znaczące implikacje dla zastosowań biomedycznych i farmaceutycznych, ponieważ może pomóc w opracowaniu skuteczniejszych metod leczenia chorób jelit u obu gatunków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfogeneza nabłonka jelitowego została w dużej mierze zbadana za pomocą laboratoryjnych modeli zwierzęcych, które są kosztowne, czasochłonne i nie reprezentują dokładnie procesów rozwojowych człowieka1. Co więcej, konwencjonalne statyczne modele hodowli komórkowych 2D nie są w stanie naśladować złożonej organizacji przestrzennej architektury nabłonka 3D2. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania protokołu do indukowania morfogenezy 3D in vitro przy użyciu komórek nabłonka jelitowego z modeli zwierzęcych istotnych dla człowieka, aby pogłębić naszą wiedzę na temat architektury nabłonka jelitowego.

Psy do towarzystwa rozwinęły anatomię jelit i skład mikrobiomu, które są niezwykle podobne do ludzi, ze względu na ich wspólne środowisko i dietę podczas udomowienia3. Oprócz tego podobieństwa, zarówno ludzie, jak i psy mają różne przewlekłe choroby, które uważa się za przypisywane zdrowiu jelit. U psów, podobnie jak u ludzi, mogą spontanicznie rozwijać się choroby przewlekłe, takie jak otyłość, dysfunkcje poznawcze, cukrzyca, nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i gruczolakorak jelita grubego4,5,6,7,8,9,10. Pomimo rozwoju i wykorzystania ludzkich i mysich komórek nabłonkowych w poprzednich badaniach Gut-on-a-Chip2,11,12,13,14, nabłonek jelitowy psów nie był do tej pory wykorzystywany. Nasze nowatorskie podejście, wykorzystujące nabłonek organoidów jelitowych psów w dynamicznym systemie hodowli z morfogenezą nabłonka 3D, ma znaczące implikacje zarówno dla medycyny psów, jak i ludzi.

Ostatnie postępy w hodowli organoidów jelitowych doprowadziły do powstania hodowli organoidów jelitowych u psów15. Ten system hodowli polega na hodowli jelitowych komórek macierzystych w określonym kondycjonowaniu morfogenu, w wyniku czego powstaje model 3D o właściwościach samoodnawiających się pochodzących z dorosłych komórek macierzystych16. Jednak przeprowadzanie testów transportu lub kokultur gospodarz-mikrobiom stwarza trudności z tym modelem 3D ze względu na zamknięty charakter światła jelitowego17. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy stworzyli monowarstwę 2D pochodzącą z organoidów jelitowych, która pozwala na naświetlenie powierzchni światła18,19. Jednak zarówno organoidy 3D, jak i monowarstwy 2D są utrzymywane w warunkach statycznych, które nie odzwierciedlają dokładnie biomechaniki mikrośrodowiska jelitowego in vivo. Połączenie technologii organoidów psów pochodzących od pacjentów z morfogenezą 3D in vitro stwarza okazję do badań translacyjnych nad przewlekłymi chorobami wieloczynnikowymi. Podejście to umożliwia naukowcom opracowanie skuteczniejszych metod leczenia przynoszących korzyści zarówno ludziom, jak i psom oraz dalszy postęp badań translacyjnych, zgodnie z inicjatywą One Health, która jest podejściem opartym na współpracy, które uznaje wzajemne powiązania między zdrowiem ludzi, zwierząt i środowiska. Promuje interdyscyplinarną współpracę w celu sprostania złożonym wyzwaniom zdrowotnym i osiągnięcia optymalnych wyników zdrowotnych dla wszystkich. Poprzez zrozumienie współzależności między ludźmi, zwierzętami i ekosystemami, inicjatywa ma na celu ograniczenie ryzyka związanego z pojawiającymi się chorobami zakaźnymi, degradacją środowiska i innymi wspólnymi problemami zdrowotnymi20,21,22.

Ten protokół przedstawia kompleksowe metody hodowli komórek nabłonka jelitowego psów uzyskanych z organoidów pacjentów na mikrourządzeniu Gut-on-a-Chip z porowatą membraną na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS). Ustalenie morfogenezy nabłonka 3D poprzez integrację organoidów jelitowych psów i tej technologii Gut-on-a-Chip umożliwia nam badanie, w jaki sposób jelito rozwija się i utrzymuje swoją organizację komórkową i niszę komórek macierzystych. Platforma ta oferuje cenną okazję do zbadania wpływu społeczności mikrobiomu na zdrowie jelit i zrozumienia, w jaki sposób te społeczności generują metabolity drobnoustrojów, które przyczyniają się do patofizjologii jelit14,23. Postępy te można teraz rozszerzyć na próbki jelit psów, dając naukowcom możliwość zbadania skomplikowanego związku między mikrobiomem jelitowym a fizjologią gospodarza. Otwiera to możliwości uzyskania cennych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw patofizjologii jelit i zrozumienia potencjalnej roli metabolitów drobnoustrojów zarówno w zdrowiu psów, jak i ludzi, a także w różnych stanach chorobowych. Protokół zastosowany w psim Gut-on-a-Chip jest powtarzalny, co czyni go odpowiednim modelem eksperymentalnym dla medycyny porównawczej, ponieważ takie podejście umożliwia badanie interakcji gospodarz-mikrobiom, infekcji patogenami i efektów terapeutycznych opartych na probiotykach zarówno u psów, jak i ludzi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee of Washington State University (ASAF# 6993). W tym protokole wykorzystaliśmy dobrze znane urządzenie mikroprzepływowe Gut-on-a-Chip wykonane z PDMS, które zostało wyprodukowane wewnętrznie2 (Rysunek 1D). Szczegółowe metody wytwarzania mikrourządzenia Gut-on-a-Chip można znaleźć w poprzednich raportach2,24. Protokół ten demonstruje unikalną integrację organoidów jelitowych i układu mikroprzepływowego (Rysunek 2).

