Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Summary

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Abstract

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) organizmu posiadają niezwykłą zdolność do różnicowania się w wiele linii dorosłych komórek w ciele i są znane ze swoich właściwości immunomodulujących i przeciwzapalnych. Wykorzystanie tych komórek macierzystych jest dobrodziejstwem dla dziedziny biologii regeneracyjnej, ale jednocześnie zmorą dla medycyny regeneracyjnej i terapii ze względu na wiele niejasności komórkowych z nimi związanych. Niejasności te mogą wynikać z różnorodności źródeł pochodzenia tych komórek macierzystych oraz z warunków ich wzrostu in vitro, które odbijają się na ich funkcjonalnej niejednorodności.

To gwarantuje metodologie dostarczania oczyszczonych, jednorodnych populacji MSCs do zastosowań terapeutycznych. Postępy w dziedzinie cytometrii przepływowej umożliwiły wykrywanie populacji pojedynczych komórek przy użyciu podejścia wieloparametrycznego. Protokół ten określa sposób identyfikacji i oczyszczania komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHED) poprzez sortowanie pojedynczych komórek wspomagane fluorescencją. Jednoczesna ekspresja markerów powierzchniowych, a mianowicie izotiocyjanianu fluoresceiny CD90 (FITC), białka CD73-perydyniny-chlorofilu (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikocyjaniny (APC) i CD44-V450, zidentyfikowała "jasne", dodatnie ekspresory MSC za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Zaobserwowano jednak znaczny spadek odsetka poczwórnych ekspresorów tych dodatnich markerów od pasażu 7 i nowszych pasaży.

Subpopulacje poddane immunofenotypowaniu zostały posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczej komórki, gdzie tylko dwa pozytywne i jeden negatywny marker stanowiły kryteria włączenia. Metodologia ta zapewniła żywotność posortowanych populacji i utrzymała proliferację komórek po sortowaniu. Dalsza aplikacja do takiego sortowania może być wykorzystana do oceny zróżnicowania specyficznego dla linii dla bramkowanych subpopulacji. Podejście to można zastosować do innych systemów jednokomórkowych w celu poprawy warunków izolacji i uzyskania informacji o markerach na powierzchni wielu komórek.

Introduction

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą być uważane za skalowalne źródło komórek odpowiednich do terapii komórkowych i mogą być uważane za złoty standard w medycynie regeneracyjnej. Komórki te mogą być izolowane z różnych źródeł w organizmie o różnym pochodzeniu tkankowym¹. W zależności od tkanki źródłowej, każdy typ MSC wykazuje niejednoznaczne zachowanie in vitro². Widać to dobrze w ich właściwościach morfologicznych i funkcjonalnych³. Wiele badań wykazało wewnątrzklonalną zmienność wymiarów, w tym różnicowanie tkanek dorosłych, stan genomu oraz architekturę metaboliczną i komórkową MSCs^2,4.

Immunofenotypowanie komórek było powszechnym zastosowaniem cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek macierzystych i zostało wykorzystane przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) w 2006 roku do przepisania listy minimalnych kryteriów identyfikacji komórek jako MSC. Stwierdzono, że wraz z przyleganiem do plastiku i zdolnością do różnicowania się w trzy linie (osteogenną, chondrogeniczną i adipogenną) in vitro, ≥95% populacji komórek musi wykazywać ekspresję CD105, CD73, CD90, a komórki te muszą nie mieć ekspresji (≤2% dodatniej) CD34, CD45, CD11b, CD14 i HLA-DR, mierzonej za pomocą cytometrii przepływowej⁵. Chociaż MSCs zostały zdefiniowane za pomocą zestawu biomarkerów zgodnie z minimalnymi kryteriami ISCT, ich właściwości immunologiczne nie mogły być porównane z tymi biomarkerami i istniała potrzeba więcej niż te kryteria, aby ułatwić ilościowe porównania między badaniami i zmiany klonów².

Pomimo wytycznych ustalonych przez ISCT, obszerne badania nad MSC wykazały, że w tej populacji istnieje heterogeniczność, która może wynikać z wielu czynników, głównie ze względu na wszechobecny charakter heterogeniczności powstającej między dawcami MSC⁶, źródła tkanek⁷, pojedyncze komórki w populacji klonalnej⁸, oraz warunki hodowli^2,9,10. Charakterystyka i oczyszczanie tych pierwotnych komórek z różnych źródeł tkanek w celu zapewnienia jakości i losu komórek są kluczowymi etapami ich produkcji. Potrzeba zrozumienia wyświetlanych różnic w populacji wymaga skutecznej metody podziału na subpopulacje, które można podzielić i zebrać oddzielnie¹¹. Analizy na poziomie pojedynczej komórki pomagają przezwyciężyć wyzwania związane ze zmiennością między komórkami, redukują szum biologiczny wynikający z niejednorodnej populacji oraz oferują możliwość badania i charakteryzowania rzadkich komórek¹².

