Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65723

⸱

10 listopada 2023

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) organizmu posiadają niezwykłą zdolność do różnicowania się w wiele linii dorosłych komórek w ciele i są znane ze swoich właściwości immunomodulujących i przeciwzapalnych. Wykorzystanie tych komórek macierzystych jest dobrodziejstwem dla dziedziny biologii regeneracyjnej, ale jednocześnie zmorą dla medycyny regeneracyjnej i terapii ze względu na wiele niejasności komórkowych z nimi związanych. Niejasności te mogą wynikać z różnorodności źródeł pochodzenia tych komórek macierzystych oraz z warunków ich wzrostu in vitro, które odbijają się na ich funkcjonalnej niejednorodności.

To gwarantuje metodologie dostarczania oczyszczonych, jednorodnych populacji MSCs do zastosowań terapeutycznych. Postępy w dziedzinie cytometrii przepływowej umożliwiły wykrywanie populacji pojedynczych komórek przy użyciu podejścia wieloparametrycznego. Protokół ten określa sposób identyfikacji i oczyszczania komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHED) poprzez sortowanie pojedynczych komórek wspomagane fluorescencją. Jednoczesna ekspresja markerów powierzchniowych, a mianowicie izotiocyjanianu fluoresceiny CD90 (FITC), białka CD73-perydyniny-chlorofilu (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikocyjaniny (APC) i CD44-V450, zidentyfikowała "jasne", dodatnie ekspresory MSC za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Zaobserwowano jednak znaczny spadek odsetka poczwórnych ekspresorów tych dodatnich markerów od pasażu 7 i nowszych pasaży.

Subpopulacje poddane immunofenotypowaniu zostały posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczej komórki, gdzie tylko dwa pozytywne i jeden negatywny marker stanowiły kryteria włączenia. Metodologia ta zapewniła żywotność posortowanych populacji i utrzymała proliferację komórek po sortowaniu. Dalsza aplikacja do takiego sortowania może być wykorzystana do oceny zróżnicowania specyficznego dla linii dla bramkowanych subpopulacji. Podejście to można zastosować do innych systemów jednokomórkowych w celu poprawy warunków izolacji i uzyskania informacji o markerach na powierzchni wielu komórek.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą być uważane za skalowalne źródło komórek odpowiednich do terapii komórkowych i mogą być uważane za złoty standard w medycynie regeneracyjnej. Komórki te mogą być izolowane z różnych źródeł w organizmie o różnym pochodzeniu tkankowym1. W zależności od tkanki źródłowej, każdy typ MSC wykazuje niejednoznaczne zachowanie in vitro2. Widać to dobrze w ich właściwościach morfologicznych i funkcjonalnych3. Wiele badań wykazało wewnątrzklonalną zmienność wymiarów, w tym różnicowanie tkanek dorosłych, stan genomu oraz architekturę metaboliczną i komórkową MSCs2,4.

Immunofenotypowanie komórek było powszechnym zastosowaniem cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek macierzystych i zostało wykorzystane przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) w 2006 roku do przepisania listy minimalnych kryteriów identyfikacji komórek jako MSC. Stwierdzono, że wraz z przyleganiem do plastiku i zdolnością do różnicowania się w trzy linie (osteogenną, chondrogeniczną i adipogenną) in vitro, ≥95% populacji komórek musi wykazywać ekspresję CD105, CD73, CD90, a komórki te muszą nie mieć ekspresji (≤2% dodatniej) CD34, CD45, CD11b, CD14 i HLA-DR, mierzonej za pomocą cytometrii przepływowej5. Chociaż MSCs zostały zdefiniowane za pomocą zestawu biomarkerów zgodnie z minimalnymi kryteriami ISCT, ich właściwości immunologiczne nie mogły być porównane z tymi biomarkerami i istniała potrzeba więcej niż te kryteria, aby ułatwić ilościowe porównania między badaniami i zmiany klonów2.

Pomimo wytycznych ustalonych przez ISCT, obszerne badania nad MSC wykazały, że w tej populacji istnieje heterogeniczność, która może wynikać z wielu czynników, głównie ze względu na wszechobecny charakter heterogeniczności powstającej między dawcami MSC6, źródła tkanek7, pojedyncze komórki w populacji klonalnej8, oraz warunki hodowli2,9,10. Charakterystyka i oczyszczanie tych pierwotnych komórek z różnych źródeł tkanek w celu zapewnienia jakości i losu komórek są kluczowymi etapami ich produkcji. Potrzeba zrozumienia wyświetlanych różnic w populacji wymaga skutecznej metody podziału na subpopulacje, które można podzielić i zebrać oddzielnie11. Analizy na poziomie pojedynczej komórki pomagają przezwyciężyć wyzwania związane ze zmiennością między komórkami, redukują szum biologiczny wynikający z niejednorodnej populacji oraz oferują możliwość badania i charakteryzowania rzadkich komórek12.

W oparciu o cel i wybrane parametry, można zastosować kilka metod do sortowania i wzbogacania wybranych populacji. Techniki sortowania komórek mogą obejmować zarówno metody sortowania zbiorczego, jak i sortowania jednokomórkowego. Podczas gdy sortowanie zbiorcze może wzbogacić populacje docelowe poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS)13, fractionation14 i elutriation15, sortowanie pojedynczych komórek może wzbogacić bardziej jednorodne populacje za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)11. W tabeli 1 przedstawiono analizę porównawczą każdej z tych metod wraz z własnym zestawem zalet i wad

.