1. Aktywacja powierzchniowa Gut-on-a-Chip wykonanego z PDMS

  1. Przygotować 1% roztwór polietylenoiminy (PEI), dodając 1 ml 50% roztworu PEI do 49 ml wody destylowanej (DI) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby dobrze wymieszać roztwór, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
    UWAGA: Przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 0,1% roztwór aldehydu glutarowego (GA), dodając 100 μl 50% roztworu GA do 49,9 ml DI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby dobrze wymieszać roztwór, a następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
    UWAGA: Przechowuj go w temperaturze 4 °C i upewnij się, że jest chroniony przed bezpośrednim działaniem światła.
  3. Umieść urządzenie Gut-on-a-Chip w suchym piekarniku ustawionym na 60 °C i inkubuj je przez co najmniej 30 minut, aby usunąć pozostałą wilgoć.
  4. Wystaw urządzenie Gut-on-a-Chip na działanie promieniowania UV i ozonu przez 60 minut za pomocą generatora UV/Ozon.
    UWAGA: Aby zapewnić optymalną aktywację powierzchni PDMS podczas zabiegu, należy zachować odległość około 3 cm lub mniejszą między lampą UV a urządzeniem. Unikaj przepełnienia urządzeń w generatorze, aby uzyskać wydajną aktywację powierzchniową.
  5. Zabezpiecz rurki wlotowe, obejściowe i wylotowe górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatora, aby je zacisnąć. Zacisnąć również rurkę doprowadzającą do dolnego mikrokanału.
  6. Odłącz rurkę wylotową dolnego mikrokanału. Upewnij się, że rurka obejściowa dolnego mikrokanału pozostaje otwarta.
  7. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 100 μl 1% roztworu PEI przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie tego procesu, gdy urządzenie jest jeszcze ciepłe od ekspozycji na promieniowanie UV/Ozon. Obserwuj, jak roztwór PEI przepływa przez mikrokanał, a roztwór PEI wydostaje się z rurki obejściowej dla dolnego mikrokanału.
  8. Podłącz ponownie rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
  9. Zabezpiecz rurkę wlotową, obejściową i wylotową dolnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów, aby je zacisnąć. Zacisnąć również rurkę doprowadzającą do górnego mikrokanału.
  10. Odłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału. Upewnij się, że rurka obejściowa górnego mikrokanału pozostaje otwarta.
  11. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 100 μl 1% roztworu PEI przez otwór wylotowy górnego mikrokanału.
    UWAGA: Obserwuj, jak roztwór PEI przepływa przez mikrokanał, a roztwór PEI wydostaje się z rurki obejściowej górnego mikrokanału.
  12. Ponownie zamocuj rurkę wylotową górnego mikrokanału.
  13. Gdy zarówno górny, jak i dolny mikrokanalik zostaną wypełnione 1% roztworem PEI, pozwól urządzeniu inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
  14. Wykonaj kroki 1.5-1.12 z 0.1% roztworem GA.
  15. Gdy zarówno górny, jak i dolny mikrokanalik zostaną wypełnione 0,1% roztworem GA, pozwól urządzeniu inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  16. Wykonaj kroki 1.5-1.12 z wodą DI, aby usunąć nadmiar roztworu aktywującego powierzchnię.
  17. Umieść frytki w suchym piekarniku w temperaturze 60 °C i pozostaw do wyschnięcia na noc.
    UWAGA: Upewnij się, że zdjąłeś zaciski do segregatora ze wszystkich rurek, aby uniknąć uderzenia rurki. Ten proces suszenia ma kluczowe znaczenie dla równomiernej aktywacji powierzchni mikrokanału w Gut-on-a-Chip12.

2. Powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i przygotowanie podłoża hodowlanego do hodowli Gut-on-a-Chip

  1. Przygotować mieszaninę ECM z organoidowym podłożem podstawowym tak, aby końcowe stężenie Kolagenu I i Matrigelu wynosiło odpowiednio 60 μg/ml i 2 % (vol/vol).
    UWAGA: Przygotuj 50 μl mieszaniny ECM na chip jelitowy (tj. 20 μl mieszaniny ECM na każdy górny i dolny mikrokanał oraz 10 μl dodatkowo). Roztwór należy przygotować w dniu użycia i przechowywać w temperaturze 4 °C lub umieścić na lodzie do czasu, aż będzie gotowy do użycia.
  2. Wyjmij Gut-on-a-Chip, który został poddany działaniu promieniowania UV/Ozon, PEI i GA z suchego piekarnika.
    UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zobaczyć, czy nie ma wilgoci resztkowej.
  3. Pozwól Gut-on-a-Chip ostygnąć w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 10 minut.
  4. Zabezpiecz rurki wlotowe, obejściowe i wylotowe górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatora, aby je zacisnąć. Zacisnąć również rurkę doprowadzającą do dolnego mikrokanału.
  5. Odłącz rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
  6. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 20 μl mieszaniny ECM przez otwór wylotowy dolnego mikrokanału.
    UWAGA: Obserwuj, jak mieszanina ECM przepływa przez mikrokanał bez uwięzienia pęcherzyków powietrza. Jeśli obecny jest pęcherzyk powietrza, wprowadź dodatkową mieszaninę ECM do dolnego mikrokanału, aż pęcherzyk zniknie.
  7. Ponownie zamocuj rurkę wylotową dolnego mikrokanału.
  8. Zabezpiecz rurkę wlotową, obejściową i wylotową dolnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatorów, aby je zacisnąć. Zacisnąć również rurkę doprowadzającą do górnego mikrokanału.
  9. Odłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału.
  10. Za pomocą mikropipety P100 wprowadzić 20 μl mieszaniny ECM przez otwór wylotowy górnego mikrokanału.
  11. Ponownie zamocuj rurkę wylotową górnego mikrokanału.
  12. Umieść chip w nawilżonym inkubatorze CO2 z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby utworzyć warstwę ECM na membranie PDMS poddanej działaniu PEI i GA (Rysunek 3A).
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie rurki są zaciśnięte podczas inkubacji.
  13. Podczas inkubacji powłoki ECM należy przygotować dwie strzykawki o pojemności 1 ml zawierające zimną pożywkę wysiewającą, która jest pożywką do hodowli organoidów pozbawioną A8301, ale zawierającą 10 μM Y-27632 i 2,5 μM CHIR99021, jak wcześniej opisano w Gut-on-a-Chip pochodzącym z ludzkich organoidów2.
    UWAGA: A8301 został usunięty z podłoża w celu zwiększenia przyczepności komórek do powlekanego ECM, jak wcześniej zgłoszono2. Dzień 0 hodowli Gut-on-a-Chip wymaga tylko przepływu w górnych mikrokanałach. W związku z tym należy przygotować pełną strzykawkę do górnego kanału, a minimum 0,2 ml do dolnego kanału.
  14. Po zakończeniu powlekania ECM wyjmij chip z inkubatora i zwolnij zacisk do rurki obejściowej podłączonej do dolnego mikrokanału.
  15. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną pożywką wysiewającą do igły o końcu, która jest połączona z dolnym mikrokanałem Gut-on-a-Chip. Ostrożnie wprowadzić podłoże wysiewające (~50 μl) do rurki obejściowej. Po napełnieniu rurki wprowadzonym medium zabezpiecz rurkę obejściową podłączoną do dolnego mikrokanału za pomocą zacisku do segregatora.
  16. Zwolnij zacisk rurki wylotowej podłączonej do dolnego mikrokanału. Ostrożnie wprowadzić podłoże wysiewające do dolnego mikrokanału, pozwalając mu płynnie przepływać przez system. Po perfuzji zabezpiecz rurkę wylotową podłączoną do dolnego mikrokanału za pomocą spinacza do segregatora.
  17. Następnie otwórz rurkę obejściową podłączoną do górnego mikrokanału.
  18. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną podłożem wysiewającym do igły o końcu, która jest połączona z górnym mikrokanałem Gut-on-a-Chip. Ostrożnie wprowadzić podłoże wysiewające (~50 μl) do rurki obejściowej. Po napełnieniu rurki wprowadzonym medium zabezpiecz rurkę obejściową podłączoną do górnego mikrokanału za pomocą zacisku do segregatora.
  19. Zwolnij rurkę wylotową podłączoną do dolnego mikrokanału. Ostrożnie wprowadzić podłoże wysiewające do górnego mikrokanału, pozwalając mu płynnie przepływać przez system. Po perfuzji zabezpiecz rurkę wylotową podłączoną do górnego mikrokanału za pomocą spinacza do segregatora.