W oparciu o cel i wybrane parametry, można zastosować kilka metod do sortowania i wzbogacania wybranych populacji. Techniki sortowania komórek mogą obejmować zarówno metody sortowania zbiorczego, jak i sortowania jednokomórkowego. Podczas gdy sortowanie zbiorcze może wzbogacić populacje docelowe poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS)¹³, fractionation¹⁴ i elutriation¹⁵, sortowanie pojedynczych komórek może wzbogacić bardziej jednorodne populacje za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)¹¹. W tabeli 1 przedstawiono analizę porównawczą każdej z tych metod wraz z własnym zestawem zalet i wad

.

Tabela 1: Analizy porównawcze różnych technik: MACS, Frakcjonowania, Elutriacji i FACS podkreślające różnice w ich zasadzie oraz zalety i wady wyboru jednej techniki nad inną. Skróty: MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Od czasu pojawienia się tej techniki, jednokomórkowa cytometria przepływowa odgrywa główną rolę w wyliczaniu¹⁶, wykrywaniu i charakterystyce określonej populacji komórek w heterogenicznej próbce¹⁷. Hewitt i in. w 2006 roku położyli podwaliny pod metodologię automatycznego sortowania komórek w celu zwiększenia izolacji jednorodnych pul zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)¹⁸. Sortowanie pojedynczych komórek wzbogaciło populację hESC transdukowanych metodą GFP, ułatwiając izolację genetycznie zmodyfikowanych klonów, co otworzyło nowy wymiar badań klinicznych. Aby poprawić wydajność sortowania, zasadniczo stosuje się dwa podejścia; Albo pożywki zbiorcze posortowanych populacji są modyfikowane w celu utrzymania żywotności i proliferacji komórek po posortowaniu¹⁹ lub algorytm/oprogramowanie sortowania komórek jest odpowiednio modyfikowane¹².

Wraz z postępem technologicznym, komercyjne cytometry przepływowe i sortery komórek były w stanie pomóc sprostać wyzwaniom, które zostały spełnione podczas aseptycznego sortowania delikatnych i rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek macierzystych różnego pochodzenia. Jednym z głównych wyzwań biologów zajmujących się komórkami macierzystymi było klonalne wyizolowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zgodnie z protokołami transfekcji wymaganymi w badaniach nad edycją genów¹⁹. Rozwiązano ten problem poprzez sortowanie pojedynczych komórek na 96-dołkowe płytki, które pokryto mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) wraz z suplementami i dostępnymi na rynku małocząsteczkowymi inhibitorami ROCK. Jednak strategie izolacji komórek można w znacznym stopniu udoskonalić za pomocą sortowania indeksowego, funkcji algorytmu sortowania, która identyfikuje immunofenotyp poszczególnych komórek sortowanych¹². Ta udoskonalona metoda sortowania pojedynczych komórek pomogła nie tylko w zwiększeniu wydajności sortowania komórek macierzystych, zwłaszcza w odniesieniu do rzadkich populacji krwiotwórczych komórek macierzystych, ale także skutecznie powiązała klony pojedynczych komórek z ich dalszymi testami funkcjonalnymi²⁰.

Ten artykuł skupia się na sortowaniu pojedynczych komórek immunofenotypowanych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHEDs) w celu wzbogacenia subpopulacji w celu zbadania ich funkcjonalnych zdolności różnicowania. Korzystając z kombinacji dwóch markerów MSC-dodatnich, CD90 i CD73, oraz ujemnego markera hematopoetycznego CD45, MSCs poddano immunofenotypowaniu i zidentyfikowano ekspresory dim i zero. Na podstawie ich immunofenotypu subpopulacje zidentyfikowano jako czyste MSC, populacje pojedyncze dodatnie i podwójnie ujemne. Zostały one posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczych komórek, aby uzyskać czyste i wzbogacone subpopulacje do dalszych badań funkcjonalnych w celu określenia, czy zróżnicowana ekspresja markerów była artefaktem warunków hodowli in vitro, czy też ma również jakikolwiek wpływ na właściwości funkcjonalne. Komórki, które nie były jednorodnymi ekspresjami "dodatnich markerów MSC", zostały posortowane w celu zbadania ich właściwości funkcjonalnych.