Tabela 1: Analizy porównawcze różnych technik: MACS, Frakcjonowania, Elutriacji i FACS podkreślające różnice w ich zasadzie oraz zalety i wady wyboru jednej techniki nad inną. Skróty: MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Od czasu pojawienia się tej techniki, jednokomórkowa cytometria przepływowa odgrywa główną rolę w wyliczaniu16, wykrywaniu i charakterystyce określonej populacji komórek w heterogenicznej próbce17. Hewitt i in. w 2006 roku położyli podwaliny pod metodologię automatycznego sortowania komórek w celu zwiększenia izolacji jednorodnych pul zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)18. Sortowanie pojedynczych komórek wzbogaciło populację hESC transdukowanych metodą GFP, ułatwiając izolację genetycznie zmodyfikowanych klonów, co otworzyło nowy wymiar badań klinicznych. Aby poprawić wydajność sortowania, zasadniczo stosuje się dwa podejścia; Albo pożywki zbiorcze posortowanych populacji są modyfikowane w celu utrzymania żywotności i proliferacji komórek po posortowaniu19 lub algorytm/oprogramowanie sortowania komórek jest odpowiednio modyfikowane12.

Wraz z postępem technologicznym, komercyjne cytometry przepływowe i sortery komórek były w stanie pomóc sprostać wyzwaniom, które zostały spełnione podczas aseptycznego sortowania delikatnych i rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek macierzystych różnego pochodzenia. Jednym z głównych wyzwań biologów zajmujących się komórkami macierzystymi było klonalne wyizolowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zgodnie z protokołami transfekcji wymaganymi w badaniach nad edycją genów19. Rozwiązano ten problem poprzez sortowanie pojedynczych komórek na 96-dołkowe płytki, które pokryto mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) wraz z suplementami i dostępnymi na rynku małocząsteczkowymi inhibitorami ROCK. Jednak strategie izolacji komórek można w znacznym stopniu udoskonalić za pomocą sortowania indeksowego, funkcji algorytmu sortowania, która identyfikuje immunofenotyp poszczególnych komórek sortowanych12. Ta udoskonalona metoda sortowania pojedynczych komórek pomogła nie tylko w zwiększeniu wydajności sortowania komórek macierzystych, zwłaszcza w odniesieniu do rzadkich populacji krwiotwórczych komórek macierzystych, ale także skutecznie powiązała klony pojedynczych komórek z ich dalszymi testami funkcjonalnymi20.

Ten artykuł skupia się na sortowaniu pojedynczych komórek immunofenotypowanych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHEDs) w celu wzbogacenia subpopulacji w celu zbadania ich funkcjonalnych zdolności różnicowania. Korzystając z kombinacji dwóch markerów MSC-dodatnich, CD90 i CD73, oraz ujemnego markera hematopoetycznego CD45, MSCs poddano immunofenotypowaniu i zidentyfikowano ekspresory dim i zero. Na podstawie ich immunofenotypu subpopulacje zidentyfikowano jako czyste MSC, populacje pojedyncze dodatnie i podwójnie ujemne. Zostały one posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczych komórek, aby uzyskać czyste i wzbogacone subpopulacje do dalszych badań funkcjonalnych w celu określenia, czy zróżnicowana ekspresja markerów była artefaktem warunków hodowli in vitro, czy też ma również jakikolwiek wpływ na właściwości funkcjonalne. Komórki, które nie były jednorodnymi ekspresjami "dodatnich markerów MSC", zostały posortowane w celu zbadania ich właściwości funkcjonalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zatwierdzenie etyczne i zgoda na udział w badaniu: Próbki ludzkiej miazgi z wypadniętych zębów mlecznych pobrano po uzyskaniu świadomej zgody oraz pełnej aprobaty etycznej Wydziału Chirurgii Szczękowej i Twarzowej (Oral and Maxillofacial Department) Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) w Bengaluru, zgodnie ze standardami ustalonymi przez Komisję ds. Etyki Szpitala (Hospital Ethical Clearance Committee) SRGCDS. Następnie izolacja, hodowla, utrzymanie i zastosowanie SHEDs zostały zatwierdzone i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi rekomendowanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Komórkami Macierzystymi (IC-SCR) w Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników i buforów