3. Przygotowanie komórek organoidowych jelit psich do siewu

UWAGA: Aby wygenerować model Gut-on-a-Chip, w tym protokole wykorzystano organoidy okrężnicy psów (określane jako kolonoidy) pochodzące od psów chorych na IBD. Te kolonoidy uzyskano z trzech do pięciu małych fragmentów tkanki okrężnicy poddanej biopsji, zgodnie z wcześniej opisaną metodą15,18. W celu uzyskania optymalnych wyników kluczowe jest stosowanie kolonoidów psów, które przeszły co najmniej trzy pasaże hodowlane w celu uzyskania stabilnych organoidów odpowiednich do zastosowań in vitro. Zaleca się hodowlę kolonoidów psów przez okres co najmniej 3-4 dni w celu ułatwienia odpowiedniego różnicowania komórek wieloliniowych w obrębie organoidów, zapewniając ich dojrzałość funkcjonalną i przydatność do kolejnych eksperymentów w modelu Gut-on-a-Chip. Maksymalny limit przejścia dla tej pracy jest mniejszy niż 20, jak wskazało poprzednie badanie, które wykazało niezmieniony fenotyp i kariotyp przez 20 kolejnych pasaży25. Sygnalizacja tych dawców jest przedstawiona w tabeli uzupełniającej S1.

  1. Hodowla kolonoidów psów na 24-dołkowych płytkach osadzonych w 30 μl Matrigel15,18 z podłożem do hodowli organoidów wymienionym w Tabeli Materiałów, które jest zmodyfikowane w stosunku do poprzednio zgłoszonego podłoża15,26,27. Kondycjonowaną pożywkę uzyskano przez hodowlę komórek Rspo1 i komórek HEK293 zmodyfikowanych do wydzielania Noggin28.
  2. Wyrzucić pożywkę do hodowli organoidów przez odsysanie próżniowe i wprowadzić 500 μl roztworu do odzyskiwania komórek w lodowatej temperaturze do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zazwyczaj trzy dołki z 24-dołkowej płytki dojrzałych organoidów jelitowych psów zapewniają wystarczającą ilość zdysocjowanych komórek, aby zasiać pojedyncze urządzenie Gut-on-a-Chip z 40-50 organoidami / jednym polem widzenia przy powiększeniu x10.
  3. Mechanicznie rozbić kopułki Matrigel przez 5 s za pomocą mikropipety P1000. Następnie zebrać zawiesinę organoidu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 200 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, po czym należy usunąć supernatant.
  5. Wprowadzić 1 ml proteazy podobnej do trypsyny w temperaturze pokojowej, uzupełnionej 10 μM Y-27632 i ponownie zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie za pomocą mikropipety P1000.
  6. Umieścić zawiesinę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut, okresowo wstrząsając mieszaniną.
  7. Wprowadzić 5 ml ciepłego organoidowego podłoża podstawowego i energicznie pipetować zawiesinę komórek za pomocą mikropipety P1000, aż stanie się mętna, bez widocznych grudek komórek.
  8. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko komórkowe z odcięciem 70 μm, aby wyeliminować wszelkie resztki Matrigel i duże skupiska komórek.
  9. Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 200 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić osad w podłożu wysiewającym. Do wysiewu jednego psiego urządzenia Gut-on-a-Chip należy użyć 20 μl podłoża wysiewającego do ponownego zawieszenia osadu komórkowego (tj. należy użyć 20 μl podłoża do wysiewu podczas wysiewu jednego urządzenia Gut-on-a-Chip).
  10. Zmodyfikuj stężenie żywotnych komórek do 1 × 107 komórek/ml za pomocą pożywki wysiewającej, jak wcześniej podano2. Przeprowadź ocenę żywotności za pomocą hemocytometru, łącząc 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego, a następnie obserwuj komórki pod mikroskopem.
    UWAGA: Bardzo ważne jest odpowiednie dostosowanie stężenia komórek, aby zapewnić optymalne przyleganie komórek i utworzenie jednolitej monowarstwy na membranie chipa. Jeśli początkowa liczba komórek jest niewystarczająca, może to spowodować opóźnione lub nieudane utworzenie zlewającej się monowarstwy. I odwrotnie, jeśli liczba komórek jest nadmierna, komórki nieprzylegające mogą agregować się w grudki w kanale, prowadząc do niepożądanych skutków koncentracji.