Protocol

Zgoda na etykę i zgoda na uczestnictwo: Ludzkie złuszczone próbki liściastej miazgi zębowej zostały otrzymane po uzyskaniu świadomej zgody i pełnej aprobaty etycznej przez Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) Oral and Maxillofacial Department, Bengaluru, zgodnie ze standardami ustalonymi przez Hospital Ethical Clearance Committee, SRGCDS. Następnie izolacja, hodowla, utrzymanie i zastosowanie SHED zostały zatwierdzone i zgodne z wytycznymi zalecanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Komórkami Macierzystymi (IC-SCR) w Manipal Institute of Regenerative Medicine, MAHE - Bengaluru. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników i

1. Do utrzymania kultur
   1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek MSC (10%) przy użyciu podłoża podstawowego dla niezróżnicowanych hESC, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen-strep) (Tabela 2).
   2. Przygotować pożywkę do hodowli komórek MSC (20%) przy użyciu podłoża podstawowego dla niezróżnicowanych hESC, 20% FBS, 1% L-glutaminy i 1% Pen-strep-strep (Tabela 2).
   3. Przygotować pożywkę neutralizującą, używając podłoża podstawowego dla niezróżnicowanych hESC, 1% L-glutaminy i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego (Anti-Anti) (Tabela 2).
2. Do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej
   1. Przygotować bufor barwiący przy użyciu 2% FBS w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   2. Przygotować roztwór podstawowy 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (1 μg/ml), dodając 1 μl w 1 ml PBS
3. Do różnicowania MSC w zależności od pochodzenia
   1. Przygotować pożywki różnicujące do różnicowania osteogennego, chondrogenicznego i adipogennego zgodnie ze składem opisanym w tabeli 3. Przygotowane porcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania doświadczenia.
   2. Przygotuj pożywkę pozbawioną surowicy (2% pożywki) przy użyciu podłoża podstawowego dla niezróżnicowanych hESC, 2% FBS, 1% L-glutaminy i 1% Pen-strep (Tabela 2).

TYP NOŚNIKA			PRZEZNACZENIE MEDIÓW			KOMPOZYCJA NA 50 ml
						FBS (Sieć Usługowa	Pióro-paciorkowiec	L-glutamina	PODSTAWOWA POŻYWKA DLA NIEZRÓŻNICOWANYCH hESC
10% media			Kultura i utrzymanie MSC			5 ml	500 μL	500 μL	44 ml
20% media			Test CFU-F			10 ml	500 μL	500 μL	39 ml
Surowica głodna (2%) media			Media dla studzienek kontrolnych w protokole różnicowania			1 ml	500 μL	500 μL	48 ml
Neutralizacja mediów			Pożywka do neutralizacji zawiesiny komórek po trypsynizacji			-	500 μL	500 μL	49 ml

Tabela 2: Pożywki do hodowli komórkowych do utrzymania hodowli i testów. Skróty: MSC = mezenchymalna komórka macierzysta; CFU-F = jednostka tworząca kolonię-fibroblast.

Składniki	OŻYWY OSTEOGENNE	POŻYWKI CHONDROGENNE	POŻYWKI ADYPOGENNE
Pożywka podstawowa	90 ml	90 ml	90 ml
Media indukcyjne	10 ml	10 ml	10 ml
Całkowita objętość	100 ml	100 ml	100 ml

Tabela 3: Media różnicujące do trójliniowego różnicowania SHEDs.

2. Hodowla i utrzymanie SHEDów

1. Utrzymuj komórki w 10% pożywce hodowlanej MSC i wykonuj zmiany pożywki co 2 dni lub w razie potrzeby.
2. Trypsynizuj komórki przy 95% konfluencji przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA.
3. Zneutralizuj komórki po trypsynizacji za pomocą pożywki neutralizującej.
4. Odwirować probówkę o masie 300 × g przez 6 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10% pożywce hodowlanej MSC.
6. Komórki nasienne do świeżo przygotowanych naczyń do hodowli komórkowych zawierających 10% pożywki hodowlanej MSC do dalszych eksperymentów lub podhodowli.
   UWAGA: Optymalna gęstość wysiewu dla SHED wynosi odpowiednio 0,2 × 10⁶ komórek w szalce 100 mm i 0,8 × 10⁶ komórek w kolbie T-75, aby uzyskać odpowiednio 1,5 × 10⁶ komórek i 4 × 10⁶ komórek przy 90-100% konfluencji.