  1. Do utrzymania hodowli
    1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek MSC (10%), wykorzystując pożywkę podstawową dla niezróżnicowanych hESC, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy oraz 1% penicyliny-streptomycyny (Pen-strep) (Tabela 2).
    2. Przygotować pożywkę do hodowli komórek MSC (20%), wykorzystując pożywkę podstawową dla niezróżnicowanych hESC, 20% FBS, 1% L-glutaminy oraz 1% Pen-strep (Tabela 2).
    3. Przygotować pożywkę neutralizującą, wykorzystując pożywkę podstawową dla niezróżnicowanych hESC, 1% L-glutaminy oraz 1% antybiotyku-antymykotyku (Anti-Anti) (Tabela 2).
  2. Do analizy cytometrycznej i sortowania
    1. Przygotować bufor barwiący, stosując 2% FBS w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
    2. Przygotować roztwór stokowy 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1 µg/mL) poprzez dodanie 1 µL do 1 mL PBS
  3. Do różnicowania MSC w kierunku konkretnych linii komórkowych
    1. Przygotować pożywki różnicujące do różnicowania osteogennego, chondrogennego i adipogennego zgodnie ze składem opisanym w Tabeli 3. Przygotowane alikwoty przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
    2. Przygotować pożywkę do głodzenia surowiczego (pożywka 2%), wykorzystując pożywkę podstawową dla niezróżnicowanych hESC, 2% FBS, 1% L-glutaminy oraz 1% Pen-strep (Tabela 2).
RODZAJ POŚRODKAPRZEZNACZENIE POŚCIWÓKSKŁAD NA 50 ML
FBS (płodowa surowica bydlęca)Pen-StrepL-glutaminaPODŁOŻE PODSTAWOWE DLA NIERÓŻNICOWANYCH hESC
10% pożywkiHodowla i utrzymanie MSC5 mL500 μL500 μL44 ml
20% pożywkitest CFU-F10 ml500 μL500 μL39 ml
pożywka z ograniczoną zawartością surowicy (2%)Pożywki dla studni kontrolnych w protokole różnicowania1 ml500 μL500 μL48 ml
Pożywki neutralizującePożywka do neutralizacji zawiesiny komórkowej po trypsynizacji -500 μL500 μL49 ml 

Tabela 2: Pożywki do hodowli komórkowej stosowane do utrzymania kultur i w testach. Skróty: MSC = mezenchymalna komórka macierzysta; CFU-F = jednostka tworząca kolonię fibroblastów.

SKŁADNIKIPOŚR. OSTEOGENICZNEPOŚR. CHONDROGENICZNEPOŚRODKIE ADIPOGENNE
Pożywka podstawowa90 ml90 ml90 mL
Pożywki indukcyjne10 mL10 ml10 mL
Objętość całkowita100 mL100 mL100 mL

Tabela 3: Pożywki do różnicowania trójliniowego komórek SHED.**

2. Hodowla i utrzymanie komórek SHED

  1. Utrzymywać komórki w 10% pożywce hodowlanej dla MSC i wymieniać pożywkę co 2 dni lub w razie potrzeby.
  2. Trypsynizować komórki przy 95% konfluencji, używając 0,25% trypsyny-EDTA.
  3. Zneutralizować komórki po trypsynizacji przy użyciu pożywki neutralizującej.
  4. Wirować probówkę z prędkością 300 × g przez 6 min w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu komórkowego.
  5. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 10% pożywce hodowlanej dla MSC.
  6. Wysiać komórki do świeżo przygotowanych naczyń hodowlanych zawierających 10% pożywkę hodowlaną dla MSC w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów lub pasażowania.
    UWAGA: Optymalna gęstość wysiewu dla SHEDs to 0,2 × 106 komórek w szalce 100 mm oraz 0,8 × 106 komórek w kolbie T-75, aby uzyskać odpowiednio 1,5 × 106 komórek i 4 × 106 komórek przy 90-100% konfluencji.