4. Zasiewanie i formowanie monowarstwy komórek 2D

  1. Odłącz rurkę wylotową górnego mikrokanału. Upewnij się, że rurka obejściowa górnego mikrokanału pozostaje otwarta. Zabezpiecz zarówno wlot, jak i wylot dolnego mikrokanału, używając klipsów do segregatora, aby je zacisnąć.
  2. Za pomocą mikropipety P100 lub P20 wprowadź 20 μl zawiesiny komórek z protokołu 3 do otworu wylotowego górnego mikrokanału (Rysunek 3B Wysiew).
  3. Zabezpiecz rurkę obejściową i wlotową górnego mikrokanału za pomocą zacisków do segregatora, aby go zacisnąć. Następnie ponownie przymocuj rurkę wylotową do otworu wylotowego górnego mikrokanału, upewniając się, że rurka pozostaje otwarta przez cały proces, aby uniknąć wywierania nacisku na górny mikrokanał. Po wykonaniu tego kroku powoli zabezpiecz rurkę wylotową górnego kanału za pomocą zacisku do segregatora, aby go zacisnąć.
  4. Sprawdź za pomocą mikroskopu, czy komórki są równomiernie rozmieszczone w górnym mikrokanaliku.
    UWAGA: Ważne jest, aby zacisnąć rurkę, aby zatrzymać ruch medium w kanale, aby umożliwić stabilne warunki statyczne do momentu uzyskania pożądanego połączenia ogniwa.
  5. Umieścić chip w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Potrzeba około 3 godzin, aby komórki organoidów jelitowych psów przyczepiły się do powłoki ECM (Rysunek 3B Łącznik).
  6. Podłączyć strzykawkę podłączoną do górnego mikrokanału Gut-on-a-Chip do pompy strzykawkowej umieszczonej w inkubatorzeCO2.
    UWAGA: Ostrożnie przepłukać pożywkę do mikrokanalika za pomocą pokrętła pompy strzykawkowej i usunąć niezwiązane komórki. Zbadaj chip pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszelkie nieprzyczepione komórki zostały skutecznie zmyte.
  7. Rozpocząć przepływ pożywki hodowlanej przy 30 μl/h za pomocą pożywki wysiewnej. Ten ciągły przepływ dotyczy początkowo tylko górnego mikrokanału, aż do ustanowienia monowarstwy 2D na chipie Gut-on-a-Chip. W przypadku dolnego mikrokanału należy pozostawić mikrokanaliki zaciśnięte, a podłoże nieprzepłukane.
  8. Od następnego dnia po wysianiu komórek należy zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do hodowli organoidów, która zawiera A8301 i brakuje 10 μM Y-27632 i 2,5 μM CHIR99021, z pożywki wysiewnej.
  9. Po ustaleniu monowarstwy zainicjuj ciągły przepływ medium również do dolnego mikrokanału. Zwykle potrzeba od 2 do 3 dni, aby komórki nabłonka organoidów jelitowych psów wytworzyły monowarstwy nabłonka (Rysunek 3C).

5. Ustalenie morfogenezy 3D u psa Gut-on-a-Chip

UWAGA: Po utworzeniu zlewających się monowarstw w Gut-on-a-Chip, wprowadzono średni przepływ zarówno górnego, jak i dolnego kanału oraz szczepu komórkowego, aby zainicjować morfogenezę 3D do monowarstwy 2D, jak pokazano w Rysunek 2.

  1. Wprowadź pożywkę do hodowli organoidów zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, aby zainicjować rozwój morfogenezy 3D w systemie Gut-on-a-Chip. Aby osiągnąć naprężenie ścinające 0,02 dyn/cm2 w istniejącej konstrukcji Gut-on-a-Chip (tj. mikrokanał o wysokości 500 μm), zwiększ natężenie przepływu do 50 μL/h29.
  2. Zainicjuj 10% odkształcenia komórki i częstotliwość 0,15 Hz, zgodnie z wcześniejszymi zaleceniami2, używając bioreaktora regulowanego komputerowo, stosując cykliczne naprężenia do komórek hodowanych in vitro. Ten proces zastosowałby ssanie próżniowe do urządzenia Gut-on-a-Chip.
  3. Utrzymuj te warunki hodowli przez co najmniej 2 do 3 dni. Morfogeneza 3D monowarstwy jelita psa zwykle zachodzi 2 do 3 dni po rozpoczęciu przepływu kanału opony twardej i ssania próżniowego (Rysunek 3C).

6. Charakterystyka psa Gut-on-a-Chip

  1. Obrazowanie żywych komórek
    1. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z Gut-on-a-Chip, delikatnie przepuszczając pożywkę za pomocą pompy strzykawkowej.
    2. Odłącz urządzenie Gut-on-a-Chip od pompy strzykawkowej.
      UWAGA: Unikaj wszelkich manewrów, które mogą wywierać nacisk w Gut-on-a-Chip.
    3. Umieść urządzenie na mikroskopie, aby uchwycić obrazy ustalonego nabłonka 3D. Do wizualizacji struktury warstw nabłonka 3D za pomocą kontrastu fazowego należy użyć obiektywów 10x i 20x (Rysunek 3C).
  2. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Przygotować roztwór blokujący, rozpuszczając 1 g BSA w 50 ml roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w celu uzyskania 2% masy ciała. Przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 μm w celu filtracji. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować roztwór przepuszczalny, łącząc 150 μl Triton X-100 z 50 ml roztworu blokującego, uzyskując końcowe stężenie 0,3% Triton X-100. Przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 μm w celu filtracji. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przeprowadzić utrwalenie komórek, wstrzykując 100 μl 4% PFA zarówno do górnego, jak i dolnego mikrokanału, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    4. Przepłukać komórki, wstrzykując 100 μl PBS zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    5. Przeprowadź przenikanie komórek, wstrzykując 100 μl 0,3% Tritonu do górnych i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11. Ustaw urządzenie w pozycji RT na 30 minut.
    6. Przepłukać komórki, wstrzykując 100 μl PBS zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    7. Wykonać blokowanie komórek, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, wstrzykując 100 μl 2% BSA zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11. Umieść urządzenie w RT na 1 godzinę.
    8. Wstrzyknąć 20 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA i umieścić go w temperaturze pokojowej na 3 godziny, a następnie przez noc inkubować w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie rurki są zaciśnięte podczas inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc. Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego powinno być 2-5 razy wyższe niż stężenie zalecane dla barwienia organoidów jednowarstwowych lub 3D (rysunek uzupełniający S1).
    9. Przepłukać komórki, wstrzykując 100 μl PBS zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    10. Wstrzyknąć 20 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 2% BSA i umieścić go w temperaturze pokojowej przez 1 h.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie rurki są zaciśnięte podczas inkubacji. Począwszy od tego kroku, konieczne jest osłonięcie konfiguracji urządzenia folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu.
    11. Przepłukać komórki, wstrzykując 100 μl PBS zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanałów, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    12. Przygotować połączony roztwór do barwienia przeciwdziałającego F-aktynie i DAPI (diamidyno-2-fenyloindolowi). Wstrzyknąć 20 μl połączonego roztworu do górnych i dolnych mikrokanalików, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
    13. Przepłukać komórki, wstrzykując 100 μl PBS zarówno do górnych, jak i dolnych mikrokanalików, jak opisano w krokach 2.4-2.11.
      Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne architektury komórek nabłonka 3D za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego.