3. Charakterystyka MSC

1. Krótkoterminowy test wzrostu komórek
   1. Nasiona 4 × 10⁴ komórki/basenik w trzech powtórzeniach na płytki 6-dołkowe w 10% pożywkach hodowlanych MSC.
   2. Inkubować płytki przez 7 dni w temperaturze 37 °C i dokonywać zmian pożywki co 2 dni.
   3. Zbierz komórki w dniach 2, 4 i 8, stosując 0,25% trypsynę i przemyj pożywką hodowlaną.
   4. Odwirować komórki w temperaturze 300 g przez 6 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki.
   5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ ich żywotność metodą wykluczania błękitu trypanowego.
   6. Obliczyć szybkość proliferacji za pomocą równania (1):
      (1)
2. Test fibroblastów tworzących kolonie (CFU-F)
   1. Wysiewaj 10 000 komórek w naczyniu o średnicy 100 mm i hoduj je w 20% pożywkach hodowlanych MSC.
   2. Inkubować płytki przez 14 dni w temperaturze 37 °C i dokonywać zmian pożywki co 3 dni.
   3. Po 14 dniach spłucz kolonie PBS, utrwal je barwnikiem fioletu krystalicznego w metanolu i ponownie spłucz PBS, aby usunąć pozostałą plamę.
   4. Policz i zobrazuj kolonie.
      UWAGA: Policz kolonie z >50 komórkami. Wydajność tworzenia kolonii jest obliczana jako liczby jednostek tworzących kolonie.
3. Test immunofluorescencyjny
   1. Wysiewaj MSCs na szalkach o średnicy 35 mm i pozwól im rosnąć do 80-90% zrębla.
   2. Wyjmij podłoże i raz opłucz naczynia PBS.
   3. Utrwalić komórki 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Po utrwaleniu umyj studzienki PBST przez 3 x 5 min na kołysce.
   5. Dodaj 0,3% Triton X-100 w PBST (0,05% roztwór Tween 20 w PBS) w celu przepuszczalności komórek. Trzymaj go na bujaku przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Myj studzienki PBST przez 3 x 5 min na kołysce.
   7. Dodaj 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu zablokowania i trzymaj ją na bujaku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   8. Myj studzienki PBST przez 3 x 5 min na kołysce.
   9. Dodać 800 μl mysiej antywimentyny w rozcieńczeniu 1:500, trzymać ją na kołysce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przenieść płytkę do 4 °C w celu inkubacji przez noc.
   10. Następnego dnia usuń przeciwciało pierwotne i przemyj studzienki PBST przez 3 x 5 minut na kołysce.
   11. Dodaj 800 μl rozcieńczenia 1:1,000 koziego przeciwciała wtórnego anty-mysiego IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555, i trzymaj je przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce.
   12. Myj studzienki PBST przez 3 x 5 min na kołysce.
   13. Dodaj Alexa fluor 488 Phalloidin Probes 240 μL w 1,000 μL PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60 minut na bujaku.
   14. Myj studzienki PBST przez 3 x 5 min na kołysce.
   15. Dodać 700 μl mocownika DAPI i obserwować komórki pod mikroskopem.
4. Zróżnicowanie w zależności od pochodzenia
   1. Różnicowanie w oparciu o kulturę 2D
      1. Weź dwie 48-dołkowe płytki i oznacz je odpowiednio jako linie osteogenne i adipogenne.
      2. Wysiewaj 15 000 komórek/studzienkę w czterech dołkach każdej płytki i hoduj je w 10% pożywce hodowlanej MSC.
      3. Gdy monowarstwa komórek osiągnie 90% konfluencji, oznacz pierwsze dwie studzienki jako "Kontrola" i zastąp istniejące podłoża pożywkami pozbawionymi surowicy (pożywka 2%). W ostatnich dwóch studzienkach oznaczonych jako "Test" dodaj pożywki różnicujące jednej z dwóch linii, adipogennej lub osteogennej. Oznacz to jako Dzień 0.
      4. Delikatnie wymieniaj podłoże co trzeci dzień, aby uniknąć łuszczenia się i uważaj, aby uniknąć zanieczyszczenia.
      5. Utrzymuj te warunki do dwudziestego pierwszego dnia, a następnie przygotuj się do eksperymentu z barwieniem.
   2. Zróżnicowanie w oparciu o kulturę 3D
      1. Weź dwie probówki o pojemności 15 ml do przeprowadzenia różnicowania chondrogenicznego przy użyciu hodowli osadów 3D.
      2. Przenieść 1 × 10⁶ komórek do każdej probówki i odwirować przy 300 × g przez 6 minut, aby uzyskać osad. Oznacz jedną probówkę jako "Kontrola" i dodaj do niej 10% pożywki hodowlanej MSC; oznacz drugą probówkę jako "Test" i dodaj chondrogenne podłoże różnicujące. Ostrożnie umieść probówki w inkubatorze z luźno zakręconymi nakrętkami. Oznacz to jako Dzień 0.
      3. Ostrożnie zmieniaj pożywkę co trzeci dzień, aby nie wyprzemieścić/nie rozpaść osadu podczas wymiany podłoża.
      4. Utrzymuj te warunki do dwudziestego pierwszego dnia, a następnie przetwarzaj komórki do dalszych eksperymentów.
5. Barwienie cytochemiczne specyficzne dla linii rodowej
   1. W przypadku kultur 2D do barwienia należy użyć zróżnicowanych (testowych) i niezróżnicowanych płytek MSCs (kontrolnych) (z kroku 3.4.1.5), a następnie najpierw usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS. Utrwalić komórki za pomocą 4% PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i przemyć raz PBS. Wykonaj barwienie dla każdej linii w następujący sposób.
      1. W przypadku linii adipocytów dodaj roztwór do permeabilizacji z zestawu i inkubuj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj i dodaj 1 ml roztworu roboczego Oil red O i trzymaj go przez 10 minut. Usuń plamę i przemyj pięć razy wodą destylowaną.
      2. W przypadku linii osteocytów dodaj 5% świeżo przygotowanego azotanu srebra (w wodzie destylowanej) do każdej studzienki i utrzymuj płytkę w promieniowaniu UV przez 1 godzinę. Usuń roztwór i dodaj 2,5% tiosiarczanu sodu, aby usunąć nieprzereagowane srebro; Trzymaj go przez 5 minut. Usuń plamę, umyj dwukrotnie wodą destylowaną i obserwuj wybarwione komórki pod mikroskopem.
   2. W przypadku kultur 3D należy zebrać osad po zakończeniu okresu różnicowania z etapu 3.4.2.3 i uzyskać kriosekcje zróżnicowanej tkanki w postaci osadu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu i osiągnij temperaturę pokojową przed przystąpieniem do barwienia.
      1. W przypadku linii chondrocytów postępuj zgodnie ze wskazówkami zestawu do barwienia, aby dodać wystarczającą ilość roztworu myjącego, usuń go, dodaj roztwór utrwalający i inkubuj przez 30 minut. Przemyć wodą destylowaną, dodać roztwór barwiący i inkubować przez 30 minut. Przemyć trzykrotnie 0,1 N kwasem solnym; dodać wodę destylowaną, aby zneutralizować kwasowość. Obserwuj wybarwione komórki pod mikroskopem jasnego pola.