3. Charakterystyka MSC

  1. Krótkoterminowy test wzrostu komórek
    1. Wysiać 4 × 104 komórek/dołek w trzech powtórzeniach na płytkach 6-dołkowych w 10% pożywce hodowlanej MSC.
    2. Inkubować płytki przez 7 dni w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co 2 dni.
    3. Zebrać komórki w dniach 2, 4 i 8, stosując traktowanie 0,25% trypsyną, a następnie przemyć pożywką hodowlaną.
    4. Wirować komórki przy 300 g przez 6 min w temperaturze pokojowej i resuspendować osad w 1 mL pożywki.
    5. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i określić ich żywotność metodą wykluczania błękitu trypanu.
    6. Obliczyć tempo proliferacji zgodnie z równaniem (1):
      figure-protocol-1    (1)
  2. Test jednostek tworzących kolonie fibroblastów (CFU-F)
    1. Wysiać 10 000 komórek do szalki 100 mm i hodować je w 20% pożywce hodowlanej MSC.
    2. Inkubować płytki przez 14 dni w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co 3 dni.
    3. Po 14 dniach wypłukać kolonie PBS, utrwalić je barwnikiem fioletem krystalicznym w metanolu i ponownie wypłukać PBS, aby usunąć pozostałości barwnika.
    4. Policzyć i sfotografować kolonie.
      UWAGA: Należy liczyć kolonie zawierające >50 komórek. Efektywność tworzenia kolonii oblicza się jako liczbę jednostek tworzących kolonie.
  3. Test immunofluorescencji
    1. Wysiać MSC na szalkach 35 mm i hodować do osiągnięcia 80–90% konfluencji.
    2. Usunąć pożywkę i raz wypłukać szalki PBS.
    3. Utrwalić komórki 1 mL 4% paraformaldehydem (PFA), inkubując przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
    4. Po utrwaleniu przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    5. Dodać 0,3% Triton X-100 w PBST (0,05% roztwór Tween 20 w PBS) w celu permeabilizacji komórek. Inkubować na kołysarce przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    7. Dodać 3% albuminy surowicy wołowej (BSA) w celu blokowania i inkubować na kołysarce przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    8. Przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    9. Dodać 800 µL rozcieńczenia 1:500 przeciwciała mysiego przeciwko wimentynie, inkubować na kołysarce przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść płytkę do 4 °C na inkubację nocną.
    10. Następnego dnia usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    11. Dodać 800 µL rozcieńczenia 1:1 000 przeciwciała wtórnego koziego przeciwko mysiemu IgG (H+L), adsorbowanego krzyżowo, Alexa Fluor 555 i inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej na kołysarce.
    12. Przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    13. Dodać sondy faloidyny Alexa Fluor 488 240 µL w 1 000 µL PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min na kołysarce.
    14. Przemyć dołki PBST 3 x 5 min na kołysarce.
    15. Dodać 700 µL medium montażowego z DAPI i obserwować komórki pod mikroskopem.
  4. Różnicowanie liniowo-specyficzne
    1. Różnicowanie po hodowli 2D
      1. Przygotować dwie płytki 48-dołkowe i oznaczyć je odpowiednio jako linie osteogenna i adipogenna.
      2. Wysiać 15 000 komórek/dołek w czterech dołkach każdej płytki i hodować je w 10% pożywce hodowlanej MSC.
      3. Po osiągnięciu przez monowarstwę komórek 90% konfluencji, oznaczyć pierwsze dwa dołki jako „Kontrola” i zastąpić istniejącą pożywkę pożywką z ograniczoną zawartością surowicy (pożywka 2%). W dwóch ostatnich dołkach oznaczonych jako „Test” dodać pożywkę różnicującą dla jednej z dwóch linii, adipogennej lub osteogennej. Dzień ten oznaczyć jako Dzień 0.
      4. Ostrożnie wymieniać pożywkę co trzeci dzień, aby zapobiec odklejaniu się komórek, dbając o uniknięcie kontaminacji.
      5. Utrzymywać te warunki do dwudziestego pierwszego dnia, a następnie przygotować próbki do eksperymentu z barwieniem.
    2. Różnicowanie po hodowli 3D
      1. Przygotować dwie probówki 15 mL do przeprowadzenia różnicowania chondrogennego z wykorzystaniem hodowli w formie peletu 3D.
      2. Przenieść 1 × 106 komórek do każdej probówki i wirować przy 300 × g przez 6 min w celu utworzenia peletu. Jedną probówkę oznaczyć jako „Kontrola” i dodać do niej 10% pożywki hodowlanej MSC; drugą probówkę oznaczyć jako „Test” i dodać pożywkę różnicującą chondrogenną. Probówki ostrożnie umieścić w inkubatorze z lekko dokręconymi nakrętkami. Dzień ten oznaczyć jako Dzień 0.
      3. Wymieniać pożywkę co trzeci dzień w sposób ostrożny, aby nie przesunąć ani nie rozbić peletu podczas wymiany pożywki.
      4. Utrzymywać te warunki do dwudziestego pierwszego dnia, a następnie przetworzyć komórki do dalszych eksperymentów.
  5. Cytochemiczne barwienie liniowo-specyficzne
    1. W przypadku hodowli 2D, do barwienia użyć płytek z różnicującymi się (test) i nieróżnicującymi się MSC (kontrola) (z kroku 3.4.1.5.); najpierw usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS. Utrwalić komórki 4% PFA przez 30 min w temperaturze pokojowej, usunąć nadosad i raz przemyć PBS. Przeprowadzić barwienie dla każdej linii w następujący sposób:
      1. Dla linii adipocytów dodać roztwór do permeabilizacji z zestawu i inkubować płytkę przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przygotować i dodać 1 mL roboczego roztworu Oil Red O i inkubować przez 10 min. Usunąć barwnik i przemyć pięciokrotnie wodą destylowaną.
      2. Dla linii osteocytów dodać do każdego dołka 5% świeżo przygotowanego azotanu srebra (w wodzie destylowanej) i naświetlać płytkę promieniami UV przez 1 h. Usunąć roztwór i dodać 2,5% tiosiarczanu sodu w celu usunięcia nieprzereagowanego srebra; inkubować przez 5 min. Usunąć barwnik, przemyć dwukrotnie wodą destylowaną i obserwować zabarwione komórki pod mikroskopem.
    2. W przypadku hodowli 3D, zebrać pelet po zakończeniu okresu różnicowania z kroku 3.4.2.3 i wykonać kriosekcje zróżnicowanej tkanki w formie peletu. Pozostawić preparaty do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do barwienia.
      1. Dla linii chondrocytów postępować zgodnie z instrukcją zestawu do barwienia: dodać odpowiednią objętość roztworu płuczącego, usunąć go, dodać roztwór utrwalający i inkubować przez 30 min. Przemyć wodą destylowaną, dodać roztwór barwiący i inkubować przez 30 min. Przemyć trzykrotnie 0,1 N kwasem solnym; dodać wodę destylowaną, aby zneutralizować kwasowość. Obserwować zabarwione komórki pod mikroskopem w świetle przechodzącym.

4. Barwienie powierzchni komórek do immunofenotypowania

UWAGA: Zalecanymi naczyniami do hodowli komórkowej w celu uzyskania optymalnej liczby komórek w krokach 4.2-4.5 są szalki 100 mm lub kolby T75.