7. Funkcja bariery nabłonkowej

  1. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z Gut-on-a-Chip, delikatnie przepuszczając pożywkę za pomocą pompy strzykawkowej. Upewnij się, że wszystkie rurki są otwarte podczas pomiaru.
  2. Wyjmij Gut-on-a-Chip z pompy strzykawkowej i umieść go w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut.
  3. Usunąć elektrody Ag/AgCl z 70% roztworu EtOH.
  4. Umieść dwie elektrody Ag/AgCl odpowiednio na górnym wlocie i dolnym wylocie, aby zmierzyć rezystancję warstwy nabłonka za pomocą multimetru.
  5. Umieść dwie elektrody Ag/AgCl odpowiednio w dolnym i górnym wylocie. Podaj średnią tych dwóch wartości jako wartość rezystancji dla Gut-on-a-Chip.
    UWAGA: Ślepa próba TEER powinna być mierzona na Gut-on-a-Chip z powłoką ECM bez nabłonka.
  6. Obliczać Wartość przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER) (kΩ × cm2) można obliczyć za pomocą równania (1).
    TEER = (Ωt - Ωślepa) × A (1)
    Gdzie Ωt jest wartością oporu zmierzoną w określonym punkcie czasowym od rozpoczęcia eksperymentu,Ω ślepa próba jest wartością oporu zmierzoną w czasie bez nabłonka, a A jest obszarem powierzchni pokrytym warstwą komórek (około 0,11cm2 dla tej konstrukcji Gut-on-a-Chip29).
    1. Oblicz znormalizowane TEER za pomocą równania (2).
      TEER = figure-protocol-1 (2)
      Gdzie Ω0 to wartość rezystancji w początkowym punkcie czasowym odczytu eksperymentu, jak podano wcześniej30 (Rysunek 4C).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół niezawodnie ułatwia spontaniczny rozwój morfogenezy jelit 3D w systemie Gut-on-a-Chip. Podejście to wykorzystuje komórki nabłonka jelitowego psów uzyskane z organoidów jelitowych pochodzących od psów dotkniętych nieswoistym zapaleniem jelit (IBD) (Rysunek 1B). Sporadyczne grupowanie morfogenezy 3D komórek nabłonka jelitowego psów można zaobserwować w całym mikrokanale po 6-9 dniach średniego przepływu (Rysunek 3C). Te zmiany morfologiczne można monitorować za pomocą technik kontrastu fazowego. W tym badaniu wykorzystaliśmy organoidy pochodzące od dwóch psów, u których zdiagnozowano IBD. Warto zauważyć, że udaną morfogenezę 3D zaobserwowano w dwóch replikacjach biologicznych, z których każda została przeprowadzona z dwoma kontrpróbami technicznymi. Wyniki tego badania stanowią podstawę do przyszłych badań nad organoidami jelitowymi pochodzącymi od innych dawców psów. Wyniki te pokazują potencjalną stosowalność i powtarzalność naszego podejścia eksperymentalnego, które wcześniej opisywano w próbkach ludzkich. Odkrycia te stanowią kolejne potwierdzenie, że technologia Gut-on-a-Chip ma zastosowanie do komórek nabłonka jelitowego psów, jak wcześniej informowano w badaniach z wykorzystaniem ludzkich komórek nabłonka jelitowego2.

Ten protokół pokazał, że barwienie immunofluorescencyjne może być użyte do oceny struktury 3D monowarstw pochodzących z organoidów, które utworzyły struktury podobne do kosmków w mikroprzepływowych chipach za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 4 A,B). Protokół ten można dostosować do walidacji zróżnicowanych i przestrzennie zorganizowanych fenotypów komórkowych poprzez barwienie immunofluorescencyjne. Wizualizacja morfogenezy 3D w Gut-on-a-Chip stanowi doskonałą okazję do zbadania reakcji gospodarza podczas różnych interakcji patologicznych14,23,31. W połączeniu z komórkami nabłonkowymi pochodzącymi od dawców pacjentów, jak opisano wcześniej u ludzi, technologia ta może być wykorzystana do konstruowania spersonalizowanych modeli chorób jelit13. Dzięki integracji obrazowania immunofluorescencyjnego z ukierunkowanymi technikami wizualizacji RNA, takimi jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, możliwa może być wizualna analiza transkryptomów i proteomów gospodarza w systemie Gut-on-a-Chip.