4. Barwienie powierzchni komórek do immunofenotypowania

UWAGA: Zalecane płytki do hodowli komórkowych w celu uzyskania optymalnej liczby komórek w krokach 4.2-4.5 to szalki 100 mm lub kolby T75.

1. Przygotowanie komórek do eksperymentów z cytometrią przepływową
   1. Trypsynizować i zbierać komórki z naczynia / kolby zlewającej się i odwirowywać przy 300 × g przez 6 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
   2. Zawiesić osad w 1 ml pożywki i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru zgodnie z metodą wykluczania błękitu trypanowego.
   3. Po przeliczeniu ponownie odwirować zawiesinę komórek i jeszcze dwukrotnie przepłukać osad 1 ml buforu barwiącego.
   4. Odrzucić sklarowany osad i na koniec ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu barwiącego, w zależności od protokołu (patrz kroki 4.2 do 4.5).
2. Przygotowanie kontroli wynagrodzeń
   1. Weź siedem probówek FACS i oznacz je jako niebarwione, DAPI, V450, FITC, PE, PerCP-Cy 5.5 i APC.
   2. Zawiesić końcowe osady w buforze do barwienia (patrz krok 4.1.), utrzymując gęstość komórek 0,5 × 10⁶ komórek na 50 μl na probówkę dla probówek niebarwionych i DAPI.
   3. Przygotować pojedynczo barwione probówki do kompensacji, jak opisano w Tabeli 4.
   4. Po przygotowaniu delikatnie zmieszać każdą probówkę i inkubować w ciemności przez 30 minut.
   5. Po inkubacji przeprowadzić dwa płukania, dodając 1 ml buforu barwiącego do każdej probówki, a następnie krótko wirować i odwirować przy 200 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu barwiącego i odstawić do czasu nabycia.
   7. W przypadku probówki DAPI należy przeprowadzić szok cieplny, inkubując ją w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie 15 minut na lodzie. Dodać 5 μl DAPI do zawiesiny i trzymać w ciemności aż do momentu nabycia przebiegu.
3. Przygotowanie kontroli fluorescencyjnej minus jeden (FMO)
   1. Zawiesić końcowe osady w buforze barwiącym (patrz krok 4.1), zachowując gęstość komórek 0,5 × 10⁶ komórek na 50 μl dla każdej probówki.
   2. Weź pięć probówek FACS i oznacz je jako izotyp CD44-V450, izotyp CD90-FITC, CD45-PE, CD73-PerCP Cy5.5 i izotyp CD105-APC.
   3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z tabelą 5.
   4. Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   5. Po inkubacji przepłukać każdą probówkę dwukrotnie 1 ml buforu barwiącego, a następnie krótko wirować i odwirować przy 200 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu barwiącego i odstawić go do czasu nabycia.
4. Przygotowanie próbek do analizy
   1. Zawiesić końcowe osady w buforze barwiącym (patrz krok 4.1), utrzymując gęstość komórek 0,5 ×^{10 6} komórek na 50 μl dla każdej probówki.
   2. Weź dwie probówki FACS i oznacz je jako Mieszane probówki 1 i 2.
   3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z tabelą 6.
   4. Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   5. Po inkubacji przepłukać każdą probówkę dwukrotnie 1 ml buforu barwiącego, a następnie krótko wirować i odwirować przy 200 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu barwiącego i odstawić do momentu nabycia.
5. Przygotowanie próbek do sortowania jednokomórkowego
   1. Weź dwie probówki FACS, dodaj 1 ml FBS i zwiń probówkę, aż po wewnętrznej stronie każdej probówki utworzy się równa warstwa FBS. Inkubuj to przez 1-2 godziny, przetwarzając próbkę do barwienia. Oznacz te probówki jako Mieszane probówki 1 i 2.
   2. Zawiesić końcowe osady w buforze barwiącym (patrz krok 4.1), utrzymując gęstość komórek 2-3 ×^{10 6} komórek na 50 μl na każdą probówkę.
   3. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał w mieszanych probówkach 1 i 2 zgodnie z tabelą 7.
   4. Delikatnie wymieszaj probówki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   5. Po inkubacji przepłukać każdą probówkę dwukrotnie 1 ml buforu barwiącego, a następnie krótko wirować i odwirować przy 200 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu barwiącego i odstawić. Dodaj 5 μl DAPI 15 minut przed sortowaniem.
      UWAGA: Należy pamiętać, że w przypadku eksperymentów sortowania zaleca się większą gęstość komórek na probówkę.