  1. Przygotowanie komórek do eksperymentów z cytometrii przepływowej
    1. Poddać komórki trypsynizacji i zebrać je z konfluentnej szalki/kolby, a następnie odwirować przy 300 × g przez 6 min w celu otrzymania osadu komórkowego.
    2. Resuspendować osad w 1 mL pożywki i określić liczbę żywych komórek przy użyciu hemocytometru zgodnie z metodą wykluczania błękitu trypanu.
    3. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową po policzeniu i przemyć osad dwukrotnie 1 mL buforu do barwienia.
    4. Odlać nadsącz i ostatecznie resuspendować osad w odpowiedniej objętości buforu do barwienia, zależnie od protokołu (patrz kroki 4.2 do 4.5).
  2. Przygotowanie kontroli kompensacji
    1. Wziąć siedem probówek do FACS i oznaczyć je jako: Niebarwione, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 oraz APC.
    2. Resuspendować końcowy osad w buforze do barwienia (patrz krok 4.1), zachowując gęstość komórek 0,5 × 106 komórek na 50 µL na probówkę dla probówek Niebarwionych i DAPI.
    3. Przygotować probówki barwione pojedynczo do kompensacji zgodnie z opisem w Tabeli 4.
    4. Delikatnie wymieszać każdą probówkę na wortexie po przygotowaniu i inkubować w ciemności przez 30 min.
    5. Po inkubacji przemyć probówki dwukrotnie, dodając 1 mL buforu do barwienia do każdej probówki, a następnie krótko wymieszać na wortexie i odwirować przy 200 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać nadsącz, resuspendować osad w 500 µL buforu do barwienia i odstawić do momentu akwizycji.
    7. W przypadku probówki DAPI przeprowadzić zabieg szoku termicznego poprzez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C przez 5 min, a następnie przez 15 min na lodzie. Dodać 5 µL DAPI do zawiesiny i przechowywać w ciemności do momentu akwizycji pomiarów.
  3. Przygotowanie kontroli FMO (fluorescence minus one)
    1. Resuspendować końcowy osad w buforze do barwienia (patrz krok 4.1), zachowując gęstość komórek 0,5 × 106 komórek na 50 µL dla każdej probówki.
    2. Wziąć pięć probówek do FACS i oznaczyć je jako: izotyp CD44-V450, CD90-FITC, CD45-PE, izotyp CD73-PerCP Cy5.5 oraz izotyp CD105-APC.
    3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z Tabelą 5.
    4. Delikatnie wymieszać probówki na wortexie i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Po inkubacji przemyć każdą probówkę dwukrotnie 1 mL buforu do barwienia, a następnie krótko wymieszać na wortexie i odwirować przy 200 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać nadsącz, resuspendować osad w 500 µL buforu do barwienia i odstawić do momentu akwizycji.
  4. Przygotowanie próbek do analizy
    1. Resuspendować końcowy osad w buforze do barwienia (patrz krok 4.1), zachowując gęstość komórek 0,5 × 106 komórek na 50 µL dla każdej probówki.
    2. Wziąć dwie probówki do FACS i oznaczyć je jako Mixed tube 1 i 2.
    3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z Tabelą 6.
    4. Delikatnie wymieszać probówki na wortexie i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Po inkubacji przemyć każdą probówkę dwukrotnie 1 mL buforu do barwienia, a następnie krótko wymieszać na wortexie i odwirować przy 200 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać nadsącz, resuspendować osad w 500 µL buforu do barwienia i odstawić do momentu akwizycji.
  5. Przygotowanie próbek do sortowania pojedynczych komórek
    1. Wziąć dwie probówki do FACS, dodać 1 mL FBS i obracać probówką, aż na wewnętrznych ściankach każdej z nich utworzy się równomierna warstwa FBS. Inkubować przez 1-2 h podczas przygotowywania próbki do barwienia. Oznaczyć te probówki jako Mixed tube 1 i 2.
    2. Resuspendować końcowy osad w buforze do barwienia (patrz krok 4.1), zachowując gęstość komórek 2-3 × 106 komórek na 50 µL dla każdej probówki.
    3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał w probówkach Mixed tube 1 i 2 zgodnie z Tabelą 7.
    4. Delikatnie wymieszać probówki na wortexie i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Po inkubacji przemyć każdą probówkę dwukrotnie 1 mL buforu do barwienia, a następnie krótko wymieszać na wortexie i odwirować przy 200 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać nadsącz, resuspendować osad w 500 µL buforu do barwienia i odstawić. Dodać 5 µL DAPI na 15 min przed sortowaniem.
      UWAGA: Należy pamiętać, że w przypadku eksperymentów z sortowaniem zaleca się wyższą gęstość komórek na probówkę.
Typ probówkiPozytywne koraliki kompensacyjne*Negatywne koraliki kompensacyjne*Komórki Dodane przeciwciało 
Probówka FITC1 kropla 1 kropla–Anti-human CD90-FITC (2 µL)
Probówka V4501 kropla1 kropla–Anti-human CD44-V450 (2 µL)
Probówka PerCP-Cy 5.51 kropla1 kropla–Anti-human CD73-PerCP Cy 5.5 (2 µL)
Probówka PE1 kropla1 kropla–Anti-human CD45-PE (2 µL)
Probówka APC1 kropla1 kropla–Anti-human CD105-APC (2 µL)
Probówka DAPI––50 µL–
Probówka niebarwiona––50 µL–
*1 kropla = 60 µL zawiesiny koralików 

Tabela 4: Próbki kontrolne do kompensacji. Skróty: Comp = kompensacja; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; APC = allofikocyjanina; PE = fikoerytryna; PerCP = peridynina-chlorofiliła-białko.