Zachowanie integralności błony jelitowej jest niezbędne dla utrzymania homeostazy jelit, a platforma Gut-on-a-Chip zapewnia cenną przewagę, umożliwiając precyzyjne monitorowanie i kwantyfikację tej kluczowej funkcji. Pomiar TEER za pomocą technologii Gut-on-a-Chip ma kilka zalet. Na przykład poprzednie badania z powodzeniem oceniły TEER podczas kohodowli komórek jelitowych z bakteriami niepatogennymi i probiotycznymi32, a także w warunkach nieszczelnego jelita23. Dzięki temu naukowcy mogą badać wpływ różnych schorzeń na funkcję bariery jelitowej i identyfikować potencjalne interwencje promujące zdrowie jelit.

figure-results-1
Rysunek 1: Stworzenie jelita na chipie IBD pochodzącego od pacjenta. (A) Integracja organoidów jelitowych pochodzących od pacjenta i platformy Gut-on-a-Chip. Biopsję endoskopową można wykonać w celu wyizolowania komórek krypty jelitowej w celu wytworzenia organoidów jelitowych specyficznych dla dawcy. Komórki nabłonkowe mogą być dysocjowane na pojedyncze komórki z organoidów, a następnie wysiewane do Gut-on-a-Chip opartego na PDMS i hodowane w unikalnym dynamicznym mikrośrodowisku. (B) Reprezentatywne obrazy kolonoidów psa z IBD. Podziałka = 100 μm. (C) Ten schemat ilustruje urządzenie Gut-on-a-Chip składające się z porowatej membrany umieszczonej między górnymi i dolnymi mikrokanałami. Górny mikrokanał jest oznaczony niebieskim obszarem, podczas gdy dolny mikrokanał jest oznaczony czerwonym obszarem. Po obu stronach mikrokanału znajdują się komory próżniowe, które deformują porowatą membranę, naśladując ruchy perystaltyczne24. (D) Konfiguracja psiego Gut-on-a-Chip obejmuje Gut-on-a-Chip oparty na PDMS zmontowany z rurką, która jest umieszczona na szkiełku nakrywkowym2,24. Rurka obejściowa ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia wzrostu ciśnienia w mikrokanaliku podczas obsługi (tj. podłączania do strzykawek). Klipsy do segregatora służą do zaciskania rurki. Materiały wrażliwe na objętość mogą być podawane przez otwarte otwory górnego lub dolnego wylotu. Pożywkę do hodowli organoidów można podawać w infuzji, podłączając strzykawki do igieł z końcem i przepływając przez górny i dolny wlot. Skróty: IBD = nieswoiste zapalenie jelit; PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Powstawanie struktur przypominających kosmki u psich IBD Gut-on-a-Chip. Zdysocjowane komórki nabłonkowe zostały umieszczone w Gut-on-a-Chip pokrytym ECM. Gdy zdysocjowane komórki zostały przyłączone do błony PDMS, zainicjowano przepływ wierzchołkowy na 3 dni (D0-D3). Kiedy tworzy się zlewająca się monowarstwa 2D (D3), inicjowany jest przepływ podstawno-boczny z częstym rozciąganiem (rozciąganie, AP i BL Flow). Po 2-3 dniach podwójnego przepływu i rozciągania błony, monowarstwa 2D zaczyna rozwijać morfogenezę 3D, a struktury przypominające kosmki powstają po 9 dniach hodowli (morfogeneza 3D, D9-D12). Skróty: ECM = macierz zewnątrzkomórkowa; PDMS = polidimetylosiloksan; AP = wierzchołkowy; BL = podstawno-boczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wysiewanie organoidów jelitowych psów i morfogeneza 3D w Gut-on-a-Chip. (A) Etapy eksperymentalne aktywacji powierzchni porowatej błony w Gut-on-a-Chip opartym na PDMS. Wykorzystanie obróbki UV/Ozone, PEI i GA w połączeniu ułatwia sieciowanie amin obecnych w roztworach ECM. Proces ten prowadzi do stabilnego unieruchomienia białek ECM na porowatej błonie. (B) Obrazy kontrastu fazowego pokazują morfologię komórek bezpośrednio po wysiewie (po lewej) i 3-5 godzin po wysiewie (po prawej). Porowata błona po 3 godzinach wysiewu wyświetla cieńsze i ciemniejsze obszary, w których przyczepiły się pojedyncze komórki, podkreślając proces przyczepiania. (C) Obrazy kontrastu fazowego przedstawiają morfogenezę 3D monowarstw jelitowych w systemie Gut-on-a-Chip. Te monowarstwy pochodziły od psów dotkniętych IBD, a te komórki organoidowe hodowano przez okres 12 dni w dynamicznych warunkach, które obejmowały przepływ płynu i ruchy rozciągające. Podziałka = 50 μm (B,C). Skróty: IBD = nieswoiste zapalenie jelit; ECM = macierz zewnątrzkomórkowa; PDMS = polidimetylosiloksan; PEI = polietylenimina; GA = aldehyd glutarowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena rozwoju morfologicznego 3D u psich Gut-on-a-Chip. (A) Obrazowanie immunofluorescencyjne psa IBD Gut-on-a-Chip, prezentujące widok z góry na w pełni rozwinięty nabłonek 3D po 12 dniach hodowli, który jest oceniany przez mikroskop fluorescencyjny. Białko ścisłego połączenia (ZO-1) jest wizualizowane na żółto; błona szczotkowo-brzegowa (F-aktyna) pojawia się na czerwono; a jądra są zabarwione DAPI i wydają się niebieskie. (B) Obrazowanie immunofluorescencyjne psiego IBD Gut-on-a-Chip przy użyciu mikroskopu konfokalnego z soczewką długodystansową. Jak pokazano na schemacie, pokazano fluorescencyjny obraz przekroju poprzecznego struktury przypominającej kosmki w pełni rozwiniętego nabłonka 3D po 12 dniach hodowli. Ponadto Z-stacking pokazuje widok z boku nabłonka 3D, który ujawnia tworzenie się struktur przypominających kosmki. Błona szczotkowo-graniczna (F-aktyna) pojawia się na czerwono, a jądra są zabarwione DAPI i wydają się niebieskie. (C) Funkcję bariery jelitowej oceniono i zmierzono za pomocą TEER w psich chipach Gut-on-a-Chips pochodzących od pacjentów. Stabilne wartości TEER zostały osiągnięte w 5 dniu hodowli na Gut-on-a-Chip. Słupki błędów wyrażają SEM pomiarów. Wartość TEER zmierzono między dwiema kontrpróbami biologicznymi z jedną kontrpróbą techniczną. Podziałka = 50 μm (A), 25 μm (B). Skróty: IBD = nieswoiste zapalenie jelit; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; TEER = przeznabłonkowy opór elektryczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Charakterystyka przeciwciała poliklonalnego anty-ZO-1 w monowarstwach pochodzących z kolonoidu psów oraz na urządzeniach Gut-on-a-Chip. (A) Barwienie immunofluorescencyjne ZO-1 na żółto z F-aktyną na czerwono i ich obraz nakładkowy. Podziałka = 25 μm. (B) Immunofluorescencyjna wizualizacja ZO-1 w kolorze żółtym w "Leaky Gut Chips" została przeprowadzona w różnych warunkach, w tym stymulacji bakteriami probiotycznymi (LGG + Cytokiny lub VSL#3 + Cytokiny) i kontrolach wolnych od zarazków bez stymulacji probiotycznej (Cytokiny). Podziałka = 50 μm. Ten rysunek jest odtworzony z Min et al.23. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Podsumowanie informacji o dawcach tkanek. Tabela podsumowująca wiek, płeć, rasę, ocenę histopatologiczną dawców i wskaźnik aktywności IBD psów (CIBDAI). CIBDAI to numeryczny system punktacji używany do wnioskowania o ciężkości klinicznej u psich IBD33. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to stanowi pionierską demonstrację zgodności organoidów jelitowych psów z opracowaniem modelu IBD Gut-on-a-Chip u psów. Integracja organoidów jelitowych i kultur jednowarstwowych pochodzących z organoidów w system mikroprzepływowy (tj. system Gut-on-a-Chip) przyczyniła się do dalszego rozwoju technologii, umożliwiając stworzenie modeli jelitowych in vitro , które ściśle naśladują dynamikę fizjologiczną i są bardziej reprezentatywne dla warunków biologicznych. W szczególności, ponieważ istnieje bardzo niewiele doniesień o hodowli Gut-on-a-Chip przy użyciu organoidów pochodzących z IBD u ludzi, obecne badanie z użyciem Gut-on-a-Chip pochodzącego z IBD u psów może dostarczyć wiodących informacji na temat badania IBD u ludzi.