Typ rurki	Dodatnie koraliki Comp*	Ujemne koraliki kompozycji*	Komórek	Dodano przeciwciało
Rurka FITC	1 kropla	1 kropla	–	Anty-ludzki CD90-FITC (2 μL)
Rura V450	1 kropla	1 kropla	–	Anty-ludzki CD44-V450 (2 μL)
Rurka PerCP-Cy 5.5	1 kropla	1 kropla	–	Anty-ludzki CD73-PerCP Cy 5.5 (2 μL)
Rura PE	1 kropla	1 kropla	–	Anty-ludzki CD45-PE (2 μL)
Rura transportera opancerzonego	1 kropla	1 kropla	–	Anty-ludzki CD105-APC (2 μL)
Rurka DAPI	–	–	50 μL	–
Niepoplamiona tuba	–	–	50 μL	–
*1 kropla = 60 μl zawiesiny perełek

Tabela 4: Próby kontrolne kompensacji. Skróty: Comp = kompensacja; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; APC = allofikocyjanina; PE = fikoerytryna; PerCP = perydynina-chlorofil-białko.

TYP RURKI	PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI DODATNIEMU (2 μL)			PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI UJEMNEMU (2 μL)	DODANO PRZECIWCIAŁA IZOTYPU (2 ΜL)	CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ	DODANO OBJĘTOŚĆ ZAWIESINY KOMÓREK	DODANO OBJĘTOŚĆ BUFORA BARWIĄCEGO
rurka FMO CD90-FITC	- Anty-ludzki CD44-V450			Anty-ludzki CD45-PE	Izotyp FITC IgG1	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD73 PerCP Cy 5.5
	- Anty-ludzki CD105-APC
Rura FMO CD73-PerCP Cy5.5	- Anty-ludzki CD44-V450			Anty-ludzki CD45-PE	Izotyp PerCP Cy 5.5 IgG1	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD90-FITC
	- Anty-ludzki CD105-APC
Rura FMO CD44-V450	- Anty-ludzki CD90-FITC			Anty-ludzki CD45-PE	Izotyp IgG1 V450	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anty-ludzki CD105-APC
Rura FMO CD105-APC	- Anty-ludzki CD44-V450			Anty-ludzki CD45-PE	Izotyp APC IgG1	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD90-FITC
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy 5.5
Rura FMO CD45-PE	- Anty-ludzki CD44-V450			-	PE IgG1 izotyp	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD90-FITC
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy 5.5
	- Anty-ludzki CD105-APC

Tabela 5: Próbki kontrolne FMO. Skróty: FMO = fluorescencja minus jeden; FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; APC = allofikocyjanina; PE = fikoerytryna; PerCP = perydynina-chlorofil-białko.

TYP RURKI	PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI DODATNIEMU (2 μL)		PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI UJEMNEMU (2 μL)	CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ	DODANO OBJĘTOŚĆ ZAWIESINY KOMÓREK	DODANO OBJĘTOŚĆ BUFORA BARWIĄCEGO
Mieszana rura 1	- Anty-ludzki CD44-V450		Anty-ludzki CD45-PE	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD90-FITC
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy5.5
	- Anty-ludzki CD105-APC
Rura mieszana 2	- Anty-ludzki CD44-V450		Anty-ludzki CD45-PE	10 μL	50 μL	40 μL
	- Anty-ludzki CD90-FITC
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy5.5
	- Anty-ludzki CD105-APC

Tabela 6: Probówki do wielokolorowego immunofenotypowania SHEDs. Skróty: SHEDs = komórki macierzyste z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych; PE = fikoerytryna.