TYP PROBÓWKI PRZECIW CIAŁA PRZECIWKO MARKEROWI POZYTYWNYM (2 µL)PRZECIW CIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI NEGATYWNEMU  (2 µL)DODANO PRZECIWCIAŁA IZOTYPOWE  (2 µL)CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ OBIETOŚĆ DODANEJ SUSPENSJI KOMÓRKOWEJ OBIETOŚĆ DODANEGO BUFORU BARWIĄCEGO 
Probówka FMO dla CD90-FITC- przeciwciało anty-CD44 przeciwko ludzkiemu antygenowi CD44 znakowane V450  Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkiom sprzężone z PEizotyp FITC IgG110 µL 50 µL 40 µL 
- Przeciwciało anty-CD73 przeciwko ludzkim komórkom, PerCP Cy 5.5
- Przeciwciało anty-CD105 przeciwko ludzkim komórkom znakowane APC
Probówka FMO dla CD73-PerCP Cy5.5- przeciwciało anty-CD44 przeciwko ludzkiemu białku CD44 znakowane V450   Przeciwciało anty-CD45 ludzkie sprzężone z PE izotyp IgG1 PerCP Cy 5.510 µL50 µL 40 µL 
- Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkim antygenom znakowane FITC   
- Przeciwciało anty-CD105 APC przeciwko ludzkim antygenom
Probówka CD44-V450 FMO- Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkim komórkom znakowane FITC   Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkim komórkom znakowane PE V450 izotyp IgG1 10 µL50 µL 40 µL 
- Przeciwciało anty-CD73 ludzkie znakowane PerCP Cy 5.5 
- Przeciwciało anty-CD105 przeciwko ludzkim komórkom znakowane APC
probówka FMO dla CD105-APC- Przeciwciało anty-CD44 ludzkie-V450  Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkiom znakowane PE izotyp APC IgG110 µL50 µL40 µL 
- Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkim komórkom znakowane FITC 
- Przeciwciało anty-ludzkie CD73-PerCP Cy 5.5 
probówka FMO dla CD45-PE- Przeciwciało anty-CD44 ludzkie-V450  -PE izotyp IgG1 10 µL50 µL 40 µL 
- Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD90-FITC 
- Przeciwciało anty-CD73 przeciwko ludzkiemu CD73 znakowane PerCP Cy 5.5 
- Przeciwciało anty-CD105 przeciwko ludzkim komórkom znakowane APC

Tabela 5: Próbki kontrolne FMO. Skróty: FMO = fluorescence minus one; FITC = fluorescein isothiocyanate; APC = allophycocyanin; PE = phycoerythrin; PerCP = peridinin-chlorophyll-protein.

TYP PROBÓWKI PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI POZYTYWNEMU (2 µL)PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI NEGATYWNEMU (2 µL)CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ OBJIĘTOŚĆ DODANEJ SUSPENSJI KOMÓRKOWEJ OBIETOŚĆ DODANEGO BUFORU BARWIĄCEGO 
Pomieszana probówka 1 - Przeciwciało anty-CD44 ludzkie-V450  Przeciwciało anty-CD45 ludzkie sprzężone z PE 10 µL 50 µL  40 µL 
- Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD90-FITC  
- Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD73-PerCP Cy5.5 
- Przeciwciało anty-CD105 przeciwko ludzkim antygenom sprzężone z APC
Wymieszano probówkę 2- Przeciwciało anty-CD44 przeciwko ludzkiemu antygenowi CD44 znakowane V450  Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkim komórkom znakowane PE 10 µL50 µL 40 µL
- Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkiemu białku, znakowane FITC  
- Przeciwciało anty-CD73 przeciwko ludzkiemu CD73 znakowane PerCP Cy5.5
- Przeciwciało anty-CD105 przeciwko ludzkim antygenom znakowane APC

Tabela 6: Probówki z próbkami do wielokolorowego immunofenotypowania SHEDs.Skróty: SHEDs = komórki macierzyste z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych; PE = fykoerytryna.

TYP PROBÓWKI PRZECIW CIAŁA PRZECIWKO MARKEROWI POZYTYWNYM (3 µL)PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI NEGATYWNEMU (3 µL)CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ OBIETOŚĆ DODANEJ SUSPENSJI KOMÓRKOWEJ OBIETOŚĆ DODANEGO BUFORU BARWIĄCEGO 
Probówka mieszana 1 - Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkim antygenom, znakowane FITC  Przeciwciało anty-CD45-PE przeciwko ludzkiemu antygenowi CD45 9 µL 50 µL  41 µL 
- Przeciwciało anty-CD73 ludzkie-PerCP Cy5.5 
Wymieszana probówka 2- Przeciwciało anty-CD90 przeciwko ludzkim komórkom sprzężone z FITC  Przeciwciało anty-CD45 ludzkie znakowane PE 9 µL50 µL 41 µL
- Przeciwciało anty-CD73 ludzkie znakowane PerCP Cy5.5 

Tabela 7: Probówki do reakcji sortowania pojedynczych komórek. Skróty: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna; PerCP = białko peridyny i chlorofilu.