Pomyślny rozwój morfogenezy 3D nabłonka jelitowego psów na Gut-on-a-Chip wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na kilka krytycznych etapów. Po pierwsze, hydrofobowa powierzchnia kanałów mikroprzepływowych PDMS może utrudniać adhezję ECM i późniejsze przyłączanie komórek, co wymaga aktywacji powierzchniowej PDMS przed powlekaniem ECM i wysiewaniem komórek (patrz sekcja 1 protokołu). Aby uzyskać stabilną hodowlę jednowarstwową, usunięcie nadmiaru nieprzyłączonych komórek ma kluczowe znaczenie po przyłączeniu komórek (kroki protokołu 4.6-4.7). Dodatkowo, dynamiczna stymulacja, taka jak stały przepływ medium i perystaltyczny ruch próżni, jest niezbędna do morfogenezy 3D nabłonka jelitowego (krok protokołu 5.2). Ostrożne obchodzenie się z nim jest niezbędne, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w mikrokanaliku podczas jakichkolwiek etapów hodowli Gut-on-a-Chip.

Jeśli napotkasz słabe wysiewanie komórek do Gut-on-a-Chip, może to być spowodowane niską liczbą komórek lub słabym przyczepieniem komórek. Aby rozwiązać problem z niską liczbą komórek, ważne jest, aby sprawdzić stan przygotowanych organoidów jelitowych, obserwując ich wzrost w Matrigel. Żywotność komórek można ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanowym po dysocjacji komórek, aby upewnić się, że nie więcej niż 20% komórek jest martwych. Jeśli liczba żywotnych komórek jest niewystarczająca, można spróbować zoptymalizować warunki pożywki organoidowej. Inną możliwością jest niepełna dysocjacja organoidów, w wyniku której powstaje nadmiar grudek komórek większych niż 70 μm, które zostają uwięzione przez filtr. Aby rozwiązać ten problem, jedną z opcji jest wydłużenie czasu pipetowania podczas dysocjacji komórek. Alternatywnie, stożkowa rurka o pojemności 15 ml może być delikatnie mieszana co minutę podczas leczenia proteazą podobną do trypsyny. Słabe przyleganie komórek do Gut-on-a-Chip może być spowodowane niewłaściwą powłoką ECM. Podczas procesu powlekania zaleca się dokładne sprawdzenie obecności pęcherzyków powietrza i zapobieganie ich tworzeniu się poprzez delikatne dodawanie większej ilości roztworu powlekającego w razie potrzeby. Przeludnienie komórek i brak możliwości wypłukania nieprzyłączonych komórek może skutkować niewystarczającą początkową warstwą monowarstwową. W takim przypadku można zastosować łagodne pulsowanie podczas naciskania tłoka strzykawki. Te kroki rozwiązywania problemów mogą pomóc w identyfikowaniu i rozwiązywaniu problemów podczas procesu hodowli Gut-on-a-Chip.

Chociaż ta platforma Gut-on-a-Chip umożliwia tworzenie pofałdowanych warstw nabłonka 3D, zdajemy sobie sprawę z potrzeby dodatkowej złożoności biologicznej, aby w pełni odtworzyć mikrośrodowisko jelitowe. Kluczowe znaczenie ma rozważenie interakcji między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi, odkładania się ECM w celu regeneracji 3D oraz obecności cech kosmków kryptowych, które ustanawiają odpowiednią niszę komórek macierzystych. Komórki zrębu, takie jak fibroblasty, odgrywają istotną rolę w produkcji białek ECM i regulacji morfogenezy jelit 34,35,36. Włączenie komórek mezenchymalnych do tego modelu może potencjalnie poprawić zarówno morfogenezę, jak i efektywność przyłączania komórek. Warstwy śródbłonka, które obejmują naczynia włosowate i naczynia limfatyczne, odgrywają kluczową rolę w zarządzaniu transportem molekularnym i rekrutacją komórek odpornościowych37,38. Włączenie komórek odpornościowych pochodzących od pacjenta może mieć zasadnicze znaczenie w modelowaniu chorób jelit, ponieważ pozwala na wykazanie wzajemnych oddziaływań między odpornością wrodzoną i nabytą, a także ustanowienie odporności swoistej tkankowo39. Po zakończeniu morfogenezy 3D na Gut-on-a-Chip, pożywka do hodowli organoidów może zostać zmodyfikowana do pożywki różnicującej organoidy. Może to być realne podejście do indukowania dodatkowego różnicowania komórkowego, w zależności od celów eksperymentalnych.