TYP RURKI	PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI DODATNIEMU (3 μL)		PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MARKEROWI UJEMNEMU (3 μL)	CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ PRZECIWCIAŁ	DODANO OBJĘTOŚĆ ZAWIESINY KOMÓREK	DODANO OBJĘTOŚĆ BUFORA PLAM
Mieszana rura 1	- Anty-ludzki CD90-FITC		Anty-ludzki CD45-PE	9 μL	50 μL	41 μL
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy5.5
Rura mieszana 2	- Anty-ludzki CD90-FITC		Anty-ludzki CD45-PE	9 μL	50 μL	41 μL
	- Anty-ludzki CD73-PerCP Cy5.5

Tabela 7: Probówki reakcyjne do sortowania jednokomórkowego. Skróty: FITC = izotiocyjanian fluoresceiny; PE = fikoerytryna; PerCP = perydynina-chlorofil-białko.

5. Sortowanie pojedynczych komórek

1. Przygotowanie sortownika komórek
   1. Zainstaluj dyszę 100 μm w sorterze.
      UWAGA: Odpowiednia dysza ma co najmniej pięciokrotną średnicę cząstki, która ma być sortowana. Wybór płynu w osłonce, który ma być użyty do sortowania, musi być ustalony na podstawie rodzaju próbki i czułości doświadczenia; Do tego eksperymentu użyto opatentowanego płynu do osłonek.
   2. Wykonuj codzienną kontrolę jakości przyrządu (QC) i skonfiguruj sorter do eksperymentu. Zapoznaj się z instrukcją obsługi instrumentu, aby uzyskać szczegółowy przewodnik po konfiguracji instrumentu.
2. Ustawianie macierzy wynagrodzeń
   1. Ustaw matrycę kompensacyjną za pomocą pojedynczych rurek kompensacyjnych od kroku 4.2.
   2. W zastrzeżonym oprogramowaniu wybierz opcję Eksperymentuj z paska narzędzi i kliknij Ustawienia kompensacji. Otwórz opcję Utwórz formanty wynagrodzeń.
   3. Sprawdź znaczniki i potwierdź. Dodawana jest nowa próbka o nazwie "Kompensacja", w ramach której nowe probówki zwane kontrolkami znacznika są dodawane automatycznie przez oprogramowanie.
   4. Wybierz probówkę Niezabarwioną i uruchom ją, aby zarejestrować 5 000 zdarzeń. Przeciągnij bramkę do populacji komórek i zastosuj ją do wszystkich kontrolek kompensacji. Ma to na celu ustawienie napięć i bramki ujemnej dla każdego parametru fluorescencyjnego.
   5. Podobnie, należy osobno załadować rurki do kompensacji pojedynczego zabarwienia, a następnie zapisać i zapisać dane. Wybierz bramkę oddzielającą populację zainteresowania i zastosuj do wszystkich kontrolek kompensacji. Ma to na celu ustawienie bramek dodatnich dla każdego parametru fluorescencyjnego.
   6. Wybierz Eksperyment z paska narzędzi i kliknij Oblicz wartości wynagrodzenia | link i zapisz.
      UWAGA: Po wygenerowaniu matrycy auto-comp za pomocą oprogramowania, parametrów napięcia fluorochromów nie można zmienić dla żadnego z kanałów w lampach mieszanych.
3. Akwizycja danych
   1. Zapisz 10 000 komórek w każdej probówce z kroków 4.3 i 4.4, aby zebrać dane do analizy immunofenotypu komórek.
4. Przygotowanie urządzeń zbierających
   1. W zależności od przeznaczenia posortowanych populacji komórek, wybierz między płytkami 6-dołkowymi, 24-dołkowymi, 48-dołkowymi lub 96-dołkowymi.
   2. Pokryj studzienki 200-500 μl FBS i utrzymuj płytki w nienaruszonym stanie przez 2 godziny.
   3. Po 2 godzinach usunąć resztki FBS i dodać 200-500 μl 10% pożywki hodowlanej MSC.
5. Sortowanie komórek w trybie sortowania pojedynczego komórkowego
   1. Uruchom mieszaną tubę 1 (od kroku 4.5) i zarejestruj 10 000 zdarzeń, aby ustawić bramki w populacji zainteresowania do sortowania, używając odpowiedniej strategii bramkowania.
   2. Załaduj płytkę zbiorczą i ustaw docelową liczbę komórek w zakresie od 2,500 do 5,000 komórek/studzienkę, a następnie wybierz maskę czystości sortowania pojedynczych komórek.
   3. Zbierz posortowane populacje w urządzeniu do zbierania i trzymaj je na lodzie do końca eksperymentu sortowania.
   4. Po zakończeniu przenieś płytki do inkubatora o stężeniu 5% CO_{2 ,} aby utrzymać kultury w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Po pobraniu pliki danych surowych zostały wyeksportowane w formacie pliku .fcs (wersja 3.0. i nowsze). Raporty sortowania generowane po każdym eksperymencie rejestrowały liczbę zdarzeń/komórek posortowanych według przypisanej studni i wskazywały liczbę konfliktów, które zostały przerwane.