5. Sortowanie pojedynczych komórek

  1. Przygotowanie sortera komórkowego
    1. Zainstaluj w sorterze dyszę 100 µm.
      UWAGA: Odpowiednia dysza powinna mieć średnicę co najmniej pięciokrotnie większą niż średnica sortowanej cząstki. Dobór płynu osłonowego do sortowania powinien zależeć od rodzaju próbki oraz czułości eksperymentu; w niniejszym doświadczeniu zastosowano zastrzeżony płyn osłonowy.
    2. Przeprowadź codzienną kontrolę jakości (QC) instrumentu i skonfiguruj sorter do eksperymentu. Szczegółowe instrukcje konfiguracji urządzenia znajdują się w instrukcji obsługi instrumentu.
  2. Ustawianie macierzy kompensacji
    1. Ustaw macierz kompensacji, wykorzystując probówki do kompensacji z pojedynczym barwnikiem z kroku 4.2.
    2. W dedykowanym oprogramowaniu wybierz Experiment z paska narzędzi i kliknij Compensation setup. Otwórz Create compensation controls.
    3. Sprawdź markery i potwierdź. Nowy okaz zostanie dodany pod nazwą "Compensation", do którego oprogramowanie automatycznie doda nowe probówki będące kontrolami markerów.
    4. Wybierz probówkę niebarwioną (Unstained) i uruchom pomiar, aby zarejestrować 5 000 zdarzeń. Przeciągnij bramkę na populację komórek i zastosuj ją do wszystkich kontroli kompensacji. Służy to do ustawienia napięć i bramki negatywnej dla każdego parametru fluorescencyjnego.
    5. Analogicznie ładuj kolejno probówki do kompensacji z pojedynczym barwnikiem, rejestrując i zapisując dane. Wybierz bramkę wyznaczającą populację docelową i zastosuj ją do wszystkich kontroli kompensacji. Służy to do ustawienia bramek pozytywnych dla każdego parametru fluorescencyjnego.
    6. Wybierz Experiment z paska narzędzi i kliknij Calculate compensation values | link and save.
      UWAGA: Po wygenerowaniu macierzy autokompensacji przez oprogramowanie, parametrów napięcia fluorochromów nie można już zmieniać dla żadnego z kanałów w probówkach mieszanych (Mixed tubes).
  3. Akwizycja danych
    1. Zarejestruj 10 000 komórek z każdej probówki z kroków 4.3. i 4.4, aby zebrać dane do analizy immunofenotypu komórek.
  4. Przygotowanie urządzeń do zbierania komórek
    1. W zależności od przeznaczenia posortowanych populacji komórek, wybierz płytki 6-, 24-, 48- lub 96-dołkowe.
    2. Pokryj dołki 200-500 µL FBS i pozostaw płytki w spokoju na 2 h.
    3. Po 2 h usuń pozostałości FBS i dodaj 200-500 µL 10% pożywki hodowlanej MSC.
  5. Sortowanie komórek w trybie sortowania pojedynczych komórek
    1. Uruchom pomiar próbki Mixed tube 1 (z kroku 4.5) i zarejestruj 10 000 zdarzeń , aby przy użyciu odpowiedniej strategii bramkowania ustawić bramki na populacji docelowej do sortowania.
    2. Załaduj płytkę do zbierania, ustaw doczelową liczbę komórek w przedziale od 2 500 do 5 000 komórek/dołek i wybierz maskę czystości sortowania pojedynczych komórek (single-cell sort purity mask).
    3. Zbierz posortowane populacje do urządzenia odbiorczego i przechowuj je w lodzie do zakończenia eksperymentu sortowania.
    4. Po zakończeniu przenieś płytki do inkubatora z 5% CO2, aby utrzymać hodowle w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po akwizycji surowe pliki danych zostały wyeksportowane w formacie pliku .fcs (wersja 3.0 i nowsze). Raporty z sortowania generowane po każdym eksperymencie odnotowywały liczbę posortowanych zdarzeń/komórek na przypisany dołek oraz wskazywały liczbę przerwanych konfliktów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystykę komórek SHEDs przeprowadzono za pomocą standardowych testów immunofluorescencji, które wykazały ekspresję wimentyny (kolor czerwony, filamenty pośrednie typu III), filamentów aktynowych (sondy Alexa fluor 488 Phalloidin) oraz jąder komórkowych barwionych DAPI (Rysunek 1A). W celu oszacowania ich zdolności do proliferacji i tworzenia kolonii przeprowadzono standardowe krótkoterminowe testy wzrostu komórek. 14,3-krotny wzrost tempa proliferacji od 2. do 8. dnia przedstawiono na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, wśród źródeł pourodzeniowych, MSC pochodzące z tkanek jamy ustnej cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich minimalne zobowiązania etyczne i znaczny potencjał różnicowania wieloliniowego21. Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) z dotkniętego trzeciego zęba trzonowego i SHED przyciągnęły największą uwagę wśród stomatologów MSC ze względu na ich potencjał terapeutyczny w chorobach neurodegeneracyjnych i urazowych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Podziękowania