Obrazowanie mikroarchitektury 3D in situ jest wyzwaniem ze względu na wymaganą dużą odległość roboczą, którą można pokonać za pomocą obiektywu długodystansowego. Dodatkowo, metody mikrofabrykacji i klejenia warstwa po warstwie utrudniają dostęp do górnych warstw w celu zbadania za pomocą SEM. W przypadku obecnej konstrukcji Gut-on-a-Chip potrzebna jest jedna pompa strzykawkowa na mikrourządzenie Gut-on-a-Chip, co zajmuje miejsce w inkubatorze CO2 i uniemożliwia eksperymenty na dużą skalę. Potrzebne są innowacje, aby zwiększyć skalowalność przyjaznej dla użytkownika platformy i badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Te obecne protokoły pozwalają na spontaniczny rozwój warstw nabłonka 3D in vitro, przewyższając ograniczenia tradycyjnych organoidów 3D, monowarstw 2D i statycznych systemów hodowli mikrourządzeń. To dynamiczne mikrośrodowisko jelitowe in vitro można kontrolować, wprowadzając kohodowlę różnych typów komórek. Wcześniejsze badania dotyczyły metod manipulowania mikrośrodowiskiem Gut-on-a-Chip, w tym kokulturacji mikrobiomu jelitowego14,23 i obwodowych komórek jednojądrzastych30. To zrekonstruowane mikrośrodowisko ma wiele potencjalnych zastosowań, w tym testowanie leków, podstawowe badania mechanistyczne i modelowanie chorób. Zrekonstruowane mikrośrodowisko ma znaczny potencjał dla szerokiego zakresu zastosowań, takich jak testowanie leków 23,40,41 i modelowanie chorób 12,13,14,30, a także podstawowe badania mechanistyczne morfogenezy jelit 42. Różnorodne testy można przeprowadzić, zbierając supernatanty do oceny metabolitów43, zbierając komórki do badania genomowego 2,32 lub wizualnie badając komórki za pomocą barwników z żywych komórek lub utrwalenia do późniejszego obrazowania immunofluorescencyjnego 23,44.

W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół opracowywania morfogenezy 3D warstw nabłonka jelitowego psów w platformie Gut-on-a-Chip. Uzyskana w ten sposób struktura nabłonka 3D zapewnia bardziej realistyczne odwzorowanie mikrośrodowiska jelitowego, co ma ogromny potencjał do zastosowań w różnych badaniach biomedycznych. Wykorzystując tę architekturę jelitową, możemy przeprowadzić więcej badań translacyjnych i potencjalnie przynieść obiecujące wyniki.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować WSU Small Animal Internal Medicine Service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) oraz Koordynatorowi Badań Klinicznych WSU VTH Valorie Wiss za ich wsparcie w rekrutacji przypadków i pobieraniu próbek od naukowców-amatorów (dawców pacjentów). Prace te były częściowo wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (K01OD030515 i R21OD031903 do Y.M.A.) oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki za Granicą Program Wyzwań dla Młodych Badaczy (202280196 do I.N.). Rysunki 1A i 3A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid podłoże podstawowe
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
GlutaMAXGibco35050-0612 mM, substytut glutaminy
1 M HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML10 mM
100x penicylina– streptomycynaCorningMT30009CI1x
Organoidy i organoidy pożywka
A-83-01 PeproTech 9094360500 nM
suplement B27 Gibco17504-0441x
CHIR99021Reprocell04-0004-base2.5 µ Komórki M
HEK293 zaprojektowane do wydzielania Noggin Baylor College of Medicine Mysia
EGFPeproTech 315-09-1MG50 ng/ml
Murine Wnt-3aPeproTech 315-20-10UG100 ng/ml
N-acetylo-L-cysteinaSigmaA9165-25G1 mM
N2 MAX Suplement prasowy Gibco17502-0481x 
NikotynamidSigmaN0636-100G10 mM
Kondycjonowany Noggin MediumNANA 10% vol/vol 
PrimocinInvivoGenant-pm-1100 &mikro; g/ml
Komórki R-spondyny1 (Rspo1)Trevigen3710-001-01Komórki Rspo1
R-Spondin-1 Kondycjonowane podłożeNANA20% obj./obj."
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG  10 &mikro; M
Y-27632StemCellTechnologies7230810 i mikro; M
[Leu15 ]-Gastrin I człowiek Sigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Odczynniki
4% roztwór paraformaldehyduFisher ScientificAAJ19943K2
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287x250 rozcieńczenie
Anti-Rabbit IgG H& L oznaczone Alexa Fluor 555Abcamab150078x1,000 rozcieńczenie
Przeciwciało poliklonalne anty-ZO-1Thermo Fisher Scientific61-7300x50 rozcieńczenie
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
Kolagen I, Ogon Szczura 3 mg / mlGibcoA10483-01
Diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific62248rozcieńczenie x1 000
EMS Aldehyd glutarowy Wodny 50%mikroskopia elektronowa Sciences16320
Matrigel MatrixCorning356255
roztwór poli(etyleniminy)Sigma408700-250ML
TrypLE ExpressGibco12604-021
Materiały i sprzęt
24-well Płytki hodowlaneMultimetr przemysłowy Corning3524
87 VWirówka Fluke Corporation
Inkubator CO2Eppendorf
DMi8 Suszarka suchaLeica microsystemsDMi8
FlexCell FX-5000 System napinaniaFlexcell International Corporation
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowymLeica microsystemsDMi1
SP8-X odwrócony mikroskop konfokalnyLeica microsystemsSP8-X
Pompa strzykawkowaBraintree Modelnaukowy nr. BS-8000 Strzykawka 120 V
, sterylna 3 mlBD Biosciences14-823-435
Strzykawki, 1 ml sterylnaBD Biosciences14-823-434
Generator UV/ozonuJelight Companymodel nr 30
Software
LAS X oprogramowanie do obrazowania Mikrosystemy
5910R Mikroskop fluorescencyjny Eppendorf C170i Fisher Scientific 15-103-0519 Leica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2(2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368(2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663(2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43(2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1(2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300(2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641(2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525(2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13(2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Canine Gut On A ChipIntestinal OrganoidsThree Dimensional MorphogenesisInflammatory Bowel DiseaseOrganoid Derived MonolayerMicrofluidic ChipIntestinal Barrier FunctionHost Microbiome InteractionsImmunofluorescent StainingComparative Medicine

Related Articles