Results

SHED zostały scharakteryzowane za pomocą standardowych testów immunofluorescencyjnych pokazujących ekspresję wimentyny (czerwone, pośrednie włókna typu III), filamentów aktynowych (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) i jąder barwionych DAPI (Rysunek 1A). Aby oszacować ich zdolności proliferacyjne i do tworzenia kolonii, przeprowadzono standardowe krótkoterminowe testy wzrostu komórek. 14,3-krotny wzrost tempa proliferacji od dnia 2 do dnia 8 wykazano w Rysunek 1B. Właściwości klonog...

Discussion

W dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, wśród źródeł pourodzeniowych, MSC pochodzące z tkanek jamy ustnej cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich minimalne zobowiązania etyczne i znaczny potencjał różnicowania wieloliniowego²¹. Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) z dotkniętego trzeciego zęba trzonowego i SHED przyciągnęły największą uwagę wśród stomatologów MSC ze względu na ich potencjał terapeutyczny w chorobach neurodegeneracyjnych i urazowych

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µ m) Zestaw cząstek	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Służy do ustawiania opóźnienia lasera po otwarciu modułu sortowania.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometr	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Płyn osłonowy	BD Biosciences	342003	Używany jako płyn osłonkowy zarówno do analizy, jak i sortowania eksperymentów w BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS& T Koraliki badawcze	BD Biosciences	655050	Służy do konfiguracji instrumentu w zależności od rozmiaru dyszy.
Mysz BD Horizon V450 Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
Mysz BD Horizon V450 IgG2b itp.; Kontrola izotypu	BD Biosciences	560374	Izotyp CD44-V450
BD Pharmingen APC Mysz Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypu	BD Biosciences	555751	CD105-APC izotyp
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Roztwór podstawowy 1 mg/ml
BD Pharmingen FITC Mysz anty-ludzka CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mysz IgG1, κ Kontrola izotypu	BD Biosciences	555748	CD90-FITC izotyp
BD Pharmingen PE Mysz anty-ludzka CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypu	BD Biosciences	555749	CD45-PE izotyp
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz IgG1, κ Kontrola izotypu	BD Biosciences	550795	Izotyp CD73-PerCP-Cy 5,5
BD Pharmingen Oczyszczona mysia antywimentyna	BD Biosciences	550513
Albumina surowicy bydlęcej	Hi-Media	TC548-5G
Kryształowy fiolet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS używany do prac hodowlanych i konserwacji.
Alkohol etylowy	---	---	Służy do ogólnej sterylizacji.
Surowica bydlęca płodu	Gibco firmy ThermoFisher	10270-106
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco firmy ThermoFisher	10829018	Pożywka bazowa dla niezróżnicowanych hESC, stosowana do przygotowania pożywek hodowlanych
L-Glutamina 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Metanol, do biologii molekularnej	Hi-Media	MB113
Czerwony olejowy O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyd	loba chemie	30525-89-4
Penicylina Streptomycyna (100x)	Gibco firmy ThermoFisher	15140- 122
Falloidyna (odczynnik ActinGreen 488 ReadyPromes)	Invitrogen	R37110
Azotan srebra	HiMedia	MB156-25G
Tiosiarczan sodu pentahydrat	Chemport	10102-17-7
Sphero Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 3,0 - 3,4 i mikro; m	BD Biosciences	556291
Bufor do barwienia	Sporządzono w MIRM	----	Został przygotowany przy użyciu 2% FBS w PBS
StemPro Adipogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe	Gibco firmy ThermoFisher	A10410-01	Pożywki podstawowe dla pożywek adipogennych
StemPro Adipogenesis Suplement	Gibco firmy ThermoFisher	A10065-01	Pożywki indukcyjne do pożywek adipogennych
StemPro Chondrogenesis	Suplement Gibco firmy ThermoFisher	A10064-01	Pożywka indukcyjna do pożywek chondrogennych
StemPro Osteogenesis Suplement	Gibco firmy ThermoFisher	A10066-01	Pożywki indukcyjne dla pożywek osteoogennych
StemPro Osteogeneza/Chondrogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe	Gibco firmy ThermoFisher	A10069-01	Pożywki bazowe zarówno dla pożywek ostegenicznych, jak i chondrogennych
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Błękit trypanowy	Gibco od life technologies	15250-061
Trypsyna - Roztwór EDTA 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5