Dziękujemy Obiektowi Komórek Przepływowych w Centrum Zaawansowanych Badań Naukowych Jawaharlala Nehru, Bengaluru, Indie, za korzystanie z głównego urządzenia do cytometrii przepływowej. Kriosekcję hodowli osadów zróżnicowanych komórek przeprowadzono w Laboratorium Referencyjnym Neuberg Anand w Bengaluru w Indiach. Prace te były wspierane przez UC z Manipal Academy of Higher Education (MAHE) w Indiach. AG jest wdzięczna za wsparcie stypendium dr T. M. A. Pai od MAHE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alcian Blue StainHiMediaCCK029-1KT
Antybiotyk-Antybiotyk (100x) Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µ m) Zestaw cząstekBD Biosciences560497
BD FACS Accudrop Beads BD Biosciences345249Służy do ustawiania opóźnienia lasera po otwarciu modułu sortowania.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometrBD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS Płyn osłonowyBD Biosciences342003Używany jako płyn osłonkowy zarówno do analizy, jak i sortowania eksperymentów w BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& T Koraliki badawczeBD Biosciences655050Służy do konfiguracji instrumentu w zależności od rozmiaru dyszy.
Mysz BD Horizon V450 Anti-Human CD44BD Biosciences561292
Mysz BD Horizon V450 IgG2b itp.; Kontrola izotypuBD Biosciences560374Izotyp CD44-V450
BD Pharmingen APC Mysz Anti-Human CD105BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences555751CD105-APC izotyp
BD Pharmingen DAPI SolutionBD Biosciences564907DAPI Roztwór podstawowy 1 mg/ml
BD Pharmingen FITC Mysz anty-ludzka CD90BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC Mysz IgG1, κ Kontrola izotypuBD Biosciences555748CD90-FITC izotyp
BD Pharmingen PE Mysz anty-ludzka CD45BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypuBD Biosciences555749CD45-PE izotyp
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz Anti-Human CD73BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz IgG1, κ Kontrola izotypuBD Biosciences550795Izotyp CD73-PerCP-Cy 5,5
BD Pharmingen Oczyszczona mysia antywimentynaBD Biosciences550513
Albumina surowicy bydlęcejHi-Media TC548-5G
Kryształowy fioletNice chemical pvt ltd C33809
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-aldrich   D5652-50LdPBS używany do prac hodowlanych i konserwacji.
Alkohol etylowy ------Służy do ogólnej sterylizacji.
Surowica bydlęca płodu Gibco firmy ThermoFisher 10270-106
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco firmy ThermoFisher 10829018Pożywka bazowa dla niezróżnicowanych hESC, stosowana do przygotowania pożywek hodowlanych
L-Glutamina 200mM (100x)Gibco by ThermoFisher25030-081
Metanol, do biologii molekularnej Hi-Media MB113
Czerwony olejowy OHiMedia CCK013-1KT
Paraformaldehyd loba chemie30525-89-4
Penicylina Streptomycyna (100x)Gibco firmy ThermoFisher 15140- 122
Falloidyna (odczynnik ActinGreen 488 ReadyPromes)Invitrogen R37110
Azotan srebraHiMedia MB156-25G
Tiosiarczan sodu pentahydratChemport10102-17-7
Sphero Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 3,0 - 3,4 i mikro; mBD Biosciences556291
Bufor do barwienia Sporządzono w MIRM ----Został przygotowany przy użyciu 2% FBS w PBS 
StemPro Adipogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe Gibco firmy ThermoFisher A10410-01Pożywki podstawowe dla pożywek adipogennych
StemPro Adipogenesis SuplementGibco firmy ThermoFisher A10065-01Pożywki indukcyjne do pożywek adipogennych
StemPro ChondrogenesisSuplement Gibco firmy ThermoFisher A10064-01Pożywka indukcyjna do pożywek chondrogennych
StemPro Osteogenesis SuplementGibco firmy ThermoFisher A10066-01Pożywki indukcyjne dla pożywek osteoogennych
StemPro Osteogeneza/Chondrogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe Gibco firmy ThermoFisher A10069-01Pożywki bazowe zarówno dla pożywek ostegenicznych, jak i chondrogennych
Triton-X-100Hi-Media MB031
Błękit trypanowy Gibco od life technologies 15250-061
Trypsyna - Roztwór EDTA 1xHi-media TCL049
Tween-20 MERCK 9005-64-5

Bibliografia

  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy. Frontiers in Immunology. 10, 1112(2019).
  3. Li, J., et al. Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).
  4. McLeod, C. M., Mauck, R. L. On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis. European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).
  5. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  6. Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations. Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).
  7. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  8. Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies. Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).
  9. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  10. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).
  11. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).
  12. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
  13. Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Roda, B., et al. A novel stem cell tag-less sorting method. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).
  15. Hall, S. R., et al. Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry. Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).
  16. Eggleton, M. J., Sharp, A. A. Platelet counting using the Coulter electronic counter. Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).
  17. Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density. Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).
  18. Hewitt, Z., et al. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).
  19. Singh, A. M. An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11(2019).
  20. Wilson, N. K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  21. Zhou, L. L., et al. Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters. Stem Cells Inernational. 2020, 1327405(2020).
  22. Fawzy El-Sayed, K. M., et al. Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).
  23. Hardy, W. R., et al. Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).
  24. FACSAria Fusion User's Guide. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowaimmunofenotypowanieludzkie z by mleczner nicowanie kom rek macierzystychmarkery powierzchniowe kom rektest tworzenia koloniir nicowanie adipogenner nicowanie osteogenne
Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.